CN105754997B - 狂犬病毒drv-ah08株的先导rna及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用 - Google Patents
狂犬病毒drv-ah08株的先导rna及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105754997B CN105754997B CN201610191332.1A CN201610191332A CN105754997B CN 105754997 B CN105754997 B CN 105754997B CN 201610191332 A CN201610191332 A CN 201610191332A CN 105754997 B CN105754997 B CN 105754997B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bbsi
- noti
- cmv
- guide rna
- segment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 title claims abstract description 55
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 49
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 6
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims 3
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 8
- 230000009545 invasion Effects 0.000 abstract description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 39
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 4
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 4
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 101150084101 RNA2 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100353432 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP2 gene Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 101900236200 Rabies virus Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101100191561 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP3 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000007333 Brain Concussion Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 208000010772 Dog disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101710091977 Hydrophobin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010067268 Post procedural infection Diseases 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101100084449 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100137814 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091027568 Single-stranded nucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 206010066901 Treatment failure Diseases 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- -1 length about 64nt Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 101150022630 prp5 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 206010040400 serum sickness Diseases 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种狂犬病毒DRV‑AH08株的先导RNA及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用。首先我们确定了先导RNA的长度，选用出现频率最高的64nt长度的先导RNA进行后续试验，我们发现在细胞内和鼠脑内过表达先导RNA，均能抑制狂犬病毒的复制。同时，在已经感染了狂犬病毒的细胞内过表达先导RNA，能明显抑制狂犬病毒的复制；而在已经感染了狂犬病毒的小鼠上过表达先导RNA，能明显推迟小鼠发病时间，并明显提高小鼠存活率。综上所述，先导RNA不仅在狂犬病的预防方面有潜在的应用价值，还在狂犬病暴露后治疗中有巨大的药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及公共卫生和预防兽医学领域，具体地指一种狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用。
背景技术
狂犬病是一种人兽共患传染病，所有温血动物都能感染，至今仍然在全世界广泛流行。2002～2007年，全国狂犬病死亡11198例，占同期各种传染病病死数的30％，高居所有法定传染病病死数之首。因此狂犬病与艾滋病、病毒性肝炎、结核病一样，已成为危害我国人口健康与公共卫生安全的重大传染病。狂犬病一旦发病，其致死率几乎为100％，因而控制狂犬病的主要手段是预防。免疫预防分为暴露前和暴露后免疫。暴露前免疫是给经常与狂犬病病毒接触的人接种疫苗。暴露后免疫是给被患狂犬病动物或者被疑似狂犬病动物咬伤，舔伤，抓伤的人接种疫苗。对伤势过重者还要用抗狂犬病血清进行治疗。但是暴露后免疫和治疗一定要尽早、及时，一旦出现临床症状，就预示着暴露后免疫和治疗的失败和患者的死亡。
狂犬病毒因其高致死率，对公共卫生安全危害极大。狂犬病毒感染后病毒通过神经进入血脑屏障，神经细胞坏死和凋亡不明显，病理变化不典型，甚至有的病例其脑组织标本无炎症反应，狂犬病的发病机理始终不清楚，为发病后治疗带来极大困难，目前狂犬病暴露后的治疗只有使用含有中和抗体的抗血清这一种方法，而抗血清价格昂贵，而且可能产生过敏性休克和血清病等不良反应，这使得抗血清的使用有一定的局限性。
发明内容
本发明目的是针对现有技术存在的缺陷，提供了一种狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用。
为实现上述目的，本发明提供的一种狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA，所述先导RNA的核苷酸序列
为下述长短不一的RNA核苷酸序列中任意一种，分别为
先导RNA1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，
先导RNA2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，
先导RNA3的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，
先导RNA4的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，
先导RNA5的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，
先导RNA6的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，
先导RNA7的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
先导RNA(Leader RNA)是狂犬病毒感染宿主后产生的一条单股正链的非编码小RNA，长度约64nt，先导RNA既不加帽也无poly A尾巴，是狂犬病毒感染后最早的转录产物。本发明利用先导RNA这一特性，在狂犬病毒感染后，用先导RNA来进行治疗，发挥类似于RNAi的作用来抑制狂犬病毒的复制，也尚未有相关报道。
本发明还提供了一种重组真核表达载体AAV-U6，所述重组真核表达载体AAV-U6是在真核表达载体AAV的NotI酶切位点之间插入U6-BbsI-CMV-mcherry片段得到的，其中，U6-BbsI-CMV-mcherry片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
上述重组真核表达载体AAV-U6的构建方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增U6启动子：以PX335质粒(购买于Addgene，编号：#61515)为模板设计引物对，同时下游引物的末端带有与CAG Enhancer序列互补的一段同源臂)，其中，引物对为：
U6-F-NotI：5’-AAATATGCGGCCGCGAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’，
NotI
U6-R-BbsI：
5’-CATTTACCGTAAGTTATGTAAAAAAGGTCTTCTCGAAGACCC-3’；
BbsI 反向BbsI
进行PCR扩增，纯化得到NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示；
2)PCR扩增mCherry表达盒：以pmCherry(本实验室保存)为模板设计引物对，mCherry核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，其中，上游引物带有与NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT序列末端相同的一段同源臂，下游引物带有NotI酶切位点；使用的引物序列如下：
CMV-CAG-F-BbsI：
5’-GGGTCTTCGAGAAGACCTTTTTTACATAACTTACGGTAAATG，
反向BbsI BbsI
CMV-terminator-R-NotI：
5’-AAATATGCGGCCGCTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’；
NotI
PCR扩增纯化得到CAG-CMV-mCherry-Terminator-NotI片段，其核苷酸序列如SEQID No.11所示；
3)融合PCR扩增U6-BbsI-CMV-mCherry；
以NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段和
CAG-CMV-mCherry-Terminator-NotI片段作为模板进行融合PCR；其中，引物对为：
U6-F-NotI：
5’-AAATATGCGGCCGCGAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’，
NotI
CMV-terminator-R-NotI：
5’-AAATATGCGGCCGCTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’；
NotI
PCR扩增纯化得到U6-BbsI-CMV-mCherry片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
4)酶切：NotI酶切载体pAAV和片段U6-BbsI-CMV-mCherry，酶切后纯化线性化的载体和片段；
5)连接：用T4连接酶连接线性化的载体和片段，并转化大肠杆菌感受态Stbl3，挑取克隆并提质粒测序，鉴定正确即得到重组真核表达载体AAV-U6。
在上述技术方案中，所述步骤1)中，PCR反应体系如下：
PCR的条件如下：
所述步骤2)中，PCR反应体系如下：
CMV-CAG-F-BbsI：
5’-GGGTCTTCGAGAAGACCTTTTTTACATAACTTACGGTAAATG-3’，
反向BbsI BbsI
CMV-terminator-R-NotI：
5’-AAATATGCGGCCGCTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’；
NotI
PCR的条件如下：
所述步骤3)中，PCR反应体系如下：
PCR的条件如下：
本发明还提供了一种含有先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，所述先导RNA对应的双链DNA序列插入到重组真核表达载体AAV-U6的BbsI酶切位点之间。
本发明还提供了一种含有上述重组真核表达载体AAV-U6的大肠杆菌Stbl3表达菌株。
本发明提供了一种上述狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA在制备治疗和预防狂犬病的药品中的应用。
本发明还提供了一种含有先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6在制备治疗和预防狂犬病的药品中的应用。
本发明还提供了一种含有重组真核表达载体AAV-U6的大肠杆菌Stbl3表达菌株在制备治疗和预防狂犬病的药品中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明采用类腺病毒载体在小鼠脑内过表达先导RNA，然后小鼠经脑感染狂犬病毒DRV-AH08株，后经脑切片染色观察发现过表达先导RNA能抑制狂犬病毒复制，并且用体外转录的方式获得纯的先导RNA，在SK-N-SH细胞系上转染先导RNA进入细胞，再感染狂犬病毒，经狂犬病毒染色观察发现病毒的复制被抑制。同时本发明也在SK-N-SH细胞系上感染狂犬病毒后再转染先导RNA，发现先导RNA仍然能抑制狂犬病毒的复制，在活体动物试验中，感染了狂犬病毒的小鼠，经注射能过表达先导RNA的类腺病毒，可以显著的增加小鼠的存活率。利用先导RNA对狂犬病进行暴露后治疗，在狂犬病的预防与治疗方面尚属先例，相对于抗血清，先导RNA价格较低，产生过敏性反应的可能性小，极具推广价值，这对于研究狂犬病暴露后治疗手段具有重要的意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为Leader RNA转录起止位置的确定示意图；
其中，图1A是转录终止位置确定，Leader RNA转录终止的位置并不单一，大部分终止于离基因组3’末端64nt的位置；
图1B是转录起始位置确定，Leader RNA转录起始位置为基因组3’末端第一个碱基；
图2为先导RNA在SK-N-SH细胞内过表达能抑制狂犬病毒DRV-AH08的复制图；
图中，第一排为转染了对照RNA再感染狂犬病毒的细胞，在荧光条件下(左图)和明场条件下(右图)的成像。
第二排为转染了先导RNA再感染狂犬病毒的细胞，在荧光条件下(左图)和明场条件下(右图)的成像。绿色表示狂犬病毒。图片中右下角白色矩形表示200μm比例尺。
图3为先导RNA过表达载体pAAV-U6的结构示意图以及插入片段的位点(Insertionsite)和序列(Insert)示意图；
图4为含有先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6的图谱；
图5为先导RNA在鼠脑内过表达能抑制狂犬病毒DRV-AH08的复制图；
图中，图5A～C为为低倍镜下观察小鼠脑切片，图5A中左脑海马区的红色荧光为先导RNA过表达区域，右脑海马区的红色荧光为对照RNA过表达区域；
图5B中绿色荧光表示狂犬病毒；图5C为A,B图叠加的效果图。
图5D～I为鼠脑局部在高倍镜下观察的图片；
图5D表示高倍镜下观察鼠脑左边海马区，红色为先导RNA过表达的区域；
图5E表示与D图相同区域内狂犬病毒存在情况；
图5F为D图与E图叠加的效果图，在先导RNA存在的区域(红色)狂犬病毒(绿色)的含量下降；
图5G表示高倍镜下观察鼠脑右边海马区，红色为对照RNA过表达的区域；
图5H表示与G图相同区域内狂犬病毒存在情况；
图5I为H图与G图叠加的效果图，在对照RNA存在的区域(红色)狂犬病毒(绿色)的含量并没有减少，图中可见对照RNA存在的区域(红色)狂犬病毒(绿色)共同存在的细胞(黄色)。
图6为SK-N-SH感染狂犬病毒DRV-AH08后过表达先导RNA能够抑制病毒复制；
图6中，第一排为感染狂犬病毒后再转染对照RNA的细胞，在荧光条件下(左图)和明场条件下(右图)的成像；
第二排为感染狂犬病毒后再转染先导RNA的细胞，在荧光条件下(左图)和明场条件下(右图)的成像。绿色表示狂犬病毒，图片右下角白色矩形表示200μm比例尺。
图7为小鼠感染狂犬病毒DRV-AH08后过表达先导RNA能够降低小鼠死亡率的显示图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1Leader RNA1(先导RNA1)转录起始和终止位置的确定
1、Leader RNA1转录终止位置的确定
1)用DRV-AH08经脑注射感染成年小鼠，小鼠发病后心脏灌注后取脑，提取脑组织RNA；
2)用E.coli Poly(A)Polymerase(NEB)给RNA3’端加A，反应体系如下：
反应程序：在温度为37℃条件下反应30～60min；
3)用adapter1-d(T)将加A后的RNA反转成cDNA，
adapter1-d(T)序列为：
5’-ACTGTCAACTGGTGTCGTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’；
反转反应体系如下：
反应程序如下：
| 室温 | 10min |
| 42℃ | 60min |
| 冰上 | 2min |
4)反转后用一对引物进行扩增，
上游引物来源于Adapter1，序列为：
5’-ACTGTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’，
下游引物来源于DRV-AH08基因组，序列为：
5’-ACGCTTAACAACAAAATCAT-3’；
扩增后的片段与pMD-18T连接，转化DH5α，挑菌30个，送测序，比对测序结果，与d(T)紧挨的序列即为leader RNA转录终止的位置。
2、Leader RNA1转录起始位置的确定
1)用DRV-AH08经脑注射感染成年小鼠，小鼠发病后心脏灌注后取脑，提取脑组织RNA；
2)利用已知的转录终止位置，设计反转录引物，序列为：
5’-GGTGTTACATTTTTGCTTTACAAA-3’，将脑组织RNA反转成cDNA；
反转体系如下：
反应程序：
| 室温 | 10min |
| 42℃ | 60min |
| 冰上 | 2min |
3)根据设计的adapter2序列合成单链核苷酸，序列分别为
adapter2-1：
5’-GATCCGAAGCAATACGACTAGGCTAGGNNNN-3’，
adapter2-2：5’-CCTAGCCTAGTCGTATTGCTTCGGATC-3’；
将合成的单链寡核苷酸成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链adapter2，粘性末端为NNNN，变性、退火体系如下：
反应程序：
4)反转得到的cDNA与退火成双链的adapter2连接，连接体系如下
| Adapter2退火产物 | 1μl |
| cDNA | 5μl |
| T4连接酶(Takara) | 0.5μl |
| 10*T4连接酶缓冲液 | 1μl |
| 总计 | 7.5μl |
16℃孵育5-6h。
5)连接后用一对引物进行扩增，
上游引物来源于Adapter2，序列为：
5’-GATCCGAAGCAATACGACTAGGCTA-3’，
下游引物来源于Leader RNA转录终止区域，序列为：
5’-GGTGTTACATTTTTGCTTTAC-3’；
扩增后的片段与pMD-18T连接，转化DH5α，挑菌30个，送测序，比对测序结果，与adapter2紧挨的序列即为leader RNA转录起始的位置，先导RNA1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
同理，通过上述方法得到其他先导RNA2～7核苷酸序列，如SEQ ID No.1～7所示
实施例2先导RNA的过表达在体外和体内均能抑制狂犬病毒的复制
1、先导RNA1的过表达在体外能抑制狂犬病毒的复制
1)根据上述的先导RNA1核苷酸序列，利用体外转录的方法体外合成先导RNA，并纯化，分装后保存于-80℃。对照RNA购买于上海吉玛制药技术有限公司；
2)SK-N-SH细胞用MEM培养基培养(含胎牛血清15％)。细胞长满后，胰酶消化、吹散，接种于24孔板，待细胞汇合度到70-80％后进行转染。
3)按脂质体转染法，将先导RNA(40pmol)和对照RNA(40pmol)分别与脂质体混合，250μl转染液37℃孵育。每种RNA做6个复孔。
4)转染后1h，按每孔0.01MOI感染DRV-AH08。37℃孵育6h后换维持液。
5)转染后24小时，用4％多聚甲醛固定细胞，用FITC标记的狂犬病毒N蛋白单抗染色镜检。
如图2所示：将先导RNA和对照RNA分别转染SK-N-SH细胞后，感染狂犬病毒DRV-AH08，24小时后固定细胞染色镜检。与转染了对照RNA的细胞相比，转染了先导RNA1的细胞狂犬病毒的复制明显减少。
2、先导RNA1的过表达在体内能抑制狂犬病毒的复制
1)根据上述的先导RNA1核苷酸序列，构建真核表达载体AAV-U6，AAV-U6载体示意图如图(3)所示：
2)PCR扩增U6启动子，上游引物带有NotI酶切位点，下游引物带有两个反向的BbsI酶切位点，在BbsI酶切位点之后是连续的TTTTT(引物上为AAAAA)，为U6启动子的终止子。同时下游引物的末端带有与CAG Enhancer序列互补的一段同源臂，扩增后得到NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段(其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示)并纯化。使用的引物序列如下：
U6-F-NotI：
5’-AAATATGCGGCCGCGAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’；
U6-R-BbsI：
5’-CATTTACCGTAAGTTATGTAAAAAAGGTCTTCTCGAAGACCC-3’；
PCR的条件如下：
3)PCR扩增mCherry表达盒。上游引物带有与NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT序列末端相同的一段同源臂，下游引物带有NotI酶切位点。扩增后得到CAG-CMV-mCherry-Terminator-NotI片段其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示并纯化。使用的引物序列如下：
CMV-CAG-F-BbsI：
5’-GGGTCTTCGAGAAGACCTTTTTTACATAACTTACGGTAAATG-3’，
CMV-terminator-R-NotI：
5’-AAATATGCGGCCGCTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3’；
PCR的条件如下：
4)融合PCR扩增U6-BbsI-CMV-mCherry。使用U6-F-NotI和CMV-terminator-R-NotI分别作为上下游引物，
以NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段和CAG-CMV-mCherry-Terminator-NotI片段作为模板，做融合PCR，获得U6-BbsI-CMV-mCherry片段并纯化。
PCR的条件如下：
5)分别用NotI酶切载体pAAV和片段U6-BbsI-CMV-mcherry，酶切后纯化线性化的载体和片段。
6)用T4连接酶连接线性化的载体和片段，并转化大肠杆菌感受态Stbl3。
7)挑取克隆并提质粒测序，鉴定正确；
8)使用之前构建的真核表达载体AAV-U6，将先导RNA1插入AAV-U6载体中并包装成AAV病毒，在活体内过表达先导RNA1。同时用过表达其他非编码小RNA的AAV病毒作为对照。
9)过表达载体构建方式如下：
根据先导RNA和对照RNA序列在其正向寡核苷酸Forward oligo 5’端加上CACCG，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5’端加上AAAA，分别合成。如下：
Forward oligo:5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’，
Reverse oligo:3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAAAA-5’；
将合成的两条互补的寡核苷酸序列成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链，可连入经Bbs1酶切线性化的AAV-U6真核表达载体中。变性、退火体系如下：
反应程序：
10)Bbs1酶切线性化AAV-U6真核表达载体；酶切体系和反应条件如下：
37℃孵育3-4h，酶切完成后，琼脂糖凝脂电泳后，BioFluxR胶回收试剂盒回收，溶于30-40μl ddH2O中。
11)变性退火得到的先导RNA1、对照RNA双链寡聚核苷酸，分别与经Bbs1酶切线性化的质粒载体连接；反应体系如下：
| sgRNA退火产物 | 1μl |
| Bbs1线性化载体 | 50ng |
| T4连接酶(Takara) | 0.5μl |
| 10xT4连接酶缓冲液 | 1μl |
16℃孵育1-3h；
12)将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(Stbl3)，并涂布氨苄抗性平板(50μg/ml)，并挑取单克隆菌落。
13)DNA测序鉴定阳性克隆，得到AAV-U6-先导RNA1和AAV-U6-对照RNA的表达载体。
2、小鼠实验
1)使用三维立体脑定位注射仪将rAAV-U6-先导RNA1注射于小鼠左脑海马区内，再将rAAV-U6-对照RNA注射于同一只小鼠右脑海马区内注射后两周，分别经左右脑注射DRV-AH08病毒。
2)待小鼠发病濒死时，麻醉小鼠，做心脏灌注，取鼠脑，并用4％多聚甲醛固定过夜。
3)固定后的鼠脑用震荡切片机切片，厚度为30μm。分别用本实验室制作的狂犬病毒P蛋白单抗和购买的羊抗鼠二抗(绿色)孵育，孵育后于荧光显微镜下观察拍照如图5所示。在注射了rAAV-U6-先导RNA的鼠脑区域(左边海马区，红色)，狂犬病毒的量(绿色)明显少于注射了rAAV-U6-对照RNA的鼠脑区域(右边海马区，红色)，说明过表达先导RNA1能在活体水平显著抑制狂犬病毒的复制。
实施例3先导RNA1对狂犬病毒的感染有潜在的治疗作用
1、细胞水平的治疗
1)根据上述的先导RNA1核苷酸序列，利用体外转录的方法体外合成先导RNA1，并纯化，分装后保存于-80℃。对照RNA购买于上海吉玛制药技术有限公司；
2)SK-N-SH细胞用MEM培养基培养(含胎牛血清15％)。细胞长满后，胰酶消化、吹散，接种于24孔板，待细胞汇合度到70-80％后感染狂犬病毒；
3)按每孔0.01MOI感染DRV-AH08，37℃孵育1h后转染RNA；
4)按脂质体转染法，将先导RNA(40pmol)和对照RNA(40pmol)分别与脂质体混合，250μl转染液37℃孵育6h后换维持液，每种RNA做6个复孔；
5)转染后24小时，用4％多聚甲醛固定细胞，用FITC标记的狂犬病毒N蛋白单抗染色镜检，如图6所示。细胞感染狂犬病毒后，转染了先导RNA1的细胞，狂犬病毒荧光斑的数量明显少于转让了对照RNA的细胞，说明狂犬病毒感染后，在细胞水平上，过表达先导RNA1仍然可以抑制狂犬病毒的进一步复制。
2、活体水平的治疗
1)根据上述的先导RNA1核苷酸序列，使用上述真核表达载体AAV-U6，在活体内过表达先导RNA1。同时用过表达其他非编码小RNA的AAV病毒作为对照。AAV-U6能表达红色荧光蛋白作为指示；
2)小鼠经后肢肌肉感染狂犬病毒；1小时后将过表达先导RNA1的病毒AAV-U6-先导RNA1和过表达对照RNA的病毒AAV-U6-对照RNA注射进小鼠后肢肌肉，注射了狂犬病毒的位置附近。
观察实验组和对照组的小鼠存活率，如图7所示：对照组小鼠全部死亡，而实验组有30％的小鼠存活，并且对照组的小鼠平均发病死亡时间比实验组短。说明在活体水平，感染狂犬病毒后，过表达先导RNA1可以一直病毒在活体的复制，推迟发病时间，降低死亡率。
通过上述实施例2～3的方法步骤，也可以验证先导RNA2～7用于制备治疗和预防狂犬病的药品。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (4)
1.含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，其特征在于：所述先导RNA为先导RNA1，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述先导RNA对应的双链DNA序列插入到重组真核表达载体AAV-U6的BbsI酶切位点之间；其中，所述重组真核表达载体AAV-U6是在真核表达载体AAV的NotI酶切位点之间插入U6-BbsI-CMV-mcherry片段得到的，U6-BbsI-CMV-mcherry片段的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
2.根据权利要求1所述含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，其特征在于：所述重组真核表达载体AAV-U6的构建方法，包括以下步骤：
1)PCR扩增U6启动子：以PX335质粒为模板设计引物对，同时下游引物的末端带有与CAGEnhancer序列互补的一段同源臂，其中，引物对为：
U6-F-NotI：
U6-R-BbsI：
进行PCR扩增，纯化得到NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；
2)PCR扩增mcherry表达盒：以pmCherry为模板设计引物对，mCherry核苷酸序列如SEQID No.10所示，其中，上游引物带有与NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT序列末端相同的一段同源臂，下游引物带有NotI酶切位点；使用的引物序列如下：
CMV-CAG-F-BbsI：
CMV-terminator-R-NotI：
PCR扩增纯化得到CAG-CMV-mcherry-Terminator-NotI片段，其核苷酸序列如SEQ IDNo.11所示；
3)融合PCR扩增U6-BbsI-CMV-mcherry；
以NotI-U6-BbsI-BbsI-TTTTT片段和CAG-CMV-mcherry-Terminator-NotI片段作为模板进行融合PCR；其中，引物对为：
U6-F-NotI：
CMV-terminator-R-NotI：
PCR扩增纯化得到U6-BbsI-CMV-mcherry片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；
4)酶切：NotI酶切载体pAAV和片段U6-BbsI-CMV-mcherry，酶切后纯化线性化的载体和片段；
5)连接：用T4连接酶连接线性化的载体和片段，并转化大肠杆菌感受态Stbl3，挑取克隆并提质粒测序，鉴定正确即得到重组真核表达载体AAV-U6。
3.根据权利要求2所述含有狂犬病毒DRV-AH08株的先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6，其特征在于：所述步骤1)中，PCR反应体系如下：
PCR的条件如下：
；
所述步骤2)中，PCR反应体系如下：
CMV-CAG-F-BbsI：
CMV-terminator-R-NotI：
PCR的条件如下：
；
所述步骤3)中，PCR反应体系如下：
PCR的条件如下：
4.一种权利要求1所述含有先导RNA对应的双链DNA序列的重组真核表达载体AAV-U6在制备治疗和预防狂犬病的药品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610191332.1A CN105754997B (zh) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | 狂犬病毒drv-ah08株的先导rna及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610191332.1A CN105754997B (zh) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | 狂犬病毒drv-ah08株的先导rna及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105754997A CN105754997A (zh) | 2016-07-13 |
| CN105754997B true CN105754997B (zh) | 2019-02-26 |
Family
ID=56345450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610191332.1A Active CN105754997B (zh) | 2016-03-30 | 2016-03-30 | 狂犬病毒drv-ah08株的先导rna及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105754997B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000015821A1 (en) * | 1998-09-11 | 2000-03-23 | The Regents Of The University Of California | Recombinant adenovirus for tissue specific expression in heart |
| CN1475573A (zh) * | 2002-08-16 | 2004-02-18 | 本元正阳基因技术股份有限公司 | 利用rna干扰现象介导功能基因下调的腺相关病毒载体 |
| CN1626663A (zh) * | 2003-12-10 | 2005-06-15 | 清华大学 | 一种哺乳动物细胞siRNA表达载体 |
| CN101643749A (zh) * | 2009-06-11 | 2010-02-10 | 吴沛宏 | 腺相关病毒载体及其制备方法和应用 |
| CN102443595A (zh) * | 2011-11-11 | 2012-05-09 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种微rna功能的双荧光报告系统的制备方法及应用 |
| CN103589753A (zh) * | 2013-11-08 | 2014-02-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 特异性抑制人SIRT1 基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用 |
| CN104704112A (zh) * | 2012-08-03 | 2015-06-10 | 赛诺菲巴斯德 | 传染性流感病毒的生产 |
-
2016
- 2016-03-30 CN CN201610191332.1A patent/CN105754997B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000015821A1 (en) * | 1998-09-11 | 2000-03-23 | The Regents Of The University Of California | Recombinant adenovirus for tissue specific expression in heart |
| CN1475573A (zh) * | 2002-08-16 | 2004-02-18 | 本元正阳基因技术股份有限公司 | 利用rna干扰现象介导功能基因下调的腺相关病毒载体 |
| CN1626663A (zh) * | 2003-12-10 | 2005-06-15 | 清华大学 | 一种哺乳动物细胞siRNA表达载体 |
| CN101643749A (zh) * | 2009-06-11 | 2010-02-10 | 吴沛宏 | 腺相关病毒载体及其制备方法和应用 |
| CN102443595A (zh) * | 2011-11-11 | 2012-05-09 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 一种微rna功能的双荧光报告系统的制备方法及应用 |
| CN104704112A (zh) * | 2012-08-03 | 2015-06-10 | 赛诺菲巴斯德 | 传染性流感病毒的生产 |
| CN103589753A (zh) * | 2013-11-08 | 2014-02-19 | 中国人民解放军第四军医大学 | 特异性抑制人SIRT1 基因表达的shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Phosphorylation of rabies virus nucleoprotein regulates viral RNA transcription and replication by modulating leader RNA encapsidation;Yang, Y et al.;《JOURNAL OF VIROLOGY》;19990228;第73卷(第2期);第1661–1664页 |
| The Specificity of Rabies Virus RNA Encapsidation by Nucleoprotein;Yang, J et al.;《VIROLOGY》;19980301;第242卷(第1期);第110页左栏第2段、右栏第1段，第112页右栏第1段，图5、图6 |
| 狂犬病毒街毒株DRV-AH08基因组序列测定分析及G蛋白免疫原性研究;于福来;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20141015(第10期);D050-29，4.2.2.DRV-AH08全基因组组成及分析，图4-7，附录一 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105754997A (zh) | 2016-07-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110592172B (zh) | 利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点 | |
| CN106946995A (zh) | Ⅰ群血清4型禽腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| CN114134211B (zh) | Usp30基因作为靶点在抑制塞内卡谷病毒复制中的应用 | |
| CN104892756A (zh) | 一种抗菌鸡卵黄复合抗体及其制备方法与应用 | |
| CN108558995A (zh) | 一种防治新型鹅星状病毒的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN108676092A (zh) | 一种防治新型鸭呼肠孤病毒的卵黄抗体及其制备方法 | |
| CN116903753A (zh) | 一种广谱抗原虫多肽及其制备与应用 | |
| CN105754997B (zh) | 狂犬病毒drv-ah08株的先导rna及其在制备预防与治疗狂犬病毒的药品中的应用 | |
| Barbezange et al. | Molecular study of the quasispecies evolution of a typical pigeon paramyxovirus type 1 after serial passages in pigeons by contact | |
| CN109867713A (zh) | 一种犬瘟热基因工程亚单位疫苗 | |
| WO2011046193A1 (ja) | ウイルス性出血性敗血症ウイルス結合性アプタマー | |
| CN105624162A (zh) | 针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用 | |
| CN109745327A (zh) | 一种霉酚酸酯在制备预防或治疗口蹄疫病毒感染的药物中的应用 | |
| WO2023078099A1 (zh) | 一种用于治疗神经损伤疾病的基因药物 | |
| WO2022166771A1 (zh) | 3'utr的构建方法和应用 | |
| CN101905020B (zh) | 一种猪瘟活疫苗的生产方法 | |
| CN101386860A (zh) | 一种构建脑心肌炎病毒感染性克隆的方法 | |
| US20220009968A1 (en) | Crispr-cas-based composition for gene correction | |
| Anoyatbekova et al. | Identification of the emergent pestivirus infections of small ruminants in Tajikistan | |
| CA3120802A1 (en) | Novel fish totivirus | |
| Yao et al. | Construction and bacteriostatic effect analyses of a recombinant thermostable Newcastle disease virus expressing cecropin AD | |
| CN113121645B (zh) | 一种对虾PcRab7蛋白与WSSV囊膜蛋白VP28互作阻断剂多肽 | |
| CN110408602A (zh) | Pcv2-prrsv重组病毒及其制备方法、基因、应用和疫苗 | |
| CN112941104B (zh) | 一种携带斑马鱼bid序列的表达载体、构建方法及其用途 | |
| CN118910097A (zh) | 一种弓形虫GRA6和ROP2A抗原mRNA-LNP疫苗及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |