CN105567610A - 一株耐高温园林废弃物分解菌st5及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐高温纤维素降解菌热普通链霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermovulgaris</i>)，保藏号为CGMCC？No.12137。本发明所述菌能在40-70℃高温内大量产酶，纤维素酶活性高，具有耐高温、高效降解纤维素特性，可将其作为微生物菌剂应用于高温堆肥体系中，适用于园林废弃物堆肥。
Description
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及从园林废弃物堆肥中筛选出的一株高效降解纤维素的耐热菌及其在园林废弃物高温堆肥中的应用。
背景技术
园林废弃物指园林植物自然凋落或人工修剪所产生的枯枝、落叶、草屑、残花、树木与灌木剪枝及其它植物残体等，主要成分为难降解的纤维素和半纤维素。近年来，我国园林废弃物每年8%-10%的速度递增，给城市绿色化进程带来了巨大阻力，目前我国处理园林废弃物的方式主要为焚烧和填满，这两种处理方式不仅浪费了可再生资源还造成了严重的环境污染。因此，如何合理有效处理园林废弃物，使其资源化利用是目前大家普遍关注的热点问题之一。
利用堆肥技术将园林废弃物腐熟制成有机肥料和育苗基质等，是其资源化利用的有效出路之一，然而园林废弃物中含有大量的木质素、纤维素等难降解的物质，导致堆肥效率低、周期长，大大限制了园林废弃物的再利用价值。因此需要向堆肥中加入特定的微生物，以加快园林废弃物腐熟过程。纤维素降解菌是一类能够产生胞外纤维素酶将纤维素大分子水解成葡萄糖的微生物，可以加速纤维素材料的降解速度。自然界中，产生纤维素的微生物种类很多，目前研究和应用得较多的是真菌，如木霉、青霉属、曲霉属、根霉属等。细菌和放线菌的研究和应用均较少。堆肥过程中纤维素降解主要发生在高温期，而真菌主要在中温条件下，酶活最大，随着堆肥过程温度的上升，真菌活菌数量及其产生的酶活性大大降低，这就限制了产纤维素酶霉菌的在堆肥中的利用。耐高温纤维素降解菌的筛选和应用是解决上述问题的有效措施。
很多纤维素降解菌都是针对玉米秸秆、稻草、麦秸等农业废弃物，很少有专门针对园林废弃物纤维素材料的降解菌的筛选和利用研究。中国专利“一株高温纤维素降解菌及其应用”（专利申请号：201410018582.6）公布了一株从园林废弃物高温期堆肥样品中分离的高温纤维素降解菌地芽孢杆菌，纤维素酶活性为7.8U/ml，该菌为细菌。关于从园林废弃物堆肥中分离耐高温纤维素降解放线菌的报道较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一株耐高温热普通链霉菌，该菌能在40-70℃高温内大量产酶，纤维素酶活性高，具有耐高温、高效降解纤维素特性，可将其作为微生物菌剂应用于高温堆肥体系中，适用于园林废弃物堆肥。
本发明提供的技术方案是：一株耐高温纤维素降解菌热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5，保藏编号为CGMCCNo.12137，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明所述热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5已于2016年2月18日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏（保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101），其保藏号为CGMCCNo.12137，经检测存活。
本发明热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5，是从北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温中期采集的样品中分离的菌种，将其编号为菌株ST5，该菌能够在40-70℃条件下产生纤维素酶并降解纤维素。菌株在高氏I号培养基上培养时，气生菌丝灰色，基内菌丝深褐色，不产生可溶性色素。显微镜下，菌体呈菌丝状，革兰氏染色呈阳性，孢子卵圆形，表面光滑，孢子丝螺旋状，柔曲。结合菌落菌体形态特征和基于细菌16SrDNA基因序列的系统发育分析，将其鉴定为热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)。
本发明所述菌株生产纤维素酶的方法，将该菌接种于发酵培养基（培养基成分：CMC-Na0.5%，蛋白胨1%，麸皮3%，NaCl2%，KH2PO40.1%g，MgSO4·7H2O0.02%，(NH4)2SO40.3%，pH7.0-7.6）中，于温度50℃、rpm150转摇床中培养3-4d，离心取上清液，测定纤维素酶活性。
本发明还提供一种适用于园林废弃物为主要堆肥材料的高温堆肥腐熟剂，该腐熟剂以液体发酵方式获得，菌液浓度为5×109CFU/mL，麸皮和玉米面2:1混合作为菌液吸附剂，按菌液与吸附剂1:1混合，制作成固态菌剂。
同时，本发明还提供所述热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5菌株在以园林废弃物为主要材料的堆肥腐熟中的应用，以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态腐熟剂按物料重量的5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥。
本发明具有以下有益效果：
本发明所述热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5是从园林废弃物堆肥中筛选出降解纤维素的菌种，可在40-70℃温度范围内产生较多的纤维素酶，酶活高达28.02U/mL，具有耐高温、高效降解纤维素特性。相对真菌在中温条件下酶活最大，而细菌产酶活力较低的问题，热普通链霉菌既能适应高温环境，又能产生较高的纤维素酶，对纤维素材料具有很好的降解能力，所以热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)更能适应堆肥过程复杂环境。
将本发明获得的耐高温纤维素降解菌制成固态腐熟剂添加到以园林废弃物为主要材料的堆肥中，与不接种的对照相比，能够提高堆肥进入高温期的时间、延长高温期持续时间已经高温期温度，降低堆肥C/N比，从而加快堆肥腐熟进程。可将其作为微生物菌剂应用于高温堆肥体系中，适用于园林废弃物堆肥。
本发明是针对园林废弃物堆肥材料筛选的菌种和制备的腐熟剂，可以为园林废弃物的资源化利用提供一条合理、有效的途径，实现降低环境污染、资源循环利用的目的。
附图说明
图1热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)分离纯化图片
图2本发明热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)的16SrDNA基因序列。
图3通过热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)和相近菌株16SrDNA的基因序列进行同源性Blast比对时构建的系统发育树图片。
图4堆肥过程中堆体温度变化。
图5堆肥过程中碳氮比（C/N比）变化。
具体实施方式
下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。
实施例1耐高温纤维素降解菌株筛选
从北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温初期、高温中期、高温后期材料、北京延庆平原造林地区园林绿化废弃物堆积物中采集样品；称取上述新鲜样品10g放于装有10粒玻璃珠、并盛有90ml无菌水的锥形瓶中，置于30℃150rpm的摇床中摇30min，使样品充分散开，50℃下静置富集培养24h。用无菌吸管吸取1ml上清液加入到含有9ml无菌水的试管中，此即为10-1样品稀释液，再从10-1样品中取1ml加入到9ml无菌水中，此即为10-2样品稀释液，以此类推，得到10-3、10-4、10-5、10-6样品稀释液，然后用移液器吸取100μl的10-3、10-4、10-5、10-6样品稀释液于纤维素刚果红培养基上（培养基组成为：K2HPO40.5g，微晶纤维素1.88g，MgSO40.25g，明胶2.0g，刚果红0.5g，琼脂16g，蒸馏水1000ml，pH7.0），用涂布器把稀释液均匀涂布于整个平板，并置于50℃培养箱中培养3天。挑选在纤维素刚果红平板上有明显透明圈的菌落，进行编号，再进行反复划线分离纯化获得纯种菌株，将分离后的菌种接到斜面上，4℃保存进行后续实验。
将保藏于4℃的纯菌株转接到羧甲基纤维素培养基（培养基成分：CMC-Na15.0g，NH4NO31.0g，酵母膏1.0g，MgSO4·7H2O0.5g，KH2PO41.0g，蒸馏水1000ml，琼脂16g，pH7.0）平板上，50℃下活化培养，然后挑起平板上的单菌落转接到纤维素刚果红平板上，置于50℃培养箱中培养，72h后测量菌落直径d和透明圈直径D，计算其比值H，即H=D/d，H值越大，值较大表示该菌株分解纤维素的能力越强。按照纤维素刚果红鉴定培养基上形成透明圈的大小初步确定其产纤维素酶活性。
通过上述操作，获得多株纤维素降解菌，其中在北京昌平区某苹果园园林废弃物堆肥高温中期采集的样品中分离的菌种，命名为ST5的，于2016年2月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC（单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏编号为CGMCCNo.12137。对ST5菌株进行光学显微观察和革兰氏染色鉴定，该菌在高氏I号培养基上培养时，气生菌丝灰色，基内菌丝深褐色，不产生可溶性色素。显微镜下，菌体呈菌丝状，革兰氏染色呈阳性，孢子卵圆形，表面光滑，孢子丝螺旋状，柔曲，见图1。
实施例2ST5菌株分子生物学鉴定
对筛选得到的热普通链霉菌ST5进行分子鉴定，按照以下步骤进行：挑取筛选菌株的单菌落接种于液体高氏I号培养基中，30℃、120r/min摇床振荡培养，在第2d取出培养液，5000r/min离心1min取上清液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司提供），提取菌落DNA；通用引物27F和1492R对提取的细菌DNA进行PCR扩增；27F序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R序列为5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；将PCR产物进行序列测序，测序结果在NCBI数据库中BLAST进行序列分析，并进行同源性比较。
波茨坦短芽孢杆菌的16SrDNA基因序列（请参见图2）长度为1418bp，将基因序列提交到Genbank上，进行同源性比较，然后采用MEGA6.0软件绘制系统发育树，见图3，从而确定菌株的种属。结果表明该序列与热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)的16SrDNA基因序列相似度高达100%，同时结合菌落形态特征、生理生化特征、菌体显微特征确定ST5菌株为热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)。
实施例3热普通链霉菌ST5生长测定
将热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5接种到CMC液体培养基中（CMC-Na15.0g，NH4NO31.0g，酵母膏1.0g，MgSO40.5g，KH2PO41.0g，蒸馏水1000mL），每隔2h取培养液，联续取样到48h，测定各时期的OD600值，以培养时间为横坐标，各取样点的OD600值为纵坐标，绘制该菌的生长曲线，即该菌的生长测定。从测定结果可以看出0-8h为延迟期、9~16h为对数生长期、16~24h为稳定期、>26h为衰亡期。对数期的菌株的生长迅速、活力强，因此以后的发酵产酶实验中，应选用12小时的发酵液为种子液进行接种。
实施例4热普通链霉菌ST5产纤维素酶活力测定
将对数期热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)ST5按1%的接种量接种到发酵培养基（培养基成分：CMC-Na0.5%，蛋白胨1%，麸皮3%，NaCl2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.02%，(NH4)2SO40.3%），pH7.0-7.6）中，于温度50℃、rpm150转摇床中培养3-4d，将培养物8000r/min离心5min，取上清即为粗酶液，用DNS法测定纤维素酶活。取1mL上清液于试管中（空白用1ml蒸馏水代替），置于50℃水浴锅中，预热2min，然后加入4ml已经在50℃预热的底物溶液，计时反应5min后取出，加入4mLDNS显色液，摇匀后放置于沸水浴中加热5min，取出后立即放入冷水浴中冷却，用蒸馏水定容至20ml，混匀后在540nm波长处测定吸光度。对照标准曲线后换算该菌株的产酶活力。酶活力单位按照国际单位规定定义，即在1mL体系中，在1min内催化纤维素水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。经测定ST5菌株的纤维素酶活性为28.02U/mL。
实施例5固态腐熟剂的制备
（1）菌株活化：取本发明微生物4℃保存斜面接种至高氏I号固体平板培养基，在50℃的恒箱中培养12h实现菌株活化。
（2）种子液制备：将步骤（1）中经斜面活化的菌种平板1个接种至1L无菌高氏I号液体培养基中，50℃150rpm摇床条件下培养12h后得种子液。
（3）发酵种子液的制备：上述种子液按6-10%（v/v）的接种量接种至已灭菌的发酵罐中，进行扩大发酵培养。在温度50℃、振荡频率120rpm的条件下，培养48h后得发酵种子液。
（4）固态腐熟剂的制备：将麦麸与玉米面按照2:1质量比混合后作为菌液吸附剂，与步骤（3）中制得的菌液，按菌液与吸附剂体积质量比1:1混合，制作成固态腐熟剂，堆置1周后，可用于高温堆肥。
实施例6腐熟剂的堆肥效果试验
以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态腐熟剂按物料重量的5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥，以不加腐熟剂的材料为对照，当堆体温度上升到50℃时，开始翻堆，高温期每2天翻堆一次，降温期每周翻堆一次，当温度下降到40℃后不在翻堆。堆肥过程中，通过测定堆体每天的温度变化、堆肥材料碳氮（C/N）比变化，考察添加腐熟剂对园林废弃物堆肥腐熟进度的影响。
堆肥过程中堆体温度变化如图4所示。由图4可知，接种腐熟剂的堆肥处理在堆肥第3d温度上升到50℃以上，而且50℃以上的高温期持续24d，之后温度开始下降。而未接种的堆肥处理温度在堆肥第4d才上升到50℃以上，比接种的处理推迟1d到达50℃以上高温期，而且50℃以上高温期持续时间是17d，比接种的处理少了7d，接种处理的堆体高温期的最高温度也高于未接种处理，说明接种腐熟剂后能够加快堆肥进入高温期时间，以及高温期持续时间。堆肥过程中C/N变化如图5所示。由图5可知，随着堆肥的进行，接种腐熟剂和不接种的处理C/N比均持续降低，而接种的处理下降程度高于未接种处理，由此说明，添加本菌制得的腐熟剂可以加快堆肥进程，提高园林废弃物堆肥的腐熟效果。
Claims (5)
1.一株耐高温纤维素降解菌热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)，保藏号为CGMCCNo.12137。
2.一种适用于园林废弃物为主要堆肥材料的高温堆肥腐熟剂，其特征在于：该腐熟剂以液体发酵方式获得，其原料为菌液及吸附剂，按菌液与吸附剂按比例混合，制作成固态菌剂，其中菌液为权利要求1所述的热普通链霉菌(Streptomycesthermovulgaris)菌液，吸附剂为麸皮和玉米面。
3.如权利要求2所述的高温堆肥腐熟剂，其特征在于：所述菌液浓度为5×109CFU/mL，麸皮和玉米面2:1混合作为菌液吸附剂，按菌液与吸附剂1:1混合，制作成固态菌剂。
4.如权利要求2或3所述高温堆肥腐熟剂在堆肥腐熟中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：以园林废弃物为主要堆肥原料，添加动物粪便和水，使混合物料碳氮比为25-40:1、含水率50-60%，固态腐熟剂按物料重量的2.5%-5%比例接种到堆肥物料中，进行高温堆肥。
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