CN105400781B - 一种双嵌段分子探针及其快速检测核酸方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种双嵌段核酸探针和核酸快速检测方法。目标核酸序列与双嵌段探针末端的启动区相互作用，触发了链置换反应，依次打开双嵌段探针的发夹结构并且与之结合，从而产生了大量的带有三个polyA尾巴的Y型核酸构造物。Y型核酸构造物的polyA尾巴能够分别与多个纳米金结合，从而使得纳米金的颜色由红色变成蓝色，检测结果肉眼可见，核酸浓度与颜色变化程度直接相关。本发明操作简单，无需蛋白酶，无需标记，反应条件温和，对核酸的检测限为0.01pM，能够分辨单个核酸突变，检测结果既可定量分析也可以，可用于核酸的现场快速检测。

Description

一种双嵌段分子探针及其快速检测核酸方法

技术领域

本发明属于核酸检测领域，涉及一种双嵌段分子探针及其快速检测核酸方法。

背景技术

核酸快速检测技术在医疗诊断，食品安全和环境监控领域有广泛的应用前景。当前核酸检测方法主要采用蛋白酶(例如核酸聚合酶、连接酶和外切酶)作为信号扩增工具。这些方法虽然能够达到较低检测限，但是这些方法操作较为复杂，耗时，耗力，成本相对较高。催化发夹组装是一个无酶的信号放大策略，常被用于增强核酸杂交信号。催化发夹组装利用亚稳态的发夹探针来组装Y型核酸结构。它能够将核酸的功能和结构的信息进行编码，而且只有较低的背景信号，这些特点使得它在核酸检测中具有更大的应用前景。实际上，催化发夹组装已经常常与其他检测手段相结合，例如化学发光电化学技术，电化学和荧光检测技术。这些技术虽然具有较高的灵敏度，但是它们往往需要使用先进复杂的仪器，这些不足在一定很大程度上已经限制了它们的广泛应用。

金纳米粒比色检测技术灵敏度高，只需要简单的仪器，甚至可以直接用肉眼观察。金比色测定法通过结合催化发夹组装信号放大策略，可实现超灵敏的核酸快速检测。这是因为这种结合可以将核酸识别可以简单的转化为颜色变化。这些快算检测方法通常需要制备巯基修饰的核酸探针。然而，这种探针制备方法通常比较耗时(20-40小时)。此外，探针修饰巯基还增加了检测成本。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于将基于polyA与发夹探针结合的双嵌段探针的催化发夹组装的信号放大作用与纳米金比色检测技术相结合，构建一种核酸的快速检测方法。该方法具有特异性高，操作简单，检测迅速等优点。

本发明所采取的技术方案是：

一种用于快速检测DNA的试剂盒，其包括至少3条双嵌段分子探针：双嵌段分子探针1、双嵌段分子探针2和双嵌段分子探针3；所述双嵌段分子探针1从5’到3’依次包括：启动区、发夹结构区和polyA区；其中，双嵌段分子探针1的启动区及发夹结构区5’茎区的部分序列与目标DNA的部分序列互补，双嵌段分子探针2的启动区与双嵌段分子探针1的发夹结构区的部分序列互补，双嵌段分子探针3的启动区与双嵌段分子探针2的发夹结构区的部分序列互补。

所述双嵌段分子探针1的启动区及发夹结构区5’茎区序列与双嵌段分子探针3的发夹结构3’茎区及环区的部分序列互补；所述双嵌段分子探针2的启动区及发夹结构区5’茎区序列与双嵌段分子探针1的发夹结构3’茎区及环区的部分序列互补；所述双嵌段分子探针3的启动区及发夹结构区5’茎区序列与双嵌段分子探针2的发夹结构3’茎区及环区的部分序列互补。

所述三条双嵌段分子探针的发夹结构区打开后，可将三条双嵌段分子探针组装成Y型核酸结构。

作为优选的，所述双嵌段分子探针的启动区至少含有4个碱基。

进一步优选的，所述双嵌段分子探针的启动区含有6～8个碱基。

作为优选的，所述双嵌段分子探针的polyA区至少含有5个腺嘌呤。

进一步优选的，所述双嵌段分子探针的polyA区含有15～20个腺嘌呤。

所述试剂盒中还含有纳米金胶溶液、核酸杂交缓冲液。

一种快速检测DNA的方法，包括以下步骤：

1)将双嵌段探针加到样品液中，室温反应，使催化发夹探针组装反应充分；

2)步骤1)中反应完成后，取反应液与纳米金溶液混合，静置，待显色反应完全；

3)根据颜色反应结果判断样品是否含有目标核酸。

步骤3)的判断方法为：(1)当纳米金溶液由红色变成蓝色，表明样品液中含有目标DNA；或者用显色反应液在650纳米和524nm处的OD值比值表示，若比值在0.26以上，说明此样品中含有目标核酸，检测得到OD值比值与核酸浓度正相关。

下面以某一特定目标DNA序列的检测为例，对本发明的技术方案作进一步的说明：

目标DNA，从5’至3’依次含有y*、b*、x*、a*区段，根据该目标DNA设计三条双嵌段分子探针DHP1，DHP2和DHP3，其中：

DHP1从5’-3’依次包括a、x、b、y、z*、c*、y*、b*、x*区段和polyA结构区，其中a区段为启动区，x至x*区段为发夹结构区。目标DNA的a*、x*、b*、y*区分别与DHP1的a、x、b、y区段互补。

DHP2从5’-3’依次包括b、y、c、z、x*、a*、z*、c*、y*区段和polyA结构区，其中b区段为启动区，y至y*区段为发夹结构区。b、y、c、z区分别与DHP1的b*、y*、c*、z*区段互补。

DHP3从5’-3’依次包括c、z、a、x、y*、b*、x*、a*、z*区段和polyA结构区，其中c区段为启动区，z至z*区段为发夹结构区。c、z、a、x区分别与DHP1的c*、z*、a*、x*区段互补。

当样品中含有目标DNA时，目标DNA的a*区与DHP1的a区结合，触发了启动区介导的链置换反应，依次打开双嵌段分子探针2、双嵌段分子探针3的颈环结构并且与之结合，最终产生大量的带有三个polyA尾巴的Y型核酸构造物。在盐的作用下，该核酸构造物的polyA能够与多个纳米金结合使之聚集，并且最终使得纳米金由红色变成蓝色。

本发明的有益效果是：

(1)本发明所述的双嵌段探针具有发夹结构和polyA，无需修饰，制备成本低；

(2)在目标核酸序列存在时，目标序列通过级联的链置换反应依次与三条双嵌段探针(DHP1，DHP2和DHP3)结合，生成大量的Y型核酸结构，该Y型核酸带有3个单链polyA尾巴，多聚腺嘌呤(polyA)序列对金纳米粒子具有高亲和力，在盐存在下，该Y型核酸结构能够与纳米金结合，使得纳米金溶液由红色变成蓝色，从而达到快速检测的目的；

(3)本发明所述的核酸检测方法具有较高的灵敏度，对核酸的检测限为0.01fM，检测过程方便、迅速，可用于实地现场检测；

(4)本发明所述的核酸检测方法具有很好的特异性，能够识别单碱基突变的核酸序列。

附图说明

图1为双嵌段分子探针示意图；

图2为快速检测核酸的示意图；

图3为探针浓度对检测的影响；

图4为反应时间对检测的影响；

图5盐浓度对检测核酸的影响；

图6为核酸检测的回归曲线；

图7为特异性实验结果图；

图8为细菌DNA检测结果。

具体实施方式

一、双嵌段探针的制备

(1)双嵌段探针的设计、合成与纯化：

设计3条双嵌段分子探针：双嵌段分子探针1、双嵌段分子探针2和双嵌段分子探针3；所述双嵌段分子探针1从5’到3’依次包括：启动区、发夹结构区和polyA区；其中，双嵌段分子探针1的启动区与目标DNA的部分序列互补，双嵌段分子探针2的启动区与双嵌段分子探针1的发夹结构区的部分序列互补，双嵌段分子探针3的启动区与双嵌段分子探针2的发夹结构区的部分序列互补，三条双嵌段分子探针的发夹结构区打开后，可将三条双嵌段分子探针组装成Y型核酸结构。所述双嵌段探针的结构如图1所示，采用固相法合成，高效液相法进行纯化；

(2)双嵌段探针溶液配制：所述双嵌段探针采用超纯水溶解制成浓缩贮备液，然后用磷酸盐缓冲液(50mM Na₂HPO₄,1M NaCl,pH 6.8)稀释到合适浓度；

(3)探针退火：所述探针溶液于95℃温育5min，然后缓慢冷却室温，置于4℃保存；

二、快速检测核酸的方法

1)将上述制备的三条双嵌段分子探针加到核酸样品液中，室温(18～27℃)反应120min，使催化发夹组装反应充分；

2)取15-25μL的上述反应液与250-350μL的纳米金溶液混合，静置3min，待显色反应完全；

3)将2)中得到显色反应液加入石英比色皿，扫描200-800纳米处紫外可见光吸收；

4)计算650纳米与524纳米处吸收值的比值，若比值在0.26以上，说明此样品中含有目标核酸。

快速检测核酸的方法的示意图如图2所示。

下面举例介绍一下本发明方法的技术原理：

在有目标核酸序列存在下，目标序列与双嵌段分子探针1的5'端单链启动区结合，触发了启动区介导的链置换反应，依次打开双嵌段分子探针2、双嵌段分子探针3的颈环结构并且与之结合，最终产生大量的带有三个polyA尾巴的Y型核酸构造物。在盐的作用下，该核酸构造物的polyA能够与多个纳米金结合使之聚集，并且最终使得纳米金由红色变成蓝色。该颜色的变化程度可以直接肉眼观察，也可以用650纳米和524nm处OD值比值表示。检测得到OD值比值与核酸浓度在一定范围正相关。

下面以特异性目标DNA的检测为例，对本发明作进一步的说明。

实施例1

一、双嵌段探针的制备

(1)双嵌段探针的设计与合成

根据目标DNA序列设计双嵌段探针，目标DNA的核酸序列如下所示：

y* b* x* a*

5’-GCACTA-CTCCCT-AACATC-TCAAGC-3’(SEQ ID NO.1)

设计好的双嵌段探针，用NUPACK软件分析其二维结构的自由能，若自由能为负值则说明探针可行。将设计好的双嵌段探针交由核酸合成公司进行合成，合成好的探针用高效液相法纯化，并且用质谱检测合成的探针是否与设计的一致。合成成功的探针冻干后保存于-20℃。具体序列如下：

DHP1:

a x b y z* c* y* b* x*

5'-GCTTGA-GATGTT-AGGGAG-TAGTGC-TCCAAT-CACAAC-GCACTA-CTCCCT-AACATC-AAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.2)

DHP1从5’-3’依次包括a、x、b、y、z*、c*、y*、b*、x*区段和polyA结构区，其中a区段为启动区，x至x*区段为发夹结构区。目标DNA的a*、x*、b*、y*区分别与DHP1的a、x、b、y区段互补。

DHP2:

b y c z x* a* z* c* y*

5'-AGGGAG-TAGTGC-GTTGTG-ATTGGA-AACATC-TCAAGC-TCCAAT-CACAAC-GCACTA-AAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.3)

DHP2从5’-3’依次包括b、y、c、z、x*、a*、z*、c*、y*区段和polyA结构区，其中b区段为启动区，y至y*区段为发夹结构区。b、y、c、z区分别与DHP1的b*、y*、c*、z*区段互补。

DHP3:

c z a x y* b* x* a* z*

5'-GTTGTG-ATTGGA-GCTTGA-GATGTT-GCACTA-CTCCCT-AACATC-TCAAGC-TCCAAT-AAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.4)

DHP3从5’-3’依次包括c、z、a、x、y*、b*、x*、a*、z*区段和polyA结构区，其中c区段为启动区，z至z*区段为发夹结构区。c、z、a、x区分别与DHP1的c*、z*、a*、x*区段互补。

当样品中含有目标DNA时，目标DNA的a*区与DHP1的a区结合，触发了启动区介导的链置换反应，依次打开双嵌段分子探针1、双嵌段分子探针2、双嵌段分子探针3的颈环结构并且与之结合，最终产生大量的带有三个polyA尾巴的Y型核酸构造物。在盐的作用下，该核酸构造物的polyA能够与多个纳米金结合使之聚集，并且最终使得纳米金由红色变成蓝色。

二、快速检测核酸的方法

快速检测核酸的方法的示意图如图2所示，具体操作步骤为：

1)在0.3ml离心管中分别加入4μL实施例1中制备的三种双嵌段探针(DHP1，DHP2和DHP3)、28μL磷酸盐缓冲液和4μL核酸样品溶液，室温(18～27℃)反应120min；

2)取上述反应液30μL与270μL纳米金溶液混合，室温静置3min至显色反应完全；

3)将2)中得到的反应液加到石英比色皿，扫面200-800纳米处紫外可见光吸收谱；

4)计算650纳米与524纳米处的吸收值的比值，若比值在0.26以上，说明此样品中含有目标核酸。

三、快速检测条件的优化

为了获得最佳的检测效果，本实施例对影响检测效果的参数(探针的浓度、反应时间和盐浓度)作进一步的优化。

探针浓度优化：实验操作过程同实施例2，在核酸样品浓度为5fM的条件下研究最佳的探针浓度，探针加入的体积分别选取为100、200、300、400、500nM，最后检测加入不同浓度探针的反应液在650纳米和524纳米处的OD值并且计算其比值R_650/524，检测结果如图3所示，从中可以看出当探针加入的浓度为300nM时，最终反应液比值R_650/524与背景值差值最大，检测效果最灵敏，故最佳的探针浓度为300nM。

反应时间优化：在探针浓度为300nM，核酸样品浓度为5fM条件下研究最佳反应时间，反应时间分别选为30、60、90、120、150min，最后检测不同反应时间的反应液在比值R_650/524，检测结果如图4所示，从中可以看出响应值与背景值都随反时间的增长而增大，当反应时间为120min时，响应值与背景值差值最大，所以最优选的反应时间为120min。

盐浓度优化：本发明的快速检测方法依赖于Y型核酸构造物的polyA尾巴与纳米金的结合，而该反应会受到盐浓度的影响，故有必要探研本发明方法中最佳的盐浓度。

在探针浓度为300nM，反应时间为120min，核酸浓度为5fM的条件下研究最佳的盐浓度，盐浓度分别为25、50、75、100、125mM，最后检测加入不同浓度盐的反应液在R_650/524值，检测结果如图5所示，从中可以看出当盐浓度为100mM时，最终反应液R_650/524值最高检测效果最灵敏，故最佳的盐浓度为100mM。

根据上述对各参数的优化，可获得最优的快速检测核酸的方法。

下面对本发明的双嵌段探针和快速检测核酸的方法作进一步的效果评估。

四、灵敏性试验

配制浓度分别为0.00,0.01,0.025,0.05,0.1,1.0,3.0,和5.0pM的核酸样品溶液，以实施例3所建立的最优检测方法检测这些不同浓度的核酸样品，以核酸浓度为横坐标，R_650/524值作为纵坐标，绘制曲线，见图6，分析该曲线可知，其回归方程为Y＝0.3007X+0.2725，(R²＝0.985)，本发明方法检测限为0.01fM(根据空白值标准偏差的3倍)，线性检测范围为0.01～0.5fM。

五、特异性试验

分别配制浓度为5fM的目标序列溶液和有一个碱基突变的目标核酸溶液，采用实施例3中确定的最优检测方法检测这些不同核酸样品，其R_650/524值如图7所示，从中可以看出，本发明的免疫磁珠及其快速检测方法只对完全互补的核酸样品具有检测效果。说明本发明方法具有很的特异性和准确性。

实施例2

为了进一步确定本发明方法适用于细菌核酸检测过程，根据希瓦氏菌外膜细胞色素c蛋白的特异性核酸序列：5'-TGGTCA-ATGTGT-TCTAGC-GAAGGT-3'(SEQ ID NO.5)，设计了三条新的双嵌段探针。具体序列如下：

DHP1＊:

5'-ACCTTC-GCTAGA-ACACAT-TGACCA-TCCAAT-CACAAC-TGGTCA-ATGTGT-TCTAGC-AAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.6)；

DHP2＊:

5'-ACACAT-TGACCA-GTTGTG-ATTGGA-ACACAT-GAAGGT-TCCAAT-CACAAC-TGGTCA-AAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.7)；

DHP3＊:

5'-GTTGTG-ATTGGA-ACCTTC-ATGTGT-TGGTCA-ATGTGT-TCTAGC-GAAGGT-TCCAAT-AAAAAAAAAAAAAAA-3'(SEQ ID NO.8)。

检测结果显示(如图8所示)，当有细菌特异性探针序列存在时，颜色变化显著，这说明本发明设计双嵌段分子探针及其快速检测方法对核酸检测的普适性，本发明双嵌段分子探针及其快速检测方法可普遍用于核酸检测。

由以上实验结果可知，本发明的双嵌段探针及其快速检测核酸的方法具有较高的灵敏度，对核酸的检测限为0.01fM，检测过程方便、迅速，可用于核酸的实地现场检测；此外，本发明的检测方法具有很好的特异性，突变核酸序列对检测不产生干扰。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东省生态环境与土壤研究所

<120> 一种双嵌段分子探针及其快速检测核酸方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcactactcc ctaacatctc aagc 24

<210> 2

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcttgagatg ttagggagta gtgctccaat cacaacgcac tactccctaa catcaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 3

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggagtagt gcgttgtgat tggaaacatc tcaagctcca atcacaacgc actaaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 4

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttgtgattg gagcttgaga tgttgcacta ctccctaaca tctcaagctc caataaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 5

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<212> DNA

<213> 希瓦氏菌(Shewanella)

<400> 5

tggtcaatgt gttctagcga aggt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accttcgcta gaacacattg accatccaat cacaactggt caatgtgttc tagcaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

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<212> DNA

<213> 人工序列

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acacattgac cagttgtgat tggaacacat gaaggttcca atcacaactg gtcaaaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

<210> 8

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gttgtgattg gaaccttcat gtgttggtca atgtgttcta gcgaaggttc caataaaaaa 60

aaaaaaaaa 69

Claims (10)

1.一种用于快速检测DNA的试剂盒，其包括至少3条双嵌段分子探针：双嵌段分子探针1、双嵌段分子探针2和双嵌段分子探针3；所述双嵌段分子探针1从5’到3’依次包括：启动区、发夹结构区和polyA区；其中，双嵌段分子探针1的启动区及发夹结构区5’茎区的部分序列与目标DNA的部分序列互补，双嵌段分子探针2的启动区与双嵌段分子探针1的发夹结构区的部分序列互补，双嵌段分子探针3的启动区与双嵌段分子探针2的发夹结构区的部分序列互补。

2.根据权利要求1所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述双嵌段分子探针的启动区至少含有4个碱基。

3.根据权利要求2所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述双嵌段分子探针的启动区含有6～8个碱基。

4.根据权利要求1所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述双嵌段分子探针的polyA区至少含有5个腺嘌呤。

5.根据权利要求4所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述双嵌段分子探针的polyA区含有15～20个腺嘌呤。

6.根据权利要求1所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述双嵌段分子探针1的启动区及发夹结构区5’茎区序列与双嵌段分子探针3的发夹结构3’茎区及环区的部分序列互补；所述双嵌段分子探针2的启动区及发夹结构区5’茎区序列与双嵌段分子探针1的发夹结构3’茎区及环区的部分序列互补；所述双嵌段分子探针3的启动区及发夹结构区5’茎区序列与双嵌段分子探针2的发夹结构3’茎区及环区的部分序列互补。

7.根据权利要求6所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述三条双嵌段分子探针的发夹结构区打开后，可将三条双嵌段分子探针组装成Y型核酸结构。

8.根据权利要求1-7任一项所述的用于快速检测DNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有纳米金胶溶液、核酸杂交缓冲液。

9.一种快速检测DNA的方法，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的双嵌段探针加到样品液中，室温反应，使催化发夹探针组装反应充分；

2)步骤1)中反应完成后，取反应液与纳米金溶液混合，静置，待显色反应完全；

3)根据颜色反应结果判断样品是否含有目标核酸。

10.根据权利要9所述的快速检测DNA的方法，其特征在于，步骤3)的判断方法为：(1)当纳米金溶液由红色变成蓝色，表明样品液中含有目标DNA；或者用显色反应液在650纳米和524nm处的OD值比值表示，检测得到OD值比值与核酸浓度正相关。