CN105567685A - AaPDR3基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种启动子，该启动子是能调控基因在非分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQ？ID？No：1所示，是AaPDR3基因的启动子。该启动子可以应用于利用植物非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。另外，本发明还公开了包含该启动子的载体和表达盒。本发明也为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，尤其是通过AaPDR3基因的启动子proAaPDR3进行研究奠定了基础。

Description

AaPDR3基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种启动子及其应用，尤其涉及一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的转运蛋白基因启动子(proAaPDR3)及其在转基因植物中的应用。

背景技术

青蒿(ArtemisiaannuaL.)是菊科蒿属的一年生草本植物，植株有浓烈的挥发性香气，其植株中含有许多次级代谢产物：青蒿素、挥发油、α-蒎烯、樟脑、青蒿酮等，此外还含有黄酮类化合物。目前，青蒿素联合疗法(Artemisinin-basedcombinationtherapies，ACTs)是世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量低，尚无法完全满足全球的市场需求。

青蒿具有分泌型腺毛(glandulartrichomes)和非分泌型腺毛(nonglandulartrichomes)。在青蒿叶片的正面和背面、茎秆、花上都大量存在腺毛，这里是大量次生代谢物的累积场所，青蒿素被认为储存于分泌型腺毛。两种腺毛对于植物的生长、发育、防御、花粉传播等都起到至关重要的作用。

启动子是位于结构基因5’端上游的特定核酸序列，能够调控下游基因的表达，启动子就像一个“开关”，通过顺式作用元件和反式作用因子的相互作用来发挥其特定的功能。启动子一共分三种：组成型启动子、特异型启动子、诱导型启动子。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的启动子大多数是组成性的启动子。这类启动子能够驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害。而非分泌型腺毛特异表达的启动子只对植物的非分泌型腺毛系统进行遗传操作，不会对植物造成代谢的浪费和生长发育造成危害。

ABC(ATPbindingcassette)转运蛋白是一大类非常多样化非常特殊的超级家族。大部分ABC转运蛋白直接参与到各种分子的跨膜运输。AaPDR3是从青蒿中克隆得到的一个ABC转运蛋白中PDR(Pleiotropicdrugresistance)亚家族的转运蛋白。

因此，本领域技术人员致力于开发一种腺毛特异表达的AaPDR3基因的启动子。

发明内容

有鉴于现有技术中的启动子会驱动基因在植物所有的组织和器官中表达，会导致植物体内代谢的浪费，还可能对植物的正常生长造成一定的负担和危害的这些缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种在植物非分泌型腺毛中特异表达的启动子，能引导基因在转基因植物非分泌型腺毛中特异表达。

为实现上述目的，本发明的一方面提供了一种启动子，该启动子是能调控基因在非分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。该启动子为转运蛋白基因启动子，是诱导型启动子，也是特异型启动子。

进一步地，该启动子是青蒿AaPDR3基因上游的启动子。

进一步地，该启动子上的顺式作用元件包括：TATAbox、CAATbox、G-box、AE-box、ARE、GA-motif、G-box、MBS和Wbox。

本发明的另一方面提供上述启动子的应用，是在利用植物非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

进一步地，其中代谢产物为青蒿素。

本发明的又一方面提供一种载体，该载体连接有如上所述的启动子。该载体可以是pCAMBIA1391z载体。

本发明的再一方面，提供一种制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，包括以下步骤：

步骤一、根据青蒿基因组中AaPDR3基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如权利要求1中所述的启动子的序列；

步骤二、将步骤一中获得的AaPDR3基因的所述启动子的序列连入pCAMBIA1391z载体，获得pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体；

步骤三、将步骤二中获得的pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体转化根癌农杆菌；

步骤四、将步骤三中获得的带有pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体的根癌农杆菌转化青蒿，并进行检测；

步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位。

优选地，其中启动子与青蒿素合成途径中的关键酶基因融合，从而加强青蒿合成途径，最终提高青蒿素的合成。该青蒿素合成途径中的关键酶基因可以是PDR3基因等。

优选地，其中巢式PCR的引物序列为：

第一轮PCR：PF1：5’-CTTTTCCAGCCAAATAAGTATGCCG-3’；

PR1：5’-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3’；

第二轮PCR：PF2：5’-TTTCTTTGGTGTTGTATCAATCTCTG-3’；

PR2：5’-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3’；

优选地，为构建pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体，proAaPDR3两端分别引入了EcoRI的酶切位点和NcoI的酶切位点，使用的引物序列为：

EcoRI-Pro-PDR3-FP：5’-CGGAATTCGAACTGTTGAATTAGTATTTAC-3’；

Pro-PDR3-NcoI-RP：5’-CATGCCATGGTTTTAATGCTCAAAAAGCCC-3’。

本发明还提供了一种表达盒，该表达盒包括如前所述的启动子。优选地，该表达盒为proAaPDR3-GUS表达盒。进一步地，在该表达盒中，可以插入青蒿素合成途径中的关键酶基因。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明利用有效的青蒿表皮腺毛组织特异性启动子代替组成型启动子，可以通过分子生物学的方法构建在青蒿非分泌型腺毛特异表达目的基因的融合基因，利用遗传转化技术将其转入其他植物的基因组中，从而实现目的基因的定向操作已获得转基因植物，并且不会对植物的生长发育造成危害，能广泛用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中。另外，本发明也为深入研究非分泌型腺毛的发生和发育以及其中的次级代谢产物的代谢调控，尤其是通过AaPDR3基因的启动子proAaPDR3进行研究奠定了基础。

以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例的转基因青蒿植株的PCR检测结果图。其中，M：分子量标记；泳道1：阴性对照；泳道2：阳性对照；泳道3-12：分别是10株转基因青蒿植株基因组为模版，进行PCR得到的产物。

图2是本发明的一个较佳实施例利用AaPDR3基因启动子proAaPDR3与GUS基因融合的载体pCAMBIA1391z-proAaPDR3转化青蒿后，所获得的转基因青蒿中的GUS组织染色图。

具体实施方式

下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989年版)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实施例涉及的根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008,28(3)：38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105和质粒pCAMBIA1391z可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1。

实施例1AaPDR3基因启动子proAaPDR3的获得

1、培养青蒿无菌苗

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min，再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min后，无菌水冲洗3次-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS固体培养基上，25℃、16h/8h(日光/黑夜)光照培养，14天后即可获得青蒿无菌苗。

2、基因组DNA的提取

在1.5mL离心管中放一片青蒿叶片(1cm²左右大小，用冰盒盛取)，加入2粒钢珠。加入300μLTPSbuffer(通风橱内操作，TPS中含有巯基乙醇)，55-60Hz，震荡90秒。再加入300μLTPSbuffer(通风橱)。65℃水浴1h(每隔20min摇一摇)，可适当延长时间，最长1.5h。冷却至室温，4℃10000rpm离心15min。取300μL-400μL上清液。加入300μL-400μL异丙醇(异丙醇在-20℃预冷)。混合后在-20℃冰箱中放置10-15min(可延长至1h)。取出4℃离心12000rpm，吸去上清，在通风橱中倒置10-15min。加入75％乙醇500-600μL，将沉淀吹打起或用手指弹起，放在摇床上摇15-20min，重复一次。吸干液体，放在37℃中烘干，直到沉淀变为透明。加入50μLddH₂O回溶，即获得基因组DNA，4℃保存。

3、PCR扩增

以上述获得的基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增非分泌型腺毛特异启动子proAaPDR3序列。为了提高产物的特异性，采用两轮巢式PCR扩增，根据基因组测序得到的AaPDR3基因的启动子序列设计巢式PCR引物如表1所示，第一轮PCR反应体系如表2所示。PCR条件为：94℃预变性10min；94℃40s，50℃40s，68℃3min，34个循环；68℃延伸10min。在1％的琼脂糖凝胶中电泳检测PCR产物。

表1巢式PCR引物

表2第一轮PCR反应体系

将第一轮PCR的产物稀释50倍用作为第二轮PCR的模版，第二轮PCR的引物是FP2和RP2，反应体系如表3所示，PCR反应条件为：94℃预变性10min；94℃40s，55℃40s，68℃2min，34个循环；68℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收特异条带，连接到pJET1.2载体用于测序。将该片段的序列与AaPDR3基因的序列进行拼接，结果获得了AaPDR3基因上游约2kb的序列。获得的AaPDR3基因启动子proAaPDR3的序列如SEQIDNo：1所示。

表3第二轮PCR反应体系

实施例2分析启动子proAaPDR3的顺式作用元件，确定proAaPDR3的类型

实施例1中获得的启动子proAaPDR3序列长度为2059bp。为了寻找启动子上面的顺式作用元件，用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对启动子proAaPDR3进行分析。分析发现多克隆到的启动子上面具有除了TATAbox和CAATbox，还具有很多顺式作用元件，如：G-box、AE-box、ARE、GA-motif、G-box、MBS和Wbox等，具体如表4所示。其中，G-box在很多植物启动子中都有发现，它是很多应激响应启动子行使功能所必须的元件，在植物启动子对光、无氧环境和植物激素的响应过程中起到很重要的作用；此外，GA-motif受光调控，ABRE在植物中能够响应脱落酸；MBS是MYB转录因子结合位点。以上结果分析表明，AaPDR3基因的启动子proAaPDR3是一个诱导型的启动子，能受多种因素诱导。

表4启动子proAaPDR3序列中调控元件分析

实施例3将AaPDR3基因启动子proAaPDR3连入pCAMBIA-1391z载体，融合GUS报告基因

为了研究基因启动子在植物不同组织部位中的表达，将AaPDR3基因的启动子proAaPDR3连接pCAMBIA-1391z载体，从而融合GUS报告基因。为了实现对表达载体的构建，在对启动子proAaPDR3进行扩增时，通过正向引物引入EcoRI酶切位点，通过反向引物中引入NcoI酶切位点，引物序列如表5所示：

表5pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体构建使用的PCR引物

通过对扩增的proAaPDR3片段和pCAMBIA-1391z载体的双酶切以及连接，获得pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体。

实施例4将构建好的pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体转化根癌农杆菌并检测

将含有构建完成的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaPDR3转入根癌农杆菌(EHA105)，并进行PCR验证。结果表明：含有基因启动子片段的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaPDR3成功的构建到根癌农杆菌菌株中，从而获得含基因启动子和GUS基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391z-proAaPDR3的根癌农杆菌菌株。

实施例5将带有pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体的根癌农杆菌转化青蒿并进行检测

1)外植体的预培养

青蒿种子用体积分数为75％的乙醇浸泡1min；再用20％(w/v)的NaClO浸泡20min；无菌水冲洗3-4次；用无菌吸水纸吸干表面水分；接种于无激素的MS培养基中，25℃、16小时的日光和8小时的黑夜培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

其中，MS培养基为Murashige和Skoog在1962年发明的固体培养基，该固体培养基可以通过商业渠道获得。

2)农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到1/2MS和100μmol/LAS(乙酰丁香酮)组成的共培养培养基中，滴加活化好的含有pCAMBIA1391z-proAaPDR3植物表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3天。以滴加不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

3)抗性再生植株的筛选及检测

将所述的共培养3天的青蒿外植体转入到MS、0.5mg/L6-BA(6-苄基嘌呤)、0.05mg/LNAA(萘乙酸)、50mg/LKan(卡那霉素)和500mg/LCb(羧苄青霉素)组成的发芽筛选培养基上，于25℃、16小时的日光和8小时的黑暗中培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入1/2MS₀(无激素的MS培养基)和125mg/LCb组成的生根培养基上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

根据表达盒proAaPDR3-GUS序列中的proAaPDR3和GUS序列分别设计正向引物(proPDR3-F:5’-TGAAATTACTATATAATTAGCATAG-3’)和反向引物(GUS-R:5’-GACATCGGCTTCAAATGGCGTA-3’)对GUS基因进行检测。利用所设计的PCR特异引物，对挑取的10株转基因植株分别进行PCR检测。结果表明，其中8株能扩增出特异DNA片段(即GUS基因部分片段)，如图1所示。

实施例6启动子proAaPDR3所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位的确定

对PCR检测为阳性的青蒿植株，取其叶片进行GUS组织染色，结果如图2所示，其中，染色部位在青蒿的非分泌型腺毛中特异性表达，说明AaPDR3基因启动子proAaPDR3在转基因青蒿中能够引导外源基因在腺毛中特异表达。由此可见，本发明所克隆的proAaPDR3基因启动子可用于利用植物腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种和产业化中。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子是能调控基因在非分泌型腺毛中特异表达，其核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。

2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子是青蒿AaPDR3基因上游的启动子。

3.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子上的顺式作用元件包括：TATAbox、CAATbox、G-box、AE-box、ARE、GA-motif、G-box、MBS和Wbox。

4.如权利要求1所述的启动子的应用，其特征在于，在利用植物非分泌型腺毛组织表达和生产代谢产物的基因工程育种中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述代谢产物为青蒿素。

6.一种载体，其特征在于，所述载体连接有如权利要求1所述的启动子。

7.一种制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、根据青蒿基因组中AaPDR3基因启动子序列，利用巢式PCR克隆如权利要求1中所述的启动子的序列；

步骤二、将步骤一中获得的AaPDR3基因的所述启动子的序列连入pCAMBIA1391z载体，获得pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体；

步骤三、将步骤二中获得的pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体转化根癌农杆菌；

步骤四、将步骤三中获得的带有pCAMBIA1391Z-proAaPDR3载体的根癌农杆菌转化青蒿，并进行检测；

步骤五、确定所述启动子所引导的GUS报告基因在植株中的表达部位。

8.根据权利要求7所述的制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，所述启动子与青蒿素合成途径中的关键酶基因融合。

9.根据权利要求7所述的制备高产青蒿素的转基因青蒿的方法，其特征在于，所述巢式PCR的引物序列为：

第一轮PCR：PF1：5’-CTTTTCCAGCCAAATAAGTATGCCG-3’；

PR1：5’-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3’；

第二轮PCR：PF2：5’-TTTCTTTGGTGTTGTATCAATCTCTG-3’；

PR2：5’-TTCTTCCACTATTGCTCCCTAACCT-3’；

为构建pCAMBIA1391z-proAaPDR3载体，proAaPDR3两端分别引入了EcoRI的酶切位点和NcoI的酶切位点，使用的引物序列为：

EcoRI-Pro-PDR3-FP：5’-CGGAATTCGAACTGTTGAATTAGTATTTAC-3’；

Pro-PDR3-NcoI-RP：5’-CATGCCATGGTTTTAATGCTCAAAAAGCCC-3’。

10.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括如权利要求1所述的启动子。