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CN105486665B - 一种spr检测方法 - Google Patents

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CN105486665B
CN105486665B CN201610053230.3A CN201610053230A CN105486665B CN 105486665 B CN105486665 B CN 105486665B CN 201610053230 A CN201610053230 A CN 201610053230A CN 105486665 B CN105486665 B CN 105486665B
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屈军乐
陈开强
曾佑君
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Shandong Shenda Optical Technology Co ltd
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Shenzhen University
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Abstract

本发明提供了一种SPR检测系统及方法，经探测光路形成了包含入射角信息和波长信息的探测图像。测试时，首先进行全谱扫描，获得样品的共振波长。然后通过不断追踪共振波长进行局部光谱扫描，并且根据具体情况控制每个扫描周期的扫描点数缩短扫描时间，进而实时地获得样品的共振波长。当样品折射率发生变化时，其对应的共振波长也发生变化，通过获得共振波长的变化，以此推算出样品的折射率变化量Δn，此即波长调制SPR快速检测，而所采用的是局部扫描，并且每个局部扫描周期扫描时间可控，这样在保证灵敏度的条件下，提高了表面等离子体共振系统的检测速度，实现快速检测的应用。

Description

一种SPR检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，更具体地，涉及一种SPR检测方法。
背景技术
SPR(Surface Plasmon Resonance，表面等离子体共振)技术可以用于分子识别，特异性反应，分子间反应的动力学参数测量等等，具有广泛应用。光谱诊断SPR技术具有大的动态范围、高灵敏度以及涉及的光机电设备成熟，因此，引起了国内外学者广泛研究。但是，SPR共振波长位置无法直接准确测量，由于对应强度理上可以等于零，在其附近的区域值基本淹没在噪声中，而且SPR 技术的灵敏度对光谱分辨能力特别敏感，通常要求对光谱位置分辨能力达到 0.01nm。而且，随着传感表面分子间动态的相互作用，共振波长将发生移动，移动大小与反应分子浓度和分子量大小有关，对于普通蛋白分子如IgG，浓度为 5ug/ml，移动范围约2-3nm，反应时间约5分钟。为了测得共振波长随反应时间变化曲线，即SPR光谱曲线，通常要求时间分辨率小于1秒。特别的，实际通常需要对整个二维传感面进行并行高通量测量，由于传感面不同位置差异会导致各个位点的共振波长不同，因此，如何在1秒内能够对整个传感芯片的各个位点同时进行SPR共振波长进行快速诊断是光谱诊断SPR技术的瓶颈。
目前，有两种SPR诊断方法，一种是牺牲时间，获取高通量测量；另一种是牺牲测量通量，获取高时间分辨。前者采用单色仪扫描入射光波长，利用CCD 相机等二维探测器同步记录每个波长下光强度，随着入射波长扫描，一系列强度图被记录，不同时刻对应不同波长，每幅图像对应一个波长，每幅图像的对应像素构成强度随光谱变化的曲线，即对应传感面上某点的SPR光谱轮廓曲线，类推地，由所有像素按照上述方式构成一系列SPR光谱轮廓曲线，每条曲线对应SPR传感面的一个像素点，每条SPR光谱轮廓线的最小值即为该像素点的共振光波长，通过不断反复在同一固定的光谱范围内获取上述一系列SPR光谱轮廓曲线，监测每条SPR光谱轮廓线的最小值的变化，可以获得传感器表面折射率变化，实现SPR传感测量。由于单色仪中分光主要采用旋转的光栅实现，为机械扫描方式，转动元件惯性等因素，无法快速周期扫描；而且，对于整个传感面而言，由于传感膜厚度、光线入射角不同(白光光源准直性差，以及棱镜色散等导致)和探针分子种类和浓度等因素导致的传感芯片各点的共振光谱不一致，而且还是随着分子间相互作用产生不一致的移动，无法预先恰当设定，因此，目前所报道的皆是在固定的整个工作光谱段进行全谱线扫描，以免某些共振波长在测量过程中移除扫描范围，产生测量错误。目前，报道最快的用于光谱诊断SPR的扫描速度为2s/波长，所以获得整个SPR光谱轮廓一次花费的时间相当长，无法满足分子间相互作用的动态监测。
后者，利用光谱仪进行反射光的光谱快速分析，具有足够快的测量速度，为了提高测量通量，将传感膜不同位置反射光分别导入不同的光谱仪，实现并行探测，但每个位置需要一个光谱仪，成本高，而且无法实现高密度传感芯片监测以及成像检测。
综上所述，现有技术存在如下技术问题：没有技术能够实现二维传感芯片的所有位点的SPR光谱曲线的并行快速扫描技术，不能快速获取二维传感芯片的所有位点的SPR光谱曲线，进而无法实现二维传感芯片的所有位点的共振波长快速并行监测，而且现有技术还存在二维芯片各点传感灵敏度一致性差的缺点。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种SPR检测方法，其目的在于通过对共振光谱曲线在共振波长附近进行局部光谱扫锚，从而减小了扫描光谱范围；并通过扫描光谱范围反馈来实时追踪共振光谱，提高共振波长诊断速度；传统的宽光谱范围扫描整个SPR光谱曲线时间长(获得一条SPR光谱曲线至少是几十秒)，而某些分子相互作用时间较短，传统的宽光谱扫描不能满足分子相互作用实时监测的问题，本技术旨在解决分子相互作用实时监测的问题。
本发明提供了一种SPR检测方法，所述SPR检测方法用于SPR检测系统，其特征在于，所述SPR检测系统包括：
光源(17)，用于发射光谱连续的宽带光；
第一准直透镜组(1，2)，用于对所述宽带光进行准直后聚焦；
多模光纤MF(10)，其入射端设置在所述第一准直透镜组的输出焦平面上，用于对经过所述第一准直透镜组聚焦后的光进行耦合；
第二准直透镜组(3，4)，其输入焦平面上设置有所述多模光纤MF的出射端，用于对耦合后的光进行准直后聚焦；
孔径光阑DA(11)，位于所述第二准直透镜组的输出焦平面上，用于对经所述第二准直透镜组聚焦后的光进行空间滤波后获得聚焦的光；
透镜L5(5)，与所述第二准直透镜组共焦面设置，用于对所述聚焦光点进行准直处理；
液晶可调光学滤波器(12)，用于对光源发出的宽带光进行滤波后获得窄带光；
偏振片P1(8)，用于对所述窄带光进行偏振作用，以获得偏振态的入射光；
SPR传感单元，包括棱镜(13)、金膜(18)和流通池(14)；所述棱镜 (13)对入射光进行耦合后激发所述金膜(18)表面的等离子体共振，由所述流通池(14)使待测样品通过所述金膜(18)表面，从而进行检测；
透镜L6(6)，用于对经所述SPR传感单元的反射光进行收集、准直；
检偏器P2(9)，用于消除反射光中的杂散光，提高信噪比；
透镜L7(7)，用于将偏振光进行汇聚；
面阵探测器(15)，置于所述透镜L7的焦面，用于记录汇聚后的光谱的强度；
控制模块(16)，输入端用于接收所述面阵探测器采集的光图像，并对其进行处理后输出用于调整所述液晶可调光学滤波器的扫描光谱范围的反馈控制信号；
其中，所述SPR检测方法包括：
(1)在整个工作光谱段上以等步长方式并行扫描并记录对应波长的传感芯片的二维图像；
(2)根据所述二维图像和与图像对应的像素获得对应传感位置的共振波长；
(3)获得所有共振波长中的最大共振波长和最小共振波长；
(4)通过将所述最大共振波长向长波长方向移动第一距离后获得下次扫描区域的波长上限，通过将所述最小共振波长向短波长方向移动第二距离后获得下次扫描区域的波长下限，并根据所述波长上限和所述波长下限获得下次扫描的波长范围；
(5)确定扫描步长；
(6)在所述下次扫描的波长范围内，根据步骤(5)确定的扫描步长，在该参数下对局部光谱区域进行快速扫描并记录该扫描光谱所对应二维图像；
(7)对局部扫描图像，重复执行步骤(2)～(6)，获得不同时刻的所有传感位置的共振波长，并获得二维波长敏感SPR传感图像。
更进一步地，在步骤(1)与步骤(2)之间还包括如下步骤：获得所述二维图像中的局部临近像素的平均值，并根据平均值获得像素更少的新的二维图像。
更进一步地，步骤(2)具体为：
根据所述二维图像和与图像对应的像素获得SPR光谱曲线；
通过拟合和插值分别获得每条SPR光谱曲线的强度最小值，即对应传感位置的共振波长。
更进一步地，步骤(4)中，所述第一距离和所述第二距离的范围为3nm～50nm。
更进一步地，步骤(5)中确定扫描步长具体为：在最大共振波长和最小共振波长之间的波长范围内步长为小步长，如0.01nm-2nm，在该区域以外采用大步长，如3nm-20nm，步长也是可以变化的。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，由于该技术能够对任意局部光谱区域进行快速扫描，并且根据SPR共振波长变化自动改变扫描光谱范围，实现了二维阵列的快速光谱SPR探测，可以同时对多种生物分子的相互作用进行实时地监测，具有高通量、快速检测的优势。
附图说明
图1为完整SPR光谱曲线；其中，λa，λb分别是最小、最大共振波长，x1,x2为常数；
图2为局部SPR光谱曲线；其中，λai，λbi分别是最小、最大共振波长，x1,x2为常数；
图3为共振波长追踪示意图；
图4为光谱诊断SPR成像系统原理图；
图5动态范围实验结果；
图6蛋白相互作用测量曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明针对共振光谱曲线在共振波长附近进行局部光谱扫锚，减小了扫描光谱范围。但采用目前现有的固定扫描范围，若选取我们提出的小的光谱扫描范围，且该范围是固定不变的，那么随着生物反应进行，需要探测共振波长将会逐渐超出扫锚范围，而无法探测，所以目前无法实现小的光谱范围扫描。针对这点，本发明又提出扫描光谱范围反馈技术，来实时追踪共振光谱，提高共振波长诊断速度。
本发明提出一种具有扫描范围反馈的功能的步长灵活可调的局部特征光谱扫描技术，采用只扫描包含共振波长的在共振波长附近的光谱子区间，通过上一次测量获得的所有共振波长中的最大共振波长和最小共振波长确定当前的扫描光谱范围，然后根据获得的当前扫描的SPR光谱轮廓寻找所有共振波长中的最大共振波长和最小共振波长，再确定下一次扫描的扫描光谱范围，依次不断循环往复，可以动态跟踪所有SPR波长。
同时，为了确保所有共振波长始终都在扫描范围内，每次确定扫描范围时，均在所获的最大共振波长处向长波方向扩展一个波长范围，在最小共振波长处向短波长方向扩展一个波长范围，扩展后形成新的波长范围为扫描范围，扩展的波长范围可以根据最终SPR局部光谱曲线获取时间设定，可大可小，十分灵活，该获取时间正比于扫描波长数与每个波长的扫描时间的乘积，扩展范围越大，该获取时间越长。由于共振波长诊断精度主要受光谱扫描范围和共振点附近扫描点密度影响，因此，我们还提出步长灵活可调的扫描技术，在共振点附近采用小步长(≤2nm)精扫描，提高扫描精度和后期数据处理精度，在远离共振点区域采用大步长(＞2nm)粗扫描，提高扫描速度，既保证了区域，又实现了高精度。特别的，扫描器采用快速响应的分子机制可调滤波器，能够在几十毫秒甚至更短时间完成输出波长切换，而且能够电控切换扫描区域和步长，保证上述方法实现，目前主要有液晶可调滤光片，电光可调滤光片，声光可调滤光片以及F-P可调滤光片等。
具体步骤包括：
1)在整个工作光谱段(550nm-750nm)上以等步长方式并行扫描并记录对应波长的传感芯片的二维图像，如图1所示；
2)将获得的图像对应像素构成光谱-强度曲线，构成一系列SPR完整光谱曲线，也可以将步骤1获得的图像，先对局部临近像素计算平均值，构成像素更少的新的二维图像，然后将新构成的二维图像的对应像素构成光谱-强度曲线，即可获得信噪比更高的SPR光谱曲线；
3)先后通过拟合和插值分别获得每条SPR曲线的强度最小值，即对应传感位置的共振波长；
4)比较获得的所有共振波长的最大共振波长和最小共振波长；
5)将最大共振波长向长波长移动一段距离，此时的波长为下次扫描区域的波长上限，并将最小共振波长向短波长方向移动一段距离，此时的波长为下次扫描区域的波长下限，至此，确定出下次扫描的波长范围为波长下限到波长上限之间范围；向长波方向移动的距离和向短波长方向移动的距离可以相同，也可以不同，通常选择3nm—50nm之间。
6)确定扫描步长，在步骤3确定的最大共振波长和最小共振波长之间的波长范围内步长为小步长，如0.01nm-2nm，在该区域以外采用大步长，如3nm-20nm，步长也是可以变化的；
7)在步骤4确定的波长范围内进行局部快速扫描和记录对应二维图像，类似于步骤1，只是扫描范围和扫描步长不同；
8)针对局部扫描图像，进行步骤2-7，不断获得不同时刻的所有传感位置的共振波长，形成共振波长随时间变化曲线。也可以将每个传感位置的共振波长变化作为像素值，即可获得二维波长敏感SPR传感图像。
为了简化图像分析，我们以单点为例，进一步说明共振波长追踪过程。共振波长追踪过程如图3所示，随着传感面分子相互作用，传感面的折射率将发生变化，曲线1-k分别代表不同时刻扫描获得局部SPR光谱曲线。反应开始时的局部扫描范围为[λ0-x1，λ0+x2]，对应局部SPR曲线为曲线1(点线)，当折射率变化使共振波长将从λ0移动到λ1，此时对应的扫描区间也将自动变化为[λ1-x1，λ1+x2]，对应局部SPR曲线为曲线2，此时，折射率变化使共振波长将从λ1移动到λ2，此时对应的扫描区间也将自动变化为[λ2-x1，λ2+x2]，对应局部SPR曲线为曲线3，以此规律，循环往返，通过扫描反馈方法，实现共振波长追踪。
本发明还提供了一种SPR检测系统，其结构如图4所示，包括：光纤输出宽带光源Halogen Lamp，准直透镜组(L1，L2)，快速可调光学滤波器MF，起偏器，SPR传感单元，成像透镜组，检偏器和面阵探测器。
宽带光源为卤素灯、白光光源、以及激光激发荧光粉产生光源，发出光谱连续的宽带光550nm-800nm，透镜L1和L2为准直透镜组，将光源发出的光耦合进入多模光纤MF，多模光纤MF出射端位于透镜L3的焦面上，L3将出射光收集、准直，然后由透镜L4再次汇聚在其焦平面上，孔径光阑位于透镜L4焦平面，仅允许聚焦光点通过，其他杂散光被挡掉，起到空间滤波作用，透镜L5 与透镜L4共焦面，用于准直孔径光阑滤波后的光波，液晶可调光学滤波器LCTF 用于电控快速任意波长滤波，实现光谱快速无机械运动的窄带光谱(0.1-20nm) 扫描输出，偏振片P1用于进一步提高P光偏振度，抑制S光，P偏振光经棱镜耦合照射到棱镜表面的一薄层金属传感膜，由传感膜反射回的P偏振光经透镜 L6收集，经检偏器P2进行检偏，使P偏振光通过，再由透镜L7耦合到CCD 相机，L6与L7构成成像镜组，使传感面成像到CCD相机。反馈回路用于反馈扫描光谱范围，确保计算机能够根据反馈回的扫描范围设置液晶可调光学滤波器的扫描光谱范围。在确定光谱扫描范围后，液晶可调光学滤波器将按照指定工作模式进行光谱扫描输出，CCD相机同时记录每个输出光谱对应的传感膜反射的光强度，这样获得一系 列强度图像，每个图像的相同位置的像素组成强度随光波长变化曲线，即该位置的SPR光谱轮廓曲线，这样，这一系列二维CCD 图像将构成一系列SPR光谱轮廓曲线，而且图像的每个像素对应着传感膜表面上一个传感位点，这一系列SPR光谱轮廓曲线对应传感膜表面上的所有传感位点。
在本发明实施例中，液晶可调光学滤波器的工作模式有两种，(一)等步长扫描模式，在指定扫描范围内扫描步长不变，不断改变输出中心波长，实现光谱扫描；(二)变步长扫描模式，在指定扫描范围内扫描步长发生变化，在共振点附近区域以小步长(如0.01nm-2nm)精扫描，提高共振光谱诊断精度，在偏离共振点区域采用大步长(如3nm-20nm)，提高扫描速度。
根据获得的一系列SPR光谱轮廓曲线，通过数据拟合和插值算法，诊断出每条曲线的SPR共振波长，根据这些共振波长可以产生新的扫描范围，产生方法有多种：(1)最大共振波长和最小共振波长法，即从这些共振波长中找出最小共振波长Lamdamin和最大共振波长Lamdamax，再将最大共振波长向长波方向移动一段距离(如8nm)，即对应波长Lamdamax+8，和最小共振波长向短波方向移动一段距离(如8nm)，即对应波长Lamdamin-8，即，新的光谱扫描范围为[Lamdamin-8，Lamdamax+8]；(2)共振波长平均值法，即对所有共振波长求平均值，获得平均共振波长Lamdaave，将平均共振波长向长波方向移动一段距离，即对应的波长为Lamdaave+10nm，将平均共振波长向短波方向移动一段距离，即对应的波长为Lamdaave-10nm，即，新的光谱扫描范围为[Lamdaave-10， Lamdaave+10]；这里，移动距离可以根据测量时间任意确定，如需要快速测量，需要选择小于10nm，如对测量时间没要求，可以选择大的移动距离，如20nm。
通过反馈回路将新的扫描范围重新设置液晶可调光学滤波器，使其在新的扫描范围扫描，进而又获得一组二维CCD图像，以及对应的一系列新的共振波长，再重新获得新的扫描光谱范围，因此，循环上述过程，可以不断获得新的一系列共振波长，通监测共振波长变化，即可实现膜表面生物分子相互作用探测。
如图5所示，针对传感芯片9个不同位置点进行了动态范围测试，结果表明各位置的动态范围相同，一致性好。
为了更进一步地说明本发明实施例提供的SPR检测装置及方法，先结合具体应用实例详述如下：在传感膜表面的两个位点修饰上相同浓度的兔IgG蛋白分子，同时选取其他任意两个位点(没有修饰蛋白)作为参考，当流入PBS缓冲液时，不发生相互作用，SPR信号为水平基线(第一段曲线)，当含羊抗兔IgG 蛋白分子的溶液流过传感膜表面时，对应SPR信号发生明显曲线变化，再通入 PBS溶液SPR信号曲线变化为水平线段(第三段水平线段)，而且其幅值远高于起始段幅值(如图6中曲线1，2曲线段)，说明修饰兔IgG的位点发生了分子相互作用。而没有修饰IgG的位点SPR信号跳变到第二段水平线段，再通入PBS 溶液曲线又回到起始阶段幅值的水平线段(如图6中曲线3，4曲线段)，说明没有发生分子相互作用。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种SPR检测方法，所述SPR检测方法用于SPR检测系统，其特征在于，所述SPR检测系统包括：
光源(17)，用于发射光谱连续的宽带光；
第一准直透镜组(1，2)，用于对所述宽带光进行准直后聚焦；
多模光纤MF(10)，其入射端设置在所述第一准直透镜组的输出焦平面上，用于对经过所述第一准直透镜组聚焦后的光进行耦合；
第二准直透镜组(3，4)，其输入焦平面上设置有所述多模光纤MF的出射端，用于对耦合后的光进行准直后聚焦；
孔径光阑DA(11)，位于所述第二准直透镜组的输出焦平面上，用于对经所述第二准直透镜组聚焦后的光进行空间滤波后获得聚焦的光；
透镜L5(5)，与所述第二准直透镜组共焦面设置，用于对所述聚焦光点进行准直处理；
液晶可调光学滤波器(12)，用于对光源发出的宽带光进行滤波后获得窄带光；
偏振片P1(8)，用于对所述窄带光进行偏振作用，以获得偏振态的入射光；
SPR传感单元，包括棱镜(13)、金膜(18)和流通池(14)；所述棱镜(13)对入射光进行耦合后激发所述金膜(18)表面的等离子体共振，由所述流通池(14)使待测样品通过所述金膜(18)表面，从而进行检测；
透镜L6(6)，用于对经所述SPR传感单元的反射光进行收集、准直；
检偏器P2(9)，用于消除反射光中的杂散光，提高信噪比；
透镜L7(7)，用于将偏振光进行汇聚；
面阵探测器(15)，置于所述透镜L7的焦面，用于记录汇聚后的光谱的强度；
控制模块(16)，输入端用于接收所述面阵探测器采集的光图像，并对其进行处理后输出用于调整所述液晶可调光学滤波器的扫描光谱范围的反馈控制信号；
其中，所述SPR检测方法包括：
(1)在整个工作光谱段上以等步长方式并行扫描并记录对应波长的传感芯片的二维图像；
(2)根据所述二维图像和与图像对应的像素获得对应传感位置的共振波长；
(3)获得所有共振波长中的最大共振波长和最小共振波长；
(4)通过将所述最大共振波长向长波长方向移动第一距离后获得下次扫描区域的波长上限，通过将所述最小共振波长向短波长方向移动第二距离后获得下次扫描区域的波长下限，并根据所述波长上限和所述波长下限获得下次扫描的波长范围；
(5)确定扫描步长；
(6)在所述下次扫描的波长范围内，根据步骤(5)确定的扫描步长，在该参数下对局部光谱区域进行快速扫描并记录该扫描光谱所对应二维图像；
(7)对局部扫描图像，重复执行步骤(2)～(6)，获得不同时刻的所有传感位置的共振波长，并获得二维波长敏感SPR传感图像。
2.如权利要求1所述的SPR检测方法，其特征在于，在步骤(1)与步骤(2)之间还包括如下步骤：获得所述二维图像中的局部临近像素的平均值，并根据平均值获得像素更少的新的二维图像。
3.如权利要求1或2所述的SPR检测方法，其特征在于，步骤(2)具体为：
根据所述二维图像和与图像对应的像素获得SPR光谱曲线；
通过拟合和插值分别获得每条SPR光谱曲线的强度最小值，即对应传感位置的共振波长。
4.如权利要求1所述的SPR检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述第一距离和所述第二距离的范围为3nm～50nm。
5.如权利要求1所述的SPR检测方法，其特征在于，步骤(5)中确定扫描步长具体为：在最大共振波长和最小共振波长之间的波长范围内步长为小步长，所述小步长范围为0.01nm-2nm，在该区域以外采用大步长，所述大步长范围为3nm-20nm，步长也是可以变化的。
CN201610053230.3A 2016-01-26 2016-01-26 一种spr检测方法 Active CN105486665B (zh)

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CN201610053230.3A CN105486665B (zh) 2016-01-26 2016-01-26 一种spr检测方法
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