CN105636645A

CN105636645A - 在肌萎缩症中的血管紧张素

Info

Publication number: CN105636645A
Application number: CN201480034275.5A
Authority: CN
Inventors: R·萨巴瓦尔; M·沙普洛; R·弗兰克林
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Tarix Orphan LLC
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; Constant Therapeutics LLC
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2016-06-01
Also published as: US20180221433A1; US20160074464A1; BR112015026286A2; RU2015141336A; EP2986341A4; WO2014189634A1; MX2015014668A; JP2016522178A; EP2986341A1; AU2014269028A1; KR20160026855A; CA2909002A1

Abstract

除了其他以外，本发明提供了治疗肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或对肌萎缩症易感的对象施用血管紧张素(1-7)肽。本发明部分地基于一个意外的发现，在肌萎缩动物模型中施用血管紧张素(1-7)肽可减轻纤维化、恢复运动活性和恢复交感迷走神经平衡，这些是患有肌萎缩症的患者的特征性症状。因此，本发明提供了一种对于肌萎缩症的新的和更加有效的疗法。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包括具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-lle5-His6-Pro7(SEQID？NO:1)的天然存在的血管紧张素(1-7)。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽是SEQ？ID？NO:1的功能性等价物。在一些实施方式中，所述线形肽具有氨基酸序列Asp1-Arg2-Val3-Ser4-lle5-H’is6-Cys7(SEQ？ID？NO:2)。在一些实施方式中，所述环肽是4,7-环化血管紧张素(1-7)。

Description

在肌萎缩症中的血管紧张素

相关申请的交叉引用

本申请要求2013年4月19日提交的美国临时专利申请序号61/813,929和2013年5月1提交的美国临时专利申请序号61/818,307的优先权，其公开的全部内容通过引用在此并入本申请。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明在由美国国立卫生研究院(NIH)提供的HL14388号政府资助下进行。政府享有本发明的一些权利。

背景

肌萎缩症(MD)指肌肉纤维异常地易于损坏的一类疾病。一些亚型，如杜氏(Duchenne)肌萎缩症，通常出现在生命的非常早期，而其他的，如眼肌麻痹的肌萎缩症趋向于出现在生命的较晚期。目前对及萎缩症的治疗包括皮质类固醇给药、使用矫形设备以支持运动和防止挛缩，以及物理疗法。不幸的是，目前使用的治疗中没有一种已证明能够阻止或逆转疾病的进展。

发明概述

本发明提供了一种改良的基于血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的治疗肌萎缩症的方法。本发明部分地基于一个意外的发现，在肌萎缩动物模型中施用血管紧张素(1-7)肽可减轻纤维化、恢复运动活性和恢复交感迷走神经平衡，这些是患有肌萎缩症的患者的特征性症状。因此，本发明提供了一种新的和更加有效的肌萎缩症的疗法。

在一个方面，本发明提供了治疗肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或对肌萎缩症易感的对象施用血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂以有效剂量周期性施用，所述施用间隔可以使得肌萎缩症的至少一种症状或特征的强度、严重程度、持续时间或频率降低或者使其发病被推迟。在一些实施方式中，所述肌萎缩症的至少一种症状或特征选自下组：肌肉萎缩、肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心肌病、吞咽障碍、肠和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知障碍、行为功能障碍、社交障碍、脊柱侧弯和呼吸功能受损。

在一些实施方式中，施用所述血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂使得肌肉再生、纤维化减轻、肌力增加、弹性增加、运动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认知改善、肺功能改善和/或炎症抑制。

在一些实施方式中，所述肌萎缩症选自下组：杜氏(Duchenne)肌萎缩症、贝克型(Becker)肌萎缩症、贝克型(Becker)先天性肌强直、埃-德二氏(Emery-Dreifuss)肌萎缩症、三好氏(Miyoshi)肌肉病变、先天性肌萎缩症、面肩肱型肌萎缩症、眼咽型肌萎缩症、原发性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、多肌炎、格林-巴利(Guillian-Barre)综合征、安德森-塔维勒(Anderson-Tawil)综合征、Bethlem肌病、延髓肌萎缩症、肉毒碱缺乏症、肉毒碱棕榈酰基转移酶缺乏症、中央轴空病、中央核肌病、腓骨肌萎缩症(Charcot-marie-toothdisease)、先天性肌无力综合征、先天性肌强直性营养不良(沃克-沃伯格(Walker-Warburg)综合征)、科里(Cori)病(脱支酶缺乏症)、代-索二氏(Dejerine-Sottas)病、皮肌炎、远端型肌萎缩症、强直性肌营养不良(肌强直性肌肉萎缩)、内分泌性肌病、欧伦贝格(Eulenberg)病(先天性肌强直症)、芬兰远端肌病、福布斯氏(Forbes)病、弗里德里希(Friedrich)运动失调、福山型(Fukuyama)先天性肌萎缩症、2、3、5、7、9、10、11型糖原贮积症、高尔斯-莱恩(Gowers-Laing)远端肌病、遗传性包涵体肌炎、甲亢性肌病、甲减性肌病、包涵体肌炎、遗传性肌病、整联蛋白-缺陷性先天性肌萎缩病、肯尼迪(Kennedy)病(脊髓-延髓肌萎缩症)、乳酸脱氢酶缺乏症、兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征、肢带型肌萎缩症、麦卡德尔(McArdle)病、层黏连蛋白缺乏先天性肌萎缩症、线粒体肌病、运动神经元病、肌肉-眼-脑病、重症肌无力、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、肌原纤维肌病、肌磷酸酶缺乏症、先天性肌强直(汤姆森(Thomsen)病)、肌管性肌病、肌强直肌萎缩症、纤维质肌病、野中型(Nonaka)远端肌病、先天性副肌强直症、皮尔森(Pearson)综合征、周期性瘫痪、磷酸果糖激酶缺乏症(垂井(Tarui)病)、磷酸甘油酸盐激酶缺乏症、磷酸甘油酸盐变位酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、庞贝氏(Pompe)病(酸性麦芽糖酶缺乏症)、进行性眼外肌麻痹、韦兰德(Welander)远端肌病和ZASP相关肌病。在一些实施方式中，所述先天性肌萎缩症选自下组：层粘连蛋白-α2-缺乏的先天性肌萎缩症、乌尔里希(Ullrich)先天性肌萎缩症、沃克-沃伯格(Walker-Warburg)综合征、福山型(Fukuyama)先天性肌萎缩症和伴有精神发育迟滞和脑回肥厚的先天性肌萎缩症。在一些实施方式中，所述肌萎缩症是杜氏(Duchenne)肌萎缩症。

根据不同的实施方式可以使用任意不同的施用途径。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂是胃肠外施用。在一些实施方式中，所述胃肠外施用选自静脉内、皮内、吸入、透皮(局部)、眼内、肌内、皮下、肌内和/或经粘膜施用。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂是口服施用。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂是每周、每日施用或者以可变的间隔施用。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂以范围从约1-1,000μg/kg/天的有效剂量施用。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂以范围从约50-500μg/kg/天的有效剂量施用。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂以范围从约400-500μg/kg/天的有效剂量施用。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂与抗肌萎缩症药物联合使用。在一些实施方式中，所述抗肌萎缩症药物选自下组：Eteplirsen(AVI-4658)、HCT1026、NCX320、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、阿伐那非(avanafil)、罗地那非(iodenafil)、米罗那非(mirodenafil)、乌地那非(udenafil)、扎普司特(zaprinast)、皮质类固醇及其组合。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:1)。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽是SEQIDNO:1的功能性等价物。

在一些实施方式中，所述功能性等价物是线形肽。在一些实施方式中，所述线形肽包含包括在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少4个氨基酸的序列，其中所述至少4个氨基酸保持其在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置。在一些实施方式中，所述线形肽包含4-25个氨基酸。在一些实施方式中，所述线形肽是天然存在的血管紧张素(1-7)肽的片段。在一些实施方式中，所述线形肽包含在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方式中，所述线形肽具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQIDNO:2)。

在一些实施方式中，所述功能性等价物是环肽。在一些实施方式中，所述环肽包含氨基酸之间的连接键。在一些实施方式中，所述连接键位于与天然存在的血管紧张素(1-7)中的Tyr⁴和Pro⁷的位置对应的残基。在一些实施方式中，所述连接键是硫醚桥。在一些实施方式中，所述环肽包含与天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:1)在其他方面都相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述环肽是如下式所示的4,7-环化的血管紧张素(1-7)：

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种化学修饰，以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方式中，所述一种或多种化学修饰包含聚乙二醇化。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂如本发明所述用于治疗肌萎缩症。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是非肽激动剂。在一些实施方式中，所述非肽激动剂是具有下述结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂是口服施用。

如在本申请中所使用的，术语“约”和“近似”所表达的意义相同。本申请中带有或不带有“约/近似”的任何数字表示包含相关领域普通技术人员可以理解的任意正常波动。

下文详细清楚的描述了本发明的其他特征、目的和优势。但应理解，说明本发明实施方式的详细描述仅具有说明性，并不具有限制性。本领域技术人员可根据详细描述清楚的理解本发明范围内的各种变化和修饰。

定义

为了使本发明更加易于理解，下文中首先对某些术语进行了定义。下列术语和其他术语的其他定义将在说明书中阐述。

激动剂：本文中使用的术语“激动剂”指对目标蛋白的功能具有正向影响的任意分子。在一些实施方式中，激动剂直接或间接地加强、增强、活化和/或增加目标蛋白的活性。在特定的实施方式中，激动剂直接与目标蛋白相互作用。此类激动剂可以是例如蛋白、化学化合物、小分子、核酸、抗体、药物、配体或其他试剂。

动物：本文中使用的术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的人。在一些实施方式中，“动物”指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方式中，非人动物为哺乳动物(如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方式中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖类、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程改造的动物和/或克隆体。

近似或约：本文中使用的术语“近似”或“约”适用于一个或多个目标值，是指与规定的参考值近似的数值。在某些实施方式中，除另有说明或从上下文中显而易见(除了当这些数字将超过可能数值的100％时)，术语“近似”或“约”是指在所述参考值的任意方向(高于或低于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小幅度以内的数值范围。

生物活性：本文中的短语“生物活性”是指在生物系统中特别是在生物体中具有活性的任何试剂的一种特性。例如，当给予生物体的试剂对此生物体具有生物作用时，则认为此试剂具有生物活性。在特定的实施方式中，若一种肽具有生物活性，具有所述肽至少一种生物活性的肽的一部分一般称为“生物活性”部分。在某些实施方式中，若某种肽并不具有内在的生物活性，但抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的作用，则认为这种肽具有生物活性。

运载体或稀释剂：本文中所用的术语“运载体”和“稀释剂”是指用于制备药物制剂的药学上可接受的(如给予人体时安全无毒)的运载体或稀释用的物质。示例性的稀释剂包括无菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH缓冲液(如磷酸盐缓冲液)、无菌盐溶液、林格氏溶液或葡萄糖溶液。

剂型：本文中使用的术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗剂的物理上不连续单位。各单位含有经预先确定的活性物质的量，经计算此数量能够产生所需的治疗作用。但是应理解，组合物的总剂量应由主治医师在合理的医学判断范围内决定。

给药方案：本文中使用的术语“给药方案”(或“治疗方案”)是分别给予对象的、通常间隔一定的时间段的一组单位剂量(通常超过一个)。在一些实施方式中，给定的治疗剂具有推荐使用的可以包含一个或多个剂量的给药方案。在一些实施方式中，给药方案包含多次给药，各次给药彼此间隔相同长度的时间间隔；在一些实施方式中，给药方案包含多次给药，并且至少有两个不同长度的时间段间隔分次给药。在一些实施方式中，在预设定的时间段内连续给予治疗剂。在一些实施方式中，每日一次(QD)或每日两次(BID)给予治疗剂。

功能等价物或衍生物：本文使用的术语“功能等价物”或“功能衍生物”是指保有与原始序列基本相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能衍生物或等价物可能是天然衍生物或人工制备物。示例性的功能衍生物包括具有一个或多个氨基酸取代、缺失或增加的氨基酸序列，条件是仍保持所述蛋白的生物活性。用于取代的氨基酸与被取代的氨基酸理想地具有相似的理化性质。理想的相似理化性质包括电荷、大小、疏水性、亲水性等的相似性。

改善、增加或减少：本文中使用的术语“改善”、“增加”或“减少”，或在语法上等同的术语，是指与基线测量相关的数值，所述基线测量如在开始本申请所述的治疗前对相同个体的测量，或在未接受本申请所述的治疗的对照对象(或多个对照对象)中的测量。“对照对象”是指与接受治疗的对象患有相同形式的疾病、并与接受治疗的对象年龄相仿的对象(以确保在治疗个体和对照个体中的疾病阶段是具有可比性的)。

体外：本文使用的术语“体外”是指在人工环境如在试管或反应器、在细胞培养物等中发生的事件，而非在多细胞生物体中发生的事件。

体内：本文使用的术语“体内”是指在多细胞生物体(例如人体和非人动物)中发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，此术语可用于表示在活细胞(相对于如体外系统)中发生的事件。

分离的：本文中使用的术语“分离的”是指(1)从在初始生产时关联在一起(不论是在天然状态下和/或在实验条件下)的至少部分成分中分开的，和/或(2)人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。经分离的物质和/或实体可以从与其初始关联在一起的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本100％或100％的其他成分中分开。在一些实施方式中，经分离的试剂的纯度超过约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本100％或100％。如本申请中所使用的，若一种物质基本不含其他成分，则认为其是“纯的”。本文中使用的术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。

肌萎缩症：在本文中使用的术语“肌萎缩症”或“MD”指的是使肌肉骨骼系统衰弱的一组疾病。在一些实施方式中，肌萎缩症是类MD病症。在一些实施方式中，此类疾病包括骨骼肌进行性萎缩。在一些实施方式中，心肌和平滑肌受到影响。

预防：本文中使用的术语“预防”或“防止”，当与疾病、病症和/或状况的发生连用时是指降低发生疾病、病症和/状况的风险。见对“风险”的定义。

多肽：本文中使用的术语“多肽”是指通过肽键连接到一起的连续的氨基酸链。使用该术语指代任意长度的氨基酸链，但本领域的普通技术人员将理解此术语不限于指长链，也可指代包含通过肽键相连的两个氨基酸的最短链。如本领域的技术人员所知，可对多肽进行加工和/或修饰。

蛋白：本文中使用的术语“蛋白”是指作为独立单位发挥功能的一条或多条多肽。如果单一多肽是独立的功能单位，且无需通过与其他多肽形成永久或暂时的物理结合以形成独立的功能单位，则术语“多肽”和“蛋白”的用法可互换。若独立的功能单位由相互物理结合的一条以上的多肽构成，则术语“蛋白”是指物理偶联并作为独立单位共同发挥作用的多个多肽。

风险：通过上下文的理解可知，疾病、病症和/或状况的“风险”包含特定个体将发生疾病、病症和/或状况(如肌萎缩症)的可能性。在一些实施方式中，风险以百分比表示。在一些实施方式中，风险从0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％直至100％。在一些实施方式中，风险表示与一个参照样品或一组参照样品组相关的风险相比较的相对风险。在一些实施方式中，参照样品或参照样品组具有对某种疾病、病症、状况和/或事件(如肌萎缩症)的已知风险。在一些实施方式中，参照样品或参照样品组来自于与特定个体可比较的个体。在一些实施方式中，相对风险为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。

稳定性：在本申请中使用的术语“稳定的”指在较长的一段时间内，治疗剂维持其治疗效果(例如其全部或大部分的预期生物活性和/或物理化学完整性)的能力。可以在较长的一段时间内(例如至少1、3、6、12、18、24、30、36个月或更长)，评估治疗剂的稳定性和药物组合物维持治疗剂稳定性的能力。在某些实施方式中，已将如本申请所述的药物组合物进行制剂，以使得在制剂中的一种或多种治疗剂能够稳定，或者延缓或阻止所述一种或多种治疗剂降解。在制剂的情况下，稳定的制剂是指在贮存和加工(如冻/融、机械混合和冻干)期间所述治疗剂在其中基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性。

对象：本文中使用的术语“对象”是指人或任何非人动物(如小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括产前和产后的形态。在许多实施方式中，对象是人类。对象可为患者，即去往医师处诊断或治疗疾病的人。本文中使用的术语“对象”与“个体”或“患者”的用法可互换。对象可以患有或易患有某种疾病或病症，但可能显示或可能未显示出所述疾病或病症的症状。

基本：本文中使用的术语“基本”是指显示出目标特性或属性的完全或接近完全的范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象极少(如果有过的话)达到完全和/或向完全趋近或者实现或避免绝对的结果。因此，本文中使用术语“基本”体现了许多生物和化学现象中固有的缺乏完全性的可能。

患有：“患有”疾病、病症和/或状况的个体已被确诊或显示出所述疾病、病症和/状况的一种或多种症状。

易患：“易患”疾病、病症和/或状况的个体尚未被确诊此种疾病、病症和/状况。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或状况的个体可能未显示出所述疾病、病症和/或状况的症状。在一些实施方式中，易患疾病、病症、状况或情况(例如肌萎缩症)的个体可能具有下列一种或多种特征：(1)与所述疾病、病症和/或状况的发展相关的基因突变；(2)与所述疾病、病症和/或状况的发展相关的基因多态性；(3)与所述疾病、病症和/或状况的发展相关的蛋白表达和/或活性的增加和/或下降；(4)与所述疾病、病症、状况和/或情况的发展相关的习惯和/或生活方式；(5)已进行、计划进行或需要移植。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或状况的个体将发展为该疾病、病症和/或状况。在一些实施方式中，易患疾病、病症和/或状况的个体将不会发展为该疾病、病症和/或状况。

治疗有效量：本文中使用的术语治疗剂的“治疗有效量”是指给予患有或易患疾病、病症和/或状况的对象的量足以治疗、诊断、预防和/或延迟所述疾病、病症和/或状况的症状的发作。本领域的普通技术人员应理解治疗有效量通常是以包含至少一个剂量单位的给药方案来给药的。

治疗：本文中使用的术语“治疗”“处理”或“医治”是指用于使特定疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟发作、减轻严重程度和/或降低发生率的任何方法。可以向未显示出疾病体征和/或仅显示出疾病早期体征的对象给予治疗，以降低发生与疾病相关的病理的风险。

附图简述

图1A显示了在实施例2以及所进行的一些分析中使用的遥测技术的一些示意图，和1B显示了实施例2中所示的实验设计。

图2A显示了描述对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的平均动脉血压的柱状图，和2B显示了对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的24小时平均心率。

图3显示了表示采用无线电遥测技术检测的对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的24小时平均活动能力的柱状图。

图4A显示了表示对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的压力反射敏感性的柱状图，4B显示了通过对阿托品的应答检测的对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的心脏迷走神经张力的柱状图，4C显示了通过对普萘洛尔的应答检测的对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的心脏交感神经张力的柱状图，和4D显示了通过对氯异吲哚铵的应答检测的对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的血管舒缩交感神经张力的柱状图。

图5A显示了对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的使用马森氏(Masson)三色染色以显示肌肉组织纤维化的比较的组织病理学数据，和5B显示了对图A中的结果进行定量的柱状图。

图6显示了表示对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗的组织中1型血管紧张素受体(AT₁R)的受体表达水平的AlexaFluor488染色的结果。

图7A显示了对照C57BL6小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗和Sgcd-/-小鼠+/-使用Ang(1-7)治疗中的骨骼肌细胞的二氢乙啶(DHE)染色结果，和7B显示了表示图A中所示数据的柱状图。

图8是显示给予生理盐水、TXA127(SEQIDNO:1)、Pancyte(SEQIDNO:22)或TXA301(SEQIDNO:2)之一的第6周、第7周和第8周期间的Sgcd-/-小鼠在转轮上每分钟平均转数的示例性图。数据＝平均值±SE，和*＝p<0.05(与生理盐水组比较)。

图9是显示利用生理盐水、TXA127(SEQIDNO:1)、Pancyte(SEQIDNO:22)或TXA301(SEQIDNO:2)之一治疗20天的Sgcd-/-小鼠在转轮上每分钟平均转数的示例性图。

图10A显示了取自利用生理盐水、TXA127(SEQIDNO:1)、Pancyte(SEQIDNO:22)或TXA301(SEQIDNO:2)之一治疗的36-43周龄Sgcd-/-小鼠四头肌的示例性苏木精-伊红染色(上面一行)和马森氏(Masson)三色染色(下面一行)；10B显示了由马森氏(Masson)三色染色数据计算得到的纤维化的量(根据蓝色的面积计算)并且以柱状图表示。数据＝平均值±SE，和*＝p<0.05(与生理盐水组比较)。

图11A显示了取自使用生理盐水、TXA127(SEQIDNO:1)、Pancyte(SEQIDNO:22)或TXA301(SEQIDNO:2)之一治疗的Sgcd-/-小鼠四头肌的示例性共聚焦图像，氧化应激以二氢乙啶(DHE)染色表示；11B显示了表示染色四头肌6张切片平均值的柱状图，使用了NIHImageJ软件对荧光强度进行定量，并归一化至与使用生理盐水治疗的Sgcd-/-小鼠中检测的平均荧光强度相比的百分率。数据＝平均值±SE，和*＝p<0.05(与生理盐水组比较)。

某些实施方式的详细描述

除了其他以外，本发明提供了基于使用血管紧张素(1-7)肽及其类似物或衍生物，或者血管紧张素(1-7)受体激动剂如AVE0991治疗肌萎缩症的改进的组合物和方法。在一些实施方式中，使得肌萎缩症的至少一种症状或特征的强度、严重程度、持续时间或频率降低或者使其发病被推迟。在一些实施方式中，施用一种或多种血管紧张素(1-7)肽及其类似物或衍生物，或血管紧张素(1-7)受体激动剂使得肌肉再生、纤维化减轻、肌力增加、弹性增加、运动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认知改善、肺功能改善和/或炎症抑制。

下列章节中详述了发明的各个方面。章节的使用并不意味着限制发明。各章节可适用于发明的任意方面。在本发明中，除另有说明，使用“或者”表示“和/或”。

肌萎缩症

肌萎缩症(MD)是导致肌肉退化的一组遗传性疾病，其会造成运动变弱和受损。所有肌萎缩症的核心特征是其是渐进性的。肌萎缩症包括但不限于：杜氏(Duchenne)肌萎缩症、贝克型(Becker)肌萎缩症、贝克型(Becker)先天性肌强直、埃-德二氏(Emery-Dreifuss)肌萎缩症、三好氏(Miyoshi)肌肉病变、先天性肌萎缩症、面肩肱型肌萎缩症、眼咽型肌萎缩症、原发性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、多肌炎、格林-巴利(Guillian-Barre)综合征、安德森-塔维勒(Anderson-Tawil)综合征、Bethlem肌病、延髓肌萎缩症、肉毒碱缺乏症、肉毒碱棕榈酰基转移酶缺乏症、中央轴空病、中央核肌病、腓骨肌萎缩症(Charcot-marie-toothdisease)、先天性肌无力综合征、先天性肌强直性营养不良(沃克-沃伯格(Walker-Warburg)综合征)、科里(Cori)病(脱支酶缺乏症)、代-索二氏(Dejerine-Sottas)病、皮肌炎、远端型肌萎缩症、强直性肌营养不良(肌强直性肌肉萎缩)、内分泌性肌病、欧伦贝格(Eulenberg)病(先天性肌强直症)、芬兰远端肌病、福布斯氏(Forbes)病、弗里德里希(Friedrich)运动失调、福山型(Fukuyama)先天性肌萎缩症、2、3、5、7、9、10、11型糖原贮积症、高尔斯-莱恩(Gowers-Laing)远端肌病、遗传性包涵体肌炎、甲亢性肌病、甲减性肌病、包涵体肌炎、遗传性肌病、整联蛋白-缺陷性先天性肌萎缩病、肯尼迪(Kennedy)病(脊髓-延髓肌萎缩症)、乳酸脱氢酶缺乏症、兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征、麦卡德尔(McArdle)病、层黏连蛋白缺乏先天性肌萎缩症、线粒体肌病、运动神经元病、肌肉-眼-脑病、重症肌无力、肌腺苷酸脱氨酶缺乏症、肌原纤维肌病、肌磷酸酶缺乏症、先天性肌强直(汤姆森(Thomsen)病)、肌管性肌病、肌强直肌萎缩症、纤维质肌病、野中型(Nonaka)远端肌病、先天性副肌强直症、皮尔森(Pearson)综合征、周期性瘫痪、磷酸果糖激酶缺乏症(垂井(Tarui)病)、磷酸甘油酸盐激酶缺乏症、磷酸甘油酸盐变位酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症、庞贝氏(Pompe)病(酸性麦芽糖酶缺乏症)、进行性眼外肌麻痹、韦兰德(Welander)远端肌病和ZASP相关肌病。在一些实施方式中，所述先天性肌萎缩症选自下组：层粘连蛋白-α2-缺乏的先天性肌萎缩症、乌尔里希(Ullrich)先天性肌萎缩症、沃克-沃伯格(Walker-Warburg)综合征、福山型(Fukuyama)先天性肌萎缩症和伴有精神发育迟滞和脑回肥厚的先天性肌萎缩症。在一些实施方式中，所述肌萎缩症是杜氏(Duchenne)肌萎缩症。

肌萎缩症的症状可能随着肌萎缩症类型而有所不同，可能使某些或全部肌肉受影响。肌萎缩症的示例性症状包括肌肉运动技能发育延迟、使用一个或多个肌群困难、肌肉萎缩、肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心肌病、肌肉缺血、脊柱侧弯、吞咽、语言或进食障碍、肠和膀胱功能受损、垂涎、眼睑下垂、频繁跌倒、成人肌肉或肌群力量丧失、肌肉尺寸丧失、由于身体无力或身体生物力学改变导致的行走问题、呼吸功能受损和/或认知或行为受损/智力迟钝。

尽管还没有已知能够治愈肌萎缩症的方法，但是使用了若干支持性治疗，其中包括改善症状和疾病的疗法。皮质类固醇、ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂、物理疗法、矫正设备、轮椅或者用于ADL和肺功能的其他辅助医疗设备常用于肌萎缩症中。心脏起搏器用于防止强直性肌萎缩症中由心律失常导致的猝死。改善肌强直症状(无法放松)的抗肌强直剂包括美西律，和在一些情况下为苯妥英、普鲁卡因胺和奎宁。

杜氏(Duchenne)肌萎缩症

杜氏(Duchenne)肌萎缩症是隐性X-连锁形式的肌萎缩症，其会导致肌肉退化和最终死亡。DMD的特征为近端肌肉无力、步态异常、腓肠肌(小腿)肌肉肥大和肌酸激酶升高。很多MDM患者在5岁左右确诊，此时其症状/体征通常变得更加明显。受影响的个体通常在10-13岁左右停止走路并且在其20多岁的中期至晚期之间或之前死于心肺功能障碍。

DMD病症由位于人X染色体上的抗肌萎缩蛋白基因突变导致，其是用于编码蛋白质抗肌萎缩蛋白的，这是肌肉组织中的一种重要的结构组分，其为细胞膜的肌营养不良蛋白聚糖复合物(DGC)提供结构稳定性。抗肌萎缩蛋白连接内部胞质肌动蛋白纤维网络和胞外基质，为肌肉纤维提供了物理强度。因此，抗肌萎缩蛋白的改变或缺乏会导致异常的肌肉纤维肌膜撕裂和坏死。尽管男性和女性均能够携带这种突变，但是女性很少显示出严重的疾病症状。

DMD主要的症状是伴有肌肉萎缩的肌肉无力，通常随意肌首先受到影响，特别是影响臀部、骨盆区、大腿、肩部和小腿肌肉。肌肉无力还发生在手臂、颈部和其他区域。小腿通常会扩张。体征和症状通常出现在6岁以前，并且可能早在婴儿期就已经出现。其他身体症状包括但不限于：独立行走能力延迟、渐进性行走、走步或跑步困难并且最终丧失行走能力(通常在12岁)、频繁跌倒、疲劳；运动能力困难(跑步、跳跃、跳动)、腰部脊柱前凸增加、由于腰部脊柱前凸增加导致髋屈肌缩短、由于肌肉纤维缩短和在结缔组织出现纤维化导致的跟腱挛缩和腘绳肌功能受损、肌肉纤维畸形、由于肌肉组织被脂肪和结缔组织取代导致的舌和小腿肌肉假性肥大(扩张)、神经行为失调(例如ADHD)的风险增加、学习障碍(诵读困难)和特定认知技能的非渐进性变弱(特别是短期口头记忆)、骨骼畸形(在一些情况下包括脊柱侧弯)。

贝克型(Becker)肌萎缩症

贝克型(Becker)肌萎缩症是X-连锁隐性遗传病，其特征为腿部和骨盆肌肉的渐进性衰弱。与DMD类似，贝克型(Becker)肌萎缩症是由抗肌萎缩蛋白基因的突变导致，然而，与DMD不同的是，患有贝克型肌萎缩症的对象与DMD的患者相比通常会产生更高水平的功能性抗肌萎缩蛋白，后者几乎不可能产生具有功能的抗肌萎缩蛋白。其结果是，通常认为贝克型(Becker)肌萎缩症的严重程度低于DMD。

贝克型(Becker)肌萎缩症的症状包括渐进性的肌肉无力，特别是在下肢、脚趾走路、频繁跌倒、呼吸困难、骨骼畸形如脊柱侧弯、疲劳和肌酸磷酸激酶(CPK)升高。症状的严重程度和分布在个体之间的差异程度比DMD大得多。

肢带型肌萎缩症

尽管肢带型肌萎缩症与杜氏(Duchenne)和贝克型(Becker)肌萎缩症具有某些相似性，但是其在病理学方面是不同的，其主要影响臀部和肩部肌肉(即“肢带”肌肉)。尽管尚不知晓肢带型肌萎缩症的准确潜在作用机制，但是认为若干肌聚多糖包括α、β、γ和δ肌聚多糖在该疾病的发展和进展中具有重要作用。

考虑到肢带型肌萎缩症的发展过程，其可能通常不是致命性的(但是在大多数重型肢带型肌萎缩症(称为LGMD2C)中能够发生心脏和呼吸肌肉衰竭)。然而，诊断为该疾病的对象通常会在确诊20年内被局限于轮椅上。尽管肢带型肌萎缩症的一些症状与其他类型的肌萎缩症重叠，但是肢带型MD患者特别常见的症状包括：行走困难、弯腰困难和在行走或爬楼梯时跌倒。

血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂

除了其他以外，本发明提供了治疗肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或对肌萎缩症易感的对象施用血管紧张素(1-7)肽。

血管紧张素(1-7)肽

本申请中所用的术语“血管紧张素(1-7)肽”同时是指天然存在的血管紧张素(1-7)和天然存在的血管紧张素(1-7)的任意功能等价物、类似物或衍生物。本申请中使用的术语“肽”和“多肽”是可互换使用的术语，并且指由肽键键合在一起的两个或两个以上氨基酸。在本申请中使用的术语“肽”和“多肽”包括线形肽和环肽。术语“血管紧张素(1-7)”、“血管紧张素-(l-7)”、“Ang-(1-7)”和“TXA-127”可互换使用。

天然存在的血管紧张素(1-7)

天然存在的血管紧张素(1-7)(也称为Ang-(1-7))是如下所示的七个氨基酸的肽：

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:1)

其是肾素-血管紧张素系统的一部分并且是从前体(也称为血管紧张素原)转换生成的，血管紧张素原是一种主要由肝脏组成性产生并释放至循环中的α-2-球蛋白。血管紧张素原是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员并且已知血管紧张素原是肾素底物。人血管紧张素原的长度为452个氨基酸，但其他物种具有各种大小的血管紧张素原。通常，前12个氨基酸是对血管紧张素活性最重要的：

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷-Phe⁸-His⁹-Leu¹⁰-Val¹¹-Ile¹²(SEQIDNO:3)

不同类型的血管紧张素可通过各种酶的作用形成。例如，血管紧张素(1-7)可通过血管紧张素转化酶2(ACE2)的作用生成。

血管紧张素(1-7)是Mas受体的内源性配体。Mas受体是包含七个跨膜区的G蛋白偶联受体。本申请中使用的术语“血管紧张素(1-7)受体”包含G蛋白偶联的Mas受体。

本申请中使用的术语“天然存在的血管紧张素(1-7)”包含由天然来源纯化的任意血管紧张素(1-7)肽以及与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相同氨基酸序列的任意重组产生或化学合成的肽。

Ang(1-7)的功能性等价物、类似物或衍生物

在一些实施方式中，适用于本发明的血管紧张素(1-7)肽是天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物。本申请中使用的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物是指与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相同氨基酸序列，并基本保留了与天然存在的血管紧张素(1-7)相同或相似的活性的任意肽。例如，在一些实施方式中，本申请中所述的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物具有使用本申请中所述或本领域中已知的方法测定的促血管生成活性，或例如一氧化氮释放、血管舒张、内皮功能改善、抑制尿分泌的活性，或本申请中讨论的其他对血管发生可产生积极影响的性质之一。在一些实施方式中，本申请中所述的天然存在的血管紧张素(1-7)的功能等价物可连接至或活化血管紧张素(1-7)受体(如G蛋白偶联的Mas受体)，如根据使用本申请中所述或本领域公知的多种检测所测定的。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物也是指血管紧张素(1-7)的类似物或衍生物或功能衍生物。

通常，血管紧张素(1-7)的功能等价物与天然存在的血管紧张素(1-7)具有相似的氨基酸序列。在一些实施方式中，本发明所述的血管紧张素(1-7)的功能等价物包含天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的七个氨基酸中的至少3个(如至少4个、至少5个、至少6个、至少7个)氨基酸的序列，其中所述至少3个(如至少4个、至少5个、至少6个或至少7个)氨基酸保持了他们在天然存在的血管紧张素(1-7)中的相对位置和/或间距。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物也包含含有与天然存在的血管紧张素(1-7)的氨基酸序列具有至少约50％(如至少60％、70％、80％或90％)一致性序列的任意肽。可通过氨基酸序列比对可确定氨基酸序列的一致性百分比。可按照本领域的多种方式进行氨基酸序列比对，例如使用公众可获得的电脑软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员能够确定用于测定比对的适宜参数，包括获得要对比的序列全长的最大比对所需的任意算法。优选WU-BLAST-2软件用于确定氨基酸序列一致性(Altschul等，MethodsinEnzymology(酶学方法)266,460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用数个检索参数，其大部分设置为默认值。可调参数的数值设置如下：重叠跨距＝1，重叠分数＝0.125，字阈值(wordthreshold)(T)＝11。HSP值(S)和HSPS2参数为动态的数值，由程序自身根据特定序列的组成来确定，然而最小值可以被调整并按上文所述来设置。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物是天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物包含在天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物或衍生物可通过取代、添加和/或缺失来改变氨基酸序列来获得。例如，天然存在的血管紧张素(1-7)(SEQIDNO:1)的序列中的一个或多个氨基酸残基可被具有相似极性的另一个氨基酸取代，其作为功能等价物，产生沉默替换。序列内氨基酸的取代可选择此氨基酸所属类别的其他成员。例如正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。非极性(疏水性)氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。无电荷极性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。负电荷(酸性)氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。氨基酸甘氨酸可被包括在非极性氨基酸家族或无电荷(中性)极性氨基酸家族中。一个氨基酸家族内的取代一般被理解为是保守性取代。例如，肽抑制剂的氨基酸序列可被修饰或取代。

血管紧张素(1-7)的功能等价物、类似物和衍生物示例在下文标题为“示例性血管紧张素(1-7)肽”的章节中描述。

血管紧张素(1-7)肽可以为任何长度。在一些实施方式中，本发明所述的血管紧张素(1-7)肽可以含有例如5-25个氨基酸残基，如5-20、5-15或5-10个氨基酸残基。在一些实施方式中，根据本发明的Ang(1-7)肽含有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个残基。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽包含一种或多种修饰，以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。在一些实施方式中，适宜的修饰选自聚乙二醇化、乙酰化、糖基化、生物素化、使用D-氨基酸和/或非天然氨基酸取代，和/或肽环化。

本申请中使用的术语“氨基酸”最为宽泛的含义是指可合并入多肽链的任何化合物和/或物质。在某些实施方式中，氨基酸具有H₂N-C(H)(R)-COOH的通式结构。在某些实施方式中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在某些实施方式中，氨基酸是合成或非天然的氨基酸(例如，α,α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸)；在一些实施方式中，氨基酸为D-氨基酸；在某些实施方式中，氨基酸为L-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中常见的二十种标准氨基酸的任意一种，包括天然包括在肽中的L-氨基酸和D-氨基酸。“非标准”或“非常规氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，无论是否合成制备或由自然来源获得的。本申请中使用的“合成或非天然氨基酸”包含经化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代物。包括肽中的羧基末端和/或氨基末端氨基酸在内的氨基酸可进行甲基化、酰胺化、乙酰化修饰，和/或使用可改变肽的循环半衰期而对其活性没有不良影响的其他化学基团取代修饰。非常规或非天然氨基酸示例包括但不限于瓜氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、4-(E)-丁烯基-4(R)-甲基-N-甲基苏氨酸(MeBmt)、N-甲基-亮氨酸(MeLeu)、氨基异丁酸、抑胃酶氨酸和N-甲基-丙氨酸(MeAla)。氨基酸可参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，可指游离氨基酸和/或肽上的氨基酸残基。从上下文使用该术语时可知该术语是指代游离氨基酸还是肽的残基。

在某些实施方式中，血管紧张素(1-7)多肽包含一个或多个L氨基酸、D-氨基酸和/或非天然氨基酸。

除了包含仅含有天然存在的氨基酸的肽以外，本发明还包含模拟肽或肽类似物。制药业常使用肽类似物作为与模板肽具有类似性质的非肽药物。这种非肽化合物被称为“肽模拟物”或模拟肽(Fauchere等，Infect.Immun.54:283-287(1986)；Evans等，J.Med.Chem.30:1229-1239(1987))。与具有疗效的肽结构上有关的肽模拟物可用作生产等价物，或者用于增强治疗或预防效果。一般而言，模拟肽与标准多肽(paradigmpolypeptide)(即，具有生物或药理学活性的多肽)结构相似，例如天然存在的受体结合多肽，但其中一个或多个肽连接被例如-CH₂NH-、-CH₂S-、-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-(顺式和反式)、-CH₂SO-、-CH(OH)CH₂-、-COCH₂-等连接选择性地取代，取代的方法是本领域公知的(Spatola,PeptideBackboneModifications(肽骨架修饰),VegaData,1(3):267(1983)；Spatola等，LifeSci.38:1243-1249(1986)；Hudson等，Int.J.Pept.Res.14:177-185(1979)；和Weinstein.B.,1983,ChemistryandBiochemistry,ofAminoAcids,PeptidesandProteins(氨基酸、肽和蛋白的化学和生物化学),Weinstein编,MarcelDekker,New-York)。这种肽模拟物与天然存在的多肽相比可以具有显著的优势，包括生产成本下降、化学稳定性提高、药理性质(如半衰期、吸收、效能、有效性等)增强，抗原性降低等。

血管紧张素(1-7)肽也包含其他类型的肽衍生物，所述衍生物包含不是肽的正常组成部分的其他化学部分，但前提是所述衍生物保持了所需的肽功能活性。此类衍生物的示例包括(1)氨基末端或另一个游离氨基的N酰基衍生物，其中所述酰基可以是链烷酰基(如，乙酰基、己酰基、辛酰基)、芳酰基(如苯甲酰基)或保护基团如F-moc(芴甲氧羰基-O-CO-)；(2)羧基末端或另一个游离羧基或羟基的酯；(3)羧基末端或另一个游离羧基的酰胺，所述酰胺由与氨或适当的胺反应而生成；(4)磷酸化的衍生物；(5)与抗体或其他生物配体偶联的衍生物及其他类型的衍生物；以及(6)与聚乙二醇(PEG)链偶联的衍生物。

Ang-(1-7)肽可通过本领域技术人员公知的任意肽合成方法来获得，包括合成(例如全部固相合成、部分固相合成、碎片缩合、经典溶液合成、自然化学连接)以及重组技术。例如，肽和肽的衍生物可以通过固相肽合成法来获得，简而言之，此法由将C末端氨基酸的羧基偶联至树脂(如二苯甲基胺树脂、氯甲基化树脂、羟甲基树脂)和连续添加N-α保护的氨基酸来组成。保护基团可以为本领域公知的任意这种基团。在向不断增长的链中增加各新的氨基酸之前，去除此前向链中添加的氨基酸的保护基团。此种固相合成已被公开，例如，Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85:2149(1964)；Vale等，Science213:1394-1397(1981)，美国专利号4,305,872和4,316,891，Bodonsky等Chem.Ind.(London),38:1597(1966)；以及Pietta和Marshall，Chem.Comm.650(1970)，由Lubell等，在“Peptides”ScienceofSynthesis(“肽”合成的科学)中的技术综述21.11,ChemistryofAmides(酰胺化学).Thieme,Stuttgart,713-809(2005)。向适当的树脂上偶联氨基酸也是本领域公知的方法，并已经在美国专利号4,244,946(在Houver-Weyl,MethodsofOrganicChemistry(有机化学方法)，卷E22a.SynthesisofPeptidesandPeptidomimetics(肽和模拟肽的合成),MurrayGoodman主编,Thieme,Stuttgart.NewYork2002中进行了综述)中公开。

除另有定义以外，本文中使用的科学和技术术语以及命名法与本领域普通技术人员通常理解的与本发明相关的意义相同。总体而言，细胞培养、感染、分子生物学方法等过程是本领域中的常用方法。这种标准技术可在参考手册如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology(现代分子生物学指南)，WileyInterscience,NewYork,2001；以及Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(纽约冷泉港实验室出版社),N.Y.,2001中找到。

在制备Ang-(1-7)肽的任何过程中，可能需要保护任何相关分子的敏感性反应基团。可通过常规的保护基团来达到此种目的，所述保护基团例如在下列文献中所述的保护基团：T.W.Greene&P.G.M.Wuts的ProtectiveGroupsInOrganicSynthesis(有机合成中的保护基团),1991,JohnWileyandSons,New-York；以及Sewald和Jakubke的Peptides:chemistryandBiology(肽：化学和生物学),2002,Wiley-VCH,Wheinheim第142页。例如，α氨基保护性基团包括酰基型保护性基团(如三氟乙酰基、甲酰基、乙酰基)、脂肪族氨基甲酸乙酯保护性基团(如叔丁氧羟基(BOC)、环己氧代羰基)、芳香族氨基甲酸乙酯型保护性基团(例如芴基-9-甲氧基-羰基(Fmoc)、苄氧羰基(Cbz)、Cbz衍生物)和烷基型保护性基团(如三苯基、甲基、苄基)。氨基酸侧链保护性基团包括苄基(对Thr和Ser)，Cbz(Tyr、Thr、Ser、Arg、Lys)、甲基乙基、环己基(Asp、His)、BOC(Arg、His、Cys)等。所述保护基团可使用本领域公知方法在方便的后续阶段中去除。

此外，Ang-(1-7)肽可按照FMOC方案在有机相中使用保护性基团合成。理想的是，所述肽使用高效液相色谱(HPLC)在C18色谱柱中纯化，并使用10％～60％的乙腈梯度洗脱，得到70％的的产率。肽的分子量可通过质谱法进行确证(在Fields的“Solid-PhasePeptideSynthesis”(固相肽合成)MethodsinEnzymology(酶学方法).卷289,学术出版社(AcademicPress),1997中进行了综述)。

或者，Ang-(1-7)肽可在重组系统中使用例如编码多肽的多核苷酸序列来制备。应理解，多肽可以包含在同一多肽中一种以上的上述修饰。

虽然肽在体外可有效地引起生物学活性，但所述肽的体内有效性可能因蛋白酶的存在而下降。血清蛋白酶具有特异性的底物要求。底物必须同时具有L氨基酸和以供断裂的肽键。此外，肽链端解酶代表了在血清中蛋白酶活性的最主要成分，肽链端解酶通常对肽的第一个肽键产生作用，并且需要游离的N末端(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。鉴于此，使用经修饰的肽通常更有优势。经修饰的肽保留了原始L氨基酸肽赋予血管紧张素(1-7)所需生物活性的结构特性，但具有不易被蛋白酶和/或肽链端解酶断裂的优势。

可使用相同类型的D氨基酸系统性取代共有序列中的一个或多个氨基酸(如D-赖氨酸取代L-赖氨酸)以生成更为稳定的肽。因此，本发明中的肽衍生物或模拟肽可全部为L、全部为D或由D和L混合的、具有正向序列或反向序列的肽。N末端或C末端D氨基酸的存在能够增加肽的体内稳定性，因为肽酶不能使用D氨基酸作为底物(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。反向D肽是指包含D氨基酸的肽，所述肽以与包含L-氨基酸的肽的相反的序列来排列。因此L-氨基酸肽的C末端残基变为D氨基酸肽的N末端，以此类推。反向D肽保留了与L氨基酸肽相同的二级构象，以及因此具有的相似活性，但在体外和体内对酶降解的抗性更高，因此比原始肽具有更强的疗效(Brady和Dodson,Nature368:692-693(1994)；Jameson等，Nature368:744-746(1994))。类似地，可使用标准方法来生成反向L肽，其中母体肽的C末端取代反向L肽的N末端。可以预见的是，不具有显著二级结构(如短肽)的L氨基酸肽的反向L肽保留了与L氨基酸肽相同的间距和侧链构象，因此常与原始的L氨基酸肽具有相似的活性。此外，反向肽可包含L氨基酸和D氨基酸的结合。氨基酸间的间距以及侧链的构象可以得到保留，从而产生与原始的L氨基酸肽相似的活性。

另一种通过作用于肽的N末端或C末端残基产生肽酶抗性的有效方法是在肽末端增加化学基团，以使得经修饰的肽不再是肽酶的底物。一种此类化学修饰是在肽的一个或两个末端进行糖基化。某些化学修饰，特别是N-末端糖基化，已显示出增加了人血清中肽的稳定性(Powell等，Pharm.Res.10:1268-1273(1993))。其他增强血清稳定性的化学修饰包括但不限于，增加N-末端烷基，所述烷基由从一到二十个碳的低级烷基组成，例如乙酰基，和/或增加C末端酰胺或经取代的酰胺基。特别地，本发明包括经修饰的肽，所述肽由带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺基的肽组成。

在肽的子序列中使用非天然存在的氨基酸取代天然氨基酸也可使肽产生蛋白水解抗性。此种取代如通过肽链端解酶作用于N末端而不影响生物活性使肽产生蛋白水解抗性。非天然存在的氨基酸的例子包括α,α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、C-α-甲基氨基酸、β-氨基酸和β-甲基氨基酸。在本发明中有用的氨基酸类似物可包括但不限于β-丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、4-氨基丁酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、环己基丙氨酸、2-氨基异丁酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、苯基甘氨酸、o-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸和其他非常规氨基酸。此外，使用非天然存在的氨基酸合成肽是本领域的常规技术。

此外，可使用本领域公知的方法产生受限肽(constrainedpeptide)，其包含共有序列或基本相同的共有序列变体(Rizo和Gierasch,Ann.Rev.Biochem.61:387-418(1992))。例如，可通过增加能够形成二硫桥的半胱氨酸残基而生成环肽来产生受限肽。可将环肽构建成没有游离N或C末端。因此尽管这种肽易于被不能在肽链末端断裂的内肽酶水解，但是不易于被肽链端解酶水解。具有N末端或C末端D氨基酸的肽的氨基酸序列以及环肽的氨基酸序列通常与其相应肽的序列相同，除了存在N末端或C末端的D氨基酸残基或其各自的环状结构以外。

环肽

在一些实施方式中，天然存在的Ang(1-7)的功能性等价物、类似物或衍生物是环肽。本申请中使用的环肽具有两个非相邻残基间的分子内共价键。此分子内的键可以为主链与主链、侧链与主链或侧链与侧链间的键(即线形肽的末端官能团和/或末端或内侧残基的侧链官能团可以连接形成环化)。典型的分子内键包括二硫键、酰胺键和硫醚键。各种环化多肽的方法以及可以对这种肽进行的多种其他修饰是本领域公知的。对于一般性的讨论，参见国际专利公开号WO01/53331和WO98/02452，其内容均通过引用并入本申请。此类环化键合和其他修饰也可用于本发明的环肽和衍生化合物。

本文中所述的环肽包含L氨基酸残基、D氨基酸残基或其任意组合。氨基酸可来自天然或非天然来源，只要分子中存在至少一个氨基和至少一个羧基；一般优选α和β氨基酸。环肽也可以含有一种或多种稀有氨基酸(例如4-羟基脯氨酸或羟基赖氨酸)、有机酸或酰胺和/或常见氨基酸的衍生物，例如具有C-末端羧酸酯化(如苄基、甲基或乙基酯)或酰胺化和/或具有N末端氨基修饰(如乙酰化或烷氧基羰基化)的氨基酸，带有或不带有任何多种侧链修饰和/或取代(如甲基化、苄基化、叔丁基化、甲苯磺酰化、烷氧基羰基化等)。适当的衍生物包括具有N-乙酰基(例如代表被环化前的线形肽的N末端氨基被乙酰化)和/或C末端酰胺基(即被环化前的线形肽的羧基末端被酰胺化)的氨基酸。环肽中可存在的普通氨基酸以外的残基包括但不限于青霉胺、β,β-四亚甲基半胱氨酸、β,β-五亚甲基半胱氨酸、β-巯基丙酸、β,β-五亚甲基-β-巯基丙酸、2-苯硫酚、2-巯基苯胺、2-巯基脯氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、α-氨基己二酸、m-氨基甲基苯甲酸以及α,β-二氨基丙酸。

在合成带有或不带有N-乙酰化和/或C-酰胺化的线形肽后，可采用本领域技术人员熟知的任意多种技术来进行环化。在一个实施方式中，在具有反应活性的氨基酸侧链间产生键合。例如，可通过任意多种方法使肽氧化使得包含两个含有巯基残基的线形肽形成二硫桥。在一种这种方法中，可使用碱性或中性的水性介质，在数天时间内，通过巯基的空气氧化产生二硫键。对所用的肽进行高度稀释使得聚凝集和分子间副反应最小化。或者，可使用强氧化剂如I₂和K₃Fe(CN)₆来形成二硫键。本领域的普通技术人员将理解必须谨慎操作以防止将Met、Tyr、Trp或His的敏感侧链氧化。在其他实施方式中，可通过形成酰胺键完成环化。例如，可在末端官能团(即环化前的线形肽的氨基末端和羧基末端)间形成肽键。在另一个此类的实施方式中，线形肽含有D-氨基酸。或者，可以通过连接一个末端和一个残基侧链或使用两个侧链来实现环化，可带有或不带有N末端乙酰基和/或C末端酰胺。能够形成内酰胺键的残基包括赖氨酸、鸟氨酸(Orn)、α-氨基己二酸、m-氨基甲基苯甲酸、α,β-二氨基丙酸、谷氨酸或天冬氨酸。形成酰胺键的方法通常为本领域熟知。在一个这种方法中，碳二亚胺介导的内酰胺形成可以通过羧酸与DCC、DIC、EDAC或DCCI的反应来完成，以形成O-酰基脲，其能够立即与游离氨基反应来完成环化。或者，可使用叠氮化物的方法完成环化，其中具有反应活性的叠氮化物中间体可由烷基酯通过酰肼产生。或者，可以使用经活化的酯类来完成环化。酯类的烷氧基碳上存在吸电子取代基使其更易于氨解。p-硝基酚、N-羟基化合物以及多卤化苯酚的酯的高反应性使得这些“活性酯”可用于合成酰胺键。在其他实施方式中，在含巯基残基的侧链和适当衍生化的α-氨基酸之间可形成硫醚键。举例如下，赖氨酸侧链可通过碳二亚胺偶联的方法(DCC、EDAC)被偶联至溴乙酸，然后与上文所述任意含巯基的残基的侧链反应来形成硫醚键。为了形成二硫醚，任意两种含巯基侧链可与二溴乙烷和二异丙胺在DMF中反应。

示例性的血管紧张素-(1-7)肽

线形血管紧张素(1-7)肽

在某些方面，本发明提供了线形血管紧张素(1-7)肽。如上文所述，天然存在的血管紧张素(1-7)的结构如下：

Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:1)

通常可以使用下述序列表示本发明的肽和肽的类似物：

Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Xaa⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Xaa⁷(SEQIDNO:4)，或其药学上可接受的盐。

Xaa¹是任意氨基酸或二羧酸。在某些实施方式中，Xaa¹是Asp、Glu、Asn和Acpc(1-氨基环戊烷羧酸)、Ala、Me₂Gly(N,N-二甲基甘氨酸)、Pro、Bet(甜菜碱，氢氧化1-羧基-N,N,N-三甲基甲铵)、Glu、Gly、Asp、Sar(肌氨酸)或Suc(琥珀酸)。在某些此种实施方式中，Xaa¹是带负电荷的氨基酸，例如Asp或Glu，通常为Asp。

Xaa²是Arg、Lys、Ala、Cit(瓜氨酸)、Orn(鸟氨酸)、乙酰化Ser、Sar、D-Arg和D-Lys。在某些实施方式中，Xaa²是带正电荷的氨基酸例如Arg或Lys，通常为Arg。

Xaa³是Val、Ala、Leu、Nle(正亮氨酸)、Ile、Gly、Lys、Pro、羟Pro(羟脯氨酸)、Aib(2-氨基异丁酸)、Acpc或Tyr。在某些实施方式中，Xaa³是脂肪族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常为Val或Nle。

Xaa⁴是Tyr、Tyr(PO₃)、Thr、Ser、同型Ser(同型丝氨酸)、氮杂Tyr(氮杂-α¹-同型-L-酪氨酸)或Ala。在某些实施方式中，Xaa⁴是羟基取代的氨基酸例如Tyr、Ser或Thr，通常为Tyr。

Xaa⁵是Ile、Ala、Leu、norLeu、Val或Gly。在某些实施方式中，Xaa⁵是脂肪族氨基酸如Val、Leu、Ile或Nle，通常为Ile。

Xaa⁶是His、Arg或6-NH₂-Phe(6-氨基苯丙氨酸)。在某些实施方式中，Xaa⁶是全部或部分带正电荷的氨基酸如Arg或His。

Xaa⁷是Cys、Pro或Ala。

在某些实施方式中，Xaa¹-Xaa⁷中的一个或多个与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，Xaa¹-Xaa⁷中除了一个或两个以外所有均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa⁶中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。

在某些实施方式中，Xaa³是Nle。当Xaa³是Nle时，Xaa¹-Xaa²和Xaa^4-7中的一个或多个任选地与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，Xaa¹-Xaa²和Xaa^4-7中除了一个或两个以外所有均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa²和Xaa^4-7中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同，从而产生氨基酸序列：Asp¹-Arg²-Nle³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:5)。

在某些实施方式中，肽具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQIDNO:2)或Asp¹-Arg²-Val³-ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQIDNO:6)。

示例性的环状血管紧张素(1-7)肽

在某些方面，本发明提供了包含连接的环状血管紧张素(1-7)(Ang-(1-7))肽类似物，所述连接例如在Ang的Tyr⁴和Pro⁷位置的相应氨基酸侧链之间的连接。这些肽的类似物一般包含7个氨基酸残基，但也可包含可裂解序列。如下文的更加详细的描述，本发明包括片段和类似物，其中一个或多个氨基酸被另一个氨基酸(包含片段)取代，例如Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQIDNO:22)，其中Ser⁴与Cys⁷之间形成连接。

虽然下面的章节描述了本发明在位置4和位置7间的硫醚键连接残基的方面，应理解其他连接(如上文所述)可以替代硫醚桥且其他残基可以被环化。硫醚桥也可称为单硫桥，或者在Ala-S-Ala中，称为羊毛硫氨酸桥。包含硫醚桥的肽可由具有下式之一的两个氨基酸形成：

在这些式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地为-H、烷基(如C₁-C₆烷基、C₁-C₄烷基)或芳烷基，其中所述烷基和芳烷基任选地被一个或多个卤素、-OH或–NRR’基团取代(其中R和R’独立地为–H或C₁-C₄烷基)。在某些实施方式中，R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶分别独立地为-H或-CH₃，例如全部为–H。

在某些实施方式中，本发明提供了包含如式(I)所示的硫醚桥的血管紧张素类似物或衍生物。通常，R¹、R²、R³和R⁴独立地选自-H和-CH₃。通过例如羊毛硫抗生素(lantibiotic)酶或通过从二硫化物中挤出硫，可以生产包含如式(I)所示的硫醚桥的肽。在一个实施例中，挤出硫的二硫化物可通过位置4的D半胱氨酸和位置7的L半胱氨酸或通过位置4的D半胱氨酸和位置7的L青霉胺形成(参见如Galande,Trent和Spatola(2003)Biopolymers71,534-551)。

在其他实施方式中，两个氨基酸间的连接可以为式(II)或式(III)中所示的桥。包含如式(II)所示的硫醚桥的肽可以例如通过在位置4的D-同型半胱氨酸和在位置7的L-半胱氨酸形成的二硫化物的硫挤出来制备。类似的，包含如式(III)所示的硫醚桥的肽可以例如位置4的D-半胱氨酸和位置7的L-同型半胱氨酸形成的二硫化物的硫挤出来制备。

如上文所述，本发明的血管紧张素类似物和衍生物的长度和氨基酸组成可以改变。本发明的血管紧张素类似物和衍生物优选具有生物活性或者是可通过蛋白水解活化(例如通过裂解2个氨基酸将具有10个氨基酸的血管紧张素(I)转化为活性片段)的无活性的前体分子。血管紧张素类似物或衍生物的大小可以改变，但一般是约5至10个氨基酸，只要所述包含3-7Nle-硫醚-环结构的“核心”五聚体片段包含在内即可。本发明的类似物或衍生物的氨基酸序列可以改变，通常只要其具有生物活性或可通过蛋白水解来活化即可。可使用本领域公知的方法来确定类似物或衍生物的生物活性，所述方法包括放射配体结合研究、体外细胞激活检测和体内实验。例如可参见Godeny和Sayeski,(2006)Am.J.Physiol.Cell.Physiol.291:C1297-1307；Sarr等，Cardiovasc.Res.(2006)71:794-802；以及Koziarz等，(1933)Gen.Pharmacol.24:705-713。

仅肽的长度可变的血管紧张素类似物和衍生物包括下列：

命名为[Cyc^4-7]Ang-(1-7)的4,7-环化类似物，来源于天然Ang-(1-7)(Asp¹-Arg²-Val³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷,SEQIDNO:7)。

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang-(1-10)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素I(Ang-(1-10))(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸-His⁹-Leu¹⁰,SEQIDNO:8)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang-(1-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素II(Ang-(1-8))(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸,SEQIDNO:9)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang-(2-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素III(Ang-(2-8))(Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸,SEQIDNO:10)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang-(3-8)的4,7-环化类似物，来源于天然血管紧张素IV(Ang-(3-8))(Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸,SEQIDNO:11)；

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang-(1-7)的4,7-环化类似物，来源于天然Ang-(1-7)(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷,SEQIDNO:12)；以及

命名为[Nle³,Cyc^4-7]Ang-(1-9)的4,7-环化类似物，来源于天然Ang-(1-9)(Asp¹-Arg²-Nle³-Cyc⁴-Ile⁵-His⁶-Cyc⁷-Phe⁸-His⁹,SEQIDNO:13)。

这些类似物可具有式(I)-(III)中所示硫醚桥之一作为Cyc^4-7部分，例如，其中Cyc⁴和Cyc⁷可由式(I)表示，例如其中R¹-R⁴各为–H或–CH₃，通常为-H。

与天然血管紧张素肽的氨基酸序列相比，Cyc^4-7类似物的位置4和位置7处的氨基酸经过修饰以允许引入上文所述的硫醚-环结构。除了血管紧张素类似物的长度以外，位置3、位置4和位置7以外的其他位置的氨基酸可以与天然存在的肽相同或不同，通常前提是只要类似物保留生物功能即可。一个示例是Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQIDNO:22)。对于无活性前体类似物，如[Cyc^4-7]Ang-(l-10)，生物功能是指类似物对可将其裂解成为生物活性片段(如Ang-(1-8)或Ang-(1-7))的血管紧张素转化酶具有敏感性或指片段自身的生物活性这两种情况之一或全部。在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物或衍生物不具有内在功能但抑制一种或多种天然存在的血管紧张素化合物的效果。

在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物可由式(IV)表示：

Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Cyc⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Cyc⁷(IV,SEQIDNO:14)

Xaa¹是任意氨基酸，但通常为带负电荷的氨基酸例如Glu或Asp，更通常为Asp。

Xaa²是带正电荷的氨基酸，例如Arg或Lys，通常为Arg。

Xaa³是脂肪族氨基酸，例如Leu、Ile或Val，通常为Val。

Cyc⁴与Cyc⁷结合形成硫醚桥。Cyc⁴可以为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为D-立体异构体。Cyc⁴(与Cyc⁷一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基团为–H或–CH₃，特别是–H。

Xaa⁵是脂肪族氨基酸，例如Leu、Ile或Val，通常为Ile。

Xaa⁶是His。

Cyc⁷与Cyc⁴结合形成硫醚桥，如式(I)、(II)或(III)中所示。Cyc⁷可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc⁷的示例(与Cyc⁴一起)如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基为–H或–CH₃，特别是–H。

在某些实施方式中，一个或多个Xaa¹-Xaa⁶(Cyc⁴和Cyc⁷除外)与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，Xaa¹-Xaa⁶中除了一个或两个以外所有均与天然存在的血管紧张素(1-7)的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa⁶中的全部均与天然存在的血管紧张素(1-7)中的相应氨基酸相同。

在某些实施方式中，Cyc⁴和Cyc⁷独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala在至少一个位置上存在。因此，环状类似物可具有由-Ala⁴-S-Ala⁷-(式(I)，其中R¹-R⁴各为-H)；-Ala⁴-S-Abu⁷-(式(I)：R¹-R³为-H且R⁴为-CH₃)或-Abu⁴-S-Ala⁷-(式(I)：R¹、R³和R⁴为–H且R²为–CH₃)形成的硫醚连接。特定的环状类似物示例包括-Abu⁴-S-Ala⁷-或-Ala⁴-S-Ala⁷-连接。

在某些实施方式中，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Abu⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQIDNO:15)或氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ala⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQIDNO:16)的血管紧张素(1-7)类似物，所述类似物由下面的结构图表示：

在某些实施方式中，本发明的血管紧张素类似物或衍生物可由式(V)表示：

Xaa¹-Xaa²-Nle³-Cyc⁴-Xaa⁵-Xaa⁶-Cyc⁷-Xaa⁸-Xaa⁹-Xaa¹⁰(V,SEQIDNO:17)

如上文所述，Xaa¹、Xaa²、Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰中的一个或多个在某些实施方式中缺失。例如，(1)Xaa¹⁰缺失，(2)Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(3)Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(4)Xaa¹缺失，(5)Xaa¹和Xaa¹⁰缺失，(6)Xaa¹、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(7)Xaa¹、Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失，(8)Xaa¹和Xaa²缺失，(9)Xaa¹、Xaa²和Xaa¹⁰缺失，(10)Xaa¹、Xaa²、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失或(11)Xaa¹、Xaa²、Xaa⁸、Xaa⁹和Xaa¹⁰缺失。对于这些实施方式中的每一个，剩余的氨基酸具有下列所述的值。

Xaa¹，当存在时可为任意氨基酸，但通常为带负电荷的氨基酸如Glu或Asp，更通常为Asp。

Xaa²，当存在时为带正电荷的氨基酸如Arg或Lys，通常为Arg。

Nle³为正亮氨酸。

Xaa⁵为脂肪族氨基酸如Leu、Nle、Ile或Val，通常为Ile。

Xaa⁶为His。

Cyc⁷与Cyc⁴结合形成硫醚桥，如式(I)、(II)或(III)中所示。Cyc⁷可为D-立体异构体和/或L-立体异构体，通常为L-立体异构体。Cyc⁷(与Cyc⁴一起)的示例如式(I)、(II)和(III)所示。通常，式(I)、(II)和(III)中的R基为–H或–CH₃，特别是–H。

Xaa⁸存在时为除Pro以外的氨基酸，通常为Phe或Ile。在某些实施方式中，Ile产生血管紧张素(1-8)抑制剂。在某些实施方式中，Phe保持了血管紧张素(1-8)或血管紧张素(1-10)的生物活性。

Xaa⁹存在时为His。

Xaa¹⁰存在时为脂肪族残基，例如Ile、Val或Leu，通常为Leu。

在某些实施方式中，Xaa¹-Xaa¹⁰的一个或多个(Nle³、Cyc⁴和Cyc⁷除外)与天然存在的血管紧张素(包含血管紧张素(1-7)、血管紧张素(1-8)、血管紧张素(1-9)、血管紧张素(1-10)、血管紧张素(2-7)、血管紧张素(2-8)、血管紧张素(2-9)、血管紧张素(2-10)、血管紧张素(3-8)、血管紧张素(3-9)和血管紧张素(3-10))中相应氨基酸相同。在某些此类实施方式中，Xaa¹-Xaa¹⁰(对于存在的那些而言)中除了一个或两个以外的全部均与天然存在的血管紧张素的相应氨基酸相同。在其他实施方式中，Xaa¹-Xaa¹⁰(对于存在的那些而言)中的全部均与天然存在的血管紧张素中的相应氨基酸相同。

在某些实施方式中，Cyc⁴和Cyc⁷独立地选自Abu(2-氨基丁酸)和Ala(丙氨酸)，其中Ala在至少一个位置上存在。因此，所包括的为含有由-Ala⁴-S-Ala⁷-(式(I)，其中R¹-R⁴各为-H)；-Ala⁴-S-Abu⁷-(式(I)：R¹-R³为-H且R⁴为-CH₃)或-Abu⁴-S-Ala⁷-(式(I)：R¹、R³和R⁴为–H且R²为–CH₃)形成的硫醚桥的环状类似物。特定的环状类似物包括-Abu⁴-S-Ala⁷-或-Ala⁴-S-Ala⁷-连接。

特别地，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Abu⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQIDNO:18)或氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Ala⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷(SEQIDNO:19)的血管紧张素(1-7)类似物或衍生物。

在另一方面，本发明提供了在位置4和位置7之间具有硫醚桥且具有血管紧张素(1-8)拮抗活性的血管紧张素(1-8)类似物或衍生物，特别是具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Abu⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷-Ile⁸(SEQIDNO:20)或氨基酸序列Asp¹-Arg²-Nle³-Ala⁴-Ile⁵-His⁶-Ala⁷-Ile⁸(SEQIDNO:21)的血管紧张素(1-8)类似物或衍生物。

Ang(1-7)受体激动剂

在一些实施方式中，本发明提供了治疗肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或对肌萎缩症易感的对象施用血管紧张素(1-7)受体激动剂。本文所述的术语“血管紧张素(1-7)受体激动剂”包含对血管紧张素(1-7)受体(特别是G蛋白偶联的Mas受体)功能具有正向影响的任何分子。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂直接或间接增强、加强、激活和/或增加血管紧张素(1-7)受体(即Mas受体)活性。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂与血管紧张素(1-7)受体(即Mas受体)直接相互作用。此类激动剂可为肽或非肽，包括如蛋白、化合物、小分子、核酸、抗体、药物、配体或其他试剂。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是非肽激动剂。

示例性的血管紧张素(1-7)受体激动剂的类别为1-(p-噻吩基苄基)咪唑。这些非肽血管紧张素(1-7)受体激动剂的示例如式(VI)所表示：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹是卤素；羟基；(C₁-C₄)-烷氧基；(C₁-C₈)-烷氧基(其中1至6个碳原子被杂原子O、S或NH(优选O)取代)；被饱和的环状醚如四氢吡喃或四氢呋喃取代的(C₁-C₄)-烷氧基；O-(C₁-C₄)-烯基；O-(C₁-C₄)-烷基芳香基；或未被取代的或被选自卤素、(C₁-C₃)-烷基、(C₁-C₃)-烷氧基和三氟甲基的取代基取代的芳氧基；

R²是CHO、COOH或(3)CO-O-(C₁-C₄)-烷基；

R³是(C₁-C₄)-烷基或芳基；

R⁴是氢、卤素(氯、溴、氟)或(C₁-C₄)-烷基；

X是氧或硫；

Y是氧或-NH-；

R⁵是氢、(C₁-C₆)-烷基；或(C₁-C₄)-烷基芳基，其中当Y是-NH-时R⁵是氢；以及

R⁶是(C₁-C₅)-烷基。

在某些实施方式中，当R²是COOH或CO-O-(C₁-C₄)-烷基时R¹不是卤素。

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)受体激动剂为AVE0991，5-甲酰基-4-甲氧基-2-苯基-1[[4-[2-(乙基氨基羰基磺酰氨基-5-异丁基-3-噻吩基]-苯基]-甲基]-咪唑，其可由下面的结构表示：

另一个示例性的血管紧张素(1-7)受体激动剂的类别为p-噻吩苄基酰胺。这些非肽血管紧张素(1-7)受体激动剂的示例如下面的结构式(VII)所示：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹是未被取代的或由选自NH₂、卤素、O-(C₁-C₃)-烷基、CO-O-(C₁-C₃)-烷基和CO₂H的基团取代的(C₁-C₅)-烷基；(C₃-C₈)-环烷基；(C₁-C₃)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基；未被取代的或由选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₆-C₁₀)-芳基；(C₁-C₃)-烷基-(C₆-C₁₀)-芳基，其中所述芳基是未被取代的或被选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代；(C₁-C₅)-杂芳基；或(C₁-C₃)-烷基-(C₁-C₅)-杂芳基；

R²是氢；未被取代的或被选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₁-C₆)-烷基；(C₃-C₈)-环烷基；(C₁-C₃)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基；未被取代的或被由选自卤素、O-(C₁-C₃)-烷基和CO-O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₆-C₁₀)-烷基；或者未被取代的或由选自卤素和O-(C₁-C₃)-烷基的基团取代的(C₁-C₃)-烷基-(C₆-C₁₀)-芳基；

R³是氢、COOH或COO-(C₁-C₄)-烷基；

R⁴是氢、卤素；或(C₁-C₄)-烷基；

R⁵是氢或(C₁-C₆)-烷基；

R⁶是氢、(C₁-C₆)-烷基、(C₁-C₃)-烷基-(C₃-C₈)-环烷基或(C₂-C₆)-烯基；以及

X是氧或NH。

血管紧张素-(1-7)受体激动剂的其他示例如美国专利号6,235,766中所述，其内容通过引用并入本申请。

上文中所述的各种血管紧张素(1-7)受体激动剂可以以药学上可接受盐的形式存在。本申请中使用的术语“药学上可接受的盐”是指保留了肽或等同物化合物所需活性但优选对肽或使用此肽的体系的其他成分的活性不产生不良影响的盐类。此种盐类的示例为与无机酸形成的酸加成盐，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等。盐也可与有机酸形成，所述有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、海藻酸、聚谷氨酸等。使用阳离子材料形成的盐可使用这些无机酸和有机酸的共轭碱。还可使用例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍等多价金属阳离子或通过N,N’-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子，或其组合(例如鞣酸锌盐)形成盐。优选无毒的、在生理学上可接受的盐。

可以通过常规方法形成所述的盐，如通过将产物的游离酸或游离碱形式与适宜的酸或碱的一种或多种等价物在所述盐不可溶于其中的溶剂或介质中反应，或在溶剂如水中反应然后将其抽真空或通过冷冻干燥除去，或者通过将现有的盐的阳离子在适宜的离子交换树脂上与另一种阳离子交换。

烷基是直链或支链的完全饱和的非芳香族烃。通常，直链或支链烷基具有1个至约20个碳原子，优选1个至约10个。直链或支链烷基的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。C1-C4直链或支链烷基也称为“低级烷基”。

烯基是包含一个或多个双键的直链或支链非芳香烃。通常，直链或支链烯基具有2至约20个碳原子，优选2至约10个。直链和支链烯基的示例包括乙烯基、正丙烯基、正丁烯基。

芳香(芳)基包括碳环芳香基如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基也包括稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。

芳烷基是被芳基取代的烷基。芳香(芳)基包括碳环芳香基例如苯、萘和蒽，以及杂芳基例如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑基、噁唑基和四唑基。芳香基团也包括稠合多环芳香环系，其中碳环芳香环或杂芳环被稠合至一个或多个其他杂芳环上。示例包括苯并噻吩基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。

药物组合物

根据本发明的方法，如本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂可以单独向对象施用(例如以纯的肽或化合物的形式)，或者如本申请所述作为组合物或药物中的成分(例如在生产用于治疗该疾病的药物中)向对象施用。所述组合物可以使用生理学上可接受的运载体或赋形剂制剂以制备药物组合物。所述运载体和组合物可以是无菌的。所述制剂应适于给药方式。将组合物制剂的方法是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceuticalsSciences(雷明顿制药科学)，第17版，MackPublishingCo.,(AlfonsoR.Gennaro编著)(1989))。

适宜的药学上可接受的运载体包括但不限于水、盐溶液(例如NaCl)、生理盐水、缓冲盐、醇类、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苄醇、聚乙二醇、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、糖类如甘露醇、蔗糖或其他、右旋糖、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，及其组合。所述药物配制品如有需要可以与助剂(例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等)混合，其不与活性化合物发生有害的反应或干扰其活性。在优选的实施方式中，使用适于静脉内施用的水溶性运载体。

所述组合物或药物如有需要还可以含有较少量的润湿或乳化剂，或pH缓冲剂，在下文中将对其中的一些进行进一步的讨论。所述组合物可以是液态溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉剂。还可以将所述组合物与常规的粘合剂和运载体如甘油三酯制成栓剂。口服制剂可以包括标准的运载体如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可以根据常规程序将所述组合物或药物制剂成适于向人施用的药物组合物。例如，在优选的实施方式中，静脉内施用的组合物通常是无菌等渗水性缓冲溶液。必要时，所述组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂以缓解注射部位疼痛。在通常情况下，成分在单位剂型中单独地或混合在一起提供，例如作为在密封容器中的冻干粉末或无水浓缩物，如标明活性剂的量的安瓿或小袋中。当拟通过输注施用所述组合物时，可以将其配制在含有无菌药用级水、生理盐水或者右旋糖/水的输注瓶中。当通过注射施用所述组合物时，可以使用无菌注射用水或生理盐水的安瓿，这样可以在施用前将所述成分混合。

在一些实施方式中，提供了组合物，包括以药物制剂提供的那些，所述组合物包含液体运载体例如但不限于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、林格氏溶液、右旋糖溶液、含有血清的溶液、Hank’s溶液、其他水溶性生理平衡溶液、油、酯类和二醇类。

本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂可以以中性或盐形式制剂。药学上可接受的盐包括与游离的氨基基团形成的那些，如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和与游离的羧基基团形成的那些，如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

口服制剂

在一些实施方式中，适宜的药物组合物是口服制剂。可以预期，在本发明的范围内可以使用任意医学上可接受的口服制剂。

在一些实施方式中，提供了包括至少一种pH降低剂的组合物。可以预期，适用于本发明一些实施方式的pH降低剂包括任意药学上可接受的pH降低剂或多种pH降低剂的组合，其a)对胃肠道无毒性，b)能够递送氢离子或者能够从局部环境诱导较高的氢离子含量和/或c)能够口服施用，用量足以将局部肠道pH值降低至在此处发现的蛋白酶的最适pH以下。可以使用不同检测以确定pH降低剂是否适于本发明及其合适的用量。例如，如果以特定的量将pH降低剂或pH降低剂的组合加入10毫升0.1M碳酸氢钠溶液使得该溶液的pH降低至不高于5.5、4.7或3.5时，则该pH降低剂或pH降低剂的组合适于本发明。在一些实施方式中，可以将某一量的一种或几种pH降低剂加入10毫升0.1M碳酸氢钠溶液中以降低pH至不高于3.4、3.2、3.0或2.8。

在一些实施方式中，适宜的一种或几种pH降低剂包括至少一种pKa不高于4.2(例如不高于4.0、3.8、3.6、3.4、3.2、3.0或2.8)的pH降低剂。适于本发明的示例性pH降低剂包括但不限于羧酸如乙酰水杨酸、乙酸、抗坏血酸、柠檬酸、富马酸、葡糖醛酸、戊二酸、甘油、乙醇酸、乙醛酸、异柠檬酸、异戊酸、乳酸、马来酸、草酰乙酸、草酰琥珀酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸和戊酸；氯化铝；氯化锌；氨基酸的盐(或其衍生物)包括乙酰谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甜菜碱、肉毒碱、肌肽、瓜氨酸、肌酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、羟基赖氨酸、羟脯氨酸、亚牛磺酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲基组氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、肌氨酸、丝氨酸、牛磺酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸的盐；某些磷酸酯包括1,6二磷酸果糖和1,6二磷酸葡萄糖在某些实施方式中也可以是适宜的pH降低剂。在特定的实施方式中，将柠檬酸或酒石酸作为pH降低剂。

任意特定pH降低剂或pH降低剂的组合所需的量是可以改变的。典型地，可以使用本领域公知和本申请所述的多种检测确定适宜的量(例如，在上文所述的10毫升0.1M氢氧化钠溶液中进行pH降低检测)。作为非限制性示例，在根据本发明的制剂中使用的pH降低剂的适宜的量可以等于或大于约100mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg、800mg、825mg、850mg、875mg、900mg、925mg、950mg、975mg或1,000mg。在其他实施方式中，所使用的柠檬酸的量可以超过1,000mg。

在一些实施方式中，可以将所使用的pH降低剂(例如柠檬酸或酒石酸)的适宜的量测定为特定剂型总重量的百分率。作为非限制性示例，所使用的pH降低剂的适宜的量可以等于或大于固体剂型总重量的约10％(例如等于或大于15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)。

在不同的实施方式中，本发明的组合物包括一种或多种吸收增强剂。如在本申请中所使用的，吸收增强剂指增加其他成分在其释放的水性或亲脂性环境中的溶解度和/或增强穿过肠壁活性肽(例如血管紧张素(1-7)肽)的吸收的试剂。在一些实施方式中，吸收增强剂称为溶解度增强剂和/或摄取增强剂。

在一些实施方式中，可以得到多种吸收增强剂的混合物，其中的一些提供增强的溶解度，一些提供增强的摄取，以及一些提供这两者。在给定的实施方式中可以得到多种数目的吸收增强剂，包括但不限于：1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种吸收增强剂。

表面活性剂是具有溶解度增强剂和摄取增强剂两种性质的有用的吸收增强剂的示例。在一些实施方式中，当将表面活性剂作为吸收增强剂时，其可以是在生产过程中便于混合和装载胶囊的自由流动的粉末。在其他实施方式中，当将表面活性剂用于增加血管紧张素(1-7)肽的生物利用度时，所述表面活性剂可以选自下组：(a)阴离子表面活性剂如胆固醇衍生物(例如胆汁酸)，(b)阳离子表面活性剂(例如酰基肉毒碱、磷脂等)，(c)非离子表面活性剂，和(d)阴离子表面活性剂和负电荷中和剂的混合物，及其组合。负电荷中和剂包括但不限于酰基肉毒碱、氯化十六烷基吡啶等。

在一些实施方式中，酸性可溶性胆汁酸和阳离子表面活性剂可以共同使用作为吸收增强剂。在一些实施方式中，酰基肉毒碱(如月桂酰基肉毒碱)、磷脂和胆汁酸可以是特别有效的吸收增强剂。

多种吸收增强剂适用于不同的实施方式中，下述示例性列表旨在说明本发明的一些实施方式。不具有限制性的，一些适宜的吸收增强剂包括：(a)水杨酸盐如水杨酸钠、3-甲氧基水杨酸、5-甲氧基水杨酸和高香兰酸盐；(b)胆汁酸如牛磺胆酸、牛磺去氧胆酸、去氧胆酸、胆酸、羟基乙酸、石胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、熊胆酸、去氢胆酸、夫西地酸等；(c)非离子表面活性剂如聚氧乙烯醚(例如Brij36T、Brij52、Brij56、Brij76、Brij96、TexaphorA6、TexaphorA14、TexaphorA60等)、p-t-辛基酚聚氧乙烯(TritonX-45、TritonX-100、TritonX-114、TritonX-305)、壬基苯氧基聚氧乙烯(例如IgepalCO系列)、聚氧乙烯山梨醇酐酯(例如吐温-20、吐温-80等)；(d)阴离子表面活性剂如琥珀辛酯磺酸钠；(e)溶血磷脂如溶血卵磷脂和溶血磷脂酰乙醇胺；(f)酰基肉毒碱、酰基胆碱和酰基氨基酸如月桂酰基肉毒碱、肉豆蔻酰基肉毒碱、棕榈酰基肉毒碱、月桂酰基胆碱、肉豆蔻酰基胆碱、棕榈酰基胆碱、十六烷基赖氨酸、N-酰基苯丙氨酸、N-酰基甘氨酸等；(g)水溶性磷脂如二庚酰基卵磷脂、二辛基卵磷脂等；(h)中链甘油酯，其是含有中链长度的脂肪酸(辛酸、癸酸和月桂酸)的单、双和三甘油酯的混合物；(i)乙二胺四乙酸；(j)阳离子表面活性剂如氯化十六烷基吡啶；(k)聚乙二醇的脂肪酸衍生物如癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、中链甘油酸酯(Labrafac)等；和(l)烷基糖类如月桂酰基麦芽糖、月桂酰基蔗糖、肉豆蔻酰基蔗糖、棕榈酰基蔗糖等。

在一些实施方式中，所述吸收增强剂将以以重量计相对于药物组合物总重量(通常不计肠溶包衣)的百分率的定量测定结果存在。以附加的非限制性示例的方式，在实施方式中存在的吸收增强剂的量的范围可以是以重量计从0.1至20％；以重量计从0.5至20％；以重量计从1.0至20％、以重量计从2.0至20％、以重量计从3.0至20％、以重量计从4.0至20％、以重量计从5.0至20％、以重量计从5.0至15％、以重量计从5.0至14％、以重量计从5.0至13％、以重量计从5.0至12％、以重量计从5.0至11％、以重量计从5.0至10％、以重量计从6.0至10％、以重量计从7.0至10％、以重量计从8.0至10％、以重量计从9.0至10％、以重量计从5.0至9.0％、以重量计从5.0至8.0％、以重量计从5.0至7.0％和以重量计从5.0至6.0％。

在一些实施方式中，pH降低剂与吸收增强剂的重量比可以是约3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1或者在任意两个前述示例性比例之间。在给定的药物组合物中的全部pH降低剂的总重量和全部吸收增强剂的总重量包括在前述示例性比例中。例如，如果药物组合物包括两种pH降低剂和三种吸收增强剂，则将以两种pH降低剂的总组合重量和全部三种吸收增强剂的总组合重量计算前述比例。

在一些实施方式中，所述吸收增强剂在酸性pH下将是可溶的，如低于pH5.5，和特别地在pH3.0和pH5.0之间。

在一些实施方式中，提供了包含一种或多种保护性载剂的组合物。如在本申请中所使用的，保护性载剂指任意保护性组分和/或结构，如运载体、层、包衣或其他载剂，其保护活性肽(例如血管紧张素(1-7)肽)使其免于受胃蛋白酶破坏。典型地，保护性载剂最终溶解，以使得在特定剂型中的活性和其他成分可以释放。保护性载剂的常见形式是肠溶包衣。在一些实施方式中，在以100转每分钟旋转所述组合物的溶出池中，适宜的肠溶性包衣可以持续至少2小时阻止本发明的药物组合物在0.1NHCl中分解，然后当pH增加至6.3后能够允许所述药物组合物在30分钟以内完全释放所有内容物。

多种肠溶性包衣是本领域公知的并且在一个或多个实施方式中是有用的。肠溶性包衣的非限制性示例包括醋酸纤维素酞酸酯、羟丙基甲基乙基纤维素琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、羧甲基乙基纤维素以及甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物。在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽、吸收增强剂如溶解度和/或摄取增强剂以及pH降低剂包括在足够粘的保护性糖浆中，以使得所述实施方式的组分能够受保护地通过胃部。

在例如胶囊中已装载了本发明的活性和其他成分后，可以将适宜的肠溶性包衣应用于所述胶囊。在其他实施方式中，将肠溶性包衣包覆在片剂外部或者包覆在活性成分颗粒的外表面，然后再将其压制成片剂，或者装入胶囊。

在一些实施方式中，理想的是本发明的所有成分尽可能同时从运载体或载剂中释放并且溶解在肠道环境中。在一些实施方式中载剂或运载体在小肠中释放活性成分也可能是优选地，增加细胞间或细胞旁转运的摄取增强剂在此处释放相比相同的摄取增强剂在结肠中更晚地释放更不太可能引起不良的副作用。然而，应理解，本发明被认为在结肠中与在小肠中同样有效。除了上文中讨论的以外，多种载剂或运载体是本领域公知的。

在一些实施方式中，理想的是保持肠溶性包衣的量较低(特别是在优化如何同时释放本发明的组分中)。在一些实施方式中，肠溶性包衣增加不超过其余药物组合物如固体剂型重量的30％(“其余”的药物组合物不包括肠溶性包衣本身)。在其他实施方式中，肠溶性包衣增加低于20％、低于19％、低于18％、低于17％、低于16％、低于15％、低于14％、低于13％、低于12％、低于11％或低于10％。在一些实施方式中，保护性载剂如肠溶性包衣的量构成或低于药物组合物(例如固体剂型)总重量的约25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％。

施用途径

如本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂(或含有本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的组合物或药物)可以以任意适宜的途径施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽是胃肠外施用。在一些实施方式中，所述胃肠外施用选自：静脉内、皮内、吸入、透皮(局部)、眼内、肌内、皮下、肌内和/或经粘膜施用。在一些实施方式中，本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂是皮下施用。如在本申请所使用的，将术语“皮下组织”定义为与皮肤下方紧邻的疏松的、无规则的结缔组织层。例如，可以通过将组合物注射进入包括但不仅限于大腿区、腹部区、臀部区或肩胛区的区域进行皮下施用。在一些实施方式中，本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂是静脉内施用。在其他实施方式中，本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂通过直接给予靶组织施用，如心脏或肌肉(例如肌内)、肿瘤(瘤内)、神经系统(例如直接注射进入脑；脑室内；鞘内)。或者，本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂(或含有本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的组合物或药物)可以通过吸入、胃肠外、皮内、经皮或经粘膜(例如口服或鼻内)施用。如有需要，可以同时使用一种以上的途径。

在一些实施方式中，本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂是口服施用。在一些实施方式中，本发明提供了本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂用于口服施用的固体剂型，其包括(a)血管紧张素(1-7)肽，(b)至少一种药学上可接受的pH降低剂，(c)至少一种有效提高血管紧张素(1-7)肽的生物利用度的吸收增强剂和(d)保护性载剂。在一些实施方式中，所述固体剂型是胶囊或片剂。用于制备口服制剂的多种方法和成分是本领域公知的，并且可以预期根据本说明书和/或2012年9月17日提交的美国临时专利申请序号61/701,972中的描述(其公开的全部内容在此并入本申请)，本领域技术人员将能够确定这些方法和成分中的哪些是与本发明相适应的。亦考虑将此类方法和成分纳入本发明的范围中。

给药

在一些实施方式中，组合物以治疗有效量和/或根据与特定预期结果(例如治疗或降低肌萎缩症的风险)相关的给药方案施用。

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量周期性的间隔施用，以使得肌萎缩症的至少一种症状或特征的强度、严重程度、持续时间或频率降低或者其发病被推迟。在一些实施方式中，所述肌萎缩症的至少一种症状或特征选自下组：肌肉萎缩、肌肉无力、肌肉脆弱、肌肉假性肥大、关节挛缩、骨骼变形、心肌病、吞咽障碍、肠和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知障碍、行为功能障碍、社交障碍、脊柱侧弯和呼吸功能受损。

在一些实施方式中，包含本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的制剂以单一剂量施用。在一些实施方式中，包含本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的制剂以有规律的间隔施用。如在本申请中所使用的，“间隔”施用表示治疗有效量周期性地施用(与单次给药相区别)。可以采用标准临床技术确定间隔。在一些实施方式中，包含本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的制剂每两个月一次、每月一次、每月两次、每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每日、每日两次或每6小时一次施用。针对单一个体的施用间隔不需要是固定的间隔，其可以随着时间而改变，这取决于个体的需求。

如在本申请中所使用的，术语“每两个月一次”指每两个月施用一次(即每两个月一次)；术语“每月一次”指每个月施用一次；术语“每三周一次”指每三周施用一次(即每三周一次)；术语“每两周一次”指每两周施用一次(即每两周一次)；术语“每周一次”指每周施用一次；和术语“每日”指每日施用一次。在一些实施方式中，在每天相同的时间进行重复给药(例如10am)。在一些实施方式中，在每天不同的时间进行重复给药。

在一些实施方式中，包含本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的制剂无限期地以有规律的间隔施用。在一些实施方式中，包含本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的制剂在确定的时间段以有规律的间隔施用。在一些实施方式中，包含本申请所述的血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂的制剂以有规律的间隔施用5年、4年、3年、2年、1年、11个月、10个月、9个月、8个月、7个月、6个月、5个月、4个月、3个月、2个月、1个月、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或1天。

根据本发明施用的特定剂量或量可以改变，例如根据预期结果的性质和/或程度，特定的施用途径和/或时间，和/或一个或多个特征(例如体重、年龄、个人病史、遗传特征、生活方式参数、心脏缺陷的严重程度和/或心脏缺陷的风险水平等或其组合)。此类剂量或量可以由那些普通技术人员确定。在一些实施方式中，根据标准临床技术确定适宜的剂量或量。例如，在一些实施方式中，适宜的剂量或量是足以使肌肉重量增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％或更多的剂量或量。例如，在一些实施方式中，适宜的剂量或量是足以使肌肉缺血的发生率或严重程度降低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100％的剂量或量。或者另外，在一些实施方式中，通过使用一种或多种体外或体内测定以辅助鉴定待施用的理想的或最佳的剂量范围或量确定适宜的剂量或量。

在不同实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂以治疗有效量施用。如在本申请中所使用的，术语“治疗有效量”主要是根据在本发明的药物组合物中所含的治疗剂的总量确定的。在通常情况下，治疗有效量足以令对象获得有意义的益处(例如治疗、调节、治愈、预防和/或改善潜在疾病或状况)。在一些特定的实施方式中，待施用的适宜剂量或量可以由来自体外或动物模型检测系统的剂量应答曲线外推得到。

在不同实施方式中，血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂包括衍生物、类似物和/或盐的治疗有效剂量的量可以以变化的量存在。在一些实施方式中，治疗有效剂量的量可以是例如约1-10,000μg/kg、约5-1,500μg/kg、约100-1,000μg/kg或400-500μg/kg。在一些实施方式中，所述治疗有效剂量的量可以是例如约1μg/kg、2.5μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、30μg/kg、40μg/kg、50μg/kg、60μg/kg、70μg/kg、80μg/kg、90μg/kg、100μg/kg、150μg/kg、200μg/kg、250μg/kg、300μg/kg、400μg/kg、500μg/kg、600μg/kg、700μg/kg、800μg/kg、900μg/kg、1000μg/kg或1500μg/kg。针对特定个体的有效剂量可以随着时间而改变(例如增加或降低)，这取决于所述个体的需求。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一次给药中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在其他实施方式中，治疗有效剂量的量可以是例如约0.001mg/kg体重至500mg/kg体重，例如从约0.001mg/kg体重至400mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至300mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至200mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至100mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至90mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至80mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至70mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至60mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至50mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至40mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至30mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至25mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至20mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至15mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至10mg/kg体重。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一次给药中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在又一个实施方式中，治疗有效剂量的量可以是例如约0.001mg/kg体重至约1mg/kg体重，例如从约0.001mg/kg体重至约0.9mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至约0.7mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至约0.6mg/kg体重、从约0.001mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、从约0.01mg/kg体重至约1mg/kg体重、从约0.01mg/kg体重至约0.9mg/kg体重、从约0.01mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.01mg/kg体重至约0.7mg/kg体重、从约0.01mg/kg体重至约0.6mg/kg体重、从约0.01mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、从约0.02mg/kg体重至约1mg/kg体重、从约0.02mg/kg体重至约0.9mg/kg体重、从约0.02mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.02mg/kg体重至约0.7mg/kg体重、从约0.02mg/kg体重至约0.6mg/kg体重、从约0.02mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、从约0.03mg/kg体重至约1mg/kg体重、从约0.03mg/kg体重至约0.9mg/kg体重、从约0.03mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.03mg/kg体重至约0.7mg/kg体重、从约0.03mg/kg体重至约0.6mg/kg体重、从约0.03mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、从约0.04mg/kg体重至约1mg/kg体重、从约0.04mg/kg体重至约0.9mg/kg体重、从约0.04mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.04mg/kg体重至约0.7mg/kg体重、从约0.04mg/kg体重至约0.6mg/kg体重、从约0.04mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、从约0.05mg/kg体重至约1mg/kg体重、从约0.05mg/kg体重至约0.9mg/kg体重、从约0.05mg/kg体重至约0.8mg/kg体重、从约0.05mg/kg体重至约0.7mg/kg体重、从约0.05mg/kg体重至约0.6mg/kg体重、从约0.05mg/kg体重至约0.5mg/kg体重。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一次给药中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在又一个实施方式中，治疗有效剂量的量可以是例如约0.0001mg/kg体重至0.1mg/kg体重，例如从约0.0001mg/kg体重至0.09mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.08mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.07mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.06mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.05mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至约0.04mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.03mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.02mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.019mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.018mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.017mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.016mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.015mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.014mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.013mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.012mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.011mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.01mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.009mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.008mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.007mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.006mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.005mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.004mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.003mg/kg体重、从约0.0001mg/kg体重至0.002mg/kg体重。在一些实施方式中，所述治疗有效剂量可以是0.0001mg/kg体重、0.0002mg/kg体重、0.0003mg/kg体重、0.0004mg/kg体重、0.0005mg/kg体重、0.0006mg/kg体重、0.0007mg/kg体重、0.0008mg/kg体重、0.0009mg/kg体重、0.001mg/kg体重、0.002mg/kg体重、0.003mg/kg体重、0.004mg/kg体重、0.005mg/kg体重、0.006mg/kg体重、0.007mg/kg体重、0.008mg/kg体重、0.009mg/kg体重、0.01mg/kg体重、0.02mg/kg体重、0.03mg/kg体重、0.04mg/kg体重、0.05mg/kg体重、0.06mg/kg体重、0.07mg/kg体重、0.08mg/kg体重、0.09mg/kg体重或0.1mg/kg体重。针对特定个体的有效剂量可以随着时间而改变(例如增加或降低)，这取决于所述个体的需求。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一次给药中提供。在一些实施方式中，本申请所述的治疗有效量在一天中提供。

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以范围从约1-1,000μg/kg/天(例如范围从约1-900μg/kg/天、1-800μg/kg/天、1-700μg/kg/天、1-600μg/kg/天、1-500μg/kg/天、1-400μg/kg/天、1-300μg/kg/天、1-200μg/kg/天、1-100μg/kg/天、1-90μg/kg/天、1-80μg/kg/天、1-70μg/kg/天、1-60μg/kg/天、1-50μg/kg/天、1-40μg/kg/天、1-30μg/kg/天、1-20μg/kg/天、1-10μg/kg/天)的有效剂量施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以范围从约1-500μg/kg/天的有效剂量施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以范围从约400-500μg/kg/天的有效剂量施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以范围从约1-100μg/kg/天的有效剂量施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以范围从约1-60μg/kg/天的有效剂量施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽以选自约1、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μg/kg/天的有效剂量施用。

在一些实施方式中，提供了一种以药物制剂提供的组合物。在一些实施方式中，药物制剂是或包含单位剂量，其根据与实现降低肌萎缩症的至少一种症状或特征的强度、严重程度、持续时间、频率或推迟其发病相关的给药方案施用。

联用疗法

在一些实施方式中，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂与一种或多种目前用于肌萎缩症的预防和/或治疗的已知治疗剂(例如抗肌萎缩症药物)联合施用。在一些实施方式中，所述已知的治疗剂根据其标准的或已批准的给药方案和/或计划施用。在一些实施方式中，所述已知的治疗剂根据同其标准的或已批准的给药方案和/或计划相比改变的方案施用。在一些实施方式中，此类改变的方案不同于标准的或已批准的给药方案，其一个或多个单位剂量的量改变(例如降低或增加)，和/或给药频率改变(例如其将单位剂量之间的一个或多个间隔扩大，以降低频率，或者缩短，以增加频率)。

在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽与一种或多种抗肌萎缩症药物联合施用。在一些实施方式中，所述一种或多种抗肌萎缩症药物是糖皮质激素(例如泼尼松或VBP15)、5型磷酸二酯酶(pde5)抑制剂或者其他疗法如促进一氧化氮的药物(例如HCT1026或NCX320)、drisapersen、反义寡核苷酸(例如AVI-4658)及其他。在一些实施方式中，所述一种或多种抗肌萎缩症药物选自下组：Eteplirsen(AVI-4658)、HCT1026、NCX320、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、阿伐那非(avanafil)、罗地那非(iodenafil)、米罗那非(mirodenafil)、乌地那非(udenafil)、扎普司特(zaprinast)、皮质类固醇及其组合。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂与一种或多种抗肌萎缩症药物同时施用。在一些实施方式中，所述血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素(1-7)受体激动剂与所述一种或多种抗肌萎缩症药物顺序施用。

试剂盒

在一些实施方式中，本发明还提供了试剂盒或其他生产物品，包含血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂，或者包含同样的制剂，并提供了将其重构(若为冻干的)和/或使用的说明书。试剂盒或其他生产物品可包括容器、注射器、小瓶和任意其他用于给药(如皮下、吸入)的物品、装置或设备。适当的容器包括如瓶子、小瓶、注射器(如预装注射器)、安瓿、套筒、储液器或二室注射器。这些容器可以由多种材质(例如玻璃或塑料)形成。在一些实施方式中，容器是预装注射器。适当的预装注射器包括但不限于带有烤硅酮涂层的硼硅酸盐玻璃注射器、带有喷涂硅酮的硼硅酸盐玻璃注射器或不带有硅酮的塑料树脂注射器。

通常，容器可以包含药剂和容器上或与容器关联的标签，所述标签可以说明重构和/或使用的方法。例如，标签可说明将药剂重构至上述浓度。标签可以进一步说明药剂用作或旨在用作如皮下给药。在一些实施方式中，容器可以包括含有血管紧张素(1-7)肽的稳定制剂的单一剂量。在各种实施方式中，稳定制剂的单一剂量以少于约15ml、10ml、5.0ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml、1.5ml、1.0ml或0.5ml的体积存在。或者，包含药剂的容器可以为多次使用瓶，允许进行药剂的重复给药(如2至6次给药)。试剂盒或其他生产物品还可包括含有适当稀释剂(如BWFI、盐水、缓冲盐水)的第二容器。在混合稀释剂和药剂时，在重构药剂中的最终蛋白浓度一般为至少1mg/ml(如至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少20mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml)。试剂盒或其他生产物品还可包括商业和用户立场需要的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和指示如何使用的药品说明书。在一些实施方式中，试剂盒和其他生产用物品可包括进行自行给药的说明。

实施例

实施例1——在杜氏(Duchenne)肌萎缩症的mdx小鼠模型中施用血管紧张素(1-7)、PanCyte 或线形PanCyte

在这个实施例中，使用已知的和被认可的杜氏(Duchenne)肌萎缩症(DMD)模型mdx小鼠评估若干血管紧张素(1-7)肽和血管紧张素(1-7)受体激动剂AVE0991针对通常在DMD患者中观察到的肌肉退化的作用。参见Dangain和Vrbova,Muscledevelopmentinmdxmutantmice(在mdx突变小鼠中的肌肉发育),1984,MuscleNerve7:700-704；亦参见Tanabe等，SkeletalmusclepathologyinX-chromosome-linkedmusculardystrophy(mdx)mouse(在X-染色体连锁肌萎缩症(mdx)小鼠中的骨骼肌病理学),1986,ActaNeuropathol,69:91-95；Kobayashi等，Endpointmeasuresinthemdxmouserelevantformusculardystrophypre-clinicalstudies(在mdx小鼠中的与肌萎缩症临床前研究相关的终点检测),2012,ActaMaterialia,22:34-42。特别地，所述mdx小鼠在其抗肌萎缩蛋白基因中具有点突变，其导致抗肌萎缩蛋白生产的破坏并且导致在这种小鼠中几乎没有功能性的抗肌萎缩蛋白存在。缺乏功能性的抗肌萎缩蛋白最终导致包括隔膜在内的多种肌肉形成显著的纤维化和显著衰弱，通常结果导致死亡。

在这个实施例中，使用三种血管紧张素(1-7)肽，分别称为血管紧张素(1-7)(SEQIDNO:1)、PanCyte(SEQIDNO:22)和线形PanCyte(也称为“TXA301”；SEQIDNO:2)以及小分子血管紧张素(1-7)受体激动剂考察其对于肌肉萎缩随着时间进展情况的影响。特别地，将110只mdx小鼠(每组10只)放入下表1所示的组别之一。

表1-研究设计

在这个实施例中，在生理盐水中制备线形PanCyte、PanCyte和AVE0991并经由肩胛下注射以给药体积100μl/小鼠连续28天每日一次皮下施用。给药溶液每3天新鲜制备一次。

在最后一次注射一周后，处死各只动物，并且取出一些肌肉并称重以确定是否施用血管紧张素(1-7)肽或血管紧张素(1-7)受体激动剂足以使经治疗的mdx小鼠与对照小鼠相比肌肉重量增加。在这项研究中，检查的肌肉为：横膈膜、腓肠肌、四头肌和三头肌。

还使用标准组织学和免疫组化方法确定了治疗小鼠和对照小鼠的肌纤维尺寸。还使用根据已知方法(例如苏木素&伊红染色)的组织病理学确定是否肌肉重量包含健康的纤维。健康肌肉组织的指标包括存在圆形纤维和集中的核。分析肌肉组织的示例性方法包括在MeolaG,“Advancedmicroscopicandhistochemicaltechniques:Diagnostictoolsinthemoleculareraofmyology,(高级显微和组织化学技术：在肌肉学分子时代的诊断工具)”2005,EurJHistochem49(1):93-96，和Karpati等，“Tracerandmarkertechniquesinthemicroscopicstudyofskeletalmuscles(在骨骼肌显微研究中的示踪物和标记物技术)”1981,MethodsAchievExpPathol,10:101-137中描述的那些，其内容通过引用在此并入。

可以预计的是施用血管紧张素(1-7)肽增加mdx小鼠中的肌肉重量。将在各种组织中观察到肥大。施用血管紧张素(1-7)肽还将增加mdx小鼠中的健康肌肉。

实施例2——在肌萎缩症的Sgcd-/-小鼠模型中施用Ang(1-7)

在这个实施例中，使用已知的肢带肌萎缩症模型Sgcd-/-小鼠评估血管紧张素(1-7)肽对骨骼肌纤维化、血压、心率、心脏活性、压力反射灵敏度、氧化应激、AT₁R受体表达以及静息心脏交感神经和迷走交感神经张力的影响。Sgcd-/-小鼠缺失了肌聚糖复合物中关键的组分，特别是其缺失了F-肌动蛋白细胞骨架和胞外基质之间的连接。由于肌肉纤维的完整性降低和肌肉细胞中细胞信号的失调使得这种缺陷导致肌肉萎缩和衰弱。此前已显示这种缺陷在幼年时就会导致运动活性降低和自主神经功能障碍。认为自主神经功能障碍在日后会导致心脏功能障碍。

为了考察血管紧张素(1-7)肽对Sgcd-/-小鼠中正常运动活性破坏的影响，采用无线电遥测技术对有意识的幼年(10-15wks)和对照C57BL6小鼠进行了分析。当小鼠10周龄时，在氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉下，经由左颈动脉将无线电遥测仪植入主动脉。恢复后，每天24小时测定血压、心率和运动活性。在2000Hz对血压检测取样1小时时间段，以便能够对收缩动脉压和脉搏间隔(PI)进行逐搏检测。使用已知的序列技术由收缩血压和脉搏间隔的自发性波动评估心率压力反射的控制。

使用序列技术由收缩血压和脉冲间隔中的自发性波动计算压力反射的灵敏度。特别地，根据4个或多个连续血压脉冲序列的平均斜率计算压力反射的灵敏度，其中血压和脉冲间隔的变化是正相关的(r²>0.85)。

分别由心率针对β-肾上腺素受体阻断剂普萘洛尔和毒蕈碱胆碱能受体阻断剂甲基阿托品的应答计算心脏交感神经张力和副交感神经张力。特别地，分别由心率针对普萘洛尔(1μg/g，IP)和甲基阿托品(1μg/g，IP)的应答评估静息心脏交感神经和副交感神经(迷走神经)张力。由对神经节阻断剂氯异吲哚铵的注射(12μg/g,IP)产生应答的平均动脉血压降低计算血管舒缩交感神经张力。

在氯胺酮-甲苯噻嗪麻醉下，将具有Ang(1-7)(也称为“TXA127”)或载剂的渗透微型泵(Alzet)植入3周龄的小鼠幼崽中。

收集2-3天的数据，并且计算24小时平均值。从3周龄开始，对照和Sgcd-/-小鼠组分别输注Ang(1-7)(300ng/kg/min)8周。在这些小鼠中使用如上文所述的相同试验方案获得检测结果。图1A显示了对在这个实施例中应用的一些数据收集技术的描述，图1B显示了针对该研究的实验。

为评估骨骼肌的表型，使用马森氏(Masson)三色染色对骨骼肌(四头肌)的石蜡切片进行染色以便对组织病理学和纤维化进行评估。使用多克隆的抗-δ和抗-β肌聚糖一抗、核染料和AlexaFluor488培育骨骼肌的冰冻切片。使用家兔抗-AT₁R和抗-Mas的核染料以及二抗山羊抗-家兔IgG检测AT₁R(Ang1型受体)和Mas(Ang(1-7)受体)。通过二氢乙啶(DHE)荧光检测氧化应激(O2^·-)。

在这个实施例中的数据以±SE表示。使用ANOVA，以及如果适合使用配对和非配对t-检验对结果进行分析，当p<0.05时确定具有显著性。

图2A和2B显示了在未给药和给予Ang(1-7)的对照和Sgcd-/-小鼠中的平均动脉血压和心率水平。图A显示了给予Ang(1-7)不会显著影响通常在Sgcd-/-小鼠中观察到的较低的血压。图B显示了与未给药的Sgcd-/-对照相比给予Sgcd-/-小鼠Ang(1-7)看起来轻度降低动物的心率。

如图3所示，与预期一致，在Sgcd-/-小鼠中运动活性显著降低。然而，通过给予Ang(1-7)显著减少这种运动活性的降低。事实上，在给药Sgcd-/-小鼠中的运动水平与对照C57BL6小鼠相比未出现显著改变。

图4显示了在对照和Sgcd-/-小鼠之间以及在未给药和给予Ang(1-7)的动物之间对4A)压力反射灵敏度、4B)心脏迷走神经张力、4C)心脏交感神经张力和4D)血管舒缩交感神经张力的比较。如图A和B所示，通过给予Ang(1-7)，与对照小鼠相比在Sgcd-/-小鼠中压力反射灵敏度和心脏迷走神经张力的降低基本上被消除。图C和D显示了通过给予Ang(1-7)通常在Sgcd-/-小鼠中观察到的心脏交感神经张力和血管舒缩交感神经张力的增加也基本上被消除。

图5显示了关于骨骼肌(此处为四头肌)纤维化的组织病理学(图5A)和定量(图5B)数据。如从这两张图中可以看出，通过给予Ang(1-7)显著降低了在Sgcd-/-小鼠中观察到的明显的纤维化。事实上，图5B显示了在给予Ang(1-7)的Sgcd-/-小鼠中观察到的纤维化水平与对照C57BL6小鼠是相当的。

在Sgcd-/-小鼠中，观察到了血管紧张素1型受体(AT₁R)增加并且其与运动活性减少和自主神经功能障碍相关(参见Sabharwal等，Receptoractivity-modifyingprotein1increasesbaroreflexsensitivityandattenuatesAngiotensin-inducedhypertension(受体活性修饰蛋白1增加压力反射灵敏度和减轻血管紧张素诱导的高血压),2010,Hypertension,55(3):627-635)。图6显示了给予Ang(1-7)基本上消除了在未给药的Sgcd-/-小鼠中观察到的AT₁R增加。

氧化应激水平增加(如通过超氧化物水平的增加)已经与肌萎缩症的多种症状相关联(参见Terrill等，Oxidativestressandpathologyinmusculardystrophies:focusonproteinthioloxidationanddysferlinopathies(在肌萎缩症中的氧化应激和病理学：聚焦蛋白巯基氧化和dysferlin肌病(dysferlinopathies)),2013,FEBSJournaldoi:10.1111/febs.12142；亦参见Murphy和Kehrer,Oxidativestressandmusculardystrophy(氧化应激和肌萎缩症),1989,ChemBiolInteract,69(2-3):101-173)。在Sgcd-/-小鼠中通常观察到类似现象并且认为其与在该模型中观察到的运动活性和自主神经功能方面的困难具有相关性。图7A和7B显示了给予Ang(1-7)能够强烈降低在未给药的Sgcd-/-小鼠中观察到的超氧化物水平的显著升高。图A显示了样品的二氢乙啶荧光，而图B显示了对各组中超氧化物水平的定量评估。

Ang(1-7)肽在Sgcd-/-小鼠中具有减少骨骼肌纤维化以及恢复其运动活性和交感迷走神经平衡的能力，同时不会导致血压降低，这表明Ang(1-7)肽具有作为肌萎缩症疗法的显著的治疗潜能。如该实施例中所示，与未给药的Sgcd-/-小鼠相比，Ang(1-7)肽改善了在Sgcd-/-小鼠中每个观察到的功能障碍的测量。基于这一发现，如上述实施例所示，血管紧张素(1-7)肽和/或血管紧张素受体激动剂的施用可以为肌萎缩症的治疗提供一种有力的和新的方法。

实施例3——PanCyte和线形PanCyte组合物向mdx小鼠的口服施用

在这个实施例中，在示例性的口服剂型中使用特定的血管紧张素(1-7)肽，称为PanCyte(SEQIDNO:22)和线形PanCyte(也称为“TXA301”；SEQIDNO:2)以评估口服施用对mdx小鼠状况的影响。在这个实施例中，根据已知方法使用灌胃给予药剂，并且根据2012年9月17日提交的美国临时专利申请61/701,972中描述的方法分别使用柠檬酸、月桂酰基肉毒碱和羟丙基甲基纤维素钛酸酯制备PanCyte和线形PanCyte的水性制剂。

根据如表2所示的设计在该实施例中使用将共计80只mdx小鼠分成8组，包括PBS对照和裸血管紧张素(1-7)肽对照：

表2-研究设计

与实施例1中一致，在最后一次注射一周后，处死各只动物，并且取出一些肌肉并称重以确定是否口服施用血管紧张素(1-7)肽和/或包括PanCyte或线形PanCyte的组合物足以使经治疗的mdx小鼠与对照小鼠相比肌肉重量增加。在这项研究中，检查的肌肉为：横膈膜、腓肠肌、四头肌和三头肌。

还使用标准组织学和免疫组化方法确定了治疗小鼠和对照小鼠的肌纤维尺寸。如上述实施例1中所述还使用根据已知方法(例如苏木素&伊红染色)的组织病理学确定是否肌肉重量包含健康的纤维。健康肌肉组织的指标包括存在圆形纤维和集中的核。

可以预计的是口服施用包括PanCyte或线形PanCyte的组合物足以在mdx小鼠中增加肌肉重量。将在各种组织中观察到肥大。口服施用包括PanCyte或线形PanCyte的组合物还将增加mdx小鼠中的健康肌肉组织。

实施例4——经血管紧张素(1-7)肽治疗后在肌萎缩症Sgcd-/-小鼠模型中的功能表现和纤维化程度

在这个实施例中，使用已建立的肢带型肌萎缩症-2F(LGMD-2F)小鼠模型肌聚糖δ缺陷小鼠(Sgcd-/-)考察血管紧张素(1-7)肽对该疾病患者功能损伤和纤维化进展的影响。通常已知Sgcd-/-小鼠在幼年时显示出运动活性降低和骨骼肌营养不良的表型，并且该实施例显示使用血管紧张素(1-7)肽治疗改善运动活性和降低纤维化速率。

将共计32只Sgcd-/-小鼠随机分配至四个治疗组之一(每组n＝8)：生理盐水组(载剂)、TXA127组、Pancyte组和TXA301。血管紧张素(1-7)肽的施用剂量为TXA127500μg/kg/天、PanCyte50μg/kg/天和TXA30150μg/kg/天。将含有治疗剂的渗透微量泵植入28-35周龄的小鼠中，并且输注血管紧张素(1-7)肽8周。在治疗的最后3周，将小鼠放入带有滚轮的笼中以计算各只动物进行自主运动的量。每日收集滚轮的总转数(跑动距离)。在8周治疗结束时，收集小鼠的四头肌进行组织病理学和氧化应激分析。

图8显示了在第6、7和8周各治疗组小鼠转动滚轮的平均转数。与生理盐水对照组的小鼠相比，给予TXA127和TXA301在进行自主运动的量方面获得了显著改善，给予TXA127显示出了最大程度的改善。图9显示了与图8相同的数据，仅以各治疗组在三周测试期(第6、7和8周)的累积总数表示。而且，与生理盐水对照动物相比，给予TXA127和TXA301的那些组在进行运动的量方面显示出了显著增加。值得注意的是，与生理盐水对照动物相比，给予TXA127获得超过6倍的改善。

使用H&E染色考察小鼠营养不良的四头肌肌肉的形态。图10A显示了经治疗小鼠的示例性H&E(上面一行)和马森氏(下面一行)染色。如图10A和10B所示，给予生理盐水的Sgcd-/-小鼠显示出集中的核增加、脂肪酸浸润和胶原沉积，而使用TXA127治疗显著降低Sgcd-/-小鼠骨骼肌的纤维化。此外，给予小鼠TXA301也显示出一些改善，而在给予PanCyte的小鼠中未观察到纤维化减少。

使用二氢乙啶(DHE)考察在经治疗的Sgcd-/-小鼠中的氧化应激程度。简言之，将DHE溶液用于骨骼肌切片并且在共聚焦显微镜上捕获图像(红色表示氧化应激)。示例性的共聚焦图像如图11A所示。对于纤维化程度的定量而言，从各只小鼠获得平均6张骨骼肌四头肌切片。使用NIHImageJ软件对各只小鼠的荧光强度进行定量并且规一化至在给予生理盐水的Sgcd-/-小鼠中测定的平均荧光强度的百分率。如图11A和11B所示，TXA127显著减弱了给予生理盐水的Sgcd-/-小鼠显示出的氧化应激增加。

该实施例清楚地显示了给予血管紧张素(1-7)肽如TXA127和/或TXA301在治疗肌萎缩症中具有显著作用，包括在该实施例中的症状如纤维化程度、氧化应激程度和功能性肌肉损伤的程度。

等同方式和范围

本领域的技术人员将能够理解，或能够使用不超出常规实验的方法来确定，本申请所描述的特定实施方式的多种等同方式。本发明的范围并不旨在限于上述说明书，而是如所附的权利要求书中所示。

Claims

1.一种治疗肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或对肌萎缩症易感的对象施用血管紧张素(1-7)肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量周期性施用，所述施用间隔可以使得肌萎缩症的至少一种症状或特征的强度、严重程度、持续时间或频率降低或者使其发病被推迟。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肌萎缩症的至少一种症状或特征选自下组：肌肉萎缩、肌肉无力、肌肉脆弱、关节挛缩、骨骼变形、心肌病、吞咽障碍、肌肉假性肥大、肠和膀胱功能受损、肌肉缺血、认知障碍、行为功能障碍、社交障碍、脊柱侧弯和呼吸功能受损。

4.根据权利要求1所述的方法，其中施用所述血管紧张素(1-7)肽使得肌肉再生、纤维化减轻、肌力增加、弹性增加、运动范围增加、耐力增加、易疲劳性降低、血流增加、认知改善、肺功能改善和/或炎症抑制。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述肌萎缩症选自下组：杜氏(Duchenne)肌萎缩症、贝克型(Becker)肌萎缩症、埃-德二氏(Emery-Dreifuss)肌营养不良、肢带型肌萎缩症、三好氏(Miyoshi)肌肉病变、先天性肌萎缩症、面肩肱型肌萎缩症、眼咽型肌萎缩症、原发性侧索硬化症、脊髓性肌萎缩症、多肌炎、格林-巴利(Guillian-Barre)综合征和强直性肌萎缩症。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述先天性肌萎缩症选自下组：层粘连蛋白-α2-缺乏的先天性肌萎缩症、乌尔里希(Ullrich)先天性肌萎缩症、沃克-华宝(Walker-Warburg)综合征、福山型(Fukuyama)先天性肌萎缩症和伴有精神发育迟滞和脑回肥厚的先天性肌萎缩症。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽是胃肠外施用。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述胃肠外施用选自：静脉内、皮内、吸入、透皮(局部)、眼内、肌内、皮下、肌内和/或经粘膜施用。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽是口服施用。

10.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽是每月、每周、每日施用或者以可变的间隔施用。

11.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量范围从约1-1,000ug/kg/天施用。

12.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量范围从约50-500ug/kg/天施用。

13.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽以有效剂量范围从约400-500ug/kg/天施用。

14.根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽与一种或多种抗肌萎缩症药物联合施用。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种抗肌萎缩症药物选自下组：Eteplirsen(AVI-4658)、HCT1026、NCX320、西地那非(sildenafil)、他达拉非(tadalafil)、伐地那非(vardenafil)、阿伐那非(avanafil)、罗地那非(iodenafil)、米罗那非(mirodenafil)、乌地那非(udenafil)、扎普司特(zaprinast)、皮质类固醇及其组合。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽包含天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:1)。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽是SEQIDNO:1的功能性等价物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述功能性等价物是线形肽。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述线形肽包含包括在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的7个氨基酸中的至少4个氨基酸的序列，其中所述至少4个氨基酸保持其在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中出现的相对位置。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述线形肽含有4-25个氨基酸。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述线形肽是所述天然存在的血管紧张素(1-7)的片段。

22.根据权利要求18所述的方法，其中所述线形肽含有在所述天然存在的血管紧张素(1-7)中的氨基酸取代、缺失和/或插入。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述线形肽具有氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Ser⁴-Ile⁵-His⁶-Cys⁷(SEQIDNO:2)。

24.根据权利要求17所述的方法，其中所述功能性等价物是环肽。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述环肽包含氨基酸之间的连接键。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述连接键位于与天然存在的血管紧张素(1-7)中的Tyr⁴和Pro⁷的位置对应的残基。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述连接键是硫醚桥。

28.根据权利要求24所述的方法，其中所述环肽包含与天然存在的血管紧张素(1-7)氨基酸序列Asp¹-Arg²-Val³-Tyr⁴-Ile⁵-His⁶-Pro⁷(SEQIDNO:1)在其他方面都相同的氨基酸序列。

29.根据权利要求24所述的方法，其中所述环肽是如下式所示的4,7-环化的血管紧张素(1-7)：

30.根据权利要求17所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)肽包含一个或多个化学修饰以增加蛋白酶抗性、血清稳定性和/或生物利用度。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述一个或多个化学修饰包含聚乙二醇化。

32.一种治疗肌萎缩症的方法，所述方法包括向患有或对肌萎缩症易感的对象施用血管紧张素(1-7)受体激动剂。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是非肽激动剂。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述非肽激动剂是具有下述结构的化合物：

或其药学上可接受的盐。

35.根据权利要求32-34中任意一项所述的方法，其中所述血管紧张素(1-7)受体激动剂是口服施用。