CN105567662A - 一种嗜热β-葡萄糖苷酶突变体-M36N及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种嗜热β-葡萄糖苷酶突变体M36N及其编码基因和应用。本发明提供的突变体是通过改变酶蛋白的催化口袋loop特殊氨基酸残基的极性构建自嗜热真菌篮状菌Talaromyces？leycettanus？JCM12802的高温酸性β-葡萄糖苷酶BGL3A。在此改造条件下，突变体的对纤维二糖的亲和力比野生型(突变前)提高2.2倍，催化效率提高2.3倍，且最适反应pH值和温度不变。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和遗传工程领域，具体地，本发明涉及一种嗜热β-葡萄糖苷酶突变体M36N及其编码基因和应用。
背景技术
当今，以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。纤维素的降解是三类酶协同作用的结果，包括：内切纤维素酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)，这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子切割产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；外切纤维素酶(exo-1，4-β-D-glucanase或cellobiohydrolase，EC3.2.1.91，简称CBH)，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4糖苷键，每次降解产生一个纤维二糖分子；β-葡糖苷酶(β-D-glucosidase，EC3.2.1.21，简称BG)，这类酶作用于纤维二糖或纤维寡糖的非还原端，产生葡萄糖分子。其中BG通常不直接作用于纤维素，但是它可以降解对纤维素降解起抑制作用的纤维二糖，所以它是快速降解纤维素过程中所必须的酶类。因此对β-葡萄糖苷酶的深入研究受到人们越来越多的关注，特别是β-葡萄糖苷酶的分子改良研究。
本发明针对酶分子具体结构进行分析和改良，以达到提高催化效率的目的。本发明所提供的高温酸性β-葡萄糖苷酶突变体对于纤维二糖底物的催化效率得到了极大地提高。
发明内容
本发明的目的是提供了一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体M36N。
本发明的再一目的是提供编码上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体M36N的基因。
本发明的再一目的是提供包含上述突变体基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
本发明以来源于嗜热真菌篮状菌TalaromycesleycettanusJCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶为母本，采用分子生物学技术对酸性β-葡萄糖苷酶序列进行区域替换后表达。
根据本发明的高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体，是β-葡萄糖苷酶的催化活性通道loop区域替换后得到的突变体，即β-葡萄糖苷酶的36位氨基酸由甲硫氨酸“M”突变为天冬酰胺“N”
所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWNGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAGINAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQACAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGYIMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPPVAFSSWNGGKANVDVTGDHKSVVRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLAMGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIAKQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKELFDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWVVPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
TATGGCTTCGGCGGCTCTGGCTGGGACGCCGCTTATGGCAGAGCAAAGGCTGCGCTGAACAAGCTCAACCAGACCGAGAAGGTTGGTATCGTCACCGGTGTCAAGTGGAACGGCGGCCCTTGTGTTGGCAACACCTACAAGCCCAGTTCGATTGACTACCCTTCTCTGTGTTTGCAAGACTCTCCTCTCGGGGTGCGTTTTGCCAACCCTGTGACTGCCTTCCCGGCTGGTATCAACGCCGGCGCCACATGGGATAGATCTCTCATCAACGCCCGTGGTGCGGCCATGGGCGCTGAGGCCAAGGGCCTCGGTGTGAACGTCCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCTCTCGGCAAGAATCCCAATAGTGGCAGAATCTGGGAAGGGTTCTCGAATGATCCCTATCTCAGCGGTGTTGCGATGGAGGAAACCATCGCCGGAATGCAAGGATCTGGTGTGCAGGCCTGCGCCAAGCACTATATTGGTAACGAGCAAGAGCACAACCGTGAAACCATCAGCTCCAACATCGATGACCGCACTCTGCACGAGCTCTACGTCTGGCCGTTCATGAACGCCGTCAAGGCCAACGTCGCCTCCGTCATGTGCTCGTACAACGAGGTCAATGGTTCCTGGTCCTGTGAGAATGATGCTCTTCTCAACGGTCTGTTGAAGACTGAGCTCGGATTCCCCGGATACATCATGAGCGATTGGAACGCGCAGCACACCACGGTCAACAGCGCCAACTCGGGTCTCGATATGACCATGCCTGGCAGTGACTTCAACAACCCTCCTGGCAGCATCTACTGGGGGCCCAACCTCGAAGCCGCCGTCGCCAATGGCTCCGTTCCGCAGTCCCGTTTGGACGACATGGTCACTCGTATCCTTGCGTCTTGGTACTTGGTTGGCCAGGATGAGGGCTACCCACCGGTCGCCTTCAGCTCCTGGAATGGCGGCAAGGCCAATGTTGACGTGACGGGCGATCACAAGAGCGTCGTCAGAGCTGTGGCTCGTGACTCTATCGTTCTTCTGAAGAACGACAATAACGCTTTGCCTCTGCGCAAGCCCAAGAGCCTCGCGATCATCGGCCAGGATGCAACTGTCAACCCTGCCGGGCCCAACGCTTGCTCTGATCGCGGCTGCGACACCGGTACTCTCGCCATGGGTTGGGGCAGTGGTACCGCTCAGTTCCCATACATCGTCGGCCCTCTCGATGCTATCCAGTCTCAGGCTGCCGCTGATGGCACTAACATCACCACCAGCACGACCGATGATACCACCGCGGCAGCTTCTGCAGCCGCCTCCGCCGGAACCGCCATCGTCTTCATCAACTCCGACTCTGGTGAAGGTTACATCACCGTCGAGGGCAACGCTGGTGACCGCAACAACCTCGACCCCTGGCACAACGGCAACGAGCTCGTCCAGGCCGTTGCGGCTGTGAACAAGAATGTCATTGTCGTTGTCCACAGCGTCGGTCCCGTGATCTTGGAGGCTATCCTTGCACAGCCCAACGTCAAGGCCATTGTGTGGCCCGGTCTCCCTGGACAAGAGAGCGGCAATGCCCTGGTCGATGTTCTGTACGGCTCCACCTCCCCCAGCGGCAAGTTGCCCTATACCATTGCCAAGCAGTTCAGCGACTATGGCACCACCTGGACGACCTCCCTGGTCGATGACTTCACCGAGGGTCTGTTCATTGACTACCGCCACTTTGACGAGAACAACATTACTCCCAGATACGAGTTCGGATACGGCTTGTCTTACACCACCTTCAAATACTCCGACCTGGACGTCAACGTCCAGGCCCGCCCCGGCGCAGCCGAAGGCCCCATCGTCCCCGGCGGCGTCAAGGAACTTTTCGACACCGTCGGCACCGTCACCGTCACCGTCCAGAACAGCGGCAAGGTTGCCGGCGCGGAAGTTGCCCAGCTGTACATCGGCCTTCCCGACTCTGCCCCGTCGACCCCTCCCAAGCAGCTCAGAGGATTCCAGAAGTTGCACCTCGCGCCCGGCCAGAGAGAGGGCGCCACTTTCGAACTCACCCGCCGAGACATCAGCTACTGGGACGTTCAGCAGCAGAAGTGGGTTGTTCCTAGCGGTACGTTCAAGGTCTATGTTGGAAGCTCGAGCAGGGACATTAGGGAGCAGGAATCTTTCCGTATTTGA
本发明还是提供一种制备高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法：
1)采用over-lapPCR的方法扩增高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因序列；
2)将催化效率β-葡萄糖苷酶突变体序列片段克隆到表达载体pPIC9r上，重组载体命名pPIC9r-A-M36N；
3)将突变体重组载体转化毕赤酵母GS115，诱导表达，获得突变株，优选为GS115/A-M36N。
本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体，优选为pPIC9r-A-M36N。将本发明的β-葡萄糖苷酶突变体基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将β-葡萄糖苷酶基因插入到质粒pPIC9r上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pPIC9r-A-M36N。
本发明还提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/A-M36N。
本发明还提供了上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的应用，例如在果蔬汁工业中的应用。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在食品工业中应用新的β-葡萄糖苷酶。本发明的重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，最适温度为75℃，与野生型的一致，但是亲和力比野生型提高2.2倍，催化效率提高2.3倍。
附图说明
图1：高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适pH。
图2：高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体与野生型的最适温度。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、菌株及载体：表达宿主PichiapastorisGS115，表达质粒载体pPIC9r为本实验室保存。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermentas公司，连接酶购自Promaga公司，纤维二糖购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
(1)LB培养基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％NaCl，pH7.0
(2)YPD培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖
(3)MD固体培养基：2％葡萄糖，1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin
(4)MM固体培养基：1.5％琼脂糖，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇
(5)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(V/V)，1.34％YNB，0.00004％Biotin
(6)BMMY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇(V/V)
实施例1高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体编码基因A-M36N的克隆
本发明以来源于嗜热真菌篮状菌TalaromycesleycettanusJCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶(其氨基酸序列如SEQIDNO.3)为母本，采用分子生物学技术对酸性β-葡萄糖苷酶序列进行区域替换后表达。
SEQIDNO.3如下所示：
YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWMGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAGINAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQACAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGYIMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPPVAFSSWNGGKANVDVTGDHKSVVRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLAMGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNLDPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIAKQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKELFDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWVVPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
以TalaromycesleycettanusJCM12802基因组DNA为模板，在β-葡萄糖苷酶的催化活性通道loop区域处设计区域替换引物，采用over-lapPCR的方法扩增高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体编码基因A-M36N。
表1.高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体PG63X特异性引物
实施例2高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的制备。
将表达载体pPIC9r进行双酶切(EcoRI+NotI)，同时将编码高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的基因A-M36N双酶切(EcoRI+NotI)，切好的编码成熟高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的基因片段与表达载体pPIC9r连接，获得含有高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因A-M36N的重组质粒pPIC9r-A-M36N并转化毕赤酵母GS115，获得重组酵母菌株GS115/A-M36N。
取含有重组质粒的GS115菌株，接种于300mLBMGY培养基的1L三角瓶中，置于30℃，220rpm摇床培养48h；后将培养液3000g离心5min，弃上清，沉淀用100mL含有0.5％甲醇的BMMY培养基重悬，并再次置于30℃，220rpm条件下诱导培养。每隔12h补加0.5mL甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％，同时取上清用于酶活性检测。
重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，最适温度为75℃，与野生型的一致，但是亲和力比野生型提高2.2倍，催化效率提高2.3倍。
实施例3重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的活性分析
β-葡萄糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPG所生成的产物对硝基苯酚(pNP)的量。
反应步骤：125μl2mMpNPG底物与125μl缓冲液混匀，加入250μl适当稀释的酶液，于75℃反应10min，加入1.5mL1M的Na2CO3终止反应，使用分光光度计测定OD405值。
酶活单位的定义：1个β-葡萄糖苷酶活性单位(U)定义为在给定反应条件下，每分钟分解底物pNPG生成1μmol对硝基苯酚(pNP)所需的酶量。
实施例4重组β-葡萄糖苷酶高催化效率突变体的性质测定
1、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适pH测定方法如下:
将实施例2纯化的重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物多聚半乳糖醛酸用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中75℃下进行β-葡萄糖苷酶活力测定。结果(图1)表明，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适反应pH一致，且在pH3.0-6.0范围内有相同的作用趋势。符合不改变最适pH值提高催化效率的目的。
2、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度测定方法如下:
重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的最适温度的测定为在0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。酶反应最适温度测定结果(图2)表明，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的最适温度与野生型保持一致(75℃)。
3、重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体和野生型的动力学参数测定方法如下:
测定反应的一级反应时间。确定测定Km及Vmax的反应时间为5min。用不同浓度的纤维二糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.5)缓冲液体系中，75℃下测定酶活性，计算出其在75℃下的Km值。突变体及野生酶动力学参数如表2所示：
表2.突变体及野生型对纤维二糖酶催化反应动力学参数
结果显示，重组高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体最适pH为4.5，与野生型的一致，但是亲和力比野生型提高2.2倍，催化效率提高2.3倍。
Claims (9)
1.一种高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因，其特征在于，编码权利要求1所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体。
3.根据权利要求2所述的高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
4.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体。
5.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体pPIC9r-A-M36N。
6.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株。
7.包含权利要求2所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株GS115/A-M36N。
8.一种制备高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法，包括以下步骤：
1)用权利要求4所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组β-葡萄糖苷酶的表达；
3)回收并纯化所表达的高催化效率β-葡萄糖苷酶。
9.权利要求1所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突变体的应用。
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