CN105556311A

CN105556311A - 双室双向反向流装置

Info

Publication number: CN105556311A
Application number: CN201480027757.8A
Authority: CN
Inventors: 比容·库马尔·西尔; 胡伟平; 陈韵莹; 彭玉珍; 赵丽心; 苏迈雅; 麦耀文
Original assignee: MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd
Current assignee: MP Biomedicals Asia Pacific Pte Ltd
Priority date: 2013-04-12
Filing date: 2014-02-20
Publication date: 2016-05-04
Also published as: SG11201508425TA; WO2014168580A1; SG2013028089A

Abstract

本发明总体上涉及用于检测样品中的分析物的固相色谱测定装置、测试套件和方法。更具体地，本发明提供了具有双诊断室以检测两种或更多种分析物的双向色谱测定装置。测定装置或测试套件包括：(a)色谱元件，其包括中央样品接收区和多个试剂释放端和反应区；(b)邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。

Description

双室双向反向流装置

技术领域

本发明总体上涉及用于检测样品中的分析物的固相色谱测定装置、测试套件和方法。更具体地，本发明提供了具有双诊断室以检测两种或更多种分析物的双向色谱测定装置。

背景技术

本说明书中提供的参考文献的书目详情在本说明书的最后列出。

本说明书中对任何现有技术的参考不是，也不应被认为是承认或以任何形式暗示该现有技术构成任何国家的公知常识的一部分。

用作快速测定装置的色谱测定系统是用于检测生物样品中给定分析物的存在的多种方法之一。这些系统的一个优点是它们不需要专门的设备或经培训人员。另一个优点是使用这种类型的测定可以检测各种各样的分析物。因此，用于检测生物材料中分析物的存在的快速色谱技术的使用取得了进展，超越了临床实验室的范围，原因是发现采用这些技术的测定装置在“及时现场护理(pointofcare)”情况下(例如，在医生办公室或家庭环境中)尤其有价值。

典型的快速色谱测试利用“夹心(sandwich)”测定或“竞争”测定之一来检测期望分析物的存在。在夹心测定中，使分析物结合或“夹”在未标记的第一结合配偶体与标记的第二结合配偶体之间。例如，分析物(如HCV抗体)，可以被固定化在膜上的第一结合配偶体(在这种情况下为HCV抗原)捕获。然后，抗体-抗原复合物可以通过具有标记的第二结合配偶体(例如，标记有有色颗粒的另一种HCV抗原/抗人抗体)来检测。

相比之下，在竞争测定中，样品中的分析物与标记的分析物或标记的分析物类似物竞争固定在固体支持物上的结合配偶体。样品中较大浓度的分析物在测定中产生较低的信号，原因是标记的分析物因竞争而远离固体支持物上的结合配偶体(即，在竞争测定期间产生的信号随样品中分析物的浓度增加而降低)。因此，夹心测定提供了具有高灵敏度的定性评估，而竞争测定提供了分析物浓度的定量测量。

无论使用何种分析物检测方法，目前可用的快速测定装置常常归类为以下四种基本方式之一：“试纸(dipstick)”方式、“流经(flowthrough)”方式、“横向流(lateralflow)”方式和反向流(reverseflow)方式。

“试纸”方式(如在美国专利No.5,275,785；5,504,013；5,602,040；5,622,871和5,656,503中举例说明的)通常由具有样品接收端的多孔材料条带、试剂区和反应区组成。样品依靠毛细作用从样品接收端开始沿着测定装置移动到试剂区中。待检测分析物与引入试剂区中的试剂(优选标记的结合配偶体)结合，形成复合物。通常，这些结合对是抗体:抗原复合物或受体:配体复合物，所述标记具有引入所述复合物试剂部分中的标记如胶体金属。然后，标记的结合配偶体-抗原复合物迁移到反应区中，在其中复合物被牢牢固定化在反应区中的另一种特异性结合配偶体捕获。因此，标记的复合物在反应区内的保留导致了可见读出。

“流经”方式(如在美国专利No.4,020,046中举例说明的)也利用多孔固相材料。这种测定方式通常具有包含位于吸收层之上的固定化结合配偶体的多孔膜。一旦将样品添加到膜表面上，目标分析物就与固定化结合配偶体反应形成分析物-结合配偶体复合物。所述复合物通过添加具有标记(如酶、染料颗粒或胶体金属)的第二结合配偶体而可视化。吸收层充当过量测定试剂的槽，并且可以用于调节反应物的流量以实现分析物与结合配偶体之间的最佳反应。在这种方式中，可以通过以下方法来提高读出的灵敏度：用额外的溶液“洗涤”膜以减少标记物的任何非特异性结合或移除可干扰测定读出的任何其他材料。

“横向流”方式(参见例如美国专利No.5,075,078；5,096,837；5,354,692和5,229,073)利用多孔固相材料并且具有与试纸测定方式相似的线性结构：样品施加位点、试剂释放位点和反应位点。然而，横流方式使样品横向流过多孔固相材料，而不是使样品垂直地以毛细作用沿“试纸”向上。将样品直接施加到施加位点，目标分析物横向流至试剂释放位点，并与标记的结合配偶体形成复合物。然后，该分析物:结合配偶体复合物迁移到反应位点中，在这里其被固定化第二结合配偶体捕获并进行检测。

“反向流”方式(例如，美国专利6,316,205)利用分析物的两向流动，其使第一结合配偶体从装置的一端流动并使第二结合配偶体从装置的另一端流动，并且使得该方式因背景更清晰而更灵敏。

常规的快速测定可在各级医疗保健系统(“及时现场护理测试”)中用于确定样品中给定分析物的存在而不需要专门的设备或人员，并且在短时间段内产生结果。例如，用于传染性疾病如AIDS的简单快速的免疫测定装置已经使用了将近十年。然而，现有的快速测试并非没有其缺点。最重要地，由于目前可用方式存在各种限制，这样的装置的灵敏度经常受到质疑(Giles等，JournalofMedicalVirology，53104-109，1999)。此外，如以下举例说明的，该测定方式设计中固有地存在使用该测定装置的几个实用限制。

最初设计用于尿液分析的试纸方式使用相对大体积的样品用于分析。这对于使用这样的装置来分析血清或血液样品是相当大的限制。相比之下，基于流经方式的测定装置显著减少了样品的体积需求。

然而，在真正的自足式装置中不能采用流经方式。在基于流经方式的装置中，检测试剂(即，标记的结合配偶体)不直接并入该装置的多孔固体基质中并因此必须单独提供。这导致了关于试剂运输和稳定性的另外的限制。

横向流方式克服了试纸方式的样品体积问题和流经方式的检测试剂问题两个问题。然而，横向流方式不允许洗涤步骤，与流经方式所固有的一样。未结合的标记或者由样品溶液引入的任何干扰物质(如颗粒或有色材料)可潜在地干扰测定装置的读出。因此，横向流方式在测定过程期间常常采用过滤(例如，使用专用过滤器)，例如，在检测分析物之前使用经特殊涂覆的过滤器以除去潜在的干扰物质。此外，由于着色剂从吸收垫中回流至色谱区和/或反应区中，所以横向流方式中测试线的强度不稳定，其可能在30分钟之后发生变化。

反向流方式为最终用户提供了更多的便利，因为它仅需要小体积的样品、更高的滴定终点、更清晰的背景和稳定的测试线。然而，这种方式由于免疫相互作用而不能用于在同一色谱区域中检测抗原和抗体二者，并且无法满足物质如HIV、HCV和HBV感染在血清转换尚未形成时所需的早期检测的需求。

需要开发改进的测定装置。

发明内容

本发明提供了测定装置、测试套件和方法，用于检测样品中分析物或特征分子的存在，特别是多种分析物或特征分子的存在。与常规测定相比，通过控制测定装置中所使用的多种试剂的释放，提高了测定的灵敏度而不损害测定的特异性。通过在单一平台中同时检测抗原和抗体二者提高灵敏度而不损害对多种病症的特异性，在快速色谱测定领域中是非常期望的改进。此外，该测定可以由未经培训的人员在短时间段内进行，并且不需要专门的设备。该测定装置或测试套件可称为“双室多侧反向流装置”。在一个特别的实施方案中，该装置是“双室双向反向流装置”。

通过使用在其中检测指示或诊断特定病症的结合配偶体的单独的室避免了可影响常规测定的不利免疫相互作用，并因此，本发明的测定装置提供了这样的方法，其实现了测定反应的最佳控制而无需专门开发的特异性结合配偶体、大体积样品或者试剂或流体通道的复杂排列。本发明还提供了特别适合于使用受控系列反应的快速色谱测定的测定装置。本发明的测定装置施用小体积的中心添加的样品，并且通过与特征分子免疫相互作用实现了比常规横向流测定高得多的滴定终点。此外，本发明的测定装置提供了针对多种情况更高的测定灵敏度且不损害特异性。

因此，本发明提供了这样的测定装置或测试套件，其用于检测对特定情况如多种病症和/或单一病症的多种生物标志物(如心脏标志物)具有特异性的分析物。

本发明的一个方面提供了测定装置或测试套件，其包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括中央样品接收区及多个试剂释放端和反应区；

(b)邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。

本发明的另一个方面涉及测定装置或测试套件，其包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括中央样品接收端、两个试剂释放端、和双反应室；

(b)邻近所述反应区的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。

本发明的又一个方面涉及测定装置或测试套件，其包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括位于中央的样品接收区、在装置两端的样品接收区、和两个反应室或反应窗；

(b)位于所述反应室之间内的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件，其中所述分隔件包括不透液屏障；并且其中所述样品接收端包含可释放的第一结合配偶体，反应室包含固定化第二结合配偶体，并且所述试剂释放区包含标记的可释放的第三结合配偶体。

本发明的再一个方面提供了测定装置或测试套件，其包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括样品接收区及多个试剂释放端和反应区；

(b)位于所述反应室之间内的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件，其中所述分隔件包括不透液屏障；并且其中所述反应区包含固定化第一结合配偶体，并且所述试剂释放端包含可释放的第二结合配偶体和标记的第三结合配偶体。

本发明的又一个方面涉及设置成检测样品中的多种分析物的测定装置或测试套件，其包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括具有可释放的第一结合配偶体的中央样品接收区、具有固定化的一种或更多种第二结合配偶体的多个反应区和具有可释放的标记的第三或更多结合配偶体的多个试剂释放端；

(b)吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的分隔件。

本发明的再一个方面考虑了以下元件在制造用于检测样品中多个特征分子的检测装置或测试套件中的用途：

(b)邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件，其中所述分隔件包括不透液屏障。

本发明的另一个方面提供用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(a)将样品添加到本文所述的测定装置或测试套件的色谱元件的中央样品接收区中；

(b)使所述样品以两个方向从所述中央样品接收区流经色谱元件两侧的反应室的至少一部分；

(c)使所述样品中的分析物与固定化在所述反应室中的第一结合配偶体反应以形成第一复合物；

(d)将水溶液添加到色谱元件的试剂释放端中，并使引入所述试剂释放端中的可释放的第二结合配偶体溶解，其中所述可释放的第二结合配偶体包含标记；

(e)从所述测定装置中移除所述分隔件以使吸收垫与色谱元件的一部分接触；

(f)使所述可释放的第二结合配偶体从释放端流经所述色谱元件的反应室的至少一部分；

(g)在可释放的第二结合配偶体与底物之间形成第二复合物，所述底物选自分析物、第一结合配偶体和第一复合物；和

(h)通过显色来检测所述第二复合物。

在一个替代实施方案中，本发明涉及用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(b)使所述样品从所述中央样品接收区以两个相反的方向流经所述色谱元件的所述反应室的至少一部分；

(c)使所述第一复合物与所述反应室内的固定化的试剂反应以形成第一免疫复合物；

(d)向所述色谱元件的试剂释放端添加水溶液并使引入所述试剂释放端中的第二结合配偶体溶解；

(e)从所述测定装置中移除分隔件以使所述吸收垫与所述色谱元件的一部分接触，从而使得吸收垫能够吸收来自样品垫的流体；

(f)使所述可释放的第二结合配偶体以相反方向流经所述反应室的至少一部分；

(g)在所述可释放的第二结合配偶体与底物之间形成第二复合物，所述底物选自所述分析物、所述可释放的第一结合配偶体和所述第一复合物；和

(h)通过显色来检测所述第二复合物。

本发明的再一个实施方案考虑了用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(a)将所述样品添加到本文所述的测定装置或测试套件的色谱元件的中央样品接收区中；

(b)使所述样品从所述中央样品接收区以两个相反的方向流经所述色谱元件的反应室的至少一部分；

(c)使所述样品中的分析物与固定化在所述反应区中的第一结合配偶体反应以形成第一复合物；

(d)向所述色谱元件的试剂释放端添加水溶液并使引入所述试剂释放端中的可释放的第二结合配偶体和标记的可释放的第三结合配偶体溶解；

(e)从所述测定装置中移除分隔件以使吸收垫与色谱元件的一部分接触；

(f)使所述可释放的第二结合配偶体与所述可释放的第三结合配偶体结合以形成第二复合物；

(g)使所述第二复合物从所述试剂释放端流经所述色谱元件的反应室的至少一部分；

(h)在所述第一复合物与所述第二复合物之间形成第三复合物；和

(i)通过显色来检测所述第三复合物。

本发明另外的特征通过下面的描述将变得显而易见，或者可通过本发明的实践来获知。

美国专利No.6,316,205的内容通过引用整体并入本文。

附图说明

图1为本发明多侧反向流装置的全视图的示意图。

图2为所述装置的下壳体的示意图，示出了容纳色谱元件的不同支持元件。

图3为描绘下壳体的内部视图和色谱元件不同部分的定位的示意图。

图4为多重扫描验血(MULTISCANBloodTest)的示意图。

图5为ToRCH组(panel)的同时检测的示意图。

图6为使用双室双向反向流技术的心脏标志物的示意图。

发明详述

贯穿本说明书和所附权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”将被理解为意味着包括所述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。

除非另有明确指示，否则如本说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数方面。因此，例如，提及“可释放的结合配偶体”包括两个或更多个这种结合配偶体的组合；提及“分析物”包括分析物的混合物；提到“本发明”包括发明的单个或多个方面等。

除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然在本发明测试实践中可使用与本文所述方法和材料相似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述了优选的材料和方法。

本发明的一个方面提供了多室反向流测定装置或套件，其包括：(a)色谱元件，所述色谱元件包括中央样品接收区及多个试剂释放端和反应区；(b)邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。

在一个特定的实施方案中，本发明的测定装置包括：(a)色谱元件，所述色谱元件包括中央样品接收区、两个试剂释放端和两个反应区；(b)通常邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。该特定的实施方案描述了双向反向流装置。

所述测定装置或测试套件被设置成同时检测样品中的多个分析物或特征分子。

因此，本发明的另一个方面涉及设置成检测样品中多个分析物的测定装置或测试套件，其包括：

(b)吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件的一部分与所述吸收垫之间的分隔件。

在一个实施方案中，所述分隔件通常包括不透液屏障。在操作中，将样品施加到色谱元件的中央样品接收端，并使其通过毛细作用以相反方向朝向试剂释放端横向迁移。在样品覆盖反应室并且样品中的分析物与固定化在各反应室中的一种或更多种结合配偶体相互作用之后，向色谱元件的试剂释放端添加水溶液。将分隔件从该装置中拉出，使吸收垫与该部分的色谱元件相接触。在分隔件移除之前、与分隔件移除同时或在分隔件移除之后立即添加水溶液。分隔件可以通过将分隔件从测定装置中完全拉出来移除，或者可以将其部分地移除使得色谱元件的样品接收区与吸收垫相接触。嵌在试剂释放区中的一种或更多种试剂(例如，标记有可检测标记物如天然有色颗粒的第二结合配偶体)通过添加水溶液而释放出来，并且通过吸收垫的拉力向反应室移动。

因此，根据该实施方案的装置使得分析物能够与第一结合配偶体形成复合物优先于标记的第二结合配偶体与被束缚的分析物复合物的反应之。此外，添加到色谱元件试剂释放端中的水溶液不仅充当试剂释放溶剂，而且充当清洗液。因此，在各反应室中都观察到具有清晰背景的目视读出。

本发明测定装置的另一个实施方案包括：(a)色谱元件，所述色谱元件包括具有可释放的第一结合配偶体的中央样品接收区、具有固定化的一种或更多种第二结合配偶体的多个反应区和具有可释放的标记的第三或更多结合配偶体的多个试剂释放端；(b)吸收垫；和(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的分隔件。在一个特定的实施方案中，存在两个反应室和两个试剂释放端。当需要捕获测定时，该实施方案的测定装置是特别有用的。使用该实施方案的测定装置，分析物(例如，抗体或毒物)与在色谱元件的样品接收端处浸渍的至少一种第一结合配偶体(例如，抗原或重组蛋白或其他结合配偶体)反应。然后，分析物-结合配偶体复合物迁移到反应区，在其中该第一复合物被固定化的第二结合配偶体(“捕获剂”，如抗人IgG或抗人IgM抗体)捕获而形成第二复合物。当添加水溶液并移除分隔件时，一种或更多种标记有可检测标记如天然有色颗粒的第三结合配偶体从色谱元件的试剂释放端释放出来，并横向地流到反应区。可检测标记包括可以通过视觉检查检测的部分(例如，包含或产生有色元件的部分)，或者可以借助于人工检测系统(包括例如光学系统、光谱系统、射线照相系统等)检测的部分。为了便于操作，特别考虑了可视觉检测的标记物。

第三结合配偶体可以与第二结合配偶体相互作用形成第三复合物，所述第三复合物可以通过引入第三结合配偶体中的标记来检测。在第一结合配偶体可以是单一抗原或抗原的混合物时，一般试剂可以用作标记的第三结合配偶体，例如，与所有经GST构建的重组抗原反应的抗GST抗体。

同样地，在本发明的另一个实施方案中，考虑了使用在迁移穿过反应区之前在色谱元件的试剂释放端相互作用的两种或更多种试剂。在该实施方案中，测定装置包括：(a)色谱元件，其包括样品接收端、具有固定化第一结合配偶体的反应区和具有两种可释放结合配偶体(其中至少一种携带标记)的试剂释放端；(b)吸收垫；和(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的分隔件。使用该实施方案的测定装置，在反应区在分析物与结合到反应区的第一结合配偶体之间形成第一复合物。在添加水溶液后，在试剂释放端在第二结合配偶体与第三结合配偶体之间发生第二反应，形成携带有标记的第二复合物。当分析物-结合配偶体第一复合物与第二结合配偶体-第三结合配偶体第二复合物相互作用时，在反应区中发生第三反应，形成可被检测的标记的第三复合物。如在上述实施方案中，第二(嵌入)结合配偶体可以是单一抗原或抗原的混合物，同时充当检测器的第三(标记的)结合配偶体也可以是一般试剂，如抗GST抗体。

本发明的这些和其他实施方案解决了本发明中所使用试剂和反应发生顺序的变化。本发明的再一个方面涉及所述测定装置的分隔件组件的组成。分隔件可以由提供“时间控制(time-controlled)”屏障的材料(如半渗透膜或随时间溶解的材料)构成，而不是使用在测定期间必须手动移除的屏障。当根据该实施方案的装置投入使用时，在添加到样品接收端的样品横向迁移并覆盖反应区时，分隔件被溶解或渗透，并且吸收垫准备好工作。然后可以添加水溶液并完成测定。

本发明的另一些方面包括用于检测样品中的分析物的方法和用于进行所述测定的测试套件。本发明的另一些变换也是可能的，例如，使用单一样品和单一装置同时检测多个分析物。

关于测试套件，本文还考虑了多组件套件，其包括：色谱元件，所述色谱元件具有中央样品接收区及多个试剂释放端和反应区；吸收垫；和能够位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。该测试套件还可以与组装和使用说明书包装在一起出售。

无论采用哪个实施方案，本发明的测定装置不需要如同在常规横向流装置中所采用的，包括任何额外的使用具有特殊涂层的过滤器的过滤技术。所述测定装置是通用的并且可以用于评估多种生物流体，所述生物流体包括但不限于唾液、血清、血浆、全血、粘液、痰液、尿液、粪便物、组织液、精液和皮脂样品。其还可以用于测试环境样品、工业样品和水样品，例如，以测试污染物、毒物和微生物。这种通用性通过控制反应发生的顺序和通过对反应物进行额外的“洗涤”来实现，所述洗涤通过水溶液通过色谱元件并进入吸收垫中来提供。

本发明另外的益处在于，所述测定装置的设计提供了通用性足以适应不同产品线的需要和要求的一般平台。通过对整体设计最小限度的修改，例如，替换固定化在反应区内的结合配偶体，但是为了检测目的仍使用“一般”标记的结合配偶体，可以将特异性检测特定分析物的测定装置容易地调整为检测不同的分析物。不需要开发用于检测每种期望分析物的另外的专门反应试剂。这不仅减少了设计和生产新测定装置所需要的时间，而且显著降低了产品开发的成本。此外，由于所述测定装置的主要组件相同，所以可保持制造参数而不进行大的改变。因此，用于基于本发明的测定装置制造一系列产品的生产设施利用相同的设备和最少的原材料清单来制造所有产品，从而显著降低了操作成本。

此外，所述测定装置或测试套件能够参与现有的病理学架构以向临床医生或对象提供诊断信息和及时现场护理。

术语“测定装置”在本文中用于描述用于检测和/或测量一种或更多种目标分析物的多组件色谱设备。替代地，也可以使用术语如套件、仪器、配置。测定装置、套件、仪器和/或配置也可与组装和/或使用说明书包装在一起出售。

术语“色谱元件”是指可以将样品施加在其上并允许样品在测定过程期间迁移的固体基质。

术语“样品接收端”是指在测定期间施用样品的色谱元件的一部分。也可使用表述“样品接收区”或“样品接收区域”。样品接收端、样品接收区或样品接收区域是指单个或多个样品接收端、样品接收区或样品接收区域。

术语“试剂释放端”是指在样品接收端远端的色谱元件的一部分，并且在其中引入有一种或更多种可释放测定试剂。也可以使用表述“试剂释放区”或“试剂释放区域”。试剂释放端、试剂释放区或试剂释放区域是指单个或多个试剂释放端、试剂释放区或试剂释放区域。

术语“反应区”是指色谱元件中样品接收端与试剂释放端之间的区域，在其中已固定有对一种或更多种分析物(或对包含分析物的复合物)具有特异性的一种或更多种结合配偶体。

术语“吸收垫”是指通常位于测定装置底部的吸收材料或吸湿性材料。

术语“分隔件”是指位于色谱元件与吸收垫之间的屏障结构。

如本文中所使用的术语“壳体”或“外壳”是指测定装置的任选组件，其包围色谱元件、吸收垫和分隔件的至少一部分，并提供一些结构支持。

术语“样品”是指取样的任何期望材料，通常是生物、环境、工业或合成来源的。

术语“分析物”是指样品中待检测或待测量的化合物或组合物。分析物的实例包括抗原、抗体、污染物、毒物、变应原、微生物和病毒。

术语“结合配偶体”在本文中用于描述发生化学或物理相互作用以形成复合物的结合对的成员。“固定化”结合配偶体是指永久地或半永久地吸附、嵌入或附着至固体基底或基质(例如，色谱元件的反应区)。“可释放的”结合配偶体是指不永久固定化或附着在固体基底或基质上，并且能够迁移或移动(例如，通过扩散)的分子。

如本文中所使用的术语“标记”是指能够产生可检测信号的任何物质。适用于本发明的多种标记物包括但不限于：产色化合物(chromatogen)、荧光化合物或化学发光化合物、催化剂、酶、酶底物、染料、胶态金属和胶态非金属颗粒、和有机聚合物胶乳颗粒。对本发明特别有用的是可视觉检测的有色颗粒，如胶态金属和胶态非金属和染料颗粒。

术语“吸湿的”是指吸收性材料。

本发明涉及用于检测指示特定情况如病症或单一平台中的污染的一种或更多种分析物的测定装置。该测定装置以允许测定试剂受控释放和相互作用的方式构建。此外，本发明包括用于检测分析物的方法和采用该测定装置的测试套件。术语“对象”包括人对象和非人对象。因此，该测定装置或测试套件可应用于人类医学和兽医或畜牧业。非人对象包括绵羊、牛、马、山羊、猪、家禽、非人灵长类动物和圈养的野生动物。样品也可以是环境样品、废物样品、工业样品或者化学样品或合成样品。

如普通技术人员通过阅读本说明书将理解的，分析物可以是在化学、物理、酶或光学分析中期望检测和/或测量的任何特定物质或组分。目标分析物包括例如：抗原(如微生物、病毒或原生动物有机体的特异性抗原)；抗体，特别是响应于感染、过敏反应或疫苗所诱导的那些抗体；激素、蛋白质和其他生理物质(例如，人绒毛膜促性腺激素、雌激素、孕酮、睾丸素、皮质类固醇、人类生长因子、血红蛋白和胆甾醇)；核酸；各种酶；治疗性化合物和违禁药物；污染物和环境污染物，包括毒物；或者多种天然或合成物质，包括过敏原。如本领域技术人员所理解的，可以通过本发明测定装置和方法检测的天然物质或合成物质的数量是广泛的，并且包括但不限于以下组的化合物：ACE抑制剂、肾上腺素能药物和抗肾上腺素能药物、醇遏制剂(deterrent)(例如，双硫仑)、抗过敏剂、抗心绞痛药物、抗关节炎药物、抗感染剂(包括但不限于抗菌剂、抗生素、抗真菌剂、驱虫剂、抗疟药和抗病毒剂)、止痛剂和止痛剂组合、局部和全身麻醉剂、食欲抑制剂、抗氧化剂、抗焦虑药、减食欲药、抗关节炎药、抗哮喘剂、抗凝血剂、抗惊厥药、抗糖尿病剂、止泻药、止吐药、抗癫痫药、抗组胺剂、抗炎药、抗高血压药、抗偏头痛药、止恶心药、抗肿瘤药、抗氧化剂、抗帕金森病药、止痒剂、退热剂、抗风湿药、抗痉挛药、镇咳药、肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂、减食欲药、食欲抑制剂、心血管制剂(包括抗心律失常药、强心剂、心脏抑制剂、钙通道阻滞剂和β阻滞剂)、胆碱能药和抗胆碱能药、避孕药、利尿剂、减充血剂、生长刺激剂、草药制剂、安眠药、免疫剂、免疫调节剂、免疫抑制剂、肌肉松弛剂、神经活性剂(包括抗焦虑制剂、抗抑郁药、抗精神病药、精神兴奋剂、镇静剂和安定药)、咽痛药物、拟交感神经药、血管扩张剂、血管收缩剂、维生素、黄嘌呤衍生物、这些化合物的各种组合等。

根据本发明的装置具体地可用于检测生物、环境和工业来源样品中的分析物。如以上所指出的，这样的样品包括但不限于：全血、血清或血浆；唾液、痰液、泪液、汗液或其他分泌液；尿液或粪便；和生物来源流体，如脑脊液、间质液、细胞提取物等。具体地，与流经测定方式中所使用的样品体积相比，本发明的测定装置使用很小体积的样品。期望的样品体积范围为约1μL至约500μL，优选地约1μL至约100μL，更优选地约5μL至50μL，最优选地在约20μL与约30μL之间。

本发明的测定装置是基于结合测定的，例如但不限于免疫测定。这样的结合测定所涉及的结合配偶体包括但不限于以下结合对：抗体和抗原或半抗原；激素和受体；生物素和亲和素；碳水化合物和凝集素；效应物和受体分子；酶和辅因子、底物或抑制剂；和互补核苷酸序列。因此，以下所包括的描述和实施例仅用于说明的目的，并不应认为是限制所解决的特定应用。

本发明的装置特别适合于检测抗体-抗原结合。数千种抗体-抗原结合配偶体是已知的并且可以使用本文中的装置来检测。多个基本文件描述了抗体-抗原相互作用、抗体生产过程和其他相关事项，包括例如Borrebaeck(编辑)，AntibodyEngineering，第2版，FreemanandCompany，NY，1995；McCafferty等，AntibodyEngineering，APracticalApproachIRL，OxfordPress，Oxford，England，1996；Paul，AntibodyEngineeringProtocolsHumanaPress，HumanaPress，Towata,N.J.，1995；Paul(编辑)，FundamentalImmunology，第四版，Lippincott-Raven，NY，1999；Coligan，CurrentProtocolsinImmunologyWiley/Greene，NY；Harlow,1991和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，NY，1989；Stites等(编辑)，LangeMedicalPublications(第4版)LosAltos，Calif.及其中所引用的参考文献；Goding，MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(第2版)AcademicPress，NewYork，N.Y，1986；和Kohler和Milstein，Nature，256：第459页至第497页，1975。

图1是本发明的双室双向反向流装置的一个说明性实施方案。图1中的测定装置1由上面2的视图构成，上面2由塑料制成并且具有几个窗口或室：中间样品接收窗A、两个试剂释放窗C和C¹和两个反应室B和B¹。中间样品接收窗A用于添加样品(全血/血浆/血清/唾液/尿液等)，并允许样品以两个方向释放经过反应室B和B¹。试剂窗C和C¹用于接收追踪缓冲剂(chasebuffer)，以相反方向释放经标记的试剂经过反应室B和B¹。反应室B和B¹暴露于包括固定化捕获剂和指示剂线的色谱膜，并且使测试样品和试剂以相反方向流动并示出测试结果的可视指示。分隔件D的一部分从在装置中间的壳体突出，恰好与样品接收窗A相对，这有助于在测定过程期间移除分隔件D。

图2是双室双向反向流装置的视图，示出了该装置下壳体的视图，所述下壳体由塑料制成并且具有几个支持区以容纳色谱元件、分隔件和吸收垫。中心槽口1设计成容纳吸收垫，在其顶部放置分隔件以分隔位于色谱元件4和5末端之一处的样品垫。各色谱元件位于室2和室3中并具有三个不同的区：样品垫区(通常为两个膜)、反应区和试剂垫区。所述膜由该装置的下壳体通过塑料下壳体上适当的支持槽口来容纳。

图3说明了测定装置的不同组件和所述组件在塑料壳体底部如何调整。所述装置的每一侧都具有三个主要组件：位于分隔件上，进而位于吸收垫之上的色谱元件。每个色谱元件都由三部分组成：样品接收端A、反应区B和B¹和试剂释放端C和C¹。样品接收端是常见的并且位于装置的中央且位于分隔件上，使得样品一旦添加，其就以两个方向流经反应区。色谱元件由塑料衬背支持并具有三个区：样品吸收区(X)、反应区(Y)和试剂释放区(Z)。在本发明的这个实施方案中，连接有任选的过滤垫并且其构成样品接收的一部分，同时任选的试剂支承垫浸渍有可释放的试剂。反应区包含有色指示剂和固定化捕获配偶体。任选地，反应区还包含已知蛋白质(例如，蛋白A或蛋白L)作为装置有效性的指示剂。

本发明的测定装置能够为分析物检测提供相对于现有可用的快速色谱测定提高的灵敏度，而不损害特异性。本发明的实施例部分证明了这个进步。然而，本发明测定装置的优点不限于测定装置的功能方面，还解决了实用方面的问题。不管采用哪个实施方案，本测定装置都不需要包括额外的过滤装置，如具有特殊涂层的过滤器，以处理各种各样的生物流体。这种通用性通过测定装置的设计来实现，其允许分段反应和充分洗涤而不包括额外的步骤。

本发明的测定装置的另一个优点是该测定装置易于制造。本发明的装置采用一般的构造，其可以通过最小的改变从一个应用修改到另一个应用。

这个一般平台的通用性足以适应多个产品线的需要和要求。通过对测定装置整体设计最小限度的修改，例如将结合配偶体替换为一种特定分析物，可以使特定用于检测特定分析物的产品可以适合于用于不同分析物的另一产品。因此，不需要为每种特定产品开发另外的特定检测试剂。相反地，反应的特异性由第一结合配偶体决定，而标记的结合配偶体可以是多用途的一般构建体(例如，标记有可检测标记如天然有色颗粒的抗人抗体或抗GST抗体)。与传统快速测定的发展(其中必须为每个测定开发用于特定产品的特定检测器以维持可接受的灵敏度)相比，这是巨大的优势。因此，本发明的测定装置同时减少了用于产品开发的时间和成本。此外，由于该测定装置的主要组件可用于多种测定，所以可以保持生产参数而不需要改变。基于本发明的制造一系列产品的生产设施将使用单套制造设备和最少的原材料清单，进而显著降低操作成本。

现通过以下非限制性实施例对本发明进行描述。

实施例1(多重扫描验血)

为了检测人抗体针对不同血源性感染(HIV、HCV、HBV和梅毒)的谱，可以同时检测针对各病原体的抗原和抗体二者并示于图4中。检测针对每种病原体的两种标志分子可以用作一步(OneStop)验证测定。

实施例2(ToRCH组)

设计双室双向反向流技术以在两个不同的室中检测两种不同类型的抗体分子，如图5所示。检测针对多因素感染如ToRCH(弓形体感染(Toxo)、风疹、CMV和疱疹)的两种类型的抗体分子(IgG和IgM)对于筛选孕妇样品以防止母亲和新生儿的流产和/或出生相关并发症是非常重要的。

实施例3(心脏标志物)

双室双向反向流技术应用的另一个实例是可成为用于对患有胸痛和疑似急性冠状动脉综合征(ACS)的患者进行诊断和风险评估的心脏标志物。具体地，心肌肌钙蛋白已成为对于ACS患者所选择的心脏标志物。事实上，心肌肌钙蛋白是美国心脏病学会(ACC)和欧洲心脏病学会(ESC)的共同指南中对急性心肌梗死(AMI)的定义的核心。然而，产生与常规中心实验室测定相当的定性和定量结果的一些心脏标志物对于患有胸痛的急诊室患者很重要，所述心脏标志物包括肌酸激酶-MB(CK-MB)、肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T、和炎症标志物如CRP和MYO。双室双向反向流装置可改善诊断和临床结果，其中，在如图6所示的两个单独的室中可已检测出所有必需的生物标志物。

参考书目

Borrebaeck(ed.)，AntibodyEngineering，2^ndEditionFreemanandCompany，NY，1995

Coligan，CurrentProtocolsinImmunologyWiley/Greene，NY；Harlow，1991

Gilesetal，JournalofMedicalVirology，59.104-109，1999

Goding，MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice(2ded.)AcademicPress，NewYork，N.Y，1986

KohlerandMilstein，Nature256.495-497，1975

Lane，Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborPress，NY，1989

McCaffertyetal，AntibodyEngineering，APracticalApproachIRLatOxfordPress，Oxford，England，1996

Paul，AntibodyEngineeringProtocolsHumanaPress，Towata，N.J.，1995

Paul(ed.)，FundamentalImmunology，FourthEdition，Lippincott-Raven，N.Y，1999

Stitesetal，(eds.)BasicandClinicalImmunology(4thed.)LangeMedicalPublications，LosAltos，Calif.

Claims

1.一种测定装置或测试套件，包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括中央样品接收区及多个试剂释放端和反应室；

(b)邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和

(c)设置在所述色谱元件的部分与所述吸收垫之间的可移动的分隔件。

2.根据权利要求1所述的测定装置或套件，其中所述色谱元件包括一个样品释放端、两个试剂释放端、和双反应室。

3.根据权利要求2所述的测定装置或套件，其中所述中央样品接收区包括以两个相反方向吸收和释放第一结合配偶体的元件。

4.根据权利要求3所述的测定装置或套件，其中可释放的结合配偶体包含可检测标记。

5.根据权利要求2所述的测定装置或套件，其中所述中央样品接收区包含可释放的第一结合配偶体，和所述试剂释放端包含可释放的第二结合配偶体。

6.根据权利要求2所述的测定装置或套件，其中所述反应室包含用于特定分析物的固定化结合配偶体。

7.根据权利要求6所述的测定装置或套件，其中所述特定分析物包括一种或更多种捕获剂。

8.根据权利要求6所述的测定装置或套件，其中在所述反应室之一中包括一种或更多种作为捕获剂的抗原和/或抗体。

9.根据权利要求6所述的测定装置或套件，其中其他反应室中的所述特定分析物包括作为抗原捕获剂和/或抗体捕获剂的抗原和/或抗体。

10.根据权利要求2所述的测定装置或套件，其中所述分隔件突出超过所述装置中央区处的所述吸收垫和所述色谱元件。

11.根据权利要求1或2所述的测定装置或套件，还包括：

(d)壳体，所述壳体包围所述色谱元件、所述吸收垫和所述分隔件的至少一部分。

12.根据权利要求11所述的测定装置或套件，其中所述分隔件的一部分从所述壳体的一侧突出。

13.根据权利要求1或2所述的测定装置或套件，还包含水溶液。

14.根据权利要求1或2所述的测定装置或套件，还包括以下中的一个或更多个：用于容纳所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的两个容器；用于包装所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的包装材料；和说明书。

15.一种检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(a)将所述样品添加到根据权利要求1或2所述的测定装置或套件的色谱元件的中央样品接收区中；

(b)使所述样品从所述中央样品接收区以两个相反方向流经所述色谱元件两侧的反应室的至少一部分；

(c)使所述样品中的所述分析物与固定化在所述反应室中的第一结合配偶体反应以形成第一复合物；

(d)向所述色谱元件的试剂释放端添加水溶液并使引入试剂释放端的可释放的第二结合配偶体溶解，其中所述可释放的第二结合配偶体包含标记；

(e)从所述测定装置中移除分隔件以使吸收垫与色谱元件的部分接触；

(f)使所述可释放的第二结合配偶体从所述释放端流经所述色谱元件的所述反应室的至少一部分；

(g)所述可释放的第二结合配偶体与底物之间形成第二复合物，所述底物选自所述分析物、所述第一结合配偶体和所述第一复合物；和

(h)通过显色来检测所述第二复合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中在从所述测定装置中移除所述分隔件之前，添加所述水溶液和使所述可释放的第二结合配偶体溶解。

17.根据权利要求15所述的方法，其中在添加所述水溶液和使所述可释放的第二结合配偶体溶解之前，从所述测定装置中移除所述分隔件。

18.根据权利要求15所述的方法，其中在从所述装置的两端添加所述水溶液和使可释放的第二结合配偶体溶解同时，从所述测定装置中移除所述分隔件。

19.根据权利要求15所述的方法，其中通过将所述分隔件从所述色谱元件与所述吸收垫之间拉出，移除所述分隔件。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述分析物包括抗体、抗原、或者抗原和抗体二者。

21.一种用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(a)将样品添加到根据权利要求1或2所述的测定装置或套件的色谱元件的中央样品接收区中；

(b)使所述分析物从所述样品接收区以两个相反的方向流经所述色谱元件的反应室的至少一部分；

(c)使所述第一复合物与所述反应室中固定化的试剂反应以形成第一免疫复合物；

(d)向所述色谱元件的试剂释放端添加水溶液并使引入所述试剂释放端中的可释放的第二结合配偶体溶解；

(e)从所述测定装置中移除分隔件以使吸收垫与所述色谱元件接触，从而使得所述吸收垫能够吸收来自样品垫的流体；

(h)通过显色来检测所述第二复合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中在从所述测定装置中移除所述分隔件之前，添加所述水溶液和使可释放的第二结合配偶体溶解。

23.根据权利要求21所述的方法，其中在添加所述水溶液和使可释放的第二结合配偶体溶解之前，从所述测定装置中移除所述分隔件。

24.根据权利要求21所述的方法，其中在添加所述水溶液和使可释放的第二结合配偶体溶解同时，从所述测定装置中移除所述分隔件。

25.根据权利要求21所述的方法，其中通过将所述分隔件从所述色谱元件与所述吸收垫之间拉出，移除所述分隔件。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述分析物包括抗体、抗原、抗体或者抗原和抗体二者。

27.一种用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：

(e)从所述测定装置中移除分隔件以使所述吸收垫与所述色谱元件接触；

(g)使所述第二复合物从所述试剂释放端流经所述色谱元件的反应区的至少一部分；

(i)通过显色来检测所述第三复合物。

28.根据权利要求27所述的方法，其中在从所述测定装置中移除所述分隔件之前，添加所述水溶液。

29.根据权利要求27所述的方法，其中在添加所述水溶液之前，从所述测定装置中移除所述分隔件。

30.根据权利要求27所述的方法，其中在添加所述水溶液同时，从所述测定装置中移除所述分隔件。

31.一种测定装置或套件，包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括中央样品接收端、两个试剂释放端、和双反应区；

(b)邻近所述反应区的吸收垫；和

32.根据权利要求31所述的测定装置或套件，还包括：

33.根据权利要求31所述的测定装置或套件，还包含水溶液。

34.根据权利要求31所述的测定装置或套件，还包括以下中的一个或更多个：用于容纳所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的容器；用于包装所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的包装材料；和使用说明书。

35.一种测定装置或套件，包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括在所述装置中部的样品接收区、在两端的试剂释放区、和两个反应区或反应窗；

(b)位于所述反应区之间的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件，其中所述分隔件包括不透液屏障；和其中所述样品接收端包含可释放的第一结合配偶体，所述反应区包含固定化第二结合配偶体，和所述试剂释放区包含标记的可释放的第三结合配偶体。

36.根据权利要求35所述的测定装置或套件，还包括：

37.根据权利要求35所述的测定装置或套件，还包含水溶液。

38.根据权利要求35所述的测定装置或套件，还包括以下中的一个或更多个：用于容纳所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的容器；用于包装所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的包装材料；和说明书。

39.一种测定装置或套件，包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括样品接收区和多个试剂释放端和反应区；

(b)位于所述反应区之间的吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件与所述吸收垫之间的可移动的分隔件，其中所述分隔件包括不透液屏障；和其中所述反应区包含固定化第一结合配偶体，和所述试剂释放端包含可释放的第二结合配偶体和标记的第三结合配偶体。

40.根据权利要求39所述的测定装置或套件，还包括：

41.根据权利要求39所述的测定装置或套件，还包括水溶液。

42.根据权利要求39所述的测定装置或套件，还包括以下中的一个或更多个：用于容纳所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的容器；用于包装所述色谱元件、所述分隔件、所述吸收垫或其组合的包装材料；和使用说明书。

43.以下元件在制造用于检测样品中的多个特征分子的测定装置或套件中的用途：

(b)邻近所述中央样品接收区的吸收垫；和

44.一种配置用于检测样品中的多种分析物的测定装置或测试套件，包括：

(a)色谱元件，所述色谱元件包括具有可释放的第一结合配偶体的中央样品接收区、具有固定化的一种或更多种第二结合配偶体的多个反应区、和具有可释放的标记的第三或更多结合配偶体的多个试剂释放端；

(b)吸收垫；和

(c)位于所述色谱元件的一部分与所述吸收垫之间的分隔件。