CN105779477A - 广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用。本发明提供了取代脲类除草剂的酰胺水解酶基因及其所推导的水解酶蛋白质。该基因全长为1377bp，G+C含量为63.5％，编码458个氨基酸，是一个新的对取代脲类除草剂脲桥具有广谱水解作用的酰胺水解酶基因资源。利用该基因构建的工程菌株能高效表达取代脲类除草剂酰胺水解酶，能在24h内将30mg/L的N‑甲氧基‑N‑甲基取代脲类除草剂(利谷隆)和N,N‑二甲基取代脲类除草剂(敌草隆、绿麦隆、伏草隆)完全降解，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物上的取代脲类除草剂残留的去除，该基因可用于抗取代脲类除草剂转基因作物的培育。

Description

广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用

技术领域

本发明属于应用环境微生物领域，涉及广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用。

背景技术

除草剂的使用虽然提高了农业的生产效率，但同时带来严重的环境问题和作物药害问题。取代脲类除草剂已经被商业化生产超过50年，成为了全世界最广泛使用的重要的除草剂之一。由于其广泛重复的使用以及相对较高的水溶性，在各种污染的生境和农副产品中经常被检测到，除草剂作物药害也时有发生。因此，取代脲类除草剂残留已经成为生态环境保护和作物药害解除急需解决的问题。微生物修复除草剂污染的方法是一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比化学方法、物理方法修复农药污染具有更多优势。微生物修复除草剂残留污染的本质是微生物产生的酶对除草剂的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除除草剂残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的获得在取代脲类除草剂污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时，转基因抗除草剂作物培育是杂草治理史上的一次重大变革。2012年全球种植1.7亿公顷的转基因农作物中具有除草剂抗性性状的超过80％。因此，将除草剂降解基因转入作物中，培育转基因抗除草剂作物新品种，具有十分重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供广谱取代脲类除草剂降解菌。

本发明的另一目的是提供从该降解菌中克隆到的酰胺水解酶基因。

本发明的又一目的是提供该菌株、基因或基因编码蛋白的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为63.5％，编码458个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。

含所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的重组质粒。

作为本发明的一种优选方式，酰胺水解酶基因片段与酶切好的pET-29a(+)进行酶连获得含广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒。

含本发明所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。

作为本发明的一种优选方式，酶连好的含酰胺水解酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。

所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因在去除农作物、土壤、水体的取代脲类除草剂残留方面的应用。

所述的取代脲类除草剂优选自N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂、N,N-二甲基取代脲类除草剂；所述的N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂进一步优选利谷隆；所述的N,N-二甲基取代脲类除草剂进一步优选敌草隆、绿麦隆、伏草隆。

本发明所述的酰胺水解酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的取代脲类除草剂残留方面的应用。

所述的取代脲类除草剂优选自N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂、N,N-二甲基取代脲类除草剂；所述的N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂进一步优选利谷隆；所述的N,N-二甲基取代脲类除草剂进一步优选敌草隆、绿麦隆、伏草隆。

有益效果

1.本发明利用细菌全基因组测序技术成功的从菌株LR2014-1(CCTCCNO：M2015236)中克隆出利谷隆酰胺水解酶基因。

2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为63.5％，编码458个氨基酸。

3.通过PCR技术扩增末端含BamHI和XhoI酶切位点的完整的利谷隆酰胺水解酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-29a(+)(购自Novegen公司)的BamHI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。

4.本发明对利谷隆酰胺水解酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的降解利谷隆，对30mg/L的利谷隆在24h内能完全降解。

5.本发明对利谷隆酰胺水解酶基因的表达产物进行了底物谱研究，发现该酰胺水解酶可以降解大多数的取代脲类除草剂，包括利谷隆、敌草隆、绿麦隆、伏草隆等，为广谱的取代脲除草剂酰胺水解酶。

6.利用该基因构建的工程菌株能高效表达广谱取代脲除草剂酰胺水解酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的利谷隆的降解或去除。

附图说明

图1为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质及其编码基因来源的菌株LR2014-1在固体培养基上的菌落图和电镜图以及在加有利谷隆农药平板上产生的水解圈。

图2为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶降解利谷隆的高效液相色谱图检测图，图A为利谷隆标准品的液相色谱检测图，图B为3,4-二氯苯胺标准品的液相色谱检测图；图C本发明广谱取代脲类除草剂水解酶粗酶液降解利谷隆的高效液相色谱图检测图。

图3为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶基因功能验证的策略图。

图4为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶基因在BL21(pET-29a(+))中高效表达实验方案图；

图5为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶基因在表达宿主菌BL21(DE3)中表达的并纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳图。

图6为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质的最适温度及最适pH值的研究结果图。

图7金属离子对本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质影响的研究结果图。

图8为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解利谷隆的高效液相色谱图和质谱检测图。

图9为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解敌草隆的高效液相色谱图和质谱检测图。

图10为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解绿麦隆的高效液相色谱图和质谱检测图。

图11为本发明广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解伏草隆的高效液相色谱图和质谱检测图。

生物材料保藏信息

LR2014-1，分类命名为Diaphorobactersp.LR2014-1，保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCCNO：M2015236，保藏日期为2015年04月15日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

具体实施方式

实施例1菌株LR2014-1降解利谷隆的效果评估和代谢产物分析

1.1种子液制备

将菌株LR2014-1(CCTCCNO：M2015236)接入含30mg/L利谷隆的100mLLB培养基中，30℃、150rpm摇床培养，48h后6000rpm离心收集菌体，使用MM洗涤菌体两次，最后用10mLMM重悬，作为种子液备用。

1.2菌株LR2014-1对除草剂利谷隆的降解

将菌株LR2014-1按5％的接种量接至含有30mg/L利谷隆的100mLMM中，30℃、150rpm摇床培养，培养12h后，取3ml培养液用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2ml二氯甲烷相吹干，然后1ml甲醇复溶，用滤膜(孔径0.22μm)过滤，采用高效液相色谱进行检测。液相色谱检测条件：岛津RID-10A；C18反相柱；流动相：乙腈：水(体积比65/35)，流速：1ml·min^-1，紫外检测器，波长210nm和250nm；进样量：20μl。

实验结果表明所述菌株LR2014-1能够降解利谷隆，培养12h后，所述菌株对利谷隆的降解率高达80％以上。HPLC检测结果表明利谷隆被降解为3,4-二氯苯胺(图2)。

实施例2利谷隆酰胺水解酶基因的克隆

2.1细菌基因组总DNA的提取

菌株Diaphorobactersp.LR2014-1(Diaphorobactersp.LR2014-1，从利谷隆污染土壤中分离筛选获得的利谷隆高效降解菌株)。大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的Diaphorobactersp.LR2014-1的基因组总DNA，溶于TE(pH8.0)中，置于-20℃保藏，具体方法参考F·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。

2.2细菌基因组草图测序

将检测合格的Diaphorobactersp.LR2014-1基因组DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司进行细菌全基因组草图扫描。基因组测序结果表明，所述菌株LR2014-1基因组草图大小为3825957bp，87个scaffold，大于1000bp的scaffold有87个，通过denovo预测共4238个开放阅读框(ORF)。

2.3测序结果分析

根据细菌全基因组草图扫描结果，结合已经报道的取代脲类水解酶基因，运用生物学软件OMIGA3.0与LR2014-1全基因组序列进行本地比对，获得了利谷隆酰胺水解酶基因的疑似序列。

2.4疑似序列验证

将获得的利谷隆酰胺水解酶疑似序列定向克隆到广宿主载体pBBR1MCS-2上，以利谷隆为底物，验证疑似序列是否有功能。

2.5疑似序列的PCR扩增

以正向引物F1:5’-GAACCTCGAGGCTGACCCTGACACGACCTA-3’(SEQIDNO.3)和反向引物R1:5’-TCAGGATCCCGGCGGTCTTTTTCGTTATTG-3’(SEQIDNO.4)为引物，用PCR从Diaphorobactersp.LR2014-1基因组中扩增出利谷隆酰胺水解酶基因片段。

扩增体系：

PCR扩增程序：

a.98℃变性2min

b.98℃变性15s，64℃退火15s，68℃延伸1min45s，进行30个循环

c.68℃延伸10min

d.10℃5min,冷却到室温。

2.6PCR产物及载体用BamHI和XhoI分步酶切。

酶切体系：

酶切产物用纯化回收试剂盒纯化回收。

酶连

建立如下反应体系:

16℃温育12小时。

2.7制备大肠杆菌DH5α高效感受态细胞

具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P22-23。

2.8转化

取10μl酶连产物转化200μl感受态细胞，具体方法参照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有50mg/L卡那霉素的LB平板，培养24h候挑取阳性克隆子。

2.9验证阳性转化子表达的酶对利谷隆的降解功能

阳性转化子在LB培养基中培养至0D₆₀₀0.6-0.8之间，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。取1ml上清加入到含有终浓度为30mg/L利谷隆的2mlTris-HCl(pH8.0)缓冲液中，设置不加上清液及宿主菌中不含目的基因的空载为对照，30℃水浴12h。

反应结束后，用等体积二氯甲烷全量萃取缓冲液，去除上清水相，用无水硫酸钠除水，直接用紫外分光光度计测效果或是将二氯甲烷挥发除尽，然后甲醇复溶，过0.22μm有机相滤膜，最后采用高效液相色谱检测。液相色谱检测条件：岛津RID-10A；C18反相柱；流动相：乙腈：水(体积比65/35)，流速：1ml·min^-1，紫外检测器，波长210nm和250nm；进样量：20μl。

高效液相色谱检测结果(图2)显示该阳性转化子表达的粗酶液能够在12h内将80％利谷隆断脲桥转化为3,4-二氯苯胺。因此，实验结果表明该核苷酸序列编码的蛋白即为利谷隆酰胺水解酶。

实施例3利谷隆酰胺水解酶基因在BL21(pET-29a(+))中的高效表达

3.1利谷隆酰胺水解酶酶基因的PCR扩增

以正向引物F2:5’-TTAGGATCCCCAACGGACTGGAGAGTTGAA-3’(SEQIDNO.5)和反向引物R2:5’-AACCTCGAGTTGCGGTTCCGAACGCGGATA-3’(SEQIDNO.6)为引物，用PCR从Diaphorobactersp.LR2014-1中扩增出利谷隆酰胺水解酶基因片段。

扩增体系：

PCR扩增程序：

a.98℃变性2min

b.98℃变性15s，63℃退火15s，68℃延伸1min30s，进行30个循环

c.68℃延伸10min，

d.10℃5min,冷却到室温。

3.2PCR产物及载体用BamHI和XhoI分步酶切。

酶切及酶连体系(参考1.6)

3.3转化和表达

将酶连好的含利谷隆酰胺水解酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。涂布于含有50mg/L卡那霉素的平板，挑取阳性转化子。

3.4验证阳性转化子表达的酶对利谷隆的降解功能

阳性转化子在LB培养基中培养至OD₆₀₀0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃低温诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。取1ml上清加入到含有终浓度为30mg/L利谷隆的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，酶活体系为3ml，设置不加上清液及宿主菌中不含目的基因的空载为对照，30℃水浴12h。

用等体积二氯甲烷全量萃取缓冲液，去除上清水相，用无水硫酸钠除水，将二氯甲烷挥发除尽，然后甲醇复溶，过0.22μm有机相滤膜，最后采用高效液相色谱串联质谱检测并鉴定代谢产物。高效液相色谱检测条件：流动相：乙腈：水(体积比65/35)，ZorbaxXDB-C18，5cm×0.46cm，1.8mm反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，流速为0.25mL/min。MS分析使用ESI模式，检测器为AgilentG6410BTripleQuadMassSpectrometer。

HPLC-MS(高效液相色谱和质谱联用)检测结果表明，所述的阳性转化子的粗酶液可以将利谷隆转化为3,4-二氯苯胺(图8)。

3.5利谷隆酰胺水解酶的底物谱研究

阳性转化子在LB培养基中培养至0D₆₀₀0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃低温诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。取1ml上清分别加入到含有终浓度为30mg/L敌草隆、绿麦隆和伏草隆的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，酶活体系为3ml，设置不加上清液及宿主菌中不含目的基因的空载为对照，30℃水浴12h。

实验结果的检测方法同3.4。

实验结果表明，利谷隆酰胺水解酶可以将底物敌草隆、绿麦隆及伏草隆均转化为其对应的苯胺化合物(分别见图9,10,11)。

3.6利谷隆酰胺水解酶的酶学特性研究

阳性转化子在LB培养基中培养至0D₆₀₀0.5左右，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG,16℃低温诱导15h后，离心收集菌体。用Tris-HCl(pH8.0)洗涤菌体，超声波破碎，离心取上清。取0.5ml上清加入到含有终浓度为30mg/L利谷隆的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，酶活体系为3ml。在不同温度的水浴锅中进行酶促反应，15分钟后加入等体积的二氯甲烷终止酶促反应，最后采用高效液相色谱检测酶促反应结果，以最适温度下的降解效率为100％，计算相对酶活力。另取0.5ml上清分别加入到含有终浓度为30mg/L利谷隆的具有不同pH值范围的四种缓冲液乙酸-乙酸钠缓冲液(pH3.6,4.0,4.4,5.0,5.8),Na₂HPO₃-柠檬酸缓冲液(pH5.0,6.0,6.4,7.0,8.0),Tris-HCl缓冲液(pH7.5,7.8,8.6)和甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.6,9.0,9.4,10.0)中，酶活体系为3ml。在酶的最适温度下进行酶促反应，15分钟后加入等体积的二氯甲烷终止酶促反应，最后采用高效液相色谱检测酶促反应结果，以最高的降解效率为100％，计算相对酶活力。最后取0.5ml上清分别加入到含有终浓度为30mg/L利谷隆和0.1mM不同金属离子的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，酶活体系为3ml。在酶的最适温度下进行酶促反应，15分钟后加入等体积的二氯甲烷终止酶促反应，最后采用高效液相色谱检测酶促反应结果，以最高的降解效率为100％，计算相对酶活力。

实验结果表明，利谷隆酰胺水解酶的最适温度为35±2℃，最适pH为7.5±0.5(图6)。不同金属离子对利谷隆酰胺水解酶影响的实验结果表明，0.1mM的Zn²⁺、Cd²⁺及Ni²⁺能够严重的影响该水解酶酶活，而0.1mM的Al³⁺能够显著地促进该水解酶的酶活(图7)。

Claims (8)

1.广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因，其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO.1。

2.权利要求1所述的酰胺水解酶基因编码的酰胺水解酶蛋白质，其特征在于氨基酸序列为：SEQIDNO.2。

3.含权利要求1所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的重组质粒。

4.含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。

5.权利要求1所述的菌株LR2014-1在降解土壤、水体或农作物的取代脲类除草剂残留方面的应用。

6.权利要求1所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因在去除土壤、水体或农作物的取代脲类除草剂残留方面的基因工程应用。

7.权利要求1所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因在抗取代脲类除草剂转基因作物培育中的应用。

8.权利要求2所述酰胺水解酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的取代脲类除草剂残留方面的应用。