[go: up one dir, main page]

CN105517450A - 提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物 - Google Patents

提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN105517450A
CN105517450A CN201480045781.4A CN201480045781A CN105517450A CN 105517450 A CN105517450 A CN 105517450A CN 201480045781 A CN201480045781 A CN 201480045781A CN 105517450 A CN105517450 A CN 105517450A
Authority
CN
China
Prior art keywords
activity
feed
enzyme
additive composition
feed additive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480045781.4A
Other languages
English (en)
Inventor
L·F·罗密欧米兰
S·于
M·沃尔什
S·兰茨
C·米奇森
B·鲍尔
S·阿伦特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
International N&H Denmark ApS
Original Assignee
Danisco AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco AS filed Critical Danisco AS
Publication of CN105517450A publication Critical patent/CN105517450A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A23K10/32—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from hydrolysates of wood or straw
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括：(a)用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质；(b)将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物混合，其中所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且其中所述酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性；(c)将所述木质纤维素生物质与酶组合物的混合物温育至少约3至120小时；(d)以及任选地进行干燥和/或任选地进行包装。

Description

提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物
技术领域
本发明涉及提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物。本发明涉及的方法和组合物可使木质纤维素生物质成为动物饲料中惯常使用的谷物淀粉的适宜替代品。
背景技术
每年供给动物营养的谷物约有7.5亿吨。使用更便宜的饲料来源替代这些谷物的一部分会使全人类受益匪浅。
将谷物(如玉米)替换为较廉价的纤维素材料(如木质纤维素生物质)会深刻影响动物饲料市场，并且/或者增加人类食品和能源市场的稳定性。
木质纤维素生物质的营养价值还不足以使其成为高能量饲料原料(例如谷物)的可行替代品。单胃动物例如生猪或家禽，无法将纤维成分(例如农业废物)中的木质纤维素消化并吸收其中葡萄糖，例如达到允许替代动物饮食中大量的谷物的程度。动物，尤其是单胃动物，并不具备消化纤维素和半纤维素所需的酶；即便具备此类酶，在肠内的停留时间也会成为纤维素转化为葡萄糖的限制因素。
纤维素是化学式为(C6H10O5)n的有机化合物，它是由直链的通过β(1→4)糖苷键连接的D-葡萄糖单元组成的多糖。
半纤维素是几种杂聚物(基质多糖)中的任一种，与纤维素共存于几乎所有的植物细胞壁中。半纤维素包括木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖，和木葡聚糖。半纤维素包含许多不同的糖单体。例如，除葡萄糖之外，半纤维素中的糖单体还可包括木糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖，和阿拉伯糖。半纤维素包含大多数D-戊糖(C-5糖)，有时也包含少量L-糖。多数情况下，木糖是含量最大的糖单体，而在软木中甘露糖可能是丰度最大的糖。半纤维素中不仅存在常规糖，也存在常规糖的酸化形式(例如葡糖醛酸和半乳糖醛酸)。
Schutte等人(BritishJ.ofNutrition1991,66,83-93)研究了D-木糖在猪体内的营养意义。Schutte等人提出D-木糖和D-葡萄糖的回肠消化率均接近100％。饮食中D-木糖的存在降低了回肠食糜pH值并且增强了挥发性脂肪酸在回肠内的流动，这表明猪小肠内发生了D-木糖的微生物降解。Schutte提出在饲喂极高D-木糖含量饮食(例如每kg饮食中D-木糖为200g)的猪体内，干物质(DM)、有机物质(OM)、总能量(GE)和氮(N)的回肠消化率、粪便消化率，以及氮保留率显著降低。Schutte(1991年)也发现在猪的饮食中添加10％的木糖，其中50％的木糖能量会随尿液排出。
Verstegen等人(J.Animal.Physiol.a.Anim.Nutr.77(1997)180-188)对猪进行实验，评价了木糖作为猪能量来源的可行性。根据该文献使用的计算方法，当饮食中添加10％木糖时，饮食中38％至64％的木糖能量以代谢能(ME)的形式存在，对比饲喂饮食中含有10％木糖的猪与饲喂饮食中含有5％葡萄糖的对照猪，人们发现：两种饮食中的ME和两种饲喂方式下猪的增重都相似。
Savory等人(BritishJournalofNutrition(1992),67,103-114)研究了禽类体内由U-14C标记的单糖的代谢转归，并提出禽类吸收木糖比吸收葡萄糖和半乳糖慢得多，但比吸收甘露糖和阿拉伯糖快。Savory(1992年)也观察到鸟的排泄物中由U-14C标记的木糖和阿拉伯糖比己糖的回收率更大，因而木糖和阿拉伯糖比己糖(C6)的代谢程度更低。
附图说明
图1示出通过纤维素酶SC处理DaCS(经稀氨水预处理的玉米秸秆)而得的葡萄糖和木糖产量。
图2示出通过使用TrioTM、纤维素酶SC或者纤维素酶SC+内切木聚糖酶而从DaCS释放的葡萄糖和木糖的量。
图3示出通过使用TrioTM、纤维素酶SC118、纤维素酶151和SC118+木聚糖酶而从DaCS释放的糖的量。
图4示出通过使用TrioTM、纤维素酶SC和纤维素酶SC+四种不同的内切木聚糖酶而得的DaCS水解情况。
图5示出通过使用30μlTrioTM而得的DaCS水解产物的HPLC色谱图。
图6示出通过组合使用纤维素酶SC、纤维素酶SC和内切木聚糖酶(SoloC118,50μL)而得的DaCS水解产物的HPLC色谱图。
图7示出通过使用TrioTM、纤维素酶SC和纤维素酶SC+内切木聚糖酶而得DaCS的水解情况。
图8示出在加入或未加入纤维素酶SC118和内切木聚糖酶DaniscoXylanaseTM(参见EP1222256，该文献以引用方式并入本文)的情况下，在50℃及pH5.0下，DaCS增溶40小时后的结果(DaCS残渣的重量，以g计)。
图9示出在加入或未加入纤维素酶SC118和内切木聚糖酶DaniscoXylanaseTM的情况下，在50℃及pH5.0下，DaCS增溶40小时后的结果(增溶物质％)。
图10示出通过使用纤维素酶SC118和木聚糖酶DaniscoXylanaseTM的剂量效应，在50℃及pH5.0下，在40小时内从DaCS释放的单糖量。
图11示出通过使用纤维素酶SC118和木聚糖酶DaniscoXylanaseTM的剂量效应，在50℃及pH5.0下，在40小时内从DaCS释放的糖(单体+聚合物形式)。
图12示出以进食木糖作为能量来源的肉鸡的采食量和体重增重。
图13示出以进食木糖作为能量来源的肉鸡在饲喂第21天的体重。
图14示出以进食木糖作为能量来源的肉鸡在饲喂第0至21天内的饲料转化率。
图15示出编码内切木聚糖酶(FoxXyn6)的核苷酸序列(SEQIDNo.1)。信号序列以黑体(大写体)示出。
图16示出编码内切木聚糖酶(FoxXyn6)的核苷酸序列(SEQIDNo.2)。
图17示出内切木聚糖酶(FoxXyn6)的多肽序列(SEQIDNo.3)。该序列为酶的活性形式(如，酶的成熟形式)。
图18示出编码内切木聚糖酶(FoxXyn4)的核苷酸序列(SEQIDNo.4)。信号序列以黑体(大写体)示出。
图19示出编码内切木聚糖酶(FoxXyn4)的核苷酸序列(SEQIDNo.5)。
图20示出内切木聚糖酶(FoxXyn4)的多肽序列(SEQIDNo.6)。该序列为酶的活性形式(如，酶的成熟形式)。
图21示出编码来自黑曲霉(Aspergillusniger)(CBS513.88)的内切葡聚糖酶(EG1)的核苷酸序列(SEQIDNo.7)。
图22示出来自黑曲霉(CBS513.88)的内切葡聚糖酶(EG1)的多肽序列(SEQIDNo.8)。
图23示出编码来自黑曲霉CBS513.88的内切葡聚糖酶(EG2)的核苷酸序列(SEQIDNo.9)。
图24示出来自黑曲霉CBS513.88的内切葡聚糖酶(EG2)的多肽序列(SEQIDNo.10)。
图25示出编码内切木聚糖酶的核苷酸序列(SEQIDNo.11)。
图26示出内切木聚糖酶的多肽序列(SEQIDNo.12)。
图27示出编码来自黑曲霉CBS513.88的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列(SEQIDNo.13)。
图28示出来自黑曲霉CBS513.88的β-葡萄糖苷酶的多肽序列(SEQIDNo.14)。
图29示出编码来自黑曲霉CBS513.88的溶解性多糖单加氧酶的核苷酸序列(SEQIDNo.15)。
图30示出来自黑曲霉CBS513.88的溶解性多糖单加氧酶的多肽序列(SEQIDNo.16)。
图31示出编码来自黑曲霉(CBS513.88)的CHB1A的核苷酸序列(SEQIDNo.17)。
图32示出来自黑曲霉(CBS513.88)的CHB1A的多肽序列(SEQIDNo.18)。
图33示出编码来自黑曲霉(CBS513.88)的CHB1B的核苷酸序列(SEQIDNo.19)。
图34示出来自黑曲霉(CBS513.88)的CHB1B的多肽序列(SEQIDNo.20)。
图35示出编码来自里氏木霉(Trichodermareesei)的CHB1的核苷酸序列(SEQIDNo.21)。
图36示出来自里氏木霉的CHB1的多肽序列(SEQIDNo.22)。
图37示出编码来自里氏木霉的CHB2的核苷酸序列(SEQIDNo.23)。
图38示出来自里氏木霉的CHB2的多肽序列(SEQIDNo.24)。
图39示出编码来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EG1)的核苷酸序列(SEQIDNo.25)。
图40示出来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EG1)的多肽序列(SEQIDNo.26)。
图41示出编码来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EG2)的核苷酸序列(SEQIDNo.27)。
图42示出来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EG2)的多肽序列(SEQIDNo.28)。
图43示出编码来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EG3)的核苷酸序列(SEQIDNo.29)。
图44示出来自里氏木霉的内切葡聚糖酶(EG3)的多肽序列(SEQIDNo.30)。
图45示出编码来自里氏木霉的溶解性多糖单加氧酶的核苷酸序列(SEQIDNo.31)。
图46示出来自里氏木霉的溶解性多糖单加氧酶的多肽序列(SEQIDNo.32)。
图47示出编码来自里氏木霉的内切木聚糖酶的核苷酸序列(SEQIDNo.33)。
图48示出来自里氏木霉的内切木聚糖酶的多肽序列(SEQIDNo.34)。
图49示出编码来自里氏木霉的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列(SEQIDNo.35)。
图50示出来自里氏木霉的β-葡萄糖苷酶的多肽序列(SEQIDNo.36)。
发明内容
在第一方面，本发明提供了一种制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括：
a.用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质，
b.将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物混合，其中该酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且其中该酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性，
c.将木质纤维素生物质与酶组合物的混合物温育至少约3至120小时，优选地温育6至48小时，
d.以及任选地进行干燥和/或任选地进行包装。
在另一个方面，本发明提供了酶组合物的用途，其中在制造用于提高木质纤维素生物质对动物的营养价值的饲料添加剂组合物的过程中，酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且其中酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
本发明的另外一方面为一种能够采用本发明的方法获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物。
在另一个方面，提供了一种饲料添加剂组合物或饲料成分，其包含由酶组合物水解的经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质，其中酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
本发明的另一方面提供了一种饲料或饲料原料，其包含根据本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分，或能够采用本发明的方法或用途获得(优选地已获得)的饲料添加剂组合物。
在另一方面，提供了一种预混物，其包含根据本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分，或能够采用本发明的方法或用途获得(优选地已获得)的饲料添加剂组合物，以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
本发明还提供了一种制备饲料原料的方法，该方法包括将饲料组分与根据本发明的饲料添加剂组合物或饲料成分、或能够采用本发明的方法或用途获得(任选地已获得)的饲料添加剂组合物接触。
本发明也提供了一种改善动物生物物理特性的方法，该方法包括给动物施用能够通过本发明方法获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物，或根据本发明的饲料添加剂组合物，或根据本发明的预混物，或根据本发明的饲料原料，或者能够通过本发明方法获得(例如，已获得)的饲料原料。
在又一方面，本发明提供了能够通过本发明的方法或用途获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物、或者根据本发明的饲料添加剂组合物、或者根据本发明的预混物、或者根据本发明的饲料原料、或者能够通过本发明方法获得(例如，已获得)的饲料原料用于改善动物的生物物理特性的用途。
在一个优选的实施例中，酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
适宜地，酶组合物可进一步包含选自纤维二糖水解酶I和纤维二糖水解酶II的一种或两种酶。
适宜地，酶组合物可进一步包含溶解性多糖单加氧酶。
具体实施方式
发明人的研究(参见实例5)已经证明饲料中高含量的C-5糖单体(例如木糖)能对进食该饲料的动物健康造成不利影响。
然而，在饲料原料中使用高含量木质纤维素生物质可导致饲料原料的营养价值不够高，或者为尝试使饲料原料具有更高营养价值而对木质纤维素生物质进行处理，则会导致饲料原料中C-5糖单体(例如木糖)含量过高而可能对动物健康造成危害。
因此，发明人得出在饲喂动物之前，应优选地将C-5糖单体从任何木质纤维素生物质饲料中移除。
本发明人现已发现一种使用酶组合物处理木质纤维素生物质的独特方法，该酶组合物可使饲料原料或饲料添加剂组合物中C-5糖单体(例如木糖)含量降低，同时维持对动物有益的(例如有营养价值的)高含量C-6低聚物和糖单体。
令人惊讶的是，如果移除形成C-5碳水化合物单体的活性，则能够在不减损纤维素转化为葡萄糖的效率或时间的前提下形成大量木糖寡聚物。所得组合物对饲料应用更加有利。
本发明人惊讶地发现，消除C5糖单体生成并提高C5低聚物生成同时伴有纤维素酶活性(例如，从而生成C6低聚物和C6糖单体)是有利的活性配合效果。
包括该酶组合物的方法和用途将允许在动物饲料和动物饮食中添加更高含量的木质纤维素生物质。
本发明人惊讶地发现，可通过使用至少具有以下活性的酶组合物显著提高木质纤维素生物质对动物(尤其是单胃动物)的营养价值：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性及内切木聚糖酶活性；其中在处理木质纤维素生物质的过程中，酶组合物不存在、或基本上不存在以下活性中的一者或两者：β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
已惊讶地发现降低或去除β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性，能够显著提高木质纤维素生物质对动物(尤其是单胃动物)的营养价值。
从数据中可以看出，这些益处是源于组合物中糖单体(尤其是C-5糖单体)含量降低的同时组合物中低聚物糖(例如木糖寡聚物)含量显著提高。
此发现令人惊讶，因为在本发明之前人们就已知如果将C6单体形成酶移出体系，反应的反馈抑制会使产物(例如纤维二糖)的积累、酶反应逐渐减慢。因此在本发明之前人们已知，当形成的糖单体含量降低时，反应的反馈机制会导致酶反应整体减慢。令人惊讶的是，对于酶组合物未观察到明显的反馈机制，例如本发明所用的β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性很小的酶组合物。
本发明人惊讶地发现，使用酶混合物的方法能够显著提高木质纤维素生物质对动物(尤其是单胃动物)的营养价值，该酶混合物能够分解纤维素和半纤维素，但不具有形成碳水化合物单体的活性或不具有形成还原单体的活性(尤其不具有形成C-5碳水化合物单体的活性)。
通过使用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质，可进一步增强该效果。因此，首先使用物理和/或化学和/或生物方法处理木质纤维素生物质，然后使用酶组合物处理经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素，其中酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性；其中酶组合物中不存在、或基本上不存在以下酶活性中的一者或两者：β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
本发明意味着，可用木质纤维素生物质替代动物饲料中惯常使用的淀粉(如，来自谷物的淀粉)。这一做法有明显的好处。例如，利用本发明意味着，无需再按惯例在动物饲料应用中以较大比例使用谷物来供给动物营养。本发明能使制备动物饲料的成本降低。除此之外或作为另外一种选择，本发明减轻了长期以来由于人口规模增加和化石燃料供应限制而对供应链造成的资源压力。
本发明与单胃动物和反刍动物皆有关联，但与单胃动物最明确地相关。
就反刍动物来说，可使用根据本发明的饲料补充剂、或通过本发明制备的饲料补充剂替代谷物，来集约化生产反刍动物的肉类和乳品，并/或增加系统效率。
本发明涉及一种制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括：
a.用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质，
b.将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物混合，其中该酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且其中该酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性，
c.将木质纤维素生物质与酶组合物的混合物温育至少约3至120小时，优选地温育6至48小时，
d.以及任选地进行干燥和/或任选地进行包装。
本文所用的术语“不存在”或“不具有”是指酶组合物不具有β-木糖苷酶活性并且不具有α-阿拉伯呋喃糖酶活性。
本文结合β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性所用的术语“基本上不存在”和“基本上不具有”是指使用本文提出的“β-木糖苷酶活性测定法”测定的β-木糖苷酶活性低于3000单位/mg(适宜地低于2000单位/mg、适宜地低于1500单位/mg)，并且/或者使用本文提出的“α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性测定法”测定的α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性低于1000单位/mg(适宜地低于500单位/mg、适宜地低于450单位/mg)。
在一个实施例中，本文结合β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性所用的术语“基本上不存在”和“基本上不具有”是指使用本文提出的“β-木糖苷酶活性测定法”测定的β-木糖苷酶活性低于1500单位/mg，并且/或者使用本文提出的“α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性测定法”测定的α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性低于450单位/mg。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物具有使用本文提出的“β-木糖苷酶活性测定法”测定的低于3000单位/mg(适宜地低于2000单位/mg、适宜地低于1500单位/mg)的β-木糖苷酶活性，以及使用本文提出的“α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性测定法”测定的低于1000单位/mg(适宜地低于500单位/mg、适宜地低于450单位/mg)的α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
在一个实施例中，本文结合β-木糖苷酶活性和/或α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性所用的术语“基本上不存在”和“基本上不具有”是指使用本文提出的“β-木糖苷酶活性测定法”测定的β-木糖苷酶活性低于1500单位/mg，并且使用本文提出的“α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性测定法”测定的α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性低于450单位/mg。
在一个优选的实施例中，酶组合物可不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
在一个优选的实施例中，酶组合物可不具有β-木糖苷酶活性，并且不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
在一个优选的实施例中，本发明所用的木质纤维素生物质可为经物理预处理的、经化学预处理的、经生物预处理的、或经它们的组合预处理的木质纤维素生物质。
在另一个实施例中，经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质可与酶组合物一起温育至少约6至48小时。
在另一个优选的实施例中，本发明所用的酶组合物可基本上由以下活性组成(或由以下活性组成)：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物可还具有以下酶活性中的一者或两者：纤维二糖水解酶I活性和纤维二糖水解酶II活性。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物可还具有溶解性多糖单加氧酶活性。
在一些实施例中，本发明所用的酶组合物可具有内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，以及以下酶活性中的一者或多者：纤维二糖水解酶I活性、纤维二糖水解酶II活性或溶解性多糖单加氧酶活性。
在一些实施例中，本发明所用的酶组合物可基本上由以下酶活性组成(或由以下酶活性组成)：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，以及以下酶活性中的一者或多者：纤维二糖水解酶I活性、纤维二糖水解酶II活性或溶解性多糖单加氧酶活性。
在一些实施例中，本发明所用的酶组合物可具有内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，以及以下酶活性中的两者或更多者(适宜地为三者)：纤维二糖水解酶I活性、纤维二糖水解酶II活性或溶解性多糖单加氧酶活性。
在一些实施例中，本发明所用的酶组合物可基本上由以下酶活性组成(或由以下酶活性组成)：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，以及以下酶活性中的两者或更多者(适宜地为三者)：纤维二糖水解酶I活性、纤维二糖水解酶II活性或溶解性多糖单加氧酶活性。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物可通过其酶活性来表征。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物具有至少以下酶活性(或基本上由至少以下酶活性组成，或由至少以下酶活性组成)：使用“内切葡聚糖酶活性测定法”测得的内切葡聚糖酶活性，使用“β-葡萄糖苷酶活性测定法”测得的β-葡萄糖苷酶活性，使用“内切木聚糖酶活性测定法”测得的内切木聚糖酶活性。
下面的表格和其后的段落列出了可能存在于所述酶组合物中的这些活性的范围：
组合物中每种酶活性的以单位计的活性范围
内切葡聚糖酶活性 500-4000CMC U/g1
β-葡萄糖苷酶活性 200-3500pNPG U/g2
内切木聚糖酶活性 1500-6000ABX U/g3
组合物中每种酶活性的以单位计的活性范围
内切葡聚糖酶活性 1000-3500CMC U/g1(优选为1500-3000CMC U/g)
β-葡萄糖苷酶活性 300-3000pNPG U/g2(优选为500-2500pNPG U/g)
内切木聚糖酶活性 2000-5000ABX U/g3(优选为3000-4000ABX U/g)
1一个CMC活性单位在50℃及pH4.8的条件下，在一分钟内释出1μmol还原糖(以葡萄糖当量表示)。
2一个pNPG单位表示在50℃及pH4.8的条件下，每分钟从对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷释放1μmol硝基苯酚。
3一个ABX单位被定义为在50℃及pH5.3的条件下，每分钟产生1μmol木糖还原糖当量所需的酶量。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物可具有使用“内切葡聚糖酶活性测定法”测定的至少500CMCU/g内切葡聚糖酶活性(适宜地至少1000CMCU/g活性、适宜地至少2000CMCU/g活性或适宜地至少3000CMCU/g活性)。
在另一个实施例中，本发明所用的酶组合物可具有使用“β-葡萄糖苷酶活性测定法”测定的至少200pNPGU/gβ-葡萄糖苷酶活性(适宜地至少1000pNPGU/g活性、适宜地至少1500pNPGU/g活性或适宜地至少2500pNPGU/g活性)。
在又一个实施例中，本发明所用的酶组合物可具有使用“内切木聚糖酶活性测定法”测定的至少1500ABXU/g内切木聚糖酶活性(适宜地至少3000ABXU/g活性、适宜地至少4000ABXU/g活性、适宜地至少4500ABXU/g活性或适宜地至少5000ABXU/g)。
适宜地，本发明所用的酶组合物可具有以下活性(或基本上由以下活性组成，或由以下活性组成)：使用“内切葡聚糖酶活性测定法”测定的至少500CMCU/g内切葡聚糖酶活性(适宜地至少1000CMCU/g活性、适宜地至少2000CMCU/g活性或适宜地至少3000CMCU/g活性)；使用“β-葡萄糖苷酶活性测定法”测定的至少200pNPGU/gβ-葡萄糖苷酶活性(适宜地至少1000pNPGU/g活性、适宜地至少1500pNPGU/g活性或适宜地至少2500pNPGU/g活性)；以及使用“内切木聚糖酶活性测定法”测定的至少1500ABXU/g内切木聚糖酶活性(适宜地至少3000ABXU/g活性、适宜地至少4000ABXU/g活性或适宜地至少4500ABXU/g活性、适宜地至少5000ABXU/g)。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物可具有使用“内切葡聚糖酶活性测定法”测定的至少约500CMCU/g至约4000CMCU/g内切葡聚糖酶活性(适宜地至少约1000CMCU/g至约3500CMCU/g活性、适宜地至少约1500CMCU/g至约3000CMCU/g活性或适宜地至少约1500CMCU/g至约2500CMCU/g活性)。
在另一个实施例中，本发明所用的酶组合物可具有使用“β-葡萄糖苷酶活性测定法”测定的至少约200pNPGU/g至约3500pNPGU/gβ-葡萄糖苷酶活性(适宜地至少约300pNPGU/g至约3000pNPGU/g活性、适宜地至少约500pNPGU/g至约2500pNPGU/g活性或适宜地至少约1000pNPGU/g至约2000pNPGU/g活性)。
在又一个实施例中，本发明所用的酶组合物可具有使用“内切木聚糖酶活性测定法”测定的至少约1500ABXU/g至约6000ABXU/g内切木聚糖酶活性(适宜地至少约2000ABXU/g至约5000ABXU/g活性、适宜地至少约2500ABXU/g至约4500ABXU/g活性或适宜地至少约3000ABXU/g至约4000ABXU/g活性)。
适宜地，本发明所用的酶组合物可具有以下活性(或基本上由以下活性组成，或由以下活性组成)：使用“内切葡聚糖酶活性测定法”测定的至少约500CMCU/g至约4000CMCU/g内切葡聚糖酶活性(适宜地至少约1000CMCU/g至约3500CMCU/g活性、适宜地至少约1500CMCU/g至约3000CMCU/g活性或适宜地至少约1500CMCU/g至约2500CMCU/g活性)；使用“β-葡萄糖苷酶活性测定法”测定的至少约200pNPGU/g至约3500pNPGU/gβ-葡萄糖苷酶活性(适宜地至少约300pNPGU/g至约3000pNPGU/g活性、适宜地至少约500pNPGU/g至约2500pNPGU/g活性或适宜地至少约1000pNPGU/g至约2000pNPGU/g活性)；以及使用“内切木聚糖酶活性测定法”测定的至少约1500ABXU/g至约6000ABXU/g内切木聚糖酶活性(适宜地至少约2000ABXU/g至约5000ABXU/g活性，适宜地至少约2500ABXU/g至约4500ABXU/g活性或适宜地至少约3000ABXU/g至约4000ABXU/g活性)。
在一个优选的实施例中，本发明所用的酶组合物可具有以下活性(或基本上由以下活性组成，或由以下活性组成)：使用“内切葡聚糖酶活性测定法”测定的约1000CMCU/g至约3500CMCU/g的内切葡聚糖酶活性、使用“β-葡萄糖苷酶活性测定法”测定的约300pNPGU/g至约3000pNPGU/g的β-葡萄糖苷酶活性、以及使用“内切木聚糖酶活性测定法”测定的约2000ABXU/g至约5000ABXU/g的内切木聚糖酶活性。
在另一个实施例中，本发明所用的酶组合物可还具有以下酶活性中的一者或多者：蛋白酶活性(例如丝氨酸蛋白酶活性(E.C.3.4.21)和/或碱性枯草杆菌蛋白酶活性(E.C.3.4.21.62))、果胶酶活性(E.C.3.2.1.15)、α-葡糖苷酸酶活性(E.C.3.2.1.139)、β-葡糖苷酸酶活性(E.C.3.2.1.31)或酯酶活性(E.C.3.1.1.73)。
酯酶活性可为阿魏酸酯酶活性(E.C.3.1.1.73)。
本文所指的内切葡聚糖酶活性可为内切-1,4-β-D-葡聚糖酶活性。内切葡聚糖酶是催化纤维素、地衣聚糖和谷类β-D葡聚糖中的(1→4)-β-D-糖苷键内切水解的酶。换句话讲，本文定义的内切葡聚糖酶活性是指将纤维素、地衣聚糖和谷类β-D葡聚糖中的(1→4)-β-D-糖苷键内切水解的酶的活性。根据E.C.分类法，可将内切葡聚糖酶活性归类为E.C.3.2.1.4。内切葡聚糖酶的别名为β-葡聚糖酶。
本发明所用的酶组合物中使用的内切葡聚糖酶可为包含选自下列的一种或多种核苷酸序列(或由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成)的核酸所编码的一种或多种内切葡聚糖酶：SEQIDNo.29、SEQIDNo.27、SEQIDNo.25、SEQIDNo.9和SEQIDNo.7。
本发明所用的酶组合物中使用的内切葡聚糖酶可为包含选自下列的一种或多种多肽序列(或由选自下列的一种或多种多肽序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种多肽序列组成)的一种或多种内切葡聚糖酶：SEQIDNo.30、SEQIDNo.28、SEQIDNo.26、SEQIDNo.10和SEQIDNo.8。
“内切葡聚糖酶活性测定法”(CMCU/g)
移取1mL1％羧甲基纤维素钠盐(CMC)溶液(使用0.05M醋酸钠缓冲液配制)，分别加入样品管和空白管中。将各管置于50℃水浴温育10分钟。每隔15秒移取1mL酶稀释液，加入各样品管。每次加入酶稀释液后摇匀样品管。10分钟后，按照与向各样品管添加酶相同的顺序和时间安排，加入3mL1％3,5-二硝基水杨酸钠盐(DNS)。向样品空白管添加3mLDNS。添加DNS后，将各试管转移到不处于50℃水浴中的另一试管架上。将1mL经稀释的酶加入相应样品空白管中。为各管加盖，煮沸5分钟整。从100℃水浴中取出各管，在冰浴中放置10分钟。留在室温下10至15分钟。转移到3mL比色皿中。使用试剂空白将分光光度计调零，以去离子水为参比，在540nm处读取每个样品。
该过程测定的酶活性是相对具有指定CMC单位的酶标准物的活性。一个CMC活性单位在50℃及pH4.8的条件下，在一分钟内释出1μmol还原糖(以葡萄糖当量表示)。
在一个实施例中，本发明所用的溶解性多糖单加氧酶可为以下文献中提出的溶解性多糖单加氧酶：Levasseur等人，BiotechnologyforBiofuels2013,6:41；Kittle等人，BiotechnologyforBiofuels2012,5:79；这些文献以引用方式并入本文。
本发明所用的酶组合物中使用的溶解性多糖单加氧酶可为包含选自下列的一种或多种核苷酸序列(或由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成)的核酸所编码的一种或多种溶解性多糖单加氧酶：SEQIDNo.31和SEQIDNo.15。
本发明所用的酶组合物中使用的溶解性多糖单加氧酶可为包含选自下列的一种或多种多肽序列(或由选自下列的一种或多种多肽序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种多肽序列组成)的一种或多种溶解性多糖单加氧酶：SEQIDNo.32和SEQIDNo.16。
纤维二糖水解酶(CBH)活性可为CBHI类(CBHI)活性或CBHII类(CBHII)活性，或CBHI与CBHII的组合。适宜的是，纤维二糖水解酶可水解纤维素和纤维四糖中的(1→4)-β-D-糖苷键，从链的非还原末端释放纤维二糖。纤维二糖水解酶活性的另一个术语可为外切纤维二糖水解酶活性或纤维素1,4β-纤维二糖苷酶活性。根据E.C.分类法，可将纤维二糖水解酶II类活性归类为E.C.3.2.1.91。根据E.C.分类法，可将纤维二糖水解酶I类活性归类为E.C.3.2.1.176。
本发明所用的酶组合物中使用的纤维二糖水解酶(CBH)可为包含选自下列的一种或多种核苷酸序列(或由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成)的核酸所编码的一种或多种纤维二糖水解酶：SEQIDNo.23、SEQIDNo.21、SEQIDNo.19和SEQIDNo.17。
本发明所用的酶组合物中使用的纤维二糖水解酶(CBH)可为包含选自下列的一种或多种多肽序列(或由选自下列的一种或多种多肽序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种多肽序列组成)的一种或多种纤维二糖水解酶：SEQIDNo.24、SEQIDNo.22、SEQIDNo.20和SEQIDNo.18。
内切木聚糖酶活性可为内切-1,4-β-木聚糖酶活性。优选的是，内切木聚糖酶内切水解木聚糖中的(1→4)-β-D-木糖苷键。优选的是，内切木聚糖酶被归类为E.C.3.2.1.8。
本发明所用的酶组合物中使用的内切木聚糖酶可为包含选自下列的一种或多种核苷酸序列(或由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成)的核酸所编码的一种或多种内切木聚糖酶：SEQIDNo.33、SEQIDNo.11、SEQIDNo.5、SEQIDNo.4、SEQIDNo.2和SEQIDNo.1。
本发明所用的酶组合物中使用的内切木聚糖酶可为包含选自下列的一种或多种多肽序列(或由选自下列的一种或多种多肽序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种多肽序列组成)的一种或多种内切木聚糖酶：SEQIDNo.34、SEQIDNo.12、SEQIDNo.6和SEQIDNo.3。
“内切木聚糖酶活性测定法”(ABXU/g)
移取1.8mL1％桦木4-O-甲基葡糖醛酸木聚糖底物溶液，加入每根试管中。50℃温育10至15分钟，使底物溶液平衡。使用正位移移液管或等效设备移取0.2mL酶稀释液。涡旋混匀。50℃温育每份样品5分钟整。添加3mL1％3,5-二硝基水杨酸钠盐(DNS)溶液并混合。用盖子盖住各试管的顶部，防止蒸发。将试管放于沸水浴中，停留5分钟整。将各试管置于冰/水浴中冷却10分钟。室温温育试管10分钟。将试管内容物转移到比色皿中，以去离子水为参比，在540nm处测量。扣除相应酶空白的吸光度值，来校正背景色的吸光度。该测定法测量内切木聚糖酶作用于桦木木聚糖底物所释放还原糖的速率。使用DNS测量的还原糖释放速率与酶活性成正比。
一个ABX单位被定义为在50℃及pH5.3的条件下，每分钟产生1μmol木糖还原糖当量所需的酶量。
本文定义的β-葡萄糖苷酶活性，为水解末端非还原性β-D-葡糖基残基并释出β-D-葡萄糖的活性。根据E.C.分类法，可将β-葡萄糖苷酶活性归类为E.C.3.2.1.21。
本发明所用的酶组合物中使用的β-葡萄糖苷酶可为包含选自下列的一种或多种核苷酸序列(或由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种核苷酸序列组成)的核酸所编码的一种或多种β-葡萄糖苷酶：SEQIDNo.35和SEQIDNo.13。
本发明所用的酶组合物中使用的β-葡萄糖苷酶可为包含选自下列的一种或多种多肽序列(或由选自下列的一种或多种多肽序列组成，或基本上由选自下列的一种或多种多肽序列组成)的一种或多种β-葡萄糖苷酶：SEQIDNo.36和SEQIDNo.14。
“β-葡萄糖苷酶活性测定法”(pNPGU/g)
移取1mL3％硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液(使用0.05M醋酸钠缓冲液配制)，分别加入每份样品和对照的平行试管中。将各管置于50℃水浴中，停留5分钟。每隔15至30秒，将200μL对照或样品加入相应的平行管中。将200μL醋酸钠缓冲液加入试剂空白管中。加入样品后，涡旋各管。温育各管10分钟整。温育10分钟后，加入500μL1M碳酸钠溶液，使反应停止。加入碳酸钠溶液后，涡旋各管，并将试管置于水浴外的试管架上。向各管添加10mLmilli-Q水，涡旋混匀。使用试剂空白将分光光度计调零，在400nm处读取每个样品，由此测出4-硝基酚的浓度。
一个pNPG单位表示在50℃及pH4.8的条件下，每分钟从对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷释放1μmol硝基苯酚。
β-木糖苷酶活性可从(1→3)-β-D-木聚糖的非还原性末端水解连续的木糖残基，例如β-木糖苷酶可为1,3β-D-木糖苷酶。1,3β-D-木糖苷酶根据E.C.分类法可被归类为E.C.3.2.1.72，或可催化(1→4)-β-D-木聚糖水解，从非还原性或还原性末端去除连续的D-木糖残基，例如β-木糖苷酶可为1,4β-木糖苷酶。1,4β-木糖苷酶根据E.C.分类法可被归类为E.C.3.2.1.37。
“β-木糖苷酶活性测定法”
β-木糖苷酶酶分析方案与此前提出的分析方案(Ruttersmith,L.D.、DanielR.M.1993.Thermostableβ-glucosidaseandβ-xylosidasefromThermotogasp.strainFjSS3-B.1.Biochim.Biophys.Acta.1156:167-172，该文献的教导内容以引用方式并入本文)相似，但有一些修改。
根据本发明的β-木糖苷酶活性测定法按照下列步骤实施：β-木糖苷酶的底物为对硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(pNβxp)(Sigma–N2132)。为每个测试的酶建立剂量响应曲线。在7种剂量下(100ppm、50ppm、25ppm、12.5ppm、6.25ppm、3.13ppm、1.56ppm)对各酶进行测试，其中无酶对照样只包含底物和分析缓冲液。所有溶液均使用50mM醋酸钠缓冲液配制。标准反应混合物包含280μL0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.0，最终浓度为50mM)和由50mM醋酸钠缓冲液配制的80μL底物溶液(最终浓度为1mM)，然后加入由50mM醋酸钠缓冲液配制的不同剂量浓度的酶，将反应混合物的最终体积定容至400μl。将反应混合物(缓冲液和底物)置于70℃水浴中预热，再加入酶。加入酶并开始反应。将样品混合物温育10分钟，然后加入0.8ml0.1M的Na2CO3溶液使反应停止。使用摩尔消光系数ε400＝18,300M-1cm-1计算释放的对硝基酚浓度。将含酶孔的吸光度值减去对照组的吸光度值，再按照分析方案将所得吸光度值(A400)转换成浓度值。一个活性单位被定义为在分析条件下每分钟由pNβxp生成1μmol对硝基酚。
α-L-阿拉伯呋喃糖酶(E.C.3.2.1.55)可将阿拉伯聚糖水解为L-阿拉伯糖。
“α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性测定法”
该分析方案与此前提出的α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性分析方案(Miyazaki,K.(2005)Hyperthermophilicα-L-arabinofuranosidasefromThermotogamaritimaMSB8:molecularcloning,geneexpression,andcharacterizationoftherecombinantprotein.Extremophiles9(5):399-406，该文献的教导内容以引用方式并入本文)相似，但有一些修改。
根据本发明的α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性测定法按照下列步骤实施：α-L-阿拉伯呋喃糖酶的底物为对硝基苯基-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(pNαLaf)(Sigma-N3641)。为每个测试的酶建立剂量响应曲线。在7种剂量下(100ppm、50ppm、25ppm、12.5ppm、6.25ppm、3.13ppm、1.56ppm)对各酶进行测试，其中无酶对照样只包含底物和分析缓冲液。所有溶液均使用50mM醋酸钠缓冲液配制。标准反应混合物包含280μL0.1M醋酸钠缓冲液(pH5.0，最终浓度为50mM)和由50mM醋酸钠缓冲液配制的80μL底物溶液(最终浓度为1mM)，然后加入由50mM醋酸钠缓冲液配制的不同剂量浓度的酶，将反应混合物的最终体积定容至400μl。将反应混合物(缓冲液和底物)置于70℃水浴中预热，再加入酶。加入酶并开始反应。将反应混合物温育10min，然后加入0.8ml0.1M的Na2CO3溶液使反应停止。在400nm处，使用摩尔消光系数ε＝10,500M-1cm-1计算释放的对硝基酚浓度(Miyazaki，2005年)。将含酶孔的吸光度值减去对照组的吸光度值，再按照分析方案将所得吸光度值(A400)转换成浓度值。一个酶活性单位被定义为在分析条件下每分钟由底物生成1μmol对硝基酚。
在本发明所用的酶组合物活性的语境中所用的术语“基本上由……组成”是指酶组合物具有经表征的一种或多种活性，而不具有其它酶活性并且/或者不具有其它能够消化木质纤维素生物质的酶活性。
仅举例来说，下列酶可能适合根据本发明使用。
在一个实施例中，本发明所用的酶组合物可为单种酶或多种酶的组合(例如酶混合物)。
在一个优选的实施例中，根据本发明的酶组合物是酶混合物。
在一个实施例中，本文定义的每一种不同的酶活性优选由单独的蛋白质提供。换句话讲，每种酶活性属于不同的酶蛋白。定义的酶活性优选地是蛋白质的主要(或唯一)活性。换句话讲，定义的酶活性优选地不是蛋白质的副活性。
生物质
术语“木质纤维素”是指包含木质素和纤维素的组合物。木质纤维素材料也可包含半纤维素。
术语“纤维素”是指包含纤维素和附加组分(包括半纤维素在内)的组合物。
在一个实施例中，木质纤维素生物质为任一种纤维素或木质纤维素材料。术语“木质纤维素生物质”是指任一种木质纤维素材料，并包括含有纤维素的材料。木质纤维素生物质任选地还可包括半纤维素、木质素、淀粉、低聚糖和/或单糖。
生物质也可包含附加组分，例如蛋白质、脂质、灰分和/或提取物。生物质可源自单一来源，或者生物质可包括源自一种以上来源的混合物；例如，生物质可包括玉米棒和玉米秸秆的混合物，或草和叶片的混合物。
优选的是，木质纤维素生物质包含至少15％纤维素。
在一个实施例中，木质纤维素生物质包含至少20％纤维素。
木质纤维素生物质可为任一种纤维素或木质纤维素材料，例如农业残余物、生物能作物、工业固体废物、市政固体废物、来自造纸的淤渣、庭院废物、木材废物、林业废物和这些物质的组合。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可选自玉米棒、作物残余物如玉米皮、玉米秸秆、草、甜菜浆、小麦秸秆、小麦壳、燕麦秸秆、小麦次粉、小麦粉头、米糠、稻壳、小麦糠、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、棉花、木质素、大麦秸秆、干草、稻秆、稻壳、柳枝稷、芒草、大米草、草芦、纸废弃物、甘蔗渣、高粱渣、饲用高粱、高粱秸秆、大豆秸秆、大豆、粉碎树木获得的组分、树枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌木丛、蔬菜、水果、花。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可选自湿饲料饼、玉米纤维、玉米胚芽粕、玉米麸皮、玉米糁渣、玉米蛋白饲料、谷类面筋粉、小麦粉头、小麦次粉，基于(例如)玉米、小麦、高粱的干酒糟(DDG)和干酒糟可溶物(DDGS)，或这些物质的组合。
在一个优选的实施例中，木质纤维素生物质可选自玉米秸秆、小麦秸秆、玉米棒、甘蔗渣、柳枝稷、饲用高粱和稻秆。
在另一个实施例中，木质纤维素生物质可选自玉米秸秆、小麦秸秆、玉米棒、甘蔗渣、柳枝稷、饲用高粱和稻秆。
在一个实施例中，可用于本发明的生物质包括具有相对高碳水化合物值的生物质，这种生物质相对致密，并且/或者相对易于收集、运输、贮存和/或处理。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可包含少于50％淀粉，优选少于40％淀粉。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可包含少于30％淀粉，优选少于10％淀粉。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可包含少于3％淀粉。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可包含少于1％淀粉。
适宜的是，木质纤维素生物质不包含淀粉。
在一个实施例中，木质纤维素生物质不包含谷物。
预处理
在一个实施例中，采用本领域已知的任何预处理方法预处理木质纤维素生物质，这能够破坏木质纤维素生物质的致密结构，暴露纤维素纤维，并/或导致生物质结晶度(例如纤维素结晶度)下降，并/或增大酶活性的可及表面积。
在过去几十年里，已开发出多种预处理方法。一般来讲，这些预处理可分为机械/物理预处理、物理化学预处理、化学预处理和生物预处理，或这些预处理的组合。各种预处理的概述可见于(例如)XZhao,LZhang,DLiuReview:Fundamentalsofdifferentpretreatmentstoincreasetheenzymaticdigestibilityoflignocelluloses,Biofuels,Bioprod.Bioref.6:561–579(2012)，该文献的教导内容以引用方式并入本文。
预处理可为本领域已知的任何处理，所述处理要么导致纤维素结晶度降低，如采用Segal的方法(Segal等人，“AnEmpricalMethodforEstimatingtheDegreeofCrystallinityofNativeCelluloseUsingtheX-RayDiffractometer”,TextileResearchJournal,Oct.1959,Vol.29,No.10,786-794，该文献的教导内容以引用方式并入本文)测得；要么增大酶活性的可及表面积；或者同时实现这两种效果。
在一个实施例中，所述预处理是降低木质纤维素生物质中纤维素的结晶度的预处理。
在一个实施例中，所述预处理是在使用Segal方法(前述)测量时将木质纤维素生物质中纤维素的结晶度降低至少约20％的预处理。
在一个实施例中，所述预处理是增大木质纤维素生物质中酶活性的可及表面积的预处理。
在一个实施例中，所述预处理是将木质纤维素生物质中的可及表面积增大至少约20％、适宜地至少约30％、适宜地至少约40％的预处理。可及表面积可采用BET(Brunauer、Emmett和Teller)测定，Guo等人，BioresourceTechnology99(2008)6046-6053(该参考文献以引用方式并入本文)讲述了该测定法。
可采用Brunauer、Emmett和Teller(BET)分析法测量木质纤维素生物质的可用表面积，其中所述方法包括(i)称量0.5g干样品；(ii)使用室温(例如25℃)高纯氮气(99.999％)对样品脱气过夜；(iii)使用表面积分析仪(QuantachromeNOVA2000)执行BET分析。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可经受(或经受了)物理和/或化学和/或生物处理。该处理在本文中可称为物理和/或化学和/或生物方法预处理。
在一个实施例中，根据本发明的物理和/或化学预处理可为物理处理或化学处理或物理化学处理。
术语“物理和化学处理”与“物理化学处理”在本文中可互换使用。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可经受(或经受了)物理和/或化学预处理。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可经受(或经受了)物理预处理。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可经受(或经受了)化学预处理。
在一个实施例中，木质纤维素生物质可经受(或经受了)物理化学预处理。
物理和/或化学和/或生物处理可为本领域已知的任何物理和/或化学和/或生物处理(例如，预处理)。
机械/物理预处理
机械/物理预处理是指将切屑、磨削、干磨、湿磨、振动球磨、旋转球磨组合起来的机械粉碎过程。原料在切屑后的尺寸通常为10mm至30mm，在磨削或研磨后的尺寸通常为0.2mm至2mm，并且纤维素结晶度下降并且/或者可及表面积增大。用热水、酸或硫酸氢钠对生物质固体进行前期预处理以软化原料，可使研磨耗能更少。在本发明的一个实施例中，采用机械去结晶的方法预处理生物质。
术语“物理预处理”与“机械预处理”在本文中可互换使用。
物理化学预处理
物理化学预处理将生物质组合物的化学改性与细胞壁结构的物理断裂组合起来。一种实用的物理化学预处理为蒸汽爆破。在这种预处理中，用高压饱和蒸汽(高压和高温)处理生物质，任选地包括酸、碱或其它化学品的添加；然后迅速降压，使材料经受爆炸性减压。
在一个实施例中，物理和/或化学处理(例如，预处理)可为水热解或湿法氧化，并包括：用液态水和/或蒸汽提供的高压和/或高温，任选地包括酸、碱或其它化学品的添加。
在一个实施例中，压力在300psi至600psi范围内，优选在350psi至550psi范围内，优选在400psi至500psi范围内。
在一个实施例中，高温意味着温度在约100℃至300℃范围内，优选在约140℃至240℃范围内，例如在约170℃至200℃范围内。
仅举例来说，预处理可为包括蒸汽爆破的物理处理。
就纤维素结晶度来说，蒸汽爆破后，底物的结晶度指数(CrI)增大。Segal的文献(前述)中讲述了结晶度指数(CrI)。
物理化学预处理的另一个例子是氨纤维爆破(AFEX)，其中木质纤维素材料经液氨浸透，然后升温至约90℃。不希望被理论束缚，形成的氨气与生物质在压力下(例如17巴至20巴持续5分钟至10分钟)相互作用，然后迅速释放压力，这可能导致纤维素去结晶、半纤维素预水解和木质素结构改变以及/或者可及表面积增大。
AFEX预处理条件略微改变会导致形成不同的纤维素晶体结构，所以结晶度指数(CrI)可能受AFEX预处理条件影响。
另一种实用的物理化学预处理方法是液态热水预处理，该预处理使用水作为媒介在压力下预处理生物质，提升压力的目的是使水在高温下仍保持液态。通常也将这种预处理称为水热解或水热预处理。这种预处理可溶解总生物质的大约40％至60％，形成液态可溶性低聚糖，这些溶解的总生物质包括4％至22％纤维素和几乎全部半纤维素。因此，可观察到可及表面积增大。除此之外或作为另外一种选择，可观察到纤维素结晶度下降、纤维素与木质素的缔合程度降低以及纤维素解聚，这些因素都有助提升纤维素可及度。
在一个实施例中，预处理可为包括水热解或水热处理的物理化学预处理。
在一个实施例中，木质纤维素生物质为小麦秸秆，并且预处理包括使用水热处理。适宜的是，根据本发明的预处理可包括WO2011/125056(IBICON)中提出的水热处理，该专利的教导内容以引用方式并入本文。
辐射预处理涉及使用γ辐射、超声、电子束或微波预处理木质纤维素生物质的多种方法。辐射预处理还可与其它预处理搭配使用，以便进一步提高纤维素的可及性。不希望被理论束缚，由于纤维素、半纤维素和木质素在高辐射剂量下发生辐射降解，所以底物变得易碎。纤维素结晶度可能被γ辐射破坏到一定程度。微波预处理通常在有水、有机溶剂、碱或稀酸溶液的环境中进行。
化学预处理
化学预处理涉及在各种条件下使用不同化学品预处理生物质的多种方法。根据使用的化学品和预处理条件不同，这些预处理的机制有所不同。适宜的化学预处理方法的例子包括但绝不限于稀酸预处理、碱预处理、亚硫酸盐预处理、氧化预处理(例如湿法氧化)、纤维素溶剂预处理、氨渗滤(APR)和有机溶剂预处理。
在一个实施例中，预处理可为包括使用酸或碱处理的化学处理。
仅举例来说，物理和/或化学处理可为添加碱催化剂，或本领域已知的其它方法。
在一个实施例中，木质纤维素生物质为玉米秸秆，并且物理和/或化学处理包括使用酸处理。
在一个实施例中，预处理为稀酸预处理。例如，可将木质纤维素生物质材料与稀酸(通常为H2SO4)和水混合以形成浆液，用蒸汽加热至所需温度(通常介于160℃和220℃之间)，并且在一段停留时间后，闪蒸到大气压。
在一个具体的实施例中，预处理可包括以下几个步骤：a)使用0.2％H2SO4浸渍木质纤维素生物质(例如小麦秸秆)，例如以浸泡方式处理；b)压制材料，使干物质含量介于40％至50％之间；以及c)用190℃蒸汽预处理10min。任选地压制所得浆液，滤除液体；并任选地清洗固体残余物两至三次，之后进行压制，使最终固体含量变为约40％至50％。
在另一个具体的实施例中，预处理可包括以下几个步骤：a)用1％醋酸以浸泡方式浸渍木质纤维素生物质(例如小麦秸秆)；b)压制材料，使干物质含量介于40％至50％之间；以及c)用200℃蒸汽预处理10min。任选地压制后续浆液，滤除液体；并任选地清洗固体残余物两至三次，之后进行压制，使最终固体含量变为约40％至50％。
碱预处理可能涉及使用各种碱，例如NaOH、KOH、CaOH2、氨水、过氧化物和石灰(利用CaOH2)，来处理木质纤维素生物质，以对木质纤维素生物质进行预处理。不希望被理论束缚，据信在碱预处理期间，交联木聚糖半纤维素和木质素的分子间酯键发生皂化，从而导致生物质脱木质化。据文献记载，碱是用来溶胀纤维素并改变纤维素结晶多晶型物，从而影响纤维素消化率的合适试剂，其中纤维素结晶多晶型物改变表明结晶氢键网络改变。
在一个实施例中，物理和/或化学处理可为包括使用碱(例如氨)处理的化学处理。
在一个实施例中，预处理为无水氨预处理。
在一个具体的实施例中，预处理可为无水氨预处理，包括以下步骤：a)将木质纤维素生物质材料(例如玉米秸秆)放入容器中，为使无水氨能更顺畅地渗透生物质材料，已施压排空该容器；b)在140℃下，实施生物质材料与包含12％氨的水溶液的接触；c)氨预处理可持续最多25h，但也可能在较短的时间(如15分钟)后就观察到葡萄糖和木糖的最佳释放；d)施加真空，除去额外的氨水溶液，得到最终固体含量为50％至60％的干物质。
或者，物理化学处理可为WO2006/110891、WO2006/11899、WO2006/11900和WO2006/110901(DuPont)中所述的使用氨(例如，稀氨)的预处理方法，这些文献的教导内容以引用方式并入本文。
在一个实施例中，经预处理的生物质为用稀氨预处理过的玉米秸秆(DaCS)。
在一个实施例中，预处理为苛性脱木质化。
在一个实施例中，预处理可为苛性脱木质化预处理，包括以下步骤：1)在25至200℃之间且pH在9至11范围内的条件下，用0.5％至3％之间的亲核碱(例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化锂、氢氧化钾、氢氧化铯、氢氧化镁或它们的组合)处理生物质0.25h至20h；2)回收经预处理的生物质滤液，并使用去离子水清洗，除去任何过量的碱和溶解的副产物。
在一个具体的实施例中，预处理可为苛性脱木质化预处理，包括以下步骤：1)在约121℃且pH在9至11范围内的条件下，用0.5％至3％之间的氢氧化钠(NaOH)处理生物质0.25h至1.5h；2)回收经预处理的生物质滤液，并使用去离子水清洗，除去任何过量的碱和溶解的副产物。
Xu等人(2011)Bioresources6(1)707-720(该参考文献以引用方式并入本文)讲述了执行苛性脱木质化的一种方法。在一个实施例中，经预处理的生物质可为用前述Xu等人(2011)中提出的苛性脱木质化方法处理过的生物质。
在一个实施例中，经预处理的生物质为苛性脱木质化玉米秸秆(DLcs)和/或苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)。
在一个实施例中，经预处理的生物质为苛性脱木质化玉米秸秆(DLcs)和/或苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)。
在一个实施例中，亚硫酸盐预处理或亚硫酸盐制浆方法包括在酸性条件下对生物质材料进行亚硫酸盐处理，随后用圆盘精制(diskrefining)来机械性降低尺寸。亚硫酸盐预处理使得相当大一部分半纤维素被去除，纤维素聚合度降低，并使木质素磺化，增大了木质素亲水性。
另一种化学预处理可为氧化预处理，是指使用氧化剂除去木质素和还原性物质的方法。常用于氧化脱木质化的氧化剂包括臭氧、过氧化氢、氧气和过乙酸。该处理任选地可与其它化学或水热处理组合。根据使用的氧化剂和反应条件(例如pH)不同，木质素氧化降解的机制有所不同。就臭氧分解、湿法氧化和过酸脱木质化来说，芳香族和烯族结构降解涉及氧化剂最初的亲电攻击，然而在碱性H2O2预处理期间，这些结构被氢过氧化物阴离子的亲核攻击破坏。
在一个实施例中，物理和/或化学处理为湿法氧化。
在一个可用的实施例中，湿法氧化涉及用液态水和/或蒸汽提供的高压和/或高温，任选地包括酸、碱或其它化学品的添加。
高压可能意味着压力在300psi至600psi范围内，优选在400psi至500psi范围内，例如大约450psi。
高温可能意味着温度在约100℃至300℃范围内、优选在约180℃至200℃范围内保持5分钟至15分钟(SchmidtandThomsen,1998,BioresourceTechnol.64:139-151，该文献的教导内容以引用方式并入本文)。在一个实施例中，高温可能是约140℃至235℃。
适宜的是，湿法爆破是湿法氧化预处理方法的修改形式，其中组合了如上所述的湿法氧化和蒸汽爆破。在湿法爆破中，在预处理期间在特定停留时间后引入氧化剂。然后通过闪蒸到大气压，来终止处理(WO2006/032282，该专利以引用方式并入本文)。
仅以举例的方式，在一个实施例中，物理和/或化学预处理可涉及用液态水提供的高压和/或高温，其中水以液态和蒸汽混合物存在，任选地包括酸、碱或其它化学品的添加。此实施例中的高压可处于50psi至300psi的范围内，合适地为100psi至200psi的范围内，例如为约150psi。此实施例中的高温可处于约100℃至300℃的范围内，合适地为约170℃至220℃，例如从约170℃至200℃。
另一可用的化学预处理为有机溶剂预处理，其通过使用含水乙醇(例如40％至60％乙醇)在160-200℃下萃取30-60分钟而将纤维素生物质材料脱木质化。可添加硫酸作为催化剂。在有机溶剂预处理中，可去除大部分的半纤维素。
纤维素溶剂型预处理也是基于纤维素溶剂(例如磷酸(CPA)和离子液体(IL))对木质纤维素生物质进行处理的化学预处理。
生物预处理
在一个实施例中，可对木质纤维素生物质进行生物处理(例如生物预处理)。此类生物处理可以是本领域已知的任何生物处理。
在生物预处理中，可利用微生物对生物质进行预处理以提高剩余固体的酶消化率。所使用的微生物通常能够降解木质素和碳水化合物聚合物。例如，一些类型的真菌能够产生木质纤维素酶(这些酶能够协同降解植物细胞壁)，而其它类型的真菌能够产生过氧化氢。
生物预处理后，可及表面积可增加，从而提高纤维素的消化率。
仅以举例的方式，生物预处理可包括使用白腐真菌进行处理。已知一些白腐真菌例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、Phlebiasubserialis和糙皮侧耳菌(Pleurotousostreatus)能够有效代谢多种木质纤维素材料中的木质素(见于，例如SinghD和ChenS.“Thewhite-rotfungusPhanerochaetechrysosporium:conditionsfortheproductionoflignin-degradingenzymes.”，“AppliedMicrobiologyBiotechnology”，2008年，第81卷，第399-417页，该文献的教导内容以引用的方式并入本文)。
在预处理之前(例如经物理和/或化学和/或生物方法预处理之前)，也可使用本领域已知的方法对纤维素材料进行粒度减小、预浸泡、润湿、洗涤、或调理等处理。
本发明的方法可还包括将饲料组分与根据本发明的饲料添加剂组合物接触的步骤。
本发明也涉及改善动物生物物理特性的方法和用途。
优选地，给动物饲喂能够通过本发明方法获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物，或根据本发明的饲料添加剂组合物，或根据本发明的预混物，或根据本发明的饲料原料，或者能够通过本发明方法获得(例如，已获得)的饲料原料。
生物物理特性可选自以下一者或多者：动物性能、动物生长性能、饲料转化比率(FCR)、原材料消化能力(例如营养物质的消化率，包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率、纤维消化率)、氮保留率、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋尺寸、蛋重量、蛋质量、产蛋率和环境影响，例如粪肥产量和/或氮排泄率。
在本发明中，将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物一起温育。
适宜地，此类温育的时长为6小时至120小时，优选地为10小时至60小时、优选地为20小时至50小时、优选地为35小时至50小时、优选地为40小时至48小时。
在一些实施例中，温育期可为4小时至72小时。在一个实施例中，温育期为6小时至48小时。在一个实施例中，温育期为至少约6小时。在另一个实施例中，温育期少于72小时。本领域的技术人员应当理解，温育期将受干物质添加量的影响，当干物质添加量增大时，温育时间必须按比例地增加以达到相同的效果。
适宜地，所述温育会使得在温育期结束时，生物质中约5重量％至20重量％(优选为约10重量％至13重量％)的戊糖(木糖和阿拉伯糖)和约1重量％至10重量％(优选地为约1重量％至4重量％)的已糖为低聚物和聚合物形式。
适宜地，所述温育会使得在温育期结束时，约10重量％至29重量％(优选地为约16重量％至21重量％)的葡萄糖(木糖和阿拉伯糖)和约1重量％至10重量％(优选为约4重量％至7重量％)的木糖为单体单元。
温育期的时长可取决于所用的酶和/或所用的酶浓度。温育期的目的是使酶充分地降解生物质。举例来说，可由本领域的技术人员例如通过在酶处理之后采用重量分析测定不溶性生物质的减少量，来确定生物质是否充分降解。
在一个实施例中，干燥根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料。
术语“干燥”是指根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的水含量(重量％)被降低至小于15重量％，优选地小于10重量％。
因此，本发明还提供了根据本发明的干燥的产品或基本上干燥的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料，其水含量低于30重量％，优选地低于15重量％、优选地低于10重量％、优选地低于5重量％。
在一些实施例中，本发明可提供半液态产品或浆状产品。根据本发明的半液态产品或浆状产品的水含量低于90重量％、优选地低于80重量％、优选地低于70重量％或更优选地低于60重量％。
在一个实施例中，对根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料进行包装，并且/或者贮存于干燥的或基本上干燥的状态下。
本文所用的术语“干燥的”或“干燥状态”是指根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料不含水或仅含很少量的水。换句话讲，本文所用的术语“干燥的”或“干燥状态”可指根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的含水量(重量％)低于5重量％、优选地低于1重量％。
本文所用的术语“基本上干燥状态”是指根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料仅含很少量的水。换句话讲，本文所用的术语“基本上干燥状态”可指根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的含水量(重量％)低于30重量％、优选地低于15重量％、优选地低于10重量％。
在一个实施例中，根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的含水量低于20重量％。
在另一个实施例中，根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的含水量低于15重量％。
在另一个实施例中，根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的含水量低于10重量％。
在另一个实施例中，根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物和/或预混物和/或饲料原料的含水量低于5重量％。
优选地，根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物包含至少70％、优选地至少60％的以低聚物或聚合物形式存在于材料中的木糖单元。
本发明所用的酶组合物优选地在根据本发明的产品和/或饲料添加剂组合物中生成具有包括木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸在内的糖单元的可溶性低聚物和可溶性聚合物(例如低聚木糖、阿拉伯木聚糖低聚物)。
在一个优选的实施例中，酶组合物不会释放、或不会生成或释放大量单体形式的C-5糖(例如木糖)。
优选地，饲料添加剂组合物和/或饲料成分中少于50％的总C-5糖(例如木糖)以单体形式存在。
发明人已发现通过使用不存在或基本上不存在β-木糖苷酶活性和/或α-阿拉伯呋喃糖酶活性的酶组合物，能够将根据本发明的饲料添加剂组合物中C-5糖(例如木糖和/或阿拉伯糖和/或阿拉伯呋喃糖)含量维持在较低水平。
根据本发明的方法还可包括给动物饲喂所述饲料添加剂组合物。
在一个实施例中，设想本发明的方法还包括将饲料组分与饲料添加剂组合物混合，从而例如得到一种饲料或饲料原料。
本发明涉及通过将有效量的根据本发明的饲料添加剂组合物、或者有效量的由本发明的方法制备的饲料添加剂组合物、或者有效量的包括此类饲料添加剂组合物的饲料原料施用于动物，从而改善动物生物物理特性的用途和方法。
本文所用的术语“生物物理特性”是指选自以下的组中的一者或多者：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、原材料消化能力(例如营养物质消化率，包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率、纤维消化率)、氮保留率、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋尺寸、蛋重量、蛋质量、产蛋率和环境影响，例如粪肥产量和/或氮排泄率。
本文所用的术语“改善”是指相比于给动物饲喂未根据本发明处理的木质纤维素生物质而有所改善。
为确保木质纤维素生物质有效地降解，可在生物质中以适宜的浓度添加酶。在一些实施例中，酶的用量可以在每吨预处理的生物质中添加大约2.5g至20kg活性蛋白的范围内，合适地为每吨预处理的生物质中添加大约5g至14kg活性蛋白。
仅以举例的方式，假设每公吨(MT)饲料中添加5％至60％生物质，则每公吨饲料中活性蛋白为每公吨饲料0.125g至12kg。
在一个实施例中，饲料中酶的量可介于每公吨饲料中约0.125g至约12kg之间(合适地为每公吨饲料中约500g至约10kg之间，合适地为每公吨饲料中约1kg至约8kg之间)。
设想饲料原料中经处理的生物质含量能够是变化的。在一个实施例中，饲料中经处理的生物质含量为低于总饲料原料的90重量％、优选地为低于80重量％、合适地为低于70重量％、合适地为低于60重量％、合适地为低于50重量％、合适地为低于40重量％。优选地，饲料原料中经处理的生物质含量低于60重量％。
在一个实施例中，饲料中经处理的生物质含量高于总饲料原料的30重量％，优选地高于5重量％、优选地高于10重量％、优选地高于20重量％、优选地高于30重量％、优选地高于40重量％、合适地高于50重量％、合适地高于60重量％。优选地，饲料原料中经处理的生物质含量高于5重量％或10重量％。
在另一个实施例中，饲料中经处理的生物质含量在总饲料原料的约5重量％至70重量％的范围内，合适地在5重量％至60重量％的范围内，合适地在5重量％至50重量％的范围内，合适地在10重量％至40重量％的范围内。
在另一个实施例中，饲料中经处理的生物质含量在10重量％至70重量％的范围内。
在另一个实施例中，饲料中经处理的生物质含量在10重量％至40重量％的范围内。
在一个实施例中，本文所用的“混合”包括任何混合方法，例如搅拌、合并、喷洒等。
在一个实施例中，酶组合物在与木质纤维素生物质(例如经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质)混合之前，可为干性酶制剂(例如颗粒剂形式或位于载体上(例如小麦载体))。在另一个实施例中，酶组合物在与木质纤维素生物质(例如经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质)混合之前，可为液体制剂。
当酶在与木质纤维素生物质(例如经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质)混合之前为液体制剂时，可通过例如喷洒酶制剂或将木质纤维素生物质(例如经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质)浸入酶制剂中来混合该酶。
(酶处理之前或之后的)经物理和/或化学以及/或者生物预处理的生物质和/或干燥固体部分可经研磨和/或制粉并且/或者形成粗粉。
动物
本文所用的术语“动物”是指要施用或已经施用根据本发明的饲料添加剂组合物或包括根据本发明的所述饲料添加剂组合物的饲料原料的动物。
优选地，动物为哺乳动物、鸟类、鱼类或甲壳类动物，包括诸如牲畜或驯养动物(例如宠物)。
在一个实施例中，“动物”为牲畜。
本文所用的术语“牲畜”是指任何养殖动物。优选地，牲畜为以下动物中的一者或多者：奶牛或公牛(包括小牛)、猪(包括仔猪、生猪)、家禽(包括肉鸡、蛋鸡、小鸡和火鸡)、鸟、鱼(包括淡水鱼，例如鲑鱼、鳕鱼、鳟鱼和鲤鱼(例如锦鲤)和海鱼，例如黑鲈)、甲壳类动物(例如虾、贻贝和扇贝)、马(包括赛马)、绵羊(包括羔羊)。
在另一个实施例中，“动物”为驯养动物或宠物或动物园环境中饲养的动物。
本文所用的术语“驯养动物或宠物或动物园环境中饲养的动物”是指任何相关动物，包括犬科动物(如狗)、猫科动物(如猫)、啮齿类动物(如鼠、大鼠、小鼠)、鸟、鱼(包括淡水鱼和海鱼)，和马。
在一个实施例中，动物为单胃动物。在一个优选的实施例中，单胃动物可为家禽或猪(或它们的组合)。
在另一个实施例中，动物为反刍动物。
包装
在一个实施例中，对根据本发明的酶组合物和/或饲料添加剂组合物和/或饲料成分和/或预混物以及/或者饲料或饲料原料进行包装。
在一个优选的实施例中，酶组合物和/或饲料添加剂组合物和/或饲料成分和/或预混物以及/或者饲料或饲料原料包装在袋(例如纸袋)中。
在一个可供选择的实施例中，可将酶组合物和/或饲料添加剂组合物和/或饲料成分和/或预混物以及/或者饲料或饲料原料密封于容器中。可使用任何合适的容器。
饲料
本发明的饲料添加剂组合物可用作饲料，或者可用于制备饲料。
本文所用的术语“饲料”与“饲料原料”是同义的。
饲料可为溶液或固体的形式，这取决于其用途和/或应用模式和/或施用模式。
当本发明的组合物用作饲料或用于制备饲料(例如功能化饲料)时，该组合物可与如下一者或多者结合使用：营养上可接受的载体、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的辅料、营养上可接受的佐剂、营养活性成分。
在一个优选的实施例中，本发明的饲料添加剂组合物与饲料组分混合形成饲料原料。
本文所用的术语“饲料组分”是指全部或部分饲料原料。部分饲料原料可指饲料原料的一种组成部分或饲料原料的超过一种组成部分，例如2种或3种或4种组成部分。在一个实施例中，术语“饲料组分”涵盖预混物或预混物组成部分。
优选地，饲料为秣料或其预混物，配合饲料或其预混物。在一个实施例中，可将根据本发明的饲料添加剂组合物与配合饲料、配合饲料组分进行混合，或将根据本发明的饲料添加剂组合物混入配合饲料的预混物或混入秣料、秣料组分、或秣料预混物。
本文所用的术语“秣料”是指提供给动物的任何食物(而不是动物必须自己觅食)。秣料涵盖已被切碎的植物。
术语“秣料”包括干草、秸秆、青贮饲料、压缩饲料和颗粒饲料、油和混合给养，也包括发芽谷物和豆类。
秣料可得自选自以下的一种或多种植物：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属、Chaumoellier、羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自自然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、谷子、燕麦、高粱、大豆、树(用作树干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
术语“配合饲料”是指为粗粉、粒料、坚果、饲料饼或碎屑形式的商用饲料。配合饲料可由多种原材料和添加剂混合而成。这些共混物可根据目标动物的特定需求进行配制。
配合饲料可为提供所有日常所需的营养物质的完全饲料，提供部分给养(蛋白、能量)的浓缩物，或者仅提供附加微量营养素如矿物质和维生素的补充剂。
用于配合饲料的主要成分是饲料谷物，它们包括玉米、大豆、高粱、燕麦、和大麦。
适宜地，本文所指的预混物可为由微量成分诸如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产品、和其它必需成分组成的组合物。预混物通常为适合混入商业给养的组合物。
本发明的任何饲料原料可包括一种或多种选自包含以下各项的组的饲料材料：a)谷类，例如小粒谷类(如小麦、大麦、裸麦、燕麦和它们的组合)和/或大粒谷类，如玉蜀黍或高粱；b)来自植物(例如谷类)的副产物，例如湿饲料饼、干酒糟(DDG)、和干酒糟可溶物(DDGS)、玉米纤维、玉米胚芽粗粉、玉米麸皮、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、小麦粉头、小麦次粉或它们的组合(优选地为根据本发明的方法的副产物)；c)从诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、卡诺拉、鱼肉粉、干燥血浆蛋白、肉骨粉、马铃薯蛋白、乳清粉、干椰肉、芝麻来源获得的蛋白；d)从植物和动物来源获得的油脂和脂肪；e)矿物质和维生素。
本发明的饲料原料可包含至少30重量％、至少40重量％、至少50重量％或至少60重量％的玉米和豆粕、或玉米和全脂大豆、或小麦粗粉、或向日葵粗粉。
除此之外或作为另外一种选择，本发明的饲料原料可包括至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产物，以提供高纤维饲料原料。高纤维饲料材料的例子包括：小麦、大麦、裸麦、燕麦、来自植物(例如谷类)的副产物，例如湿饲料饼、干酒糟(DDG)、和干酒糟可溶物(DDGS)、玉米纤维、玉米胚芽粗粉、玉米麸皮、玉米粉渣、玉米蛋白饲料、小麦粉头、小麦次粉或它们的组合。也可认为一些蛋白质来源富含纤维：例如从诸如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的来源获得的蛋白质。
在本发明中饲料可为以下一种或多种：配合饲料和预混物，包括粒料、坚果或(家畜)饲料饼；以下作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、干椰肉、秸秆、谷壳、糖用甜菜废物；鱼粉；新割的草和其它饲用植物；肉骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；低聚糖；保藏的饲用植物：干草和青贮饲料；海藻；完整的或者经压碎、研磨等处理过的种子和谷物；发芽的谷物和豆类；酵母提取物。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖宠物食品。宠物食品是旨在由宠物食用的植物或动物材料，例如狗粮或猫粮。宠物食品(例如狗粮或猫粮)可为干燥形式(例如粗磨狗粮)，或湿罐头形式。猫粮可包含氨基酸牛磺酸。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖鱼食。鱼食通常包含使养殖鱼保持良好健康状态所必需的宏量营养素、痕量元素和维生素。鱼食可以为薄片状、颗粒或片剂的形式。颗粒形式(其中一些会迅速下沉)通常用于饲喂较大的鱼或底层鱼类。一些鱼食也包含添加剂，例如β-胡萝卜素或性激素，以人工提高观赏鱼的色泽。
本发明中的术语“饲料”在一些实施例中也涵盖鸟食。鸟食包括用于喂鸟器和喂养宠物鸟的食物。鸟食通常包括多种种子，也可含有板油(牛脂或羊脂)。
本文所用的术语“接触”指的是间接或直接将本发明的组合物应用到产品(如饲料)中。可使用的应用方法的例子包括，但不限于，在包括饲料添加剂组合物的材料中处理产品、将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用、将饲料添加剂组合物喷洒到产品表面或将产品浸入饲料添加剂组合物制剂中。
在一个实施例中，优选地将本发明的饲料添加剂组合物与产品(如饲料原料)进行混合。作为另外一种选择，饲料原料的乳液或原材料中可包括饲料添加剂组合物。
对于一些应用，重要的是使组合物在待影响/待处理的产品表面之上或之处可供使用。这使得组合物赋予动物以下一种或多种有利的特性：生物物理特性，例如，其中生物物理特性选自以下一种或多种：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、原材料消化能力(例如营养物质消化率，包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率、纤维消化率)、氮保留率、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋尺寸、蛋重量、蛋质量、产蛋率和环境影响，例如粪肥产量和/或氮排泄率。
可将本发明的饲料添加剂组合物和受控量的(一种或多种)酶散布、涂布和/或浸渍产品(例如饲料原料或饲料原料的原材料)。
优选地，本发明的酶组合物和/或饲料添加剂组合物对高达约70℃、高达约85℃或高达约95℃的热处理是热稳定的。可进行长达约1分钟、长达约5分钟、长达约10分钟、长达约30分钟、长达约60分钟的热处理。术语“热稳定”是指加热至特定温度前添加剂中存在/有效的酶组分的至少约75％在冷却至室温之后仍存在/有效。优选地，加热至特定温度前添加剂中存在且有效的酶组分的至少约80％在冷却至室温之后仍存在且有效。
在一个特别优选的实施例中，将酶组合物和/或饲料添加剂组合物均化，以制成粉末。
在一个可供选择的优选实施例中，将酶组合物和/或饲料添加剂组合物配制成如WO2007/044968中所描述的颗粒剂(称为TPT颗粒剂)，该文献以引用的方式并入本文。
在另一个优选的实施例中，当将酶组合物和/或饲料添加剂组合物配制成颗粒剂时，颗粒剂包括涂覆在蛋白芯上方的水合屏障盐。这类盐涂层的优势在于耐热性改善、贮存稳定性改善并且免于受到其它饲料添加剂对酶造成的不利影响。
优选地，用于盐涂层的盐在20℃下具有大于0.25的水活度，或大于60％的恒定湿度。
优选地，盐涂层包含Na2SO4。
制备饲料添加剂组合物的方法也可包括将粉末制成粒料的进一步步骤。可将粉末与本领域已知的其它组分进行混合。可施力使粉末、或包括粉末的混合物强行通过模具，并将所得线料切割成适宜的不同长度的粒料。
任选地，形成粒料之前，制粒步骤可包括蒸汽处理或调理阶段。可将包括粉末的混合物置于调理器中，例如带有蒸汽注射的搅拌器。在调理器中将混合物加热至特定温度，例如从60℃至100℃，典型的温度为70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可从数秒变化至数分钟甚至数小时。例如5秒、10秒、15秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
应当理解，本发明的饲料添加剂组合物适于加入至任何适宜的饲料材料中。
本文所用的术语“饲料材料”是指由动物食用的基本饲料材料。还应当理解，饲料材料可能包括，例如至少一种或多种未加工的谷物和/或加工过的植物和/或动物材料(例如豆粕或骨粉)。
本文所用的术语“饲料原料”是指已添加一种或多种饲料添加剂组合物的饲料材料。
技术人员应当理解，不同动物需要不同的饲料原料，并且根据饲养动物的目的不同，即使同一种动物也可能需要不同的饲料原料。
优选地，饲料原料可包括饲料材料，该饲料材料包括玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、裸麦、稻、木薯、高粱、和/或前述各者的任意副产物，以及高蛋白组分，像豆粕、油菜籽粗粉、卡诺拉粗粉、棉花籽粗粉、葵花籽粗粉、动物副产物粗粉和它们的混合物。更优选地，饲料原料可包括动物脂肪和/或植物油。
任选地，饲料原料也可包括附加的矿物质，例如，钙和/或附加的维生素。
优选地，饲料原料为玉米豆粕混合物。
在另一个方面，提供了制备饲料原料的方法。饲料原料通常在饲料加工厂中制备，在饲料加工厂中首先将原材料研磨至合适粒径大小，然后将研磨后的原材料与合适的添加剂混合。接下来，可将饲料原料制成糊状或粒状，后者通常涉及这样的方法，通过该方法将温度升高至目标水平，然后使饲料通过模具从而制备出特定大小的粒料。使粒料冷却。随后可加入液体添加剂(例如脂肪和酶)。制备饲料原料也可涉及额外的步骤，该步骤包括制粒之前的挤出或膨化，尤其是通过至少可包括使用蒸汽的适宜技术进行的挤出或膨化。
饲料原料可为饲喂单胃动物的饲料原料，诸如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉种鸡、火鸡、鸭子、鹅、水禽)、生猪(所有年龄段)、宠物(例如狗、猫)或鱼，优选地，饲料原料为家禽饲料原料。
仅举例来说，鸡(如肉鸡)的饲料原料在例如下表给出的阶段中可由下表列出的一种或多种成分(％)组成：
成分 育雏(％) 育成(％)
玉蜀黍 46.2 46.7
小麦次粉 6.7 10.0
玉蜀黍干酒糟可溶物 7.0 7.0
含48％粗蛋白的豆粕 32.8 26.2
动物/植物脂肪共混物 3.0 5.8
L-赖氨酸盐酸盐 0.3 0.3
DL-甲硫氨酸 0.3 0.3
L-苏氨酸 0.1 0.1
盐 0.3 0.4
石灰石 1.1 1.1
磷酸二钙 1.2 1.2
家禽维生素和微量矿物质 0.3 0.3
仅举例来说，鸡(如肉鸡)的饮食标准可如下表所示：
饮食标准
粗蛋白(％) 23.00 20.4026 -->
家禽代谢能(kcal/kg) 2950 3100
钙(％) 0.85 0.85
可利用磷(％) 0.38 0.38
钠(％) 0.18 0.19
可消化赖氨酸(％) 1.21 1.07
可消化甲硫氨酸(％) 0.62 0.57
可消化甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.86 0.78
可消化苏氨酸(％) 0.76 0.68
仅举例来说，产蛋鸡的饲料原料在例如下表给出的阶段中可由下表列出的一种或多种成分(％)组成：
仅举例来说，蛋鸡的饮食标准可如下表所示：
饮食标准
粗蛋白(％) 16.10
家禽代谢能(kcal/kg) 2700
赖氨酸(％) 0.85
甲硫氨酸(％) 0.42
甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.71
苏氨酸(％) 0.60
钙(％) 3.85
可利用磷(％) 0.42
钠(％) 0.16
仅举例来说，火鸡的饲料原料在例如下表给出的阶段中可由下表列出的一种或多种成分(％)组成：
仅举例来说，火鸡的饮食标准可如下表所示：
饮食标准
粗蛋白(％) 29.35 26.37 22.93 20.00
家禽代谢能(kcal/kg) 2.850 2.900 2.950 3.001
钙(％) 1.43 1.33 1.22 1.02
可利用磷(％) 0.80 0.71 0.65 0.53
钠(％) 0.16 0.17 0.17 0.17
可消化赖氨酸(％) 1.77 1.53 1.27 1.04
可消化甲硫氨酸(％) 0.79 0.71 0.62 0.48
可消化甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 1.12 1.02 0.90 0.74
可消化苏氨酸(％) 1.03 0.89 0.73 0.59
仅举例来说，仔猪的饲料原料在例如下表给出的阶段中可由下表列出的一种或多种成分(％)组成：
成分 阶段1(％) 阶段2(％)
玉蜀黍 20.0 7.0
小麦 25.9 46.6
裸麦 4.0 10.0
小麦次粉 4.0 4.0
玉蜀黍干酒糟可溶物 6.0 8.0
含48％粗蛋白的豆粕 25.7 19.9
乳清粉 10.0 0.0
大豆油 1.0 0.7
L-赖氨酸盐酸盐 0.4 0.5
DL-甲硫氨酸 0.2 0.228 -->
L-苏氨酸 0.1 0.2
L-色氨酸 0.03 0.04
石灰石 0.6 0.7
磷酸二钙 1.6 1.6
生猪维生素和微量矿物质 0.2 0.2
盐 0.2 0.4
仅举例来说，仔猪的饮食标准可如下表所示：
饮食标准
粗蛋白(％) 21.50 20.00
生猪消化能(kcal/kg) 3380 3320
生猪净能(kcal/kg) 2270 2230
钙(％) 0.80 0.75
可消化磷(％) 0.40 0.35
钠(％) 0.20 0.20
可消化赖氨酸(％) 1.23 1.14
可消化甲硫氨酸(％) 0.49 0.44
可消化甲硫氨酸+半胱氨酸(％) 0.74 0.68
可消化苏氨酸(％) 0.80 0.74
仅举例来说，生长猪/育肥猪的饲料原料在例如下表给出的阶段中可由下表列出的一种或多种成分(％)组成：
成分 生长/育肥(％)
玉蜀黍 27.5
含48％粗蛋白的豆粕 15.4
玉蜀黍干酒糟可溶物 20.0
小麦糠 11.1
米糠 12.0
芥花籽粗粉 10.0
石灰石 1.6
磷酸二钙 0.01
盐 0.4
生猪维生素和微量矿物质 0.3
赖氨酸盐酸盐 0.2
植物油 0.5
仅举例来说，生长猪/育肥猪的饮食标准可如下表所示：
形式
可以任何适宜的形式使用本发明的酶组合物和/或本发明的饲料添加剂组合物和其它组分和/或包括该酶组合物、饲料添加剂组合物和其它组分的饲料原料。
可以固体或液体制剂的形式或它们的替代形式使用本发明的酶组合物和/或本发明的饲料添加剂组合物。固体制剂的例子包括可湿润的、喷雾干燥或冷冻干燥的粉末、糊剂、大丸剂、胶囊、粒剂、片剂、粉剂和颗粒剂。液体制剂的例子包括，但不限于水性、有机或水性有机溶液、悬浮液和乳液。
在一些应用中，本发明的饲料添加剂组合物可与饲料混合，或施用于饮用水中。
针对速释型、迟释型、调释型、缓释型、脉冲释放型或控释型应用的形式的适宜例子包括粉末、糊剂、大丸剂、粒剂、片剂、丸剂、胶囊、珠剂、溶液或悬浮液中的一种或多种，且可包含调味剂或染色剂。
举例来说，如果本发明的组合物以固体形式(例如粒料形式)使用，该组合物也可包含以下一者或多者：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钙和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选地为玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羧基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐；造粒粘结剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯和滑石粉。
制备上述形式所用的营养上可接受的载体的例子包括，例如水、盐溶液、醇、硅树脂、蜡、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、单脂肪酸甘油酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
上述形式优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milksugar)、或高分子量聚乙二醇。
对于水悬浮液和/或酏剂，可将本发明的组合物与不同的甜味剂和调味剂、色素或染料进行组合，与乳化剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油、和它们的组合)进行组合。
与其它组分组合
本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或饲料原料、或预混物可与其它组分组合使用。
将本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或饲料原料、或预混物与适于动物食用的另一种组分组合能够为消费者提供医疗或生理机能益处。
在一个实施例中，“另一种组分”可为一种或多种酶。
本发明所用的合适的附加酶可为选自以下酶类的一种或多种酶：内切葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)、纤维二糖水解酶(E.C.3.2.1.91)、β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)、纤维素酶(E.C.3.2.1.74)、地衣多糖酶(E.C.3.1.1.73)、脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常被归类为E.C.2.3.1.x)、磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、植酸酶(例如6-植酸酶(E.C.3.1.3.26)或3-植酸酶(E.C.3.1.3.8))、α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)、蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))和/或甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施例中(尤其是饲料应用的实施例)，其它组分可为选自以下酶类的一种或多种酶：木聚糖酶(E.C.3.2.1.8、E.C.3.2.1.32、E.C.3.2.1.37、E.C.3.1.1.72、E.C.3.1.1.73)、淀粉酶(包括α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C.3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C.3.2.1.3))、和/或蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施例中(尤其是饲料应用的实施例)，其它组分可为淀粉酶(例如α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1))和蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62))的组合。
在一个实施例中(尤其是饲料应用的实施例)，其它组分可为β-葡聚糖酶，例如内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6)。
在一个实施例中(尤其是饲料应用的实施例)，其它组分可为甘露聚糖酶(例如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78))。
在一个实施例中(尤其是饲料应用的实施例)，其它组分可为脂肪酶(E.C.3.1.1.3)、脂质酰基转移酶(通常归类为E.C.2.3.1.x)、或磷脂酶(E.C.3.1.1.4、E.C.3.1.1.32或E.C.3.1.1.5)、合适地为脂肪酶(E.C.3.1.1.3)。
在一个实施例中(尤其是饲料应用的实施例)，其它组分可为蛋白酶(例如枯草杆菌蛋白酶(E.C.3.4.21.62)或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(E.C.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(E.C.3.4.21.x)或角蛋白酶(E.C.3.4.x.x))。
在一个实施例中，附加组分可为稳定剂、或乳化剂、或粘结剂、或载体、或赋形剂、或稀释剂、或崩解剂。
本文所用的术语“稳定剂”被定义为防止产品(如饲料产品)随时间推移发生变化的成分或成分组合。
本文所用的术语“乳化剂”是指防止乳液发生分离的成分(如饲料成分)。乳液是两种不相溶的物质，其中一种以液滴形式存在的物质包含于另一种物质之中。乳液可包括水包油型乳液或油包水型乳液，在水包油型乳液中，液滴或分散相为油，连续相为水；而在油包水型乳液中，水变成分散相，连续相为油。也可通过使用乳化剂而使泡沫(即气体分散于液体中)和悬浮液(即固体分散于液体中)稳定。
本文所用的术语“粘结剂”是指通过物理或化学反应而将产品粘结到一起的成分(如饲料成分)。例如在“凝胶化”过程中，水被吸收，从而产生粘结效果。然而，粘结剂可吸收其它液体(例如油)，并将其保持在产品之内。在本发明的语境中，粘结剂通常将用于固体产品或低水分含量的产品，例如烘培产品：酥皮糕点、甜甜圈、面包及其它产品。造粒粘结剂的例子包括以下物质中的一者或多者：聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
“载体”是指适用于施用酶的材料，并且包括本领域已知的任何此类材料，例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等，此类材料无毒且不与组合物的任何组分以有害的方式相互作用。
本发明提供了制备组合物(例如饲料添加剂组合物)的方法，该方法包括将本发明的饲料添加剂(以及优选地玉米或玉米副产物)与至少一种生理上可接受的载体混合，该载体选自以下物质中的至少一者：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA、山梨醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐和它们的混合物。
“赋形剂”的例子包括以下物质中的一者或多者：微晶纤维素和其它纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二氢钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milksugar)和高分子量聚乙二醇。
“崩解剂”的例子包括以下物质中的一者或多者：淀粉(优选地为玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复杂的硅酸盐。
“稀释剂”的例子包括以下物质中的一者或多者：水、乙醇、丙二醇和甘油、及它们的组合。
其它组分可同时(如当其它组分同时存在于混合物中或者哪怕当它们通过不同途径提供时)或依次(如其它组分可通过不同途径提供)用于本发明的饲料添加剂中。
在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或饲料原料、或预混物不包含铬或有机铬。
在一个实施例中，优选地，根据本发明的饲料添加剂组合物、或饲料成分、或饲料或饲料原料、或预混物不包含山梨酸。
生物物理特性
本文所用的“生物物理特性”是指改善动物健康和/或性能以及/或者产量的任何动物生物物理性质。举例来说，所关注的生物物理特性可为选自以下特性的一种或多种特性：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、原材料消化能力(例如营养物质消化率，包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率、纤维消化率)、氮保留率、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋尺寸、蛋重量、蛋质量、产蛋率和环境影响，例如粪肥产量和/或氮排泄率。
在一个优选的实施例中，来源于根据本发明的方法或用途的生物物理特性可为选自以下特性的一种或多种特性：动物性能、动物生长性能、饲料转化率(FCR)、原材料消化能力(例如营养物质的消化率，包括淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率、纤维消化率)、氮保留率、屠体收率、生长速率、增重、体重、质量、饲料效率、体脂百分比、体脂分布、生长、蛋尺寸、蛋重量、蛋质量、产蛋率和环境影响，例如肥料产量和/或氮排泄率。
在一个实施例中，动物的生物物理特性是指动物性能。
性能
本文所用的“动物性能”可由饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率和/或饲料中营养物质消化率(例如氨基酸的消化率)和/或饲料中消化能或代谢能及/或氮保留率而确定。
优选地，“动物性能”由饲料效率和/或动物增重和/或饲料转化率而确定。
“动物性能改善”是指相比于给动物饲喂未根据本发明处理的木质纤维素生物质，使用本发明的饲料添加剂组合物使得动物的饲料效率提高、并且/或者增重变大、并且/或者饲料转化率减小、并且/或者饲料中营养物质或能量消化率增大并且/或者氮保留率增加。
优选地，“动物性能改善”是指饲料效率提高和/或增重变大和/或饲料转化率减小。
本文所用的术语“饲料效率”是指在一段时间内给动物无限制地喂食或饲喂规定量的食物时出现的动物体重的增加量。
“饲料效率提高”是指相比于饲喂未根据本发明处理的木质纤维素生物质的动物，在饲料中使用根据本发明的饲料添加剂组合物会使每单位饲料摄入量所致的增重变大。
饲料转化率(FCR)
本文所用的术语“饲料转化率”是指为使动物体重增加特定的量而饲喂给动物的饲料的量。
饲料转化率改善是指饲料转化率降低。
“饲料转化率降低”或“饲料转化率改善”是指相比于当未根据本发明处理的木质纤维素生物质用于饲料中或用作饲料时为使动物增加特定量的体重所需的饲料量，在饲料中使用饲料添加剂组合物会使动物增加等量体重所需的饲喂动物的饲料量更少。
营养物质消化率
本文所用的营养物质消化率是指从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的营养物质的比率。营养物质消化率可通过施用给动物的营养物质施用量和动物粪便中该营养物质的排出量之间的差值来测量，或通过施用给动物的营养物质施用量和胃肠道特定区段(例如回肠)里消化物中该营养物质的保留量之间的差值来测量。
本文所用的“营养物质消化率”可由在一段时间内营养物质的摄入量和通过排泄物完全收集而得出的营养物质排出量之间的差值来测量；或通过使用未被动物吸收的惰性标记物来测量，此标记物使研究人员能够计算出在整个胃肠道或胃肠道区段消失的营养物质含量。此类惰性标记物可为二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为饲料中营养物质的百分比、或表示为饲料中每质量单位的营养物质中所含可消化的营养物质的质量单位数。
本文所用的“营养物质消化率”涵盖淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。
本文所用的“能量消化率”是指所食用饲料的总能量减去粪便的总能量，或所食用饲料的总能量减去动物胃肠道特定区段(例如回肠)中剩余消化物的总能量。本文所用的“代谢能”是指表观代谢能，并意指所食用饲料的总能量减去包含在消化产生的粪便、尿液、和气体产物中的总能量。可使用与测定营养物质消化率相同的方法，通过总能量的摄入量与粪便排出的总能量之间的差值，或与胃肠道特定区段(例如回肠)中存在的消化物总能量之间的差值来测量能量消化率和代谢能，同时对氮排泄进行适当校正来计算饲料的代谢能。
氮保留率
本文所用的氮保留率是指动物将饮食中的氮保有为体重的能力。当氮排泄量超过每日摄入量时，会出现负的氮平衡，肌肉减少时通常会观察到此现象。正的氮平衡常常与肌肉生长相关，尤其是对于生长期动物来说。
氮保留率可由在一段时间内氮的摄入量与通过排泄物和尿液完全收集而得出的氮排出量之间的差值来测量。应当理解，排出的氮包括饲料中未消化的蛋白质、内源性蛋白质的分泌物、微生物蛋白质和尿氮。
屠体收率和产肉量
本文所用的术语“屠体收率”是指经过商业或实验宰杀过程之后，作为活体重量一部分的屠体的量。术语“屠体”是指为食用而已被宰杀，并去除头部、内脏、四肢部分、和羽毛或皮的动物躯体。本文所用的术语“产肉量”是指作为活体重量一部分的可食用肉量，或作为活体重量一部分的特定肉块量。
增重
本发明还提供了增加动物(如家禽或生猪)体重的方法，该方法包括向所述动物饲喂包括根据本发明的饲料添加剂组合物的饲料原料。
“增重变大”是指相比于饲喂包括未根据本发明处理的木质纤维素生物质的饲料或饲喂由未根据本发明处理的木质纤维素生物质组成的饲料的动物，饲喂包括饲料添加剂组合物的饲料的动物体重增加。
除非另外定义，本文所用的所有科技术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的一样。Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,20ED.,JohnWileyandSons,NewYork(1994)和Hale&Marham,THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY,HarperPerennial,NY(1991)为技术人员提供了本公开中所用的许多术语的通用词典。
本公开不受本文所公开的示例性方法和材料的限制，与本文所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料均可用于本公开的实施例的实践或测试中。数值范围包括限定范围数值的端值在内。除非另外指明，任何核酸序列均以5'至3'取向从左到右书写，氨基酸序列以氨基至羧基取向从左到右书写。
把说明书作为一个整体时，本文所用的标题并非是对本公开不同方面或实施例的限制。因此，把说明书作为一个整体时，下面即将定义的术语就定义得更全面。
本文中使用氨基酸名称、三字母缩写或单个字母缩写来表示氨基酸。
本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
本文所用的术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”是同义的。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”是同义的。
术语“蛋白”和“多肽”在本文中互换使用。在本公开和权利要求书中，对于氨基酸残基可使用传统单字母和三字母代码。该三字母代码是依照IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)所定义的氨基酸三字母代码。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由不止一个核苷酸序列编码。
必须注意，如本文所用，以及在所附的权利要求书中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一种酶”的涵义包括多种此类候选试剂，并且“所述饲料”的涵义包括一种或多种饲料的涵义及本领域的技术人员已知的它们的等同物，等等。
本文所述的出版物仅仅是出于参考其在本专利提交日之前的公开内容而提供的。本文中的内容都不应理解为承认该类出版物可作为所附权利要求书中的现有技术。
现仅以举例的方式参照以下附图和实例来描述本发明。
实例
概要
由于金砖四国(巴西、俄罗斯、印度和中国)人口增长和生活水平不断提高，食物和饲料价格一直在飙升。本发明旨在提供用于动物生产的替代饲料成分。
本发明人惊讶地发现，消除C5糖单体生成并提高C5低聚物生成同时伴有纤维素酶活性(例如，从而生成C6低聚物和C-6单体糖)对用于或用作饲料原料的植物材料(例如木质纤维素生物质)的生产是有利的。
材料和方法
测试的酶为：
·纤维素酶SC是一种酶组合物，具有以下酶活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。纤维素酶SC保存于-20℃下，使用前解冻。
·内切木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶)—DaniscoXylanaseTM40000L(同义词：木聚糖酶Y5或Y5)可得自DaniscoAnimalNutrition,DuPontA/S—稀释至9293U/g。
·内切木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶)—EconaseXTTM可得自ABVista。该酶为0.51mg蛋白/ml的纯化形式。EconaseXTTM是木聚糖酶的变体，来自于放线菌Nonomuraeaflexuosa(Leskinen等人，ApplMicrobiolBiotechnol(2005)67:495–505)。
·内切木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶)—(FoxXyn6)如PCT/CN2012/079655中所教导的(该文献以引用的方式并入本文)，由核苷酸序列SEQIDNo.1或SEQIDNo.2编码且具有多肽序列SEQIDNo.3。
·内切木聚糖酶(内切-1,4-β-木聚糖酶)—(同义词：FveABC5、FoxXyn4、FveXyn4)如PCT/CN2012/079650中所教导的(该文献以引用的方式并入本文)，由核苷酸序列SEQIDNo.4或SEQIDNo.5编码且具有多肽序列SEQIDNo.6。
·TrioTM是一种比较型酶组合物，具有内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、和内切木聚糖酶活性以及C-5单体形成酶活性，例如β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。TrioTM的建议剂量为0.05至0.3mL每克纤维素或大致0.03至0.16mL每克生物质(取决于生物质组成)。使用前将TrioTM保存在-20℃。
预处理的生物质：经稀氨水预处理的玉米秸秆(DaCS)来自DuPont(生产批号HP90-HP93)。该玉米秸秆具有约65％固体含量，且含有少量乙酰胺。该玉米秸秆根据DuPont专利申请(WO2006/110901A2—该专利申请以引用的方式并入本文)制备。
使用来自Biorad(Hercules,CAUSA)的AminexHPX-87P色谱柱(300mm×7.8mm)分析糖。糖和低聚物的释放表明生物质发生水解。根据制造商，以下糖可实现良好分离：1.纤维二糖，0.1％；2.葡萄糖，10％；3.木糖，0.1％；4.半乳糖，0.1％；5.阿拉伯糖，0.1％；6.甘露糖，0.5％。使用的分析条件为：柱温箱温度设置为80℃，流速设置为0.5mlmilliQ水/min。HPLC为DionexSummit，配备P580泵和ShodexRI检测器。使用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖标准物(1％(w/v))。进样量为10或20μl。
在DionexHPLC上使用来自Dionex的CarboPac色谱柱对葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和低聚糖进行分析。
同样也在DionexHPLC的DionexCarboPac色谱柱上对释放的糖、低聚物和聚合物进行分析。
游离单糖的测定：在16000×g下离心样品5min，保留上清液。使用2ml甲醇和2ml水将强阴离子交换固相萃取柱(SAXSPE)(可得自SigmaFineChemicals)(500mg吸附剂)调理。将0.1ml样品溶液加入固相萃取柱，然后样品在真空作用下被吸入试管。使用2ml水清洗固相萃取柱，并将清洗液收集至同一试管中。根据不同单糖浓度，用水将每个样品稀释至10ml(或其它适宜体积)。酸水解后总糖的测定：向35ml试管中加入0.100ml样品、0.100ml水和0.200ml2MH2SO4。用塞子塞住该试管并于100℃下静置3小时。试管冷却后加入29.6ml水。然后将样品在13000×g下离心5min，并使用0.45μm滤纸过滤。根据不同糖浓度，进一步用水稀释样品。聚合糖含量按照以下计算：
在DionexHPLC上使用CarboPacTMPA1(4mm×250mm)对过程样品进行分析，使用CarboPacTMPA1(4mm×40mm)作为预处理柱(可得自Dionex)。柱温箱温度：30℃。流动相：A：HPLC级水，B：0.2MNaOH，进样量：25l，流速：1ml/min。所使用的梯度程序为：0min，10％B；1.1min，10％B；5.0min，0％B；33min，0％B；34min，100％B；41min，100％B；42min，10％B；56min，10％B。使用PED检测器(脉冲电化学检测器)。所使用的糖标准物为：L(+)阿拉伯糖(Merck1488)、D-半乳糖(Merck4058)、D(+)-木糖(Merck8689)、D(+)葡萄糖(Merck8337)、D(+)甘露糖(Merck5984)。聚合糖(mg/l)＝酸水解后总糖(mg/l)-游离单糖(mg/l)。
实例1使用纤维素酶SC水解经稀氨水预处理的玉米秸秆(DaCS)。
经稀氨水预处理的玉米秸秆(DaCS)：向50mlFalcon离心管中加入15gDaCS和自来水，并用2NHCl将pH调至5.0。加入1.33ml纤维素酶SC(产品生产批号118(蛋白浓度为76.6g/L)，本文中称为纤维素酶SC118)，开始反应。生物质DaCS的最终浓度为18.4％(w/v)。纤维素酶SC118：生物质比率(w/w)为1.08:100。
该反应于50℃、200rpm转速下振荡70h。分别在反应21.5h、45.5h、62.5h和70.5h(即反应结束时)时，瞬时离心Falcon离心管中的生物质，并取出液体样品。各时间间隔内的取样大小均为60μl，然后将取出的样品与60μl用于冲洗吸取样品的移液管吸头的水混合。进行HPLC分析之前将收集的样品保存于5℃下。然后将每个样品再与120μlmilliQ水混合，在100℃下加热5min并过滤。将10μl滤液进样到HPLC，分析释放的糖。分别向三个Falcon离心管中加入14mlmilliQ水，洗涤离心后所残余的生物质。将洗涤后的残余生物质在80℃下干燥20h，称重。将所称得的重量与未经酶组合物处理的生物质重量进行比较。
实例1的HPLC分析结果
图1为纤维素酶SC处理DaCS得到的葡萄糖和木糖产量。
图1基于下表(表1)中详细列出的数据。可从表中看出，在50℃及pH＝5.0下，长达70.5h内由DaCS释放的木糖含量低于释放的葡萄糖含量的1/3。
表1
实例1的重量分析结果
从表2可以看出，在体外条件下，56％的DaCS发生转化。可通过进一步优化混合来提高DaCS的转化率。
表2：在50℃，70.5h时，纤维素酶SC对玉米秸秆的生物质水解情况
结果表明对于生物质水解最有效的纤维素酶是TrioTM。从HPLC色谱图中可以看出水解产物为葡萄糖、木糖、和少量的阿拉伯糖。
纤维素酶SC混合物水解了DaCS，但与比较型酶组合物TrioTM(图2)不同的是，纤维素酶SC总体上水解效率更低，而且也产生更少C5糖(木糖和阿拉伯糖)。由于单胃动物利用C5糖的效率较低，所以形成更少的C5糖是有利的。这一结果表明纤维素酶SC具有低(或不具有)β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
结果发现纤维素酶SC加上内切木聚糖酶(DaniscoXylanaseTM)能够促进葡萄糖和低聚木糖的释放。这对于将其应用到饲料原料中是非常有利的。
实例2使用纤维素酶SC水解稀氨水处理的玉米秸秆(DaCS)以及添加内切木聚糖酶 的效果。
分别向9个容积为12ml的塑料管中加入1gDaCS、5mlMilliQ水并混匀，将管于5℃下静置过夜以确保DaCS良好水合。第二天加入150μl1NHCl，将pH调至4.6至5.1。加入酶(下表3中所列)，开始反应。该反应于50℃、180rpm转速下振荡40h。分别收集在反应时间6h、19h、和40h时的液体样品(120μl)，使用120μlMilliQ水稀释样品，保存于5℃下以备分析。酶反应结束时，在收集的各样品中再加入240μlmilliQ水，然后在100℃水浴中加热5min，之后在10000g下离心10min。随后过滤250μl上清液，并将10μl滤液进样到HPLC中进行分析。过滤1％(w/v)的葡萄糖和木糖标准物，使用与收集的样品水解产物相同的条件和进样量进行HPLC分析。
生物质减重分析：将9个管中离心后得到的残余生物质，去除上清液之后，加入4ml水，并振荡以洗掉沉淀中任何可溶解性物质。将悬浮液再次离心得到洗涤后的生物质残余物，然后在60℃下干燥48h。
表3
实例2的HPLC分析结果
纤维素酶SC(纤维素酶SC118和纤维素酶SC151)产生的木糖远远少于TrioTM(参见图2和图3)。纤维素酶制剂纤维素酶SC产生的葡萄糖也少于TrioTM。从反应时间6、19和40h的分析结果推断，该结果同样适用于整个反应过程(下图2)。
纤维素酶SC连同内切木聚糖酶(FoxXyn4)促进了整个反应时间进程中葡萄糖和木糖的释放。纤维素酶SC连同木聚糖酶一起释放的木糖(例如C5糖)远远少于TrioTM释放的木糖。
在DionexHPLC中使用CarboPac色谱柱进一步分析了表2中生成的水解产物。结果在图3中给出。从图3中可以看出，产生的单糖总量与图2结果相似。此外，图3表明纤维素酶SC处理或纤维素酶SC加上内切木聚糖酶处理得到的总的可溶性聚合糖多于TrioTM处理得到的总的可溶性聚合糖。
从图3可以看出，在添加或未添加木聚糖酶的情况下，由纤维素酶SC释放的总的可溶性聚合物型糖是由具有β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性的TrioTM释放的总的可溶性聚合物型糖的4倍。使用Dionex的CarboPac色谱柱分析糖。
实例3对使用纤维素酶SC水解经稀氨水预处理的玉米秸秆(DaCS)和添加不同木聚 糖酶的效果的进一步研究
称取1gDaCS至表3列出的每个容积为12ml的管中，加入4.6ml水和0.15ml1NHCl，并混匀。所测pH为5.03至5.17。然后在50℃下加入TrioTM、纤维素酶SC118或纤维素酶SC118加上10至120μl5种不同的木聚糖酶，开始反应，以200rpm振荡45h。管22至管24是未添加酶的对照样。管3k、管6k、管12k、管15k、管18k、和管21k是空白样。
表3“-”表示未添加相关组分
*纯EconaseXT是比EconaseXT更纯的一种形式，在SDS-PAGE凝胶上仅显示一个对应于木聚糖酶的条带。
反应结束时，将所有管以3500rpm离心10min并收集上清液。分别使用4ml和3.5mlmilliQ水洗涤沉淀两次，再重复离心操作。合并所有上清液并调至最终体积12ml。取其中0.3ml在100℃下加热7min，过滤，并将10μl滤液进样到HPLC进行糖分析。同样也将阿拉伯糖、木糖和葡萄糖(质量体积百分比)标准物过滤并将10μl滤液进样到HPLC。每个样品进行两次HPLC运行。
生物质重量分析：将最终残余的生物质沉淀置于80℃下干燥48h并称重，得到净重。
实例3的HPLC分析结果
从图4可以看出，将纤维素酶SC与所有不同的木聚糖酶组合，葡萄糖产量均提高了约30％至40％，这与由TrioTM所得的葡萄糖产量是一致的。木糖产量也提高了，但其产量明显低于TrioTM所得的产量。
由TrioTM所得的DaCS水解产物的典型的HPLC色谱图示出葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的单糖峰(见图5)，该单糖峰在聚合物区域具有非常平坦的峰(保留时间为9.22min处的峰2)。
与图5中由TrioTM所得的更高更宽的低聚物和聚合物峰相比，由纤维素酶SC(下迹线)以及纤维素酶SC与DaniscoXylanaseTM联用(上迹线)所得的DaCS水解产物的典型的HPLC色谱图示出了葡萄糖峰、木糖峰和阿拉伯糖峰(见图6)。
图5和图6示出纤维素酶SC以及纤维素酶SC与木聚糖酶联用生成的木糖峰值更低，生成的葡萄糖峰值也更低。另一方面，在保留时间6.5至11.5min区域内，低聚物和聚合物的含量较高。
本发明人惊讶地发现，将水解产物用作饲料成分时(特别是用作单胃动物的饲料成分时)，降低木糖(及甚至葡萄糖)含量并增加低聚物和聚合物含量是有利的。
本发明人发现，木糖不是单胃动物能量的有效来源，因为食用的木糖中有大约50％以尿液形式排出。另一方面，低聚物和聚合物可被占据大肠的微生物群发酵成短链脂肪酸，短链脂肪酸可被吸收进入血流并被动物用作能量来源。
实例3的重量分析结果
从下图7中根据酶反应之后所得残余生物质的重量减少可以看出，在纤维素酶SC存在的情况下，内切木聚糖酶(例如DaniscoXylanaseTM、EconaseXTTM、FoxXyn4或FoxXyn6，或DaniscoXylanaseTM、EconaseXTTM的更高纯形式)的添加均增强了水解。图7中示出的水解使用非工业加工条件以及更短时间进行，以适应小试规模测试的限制。因此，总体水解程度是次优的，但仍然反映出当纤维素酶SC和内切木聚糖酶联用时水解得到改善。
实例4对使用纤维素酶SC水解稀氨水处理的玉米秸秆(DaCS)以及纤维素酶SC和内 切木聚糖酶(DaniscoXylanase TM )剂量效应的进一步研究
向表4列出的每个管中加入1gDaCS，加入水和0.15ml1NHCl使容积达到12ml，混匀。然后在50℃下加入50至200μl纤维素酶SC118或50至200μl纤维素酶SC118加上10μlDaniscoXylanaseTM，开始反应，并以250rpm振荡40h。反应结束后，将管离心，并收集上清液。分别使用4ml和3.5ml水通过重悬和离心洗涤沉淀两次。合并上清液，并通过添加额外的水将体积调节至12ml。将合并的上清液(2ml)于100℃下放置10min使酶失活，然后离心并过滤。使用HPLC分析滤液，进样量为10μl。洗涤后的沉淀在80℃下干燥48h。
表4
实例4的重量分析结果
从图8可以看出，DaCS的干物质含量为63.3％(左边第一列)。在50℃下，将DaCS在使用HCl将pH调至5的水中温育40h，16.0％干物质变为可溶(图9中左边第二列)。添加10μl(93单位)内切木聚糖酶，使DaCS的溶解度进一步增加至26.9％。单独添加纤维素酶SC118使DaCS的溶解度增加至41.7％。10μl内切木聚糖酶与50μl纤维素酶SC118组合，使DaCS的溶解度达到约51.7％，这表明木聚糖酶和纤维素酶SC具有加性效应。为达到由10μl木聚糖酶与50μl纤维素酶SC联用得到的溶解度水平，需要单独添加3倍或更多的纤维素酶SC(150μl和200μl)。结论是，对于DaCS的增溶而言，50μl纤维素酶SC与10μl内切木聚糖酶联用优于单独添加50、100和150μl纤维素酶SC。对于干物质负荷为10％(w/v)的DaCS，50μl纤维素酶SC加上10μl内切木聚糖酶是最佳的，因为100、150和200μl纤维素酶SC加上10μl内切木聚糖酶不会进一步增加溶解度。一般认为溶解度越高，体内消化率也越高。
实例4的HPLC分析结果
从图10可以看出，在未添加酶或添加10μl(93单位)DaniscoXylanaseTM的情况下，DaCS的可溶性级分没有游离的葡萄糖。这表明由单独添加DaniscoXylanaseTM释放的26.9％的可溶性物质大体上为低聚物和聚合物形式(图9)。向反应中添加剂量为50、100、150至200μl纤维素酶SC，能够增加葡萄糖和木糖的释放，但增量与纤维素酶SC的剂量不成线性关系(图10)。
从图10中也可以看出，由50μl纤维素酶SC加上10μlDaniscoXylanaseTM释放的葡萄糖含量高于由100μl纤维素酶SC单独释放的葡萄糖含量；100μl纤维素酶SC加上10μlDaniscoXylanaseTM的效果大致上等于单独150μl纤维素酶SC，并且150μl纤维素酶SC加上10μlDaniscoXylanaseTM的效果大致上等于单独200μl纤维素酶SC。
结论是，很明显对于葡萄糖和木糖的释放，DaniscoXylanaseTM和纤维素酶SC具有协同效应，因为由50μl纤维素酶SC加上10μlDaniscoXylanaseTM释放的葡萄糖含量高于仅由10μlDaniscoXylanaseTM释放的葡萄糖含量(基本上没有葡萄糖释放)以及仅由50μl纤维素酶SC释放的葡萄糖含量的总和(图10)。
图11示出DaCS酶解、接着离心和洗涤之后所得的12ml上清液中总的可溶性糖的浓度。可以看出水解后主要的糖是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，次要组分是半乳糖和甘露糖。
结论
研究了不同纤维素酶制剂的糖释放。对于动物营养而言，商业酶组合，特别是生物乙醇行业中那些用于分解木质纤维素生物质的酶组合，用于动物营养中是不理想的，主要因为该类组合物会生成大量木糖。我们已经发现，单胃动物不能有效地消化并利用木糖。
酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，其中酶组合物中不存在、或基本上不存在以下酶活性中的一者或两者：β-木糖苷酶活性和α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性，该酶组合物被认为是降解木质纤维素生物质的同时生产最适于用作动物饲料组合物或用作饲料原料的产品的最有效组合物。
实例5：木糖作为肉鸡的能量来源
本研究共使用了240只Ross308品系的雄性肉鸡(1日龄)。在孵化时将鸡逐一称重，并分成12组，每组包括5只体重均衡的鸡。然后将每组鸡称重，并将每组鸡圈养在笼中的电加热Petersime层架式育雏器上。第一周，分别将育雏器和室温设置为32℃和29℃。此后，关闭育雏器的热供应，但在整个实验过程中室温始终维持在29℃。研究持续21天，在此期间喂给鸡以下四种处理剂中的一种：1：基础饮食(基于玉米豆粕的饮食)+玉米淀粉25％，D-木糖0％；2：基础饮食+玉米淀粉20％，D-木糖5％；3：基础饮食+玉米淀粉10％，D-木糖15％；以及4：基础饮食+玉米淀粉0％，D-木糖25％。整个研究中，为所有鸡提供新鲜水和饲料，使其自由采食。研究期间，每周监测饲料食用量和鸡体重用于计算体重增加、随意采食量以及饲料转化率。
研究持续21天，但是在处理的14天后，由于饲喂处理剂4的鸡死亡率较高并有疾病症状而将它们从研究中去除。基础饮食是玉米豆粕饮食。
在研究的前14天，与饲喂所有其它处理剂的鸡相比，饲喂饮食中包含25％木糖的鸡的饲料进食量和增重显著降低(P<0.05)(见图12)。研究的第14天，将饲喂处理剂4的所有鸡从研究中移除。此时，处理组(25％木糖)的死亡率已经达到10％，而且更多的鸡显示出定向障碍、失明和身体颤抖等症状。
饲喂处理剂饮食21天之后，与饲喂饮食中包含25％淀粉和0％木糖的鸡相比，饲喂饮食中包含10％玉米淀粉和15％木糖的鸡的增重显著降低且饲料效率明显更差(P<0.05)(参见图13和图14)。饲喂饮食中包含5％木糖和20％玉米淀粉的鸡的增重和FCR位于其它两种处理剂所得增重和FCR之间，但与两者均无显著差异。
结论是，将饮食中25％能量源替换为木糖对肉鸡健康是有害的。对生长性能产生显著不利效应之前，肉鸡似乎能够耐受饮食中添加高达5％的木糖，然而，与对照饮食相比，即使在饮食中添加5％木糖，生长性能在数值上也会降低。
实例6使用 1500 TM 和 XT TM 水解稀氨水处理的玉米秸秆 (DaCS)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)
分别向8个容积为12ml的塑料管中加入1gDaCS和5mlMilliQ水，混匀。同样，向另外8个容积为12ml的塑料管中加入1gDLswg和5mlMilliQ水，混匀。将所有管于5℃下静置过夜以确保DaCS和DLswg良好水合。第二天加入150μl1NHCl，将pH调至4.6至5.1。加入酶(下表5中所列)，开始反应。该反应于50℃、180rpm转速下振荡40h。收集反应时间6h时的液体样品(120μl)，使用120μlMilliQ水稀释样品，保存于5℃下以备分析。酶反应结束时，在收集的各样品中再加入240μlmilliQ水，然后在100℃水浴中加热5min，之后在10000×g下离心10min。随后过滤250μl上清液，并将10μl滤液进样到HPLC中进行分析。过滤1％(w/v)的葡萄糖和木糖标准物，使用与“材料和方法”部分所述相同的条件和进样量进行HPLC分析。
表5
1500是可得自Danisco(现属于DuPont)的商业酶，并且具有某些纤维素酶活性例如内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性，以及某种半纤维素酶活性例如内切木聚糖酶活性。
XT5P是可得自ABVista的商业酶，具有内切1-4β木聚糖酶活性。
结果
结果表明向经稀氨水预处理的玉米秸秆和苛性脱木质化柳枝稷中添加1500TM和XT5P对葡萄糖的释放具有协同效应，因为由1500TM(0.3ml/g)和XT5P(1.4mg/gDM)联用释放的葡萄糖多于由每种酶单独释放的葡萄糖(表6)。在这一实例中，通过加入1500TM和XT5P而提供的内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性以及β-葡萄糖苷酶活性的组合使得葡萄糖大量释放，这与加入TrioTM的结果类似。1500TM和XT5P的组合使得木糖释放显著减少，因为与TrioTM相比，该酶组合不存在大量α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性和β-木糖苷酶活性。
表6.使用 Trio TM 、 1500 TM 和 XT5P水解经稀 氨水预处理的玉米秸秆(DAcs)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)时木糖和葡萄糖的释放。
1DAcs—经稀氨水预处理的玉米秸秆
2DLswg—苛性脱木质化柳枝稷
n.d.—未检出
实例7使用 DaniscoXylanase TM 和 BG TM 水解稀氨水处理 的玉米秸秆(DaCS)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)
分别向12个容积为12ml的塑料管中加入1gDaCS和5mlMilliQ水，混匀。同样，向另外12个容积为12ml的塑料管中加入1gDLswg和5mlMilliQ水，混匀。将所有管于5℃下静置过夜以确保DaCS和DLswg良好水合。第二天加入150μl1NHCl，将pH调至4.6至5.1。加入酶(下表7中所列)，开始反应。该反应于50℃、180rpm转速下振荡40h。收集反应时间6h时的液体样品(120μl)，使用120μlMilliQ水稀释样品，保存于5℃下以备分析。酶反应结束时，在收集的各样品中再加入240μlmilliQ水，然后在100℃水浴中加热5min，之后在10000×g下离心10min。随后过滤250μl上清液，并将10μl滤液进样到HPLC中进行分析。过滤1％(w/v)的葡萄糖和木糖标准物，使用与“材料和方法”部分所述相同的条件和进样量进行HPLC分析。
表7.
是可得自Sigma-Aldrich的商业酶(C2730)，具有某些纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶活性和β-葡萄糖苷酶活性。
DaniscoXylanaseTM是得自Dansico(现属于DuPont)的商业酶并且具有内切木聚糖酶活性。
BGTM是可得自Danisco(现属于DuPont)的商业酶并且具有β-葡萄糖苷酶活性。
结果
结果显示向经稀氨水预处理的玉米秸秆和苛性脱木质化柳枝稷中添加DaniscoXylanaseTM和BGTM对葡萄糖的释放具有协同效应，因为由(0.1ml/gDM)、DaniscoXylanaseTM(3.5μl/gDM)和BGTM(0.15ml/gDM)的组合所释放的葡萄糖多于由每种酶单独释放的葡萄糖或仅由两种酶组合所释放的葡萄糖(表8)。在这一实例中，通过加入DaniscoXylanaseTM和BGTM而提供的内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性以及β-葡萄糖苷酶活性的组合得到了与TrioTM类似的葡萄糖释放。DaniscoXylanaseTM和BGTM的组合使得木糖释放显著减少，因为与TrioTM相比，该酶组合中不存在大量α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性和β-木糖苷酶活性。
表8使用 Trio TM 、 DaniscoXylanase TM 以及 BG TM 水解经稀氨水预处理的玉米秸秆(DAcs)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg) 时木糖和葡萄糖的释放。
1DAcs—经稀氨水预处理的玉米秸秆
2DLswg—苛性脱木质化柳枝稷
n.d.—未检出
实例8使用来自黑曲霉的纤维素酶(SigmaC1184)和 BG TM 水解经稀 氨水处理的玉米秸秆(DaCS)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)
分别向6个容积为12ml的塑料管中加入1gDaCS和5mlMilliQ水，混匀。同样，向另外8个容积为12ml的塑料管中加入1gDLswg和5mlMilliQ水，混匀。将所有管于5℃下静置过夜以确保DaCS和DLswg良好水合。第二天加入150μl1NHCl，将pH调至4.6至5.1。加入酶(下表9中所列)，开始反应。该反应于50℃、180rpm转速下振荡40h。收集反应时间6h时的液体样品(120μl)，使用120μlMilliQ水稀释样品，保存于5℃下以备分析。酶反应结束时，在收集的各样品中再加入240μlmilliQ水，然后在100℃水浴中加热5min，之后在10000×g下离心10min。随后过滤250μl上清液，并将10μl滤液进样到HPLC中进行分析。过滤1％(w/v)的葡萄糖和木糖标准物，使用与“材料和方法”部分所述相同的条件和进样量进行HPLC分析。
表9
来自黑曲霉的纤维素酶是可得自Sigma-Aldrich的商业酶(C1184)，并具有某些纤维素酶活性，例如内切葡聚糖酶活性，以及内切木聚糖酶活性。
BGTM是可得自Danisco(现属于DuPont)的商业酶并且具有β-葡萄糖苷酶活性。
结果
结果表明向经稀氨水预处理的玉米秸秆和苛性脱木质化柳枝稷中添加来自黑曲霉的纤维素酶和BGTM对葡萄糖的释放具有协同效应，因为由来自黑曲霉的纤维素酶和BGTM联用释放的葡萄糖多于由每种酶单独释放的葡萄糖(表10)。在这一实例中，通过加入来自黑曲霉的纤维素酶和BGTM而提供的内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性以及β-葡萄糖苷酶活性的组合得到了与TrioTM类似的葡萄糖释放。来自黑曲霉的纤维素酶和BGTM的组合使得木糖释放显著减少，因为与TrioTM相比，该酶组合中不存在大量α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性和β-木糖苷酶活性。
表10使用 Trio TM 、来自黑曲霉的纤维素酶和 BG TM 水解 经稀氨水预处理的玉米秸秆(DAcs)和苛性脱木质化柳枝稷(DLswg)时木糖和葡萄糖的释 放。
1DAcs—经稀氨水预处理的玉米秸秆
2DLswg—苛性脱木质化柳枝稷
以上说明书中提到的所有出版物以引用的方式并入本文。本领域的技术人员应当能够理解，可在不脱离本发明的范围和精神的前提下，对本发明所述方法和体系进行不同修改和更改。虽然已结合特定的优选实施例对本发明进行了描述，但应该理解，所要求保护的本发明不应不当地局限于这些特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的不同修改形式也应该在以下权利要求书范围内。

Claims (15)

1.一种制备饲料添加剂组合物的方法，所述方法包括：
a.用物理和/或化学和/或生物方法预处理木质纤维素生物质；
b.将经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质与酶组合物混合，其中所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且其中所述酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性；
c.将所述木质纤维素生物质与所述酶组合物的混合物温育至少约3至120小时；
d.以及任选地进行干燥和/或任选地进行包装。
2.一种酶组合物的用途，其中在制造用于提高木质纤维素生物质对动物的营养价值的饲料添加剂组合物的过程中，所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性以及内切木聚糖酶活性，并且其中所述酶组合物不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法或用途，其中所述酶组合物还具有以下酶活性中的一者或两者：纤维二糖水解酶I活性和纤维二糖水解酶II活性。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述酶组合物还具有溶解性多糖单加氧酶活性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述方法还包括给动物饲喂所述饲料添加剂组合物。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述木质纤维素生物质为任意纤维素或木质纤维素材料，例如农业残余物、生物能作物、工业固体废物、市政固体废物、来自造纸的淤渣、庭院废物、木材废物、林业废物以及它们的组合。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所述木质纤维素生物质选自玉米棒、作物残余物诸如玉米皮、玉米秸秆、草、甜菜浆、小麦秸秆、小麦壳、燕麦秸秆、小麦次粉(wheatmiddlings)、小麦粉头(wheatshorts)、米糠、稻壳、小麦糠、燕麦壳、棕榈仁、柑橘渣、棉花、木质素、大麦秸秆、干草、稻秆、稻壳、柳枝稷、芒草、大米草、草芦、纸废弃物、甘蔗渣、高粱蔗渣、饲用高粱、高粱秸秆、大豆秸秆、大豆、粉碎树木获得的组分、树枝、根、叶、木屑、锯末、灌木和灌木丛、蔬菜、水果和花。
8.一种饲料添加剂组合物，所述饲料添加剂组合物能够通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(例如，已获得)。
9.一种饲料添加剂组合物或饲料成分，所述饲料添加剂组合物或饲料成分包含由酶组合物水解的经物理和/或化学和/或生物方法预处理的木质纤维素生物质，其中所述酶组合物至少具有以下活性：内切葡聚糖酶活性、β-葡萄糖苷酶活性和内切木聚糖酶活性，并且不具有、或基本上不具有β-木糖苷酶活性，并且/或者不具有、或基本上不具有α-L-阿拉伯呋喃糖酶活性。
10.一种饲料或饲料原料，所述饲料或饲料原料包含根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物或饲料成分，或者能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(优选地已获得)的饲料添加剂组合物。
11.一种预混物，所述预混物包含根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物或饲料成分、或者能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(优选地已获得)的饲料添加剂组合物、以及至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途还包括使饲料组分与所述饲料添加剂组合物接触的步骤。
13.一种制备饲料原料的方法，所述方法包括使饲料组分与根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物或饲料成分，或者能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(优选地已获得)的饲料添加剂组合物接触。
14.一种用于改善动物的生物物理特性的方法，所述方法包括将能够通过权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求11所述的预混物、或者根据权利要求10所述的饲料原料、或者能够通过根据权利要求13所述的方法获得(例如，已获得)的饲料原料施用于动物。
15.能够通过根据权利要求1至7中任一项所述的方法或用途获得(例如，已获得)的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求9所述的饲料添加剂组合物、或者根据权利要求11所述的预混物、或者根据权利要求10所述的饲料原料、或者能够通过权利要求1所述的方法获得(例如，已获得)的饲料原料用于改善动物的生物物理特性的用途。
CN201480045781.4A 2013-06-21 2014-06-19 提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物 Pending CN105517450A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361837748P 2013-06-21 2013-06-21
US61/837,748 2013-06-21
PCT/EP2014/062935 WO2014202716A1 (en) 2013-06-21 2014-06-19 Methods and compositions to improve the nutritional value of lignocellulosic biomass

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105517450A true CN105517450A (zh) 2016-04-20

Family

ID=50981516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480045781.4A Pending CN105517450A (zh) 2013-06-21 2014-06-19 提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3013155A1 (zh)
CN (1) CN105517450A (zh)
AR (1) AR096670A1 (zh)
AU (1) AU2014283210A1 (zh)
BR (1) BR112015031628B1 (zh)
WO (1) WO2014202716A1 (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106360018A (zh) * 2016-11-04 2017-02-01 广州市畜宝动物营养有限公司 一种猪预混料及猪配合饲料
CN107594209A (zh) * 2017-11-01 2018-01-19 桂林市宏远能源科技服务有限公司 一种利用甘蔗渣生产鹅饲料的方法
CN108740300A (zh) * 2018-04-19 2018-11-06 河南农业大学 一种利用农作物秸秆制备单胃动物能量饲料的方法
CN111418738A (zh) * 2020-04-29 2020-07-17 浙江省淡水水产研究所 一种拟穴青蟹复合人工饲料
CN111919797A (zh) * 2020-08-20 2020-11-13 西南大学 一种提高拉萨裂腹鱼受精卵成活率的方法
CN112825961A (zh) * 2020-11-21 2021-05-25 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 一种木质素饲料添加剂及其制备方法和应用
CN114874356A (zh) * 2022-05-09 2022-08-09 天津科技大学 一种以小麦麸皮为原料提取阿拉伯木聚糖的方法、阿拉伯木聚糖和应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105683369A (zh) 2013-07-29 2016-06-15 丹尼斯科美国公司 变体酶
CN107208080B (zh) 2014-12-19 2022-03-25 诺维信公司 包括具有木聚糖酶活性的多肽和具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽的组合物
ITMI20150557A1 (it) 2015-04-16 2016-10-16 Vomm Impianti E Processi S P A Procedimento per eseguire in continuo reazioni enzimatiche su un substrato organico
WO2017088820A1 (en) * 2015-11-26 2017-06-01 Novozymes A/S Milling process
WO2017189949A1 (en) * 2016-04-28 2017-11-02 Renew Biomass, LLC Comestible comprising miscanthus plant fiber
AU2017260571A1 (en) * 2016-05-02 2018-11-22 Viridi Innovations Pty Ltd A method of obtaining useful material from plant biomass waste
MX2019005945A (es) 2016-11-25 2019-08-29 Novozymes As Xilanasa gh10, arabinofuranosidasa gh62, proceso de molienda y otra aplicacion.
MX2019007335A (es) 2016-12-21 2019-09-09 Dupont Nutrition Biosci Aps Métodos para usar serina proteasas termoestables.
EP3530743A1 (en) 2018-02-21 2019-08-28 Cambridge Glycoscience Ltd Method of production
MX2021001716A (es) 2018-08-15 2021-05-31 Cambridge Glycoscience Ltd Composiciones novedosas, su uso y metodos para su formacion.
EP4013240A1 (en) 2019-08-16 2022-06-22 Cambridge Glycoscience Ltd Methods of treating biomass to produce oligosaccharides and related compositions
JP2023506464A (ja) 2019-12-12 2023-02-16 ケンブリッジ グリコサイエンス エルティーディー 低糖の多相食料品
CN113966782A (zh) * 2021-10-26 2022-01-25 怀化学院 一种提高四棱豆豆荚营养成分含量的方法及应用
CN116530613A (zh) * 2023-04-12 2023-08-04 中科康源(唐山)生物技术有限公司 以秸秆为原料生产一种发酵饲料的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19627505A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Eco Sys Ges Fuer Analytik Und Verfahren zur Herstellung eines Futtermittels
CN1944639A (zh) * 1998-05-06 2007-04-11 安迪苏法国联合股份有限公司 酶混合物
CN100401909C (zh) * 2001-08-20 2008-07-16 鲁汶天主教大学研究开发部 包含低分子量阿糖基木聚糖的饲料添加剂，其制造方法和应用
CN103005147A (zh) * 2012-10-29 2013-04-03 重庆百奥帝克微生态科技有限公司 基于酒糟的生物饲料

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19627505A1 (de) * 1996-07-08 1998-01-15 Eco Sys Ges Fuer Analytik Und Verfahren zur Herstellung eines Futtermittels
CN1944639A (zh) * 1998-05-06 2007-04-11 安迪苏法国联合股份有限公司 酶混合物
CN100401909C (zh) * 2001-08-20 2008-07-16 鲁汶天主教大学研究开发部 包含低分子量阿糖基木聚糖的饲料添加剂，其制造方法和应用
CN103005147A (zh) * 2012-10-29 2013-04-03 重庆百奥帝克微生态科技有限公司 基于酒糟的生物饲料

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106360018A (zh) * 2016-11-04 2017-02-01 广州市畜宝动物营养有限公司 一种猪预混料及猪配合饲料
CN107594209A (zh) * 2017-11-01 2018-01-19 桂林市宏远能源科技服务有限公司 一种利用甘蔗渣生产鹅饲料的方法
CN108740300A (zh) * 2018-04-19 2018-11-06 河南农业大学 一种利用农作物秸秆制备单胃动物能量饲料的方法
CN111418738A (zh) * 2020-04-29 2020-07-17 浙江省淡水水产研究所 一种拟穴青蟹复合人工饲料
CN111919797A (zh) * 2020-08-20 2020-11-13 西南大学 一种提高拉萨裂腹鱼受精卵成活率的方法
CN112825961A (zh) * 2020-11-21 2021-05-25 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 一种木质素饲料添加剂及其制备方法和应用
CN114874356A (zh) * 2022-05-09 2022-08-09 天津科技大学 一种以小麦麸皮为原料提取阿拉伯木聚糖的方法、阿拉伯木聚糖和应用
CN114874356B (zh) * 2022-05-09 2023-02-28 天津科技大学 一种以小麦麸皮为原料提取阿拉伯木聚糖的方法、阿拉伯木聚糖和应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2014283210A1 (en) 2015-12-24
AR096670A1 (es) 2016-01-27
BR112015031628A2 (pt) 2017-11-07
WO2014202716A1 (en) 2014-12-24
EP3013155A1 (en) 2016-05-04
BR112015031628B1 (pt) 2021-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105517450A (zh) 提高木质纤维素生物质营养价值的方法和组合物
EP3010352B1 (en) Method of preparing feed additive
US10227623B2 (en) High force and high stress destructuring of cellulosic biomass
EP2793607B1 (en) Ingredients for animal feed compositions
CN104768391A (zh) 用于增加纤维素材料的消化率的方法和组合物
WO2013165968A1 (en) Processes for producing animal feed from biomass
US20230180791A1 (en) Animal feed compositions
Loman et al. Optimization of enzymatic process condition for protein enrichment, sugar recovery and digestibility improvement of soy flour
US20230276828A1 (en) Animal feed compositions
Sathitkowitchai et al. Optimization of mannanase hydrolysis of steamed palm kernel cake to improve nutritional quality
US20250057190A1 (en) Ruminant feed or supplement for ruminant feed and process for preparing the same
Naidu et al. Improving nutritive value of poor quality roughages and agro-industrial by products
WO2018231565A1 (en) Green biomass modification
Badhan et al. Research Article Improvement in Saccharification Yield of Mixed Rumen Enzymes by Identification of Recalcitrant Cell Wall Constituents Using Enzyme Fingerprinting
HK1203313B (zh) 动物饲料成分组成
Sundu Use of enzymes to improve the nutritional value of palm kernel meal and copra meal Burhanudin Sundu and J. Dingle I. Introduction
FR3010612A1 (fr) Utilisation de pectinases dans l&#39;alimentation des animaux monogastriques

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160420