CN105399834A - 一种人胰高血糖素样肽-1类似物的复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人胰高血糖素样肽-1类似物的复合物及其制备方法。具体地，本发明涉及如式(I)所示的人胰高血糖素样肽-1类似物的复合物、其制备方法和用途。GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys34-HSA(I)。
Description
技术领域
本发明涉及固相多肽合成，具体地，本发明涉及一种长效人胰高血糖素样肽-1类似物的复合物、以及其固相合成方法。
背景技术
II型糖尿病是由肥胖等因素导致的一种常见慢性疾病，II型糖尿病主要由于胰岛素分泌不足或者胰岛素抵抗导致高血糖。II型糖尿病占糖尿病总数约90％，是一种主要的糖尿病。目前II型糖尿病口服治疗药物主要包括：双胍类、磺脲类、DPP-IV抑制剂类和噻唑烷二酮类等药物。这些口服药物能够实现对血糖的控制，但胰岛β细胞功能会逐渐丧失。
人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的发现是II型糖尿病治疗领域的一个革命性突破，GLP-1不仅能够很好的控制血糖，而且能够刺激胰岛β细胞增殖、分化以及抑制凋亡，同时能够减轻II型糖尿病患者的体重，明显缓解II型糖尿病患者病程。GLP-1是肠黏膜L细胞分泌的一种多肽类激素，体内半衰期2分钟，作为治疗药物显然不合适。因此，研发GLP-1长效类似物成为一种必然。
艾塞那肽和利拉鲁肽是目前临床应用的GLP-1长效类似物，艾塞那肽一天给药二次，利拉鲁肽一天给药一次，由于GLP-1长效类似物需要注射给药，给病人带来痛苦，所以开发半衰期更长的GLP-1类似物非常必要。
GLP-1有2种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，这两者仅有一个氨基酸序列不同，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。
人血清白蛋白在人体内半衰期约为19天，本发明人意想不到地发现，通过化学方法将GLP-1类似物偶联至白蛋白可以显著延长GLP-1类似物半衰期。CJC1131通过将GLP-1类似物C端AEEA修饰，然后和白蛋白第34位Cys偶联来延长GLP-1类似物半衰期。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物或其药学上可接受的盐，所述人胰高血糖素样肽-1类似物的特征在于，GLP-1(7-36)的第8位丙氨酸被甘氨酸取代，并且在GLP-1(7-36)的C末端添加一个半胱氨酸；所述类似物通过-S-S-键与人血清白蛋白第34位Cys偶联。
根据本发明的所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物或其药学上可接受的盐，其中所述复合物的结构式如式(I)所示：
GLP-1(7-36：Ala8Gly)Cys-S-S-Cys34-HSA(I)
根据本发明的所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物或其药学上可接受的盐，其中所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、偏磷酸盐、硫酸氢盐，亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、焦磷酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、丙酸盐、富马酸盐、草酸盐、枸橼酸盐、乳酸盐或马来酸盐。
在另一方面，本发明提供了一种制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在活化剂存在下，由固相合成树脂和Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联得到Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
b)合成人胰高血糖素样肽-1类似物GLP-1(Ala8Gly)Cys；
c)裂解，脱除保护基和树脂获得GLP-1(Ala8Gly)Cys；
d)纯化、冻干步骤b)获得的GLP-1(Ala8Gly)Cys；
e)用2,2’-二硫双(5-硝基吡啶)修饰步骤d)获得的GLP-1(Ala8Gly)Cys，生成GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)；
f)纯化、冻干步骤e)获得的GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)；
g)GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)和人血清白蛋白偶联生成GLP-1(Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA；
h)离心除沉淀，上清液凝胶过滤收集GLP-1(Ala8Gly)Cys--S-S-Cys-HSA和GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)；
i)测定GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)的量，计算偶联率。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤a)中，所用的树脂为RinkAmide树脂，替代值0.3-0.8mmoL/g，所述活化剂为NMM/HATU/HOBt。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤a)和b)中，脱除Fmoc基团用20％哌啶/80％DMF溶液。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤c)中，裂解采用裂解试剂R进行裂解。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤d)和f)中，纯化采用反相高效液相色谱法，色谱柱为C18柱，柱温为40℃。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤e)中，DTNP修饰缓冲液为乙酸水溶液。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤g)中，偶联采用磷酸缓冲液。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤h)中，凝胶过滤采用SephadexG-50凝胶过滤柱。
根据本发明所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物的方法，其特征在于：所述步骤i)中，偶联率测定采用反相高效液相色谱定量分析。
动物实验结果显示，根据本发明制备的GLP-1(Ala8Gly)Cys--S-S-Cys-HAS复合物给药96小时具有良好的降血糖作用。
在另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物或其药学上可接受的盐，以及药学可接受的载体。
在进一步的方面，本发明提供了根据本发明的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白(HSA)的复合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
附图说明
图1为GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA制备的流程图。
图2为GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys合成后纯化图谱。
图3为DTNP修饰GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys后纯化图谱。
图4为给药GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA96小时后，测定的小鼠糖耐量曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
RinkAmide树脂、各种保护氨基酸以及偶联剂均购自上海吉尔生化有限公司，本发明说明书和权利要求书中所用英文缩写的含义见下表。
实施例一GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys的合成
称取替代值0.5mmol/gRinkAmide树脂20克，DMF膨化30分钟，抽干，加入20％哌啶30mL去保护15分钟，抽干，加入30mLDMF清洗1次，加入20％哌啶30ml去保护10分钟，用DMF清洗5次，按照肽链氨基酸残基序列依次完成Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Arg(pbf)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Trp(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Thr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-His(Boc)-OH,的偶联。偶联采用NMM/HATU/HOBt体系，反应溶剂为DMF，合成完成后用DMF清洗5次，用DCM清洗3次。
实施例二GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys从树脂上裂解
GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys树脂，加入裂解试剂R(TFA：45mL，苯甲醚：2.5mL，苯甲硫醚：1.5mL，二巯基乙烷：1mL)，室温裂解2小时，收集裂解液，用TFA清洗树脂，合并，氮气吹干，样品采用乙酸水溶液溶解，冻干。
实施例三DTNP修饰GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys
称取GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys多肽0.5mmoL，20mL75％乙酸水溶液溶解，加入0.6mmoLDTNP充分溶解，室温反应24小时，冷冻干燥。
实施例四GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys和GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys(NPYs)纯化
实施例二和实施例三获得的多肽采用高效液相色谱纯化，色谱柱为C18制备柱(7.6*250mm)，流速4mL/min流动相A液为0.1％TFA水溶液，流动相B液为0.1％TFA乙腈溶液，柱温40℃，采用梯度方式洗脱：初始梯度A为85％，30分钟内降为55％，收集产品峰，冻干，计算收率，GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys保留时间为17.21分钟，收率37.5％，GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys(NPYs)保留时间为18.99分钟，收率87.3％。
实施例五GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys(NPYs)和HSA偶联
称取人血清白蛋白180mg，称取实施例四获得的GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys(NPYs)10mg，溶于10mL0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH＝8.0)中偶联三个小时，溶液迅速变成黄色并有黄色沉淀产生，离心收集上清。
实施例六GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA凝胶过滤纯化
实施例五获得的上清液进行凝胶过滤，凝胶过滤柱为预装柱(7.6*250mm)，洗脱液为0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.4)，流速0.5mL/min，收集杨品峰，第一个峰为GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-HSA，第一个峰透析，冷冻干燥，计算回收率。第二个峰为GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys(NPYs)；第三个峰为5-硝基,2-巯基吡啶，颜色为黄色。
实施例七偶联率测定
准确称取偶联以前的人血清白蛋白和实施例六纯化冻干的GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA各10.0000mg，采用DTNB试剂测定游离巯基数量。样品溶于10mL0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH＝8.0)中，采用半胱氨酸作为标准品，比色在分光光度计上进行，波长为412nm，通过测定偶联前人血清白蛋白游离巯基数目为0.92mol/mol，实施例六获得的第一个峰游离巯基数目为0.03，测定偶联率为96.7％。
实施例八GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA对正常小鼠糖耐量实验
正常昆明小鼠，18-22g，雌性，实验前禁食不禁水12小时，给药前测定血糖值，给药GLP-1(7-36:Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA5mg/kg，对照组给生理盐水；每次糖耐量实验前测定空腹血糖浓度，然后腹腔注射2g/kg葡萄糖，30分钟后每20分钟测定血糖值，以时间为横坐标，血糖值为纵坐标做曲线，评价药物效果；给药后24、48、72和96小时分别测定糖耐量，实验结果通过Student’st-test统计。给药96小时后糖耐量曲线的结果显示在给药组和对照子小鼠间有统计学上的显著性差异(p<0.05)，见图4。说明长效GLP-1类似物能显著延长半衰期，具有良好的降血糖作用。
Claims (10)
1.一种GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物或其药学上可接受的盐，所述GLP-1(7-36)类似物的特征在于，GLP-1(7-36)的第8位丙氨酸被甘氨酸取代，并且在GLP-1(7-36)的C末端添加一个半胱氨酸；所述类似物通过-S-S-键与人血清白蛋白第34位Cys偶联。
2.根据权利要求1所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物或其药学上可接受的盐，其中所述复合物的结构式如式(I)所示：
GLP-1(7-36：Ala8Gly)Cys-S-S-Cys34-HSA
(I)。
3.根据权利要求1或2所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物或其药学上可接受的盐，其中所述药学上可接受的盐选自盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐、偏磷酸盐、硫酸氢盐，亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、焦磷酸盐、氢碘酸盐、氢氟酸盐、丙酸盐、富马酸盐、草酸盐、枸橼酸盐、乳酸盐或马来酸盐。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1-3任一项所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物或其药学上可接受的盐，以及药学可接受的载体。
5.根据权利要求1-3任一项所述的GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物或其药学上可接受的盐，或者根据权利要求4所述的组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
6.一种制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在活化剂存在下，由固相合成树脂和Fmoc-Cys(Trt)-OH偶联得到Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
b)合成人胰高血糖素样肽-1类似物GLP-1(Ala8Gly)Cys；
c)裂解，脱除保护基和树脂获得GLP-1(Ala8Gly)Cys；
d)纯化、冻干步骤b)获得的GLP-1(Ala8Gly)Cys；
e)用2,2’-二硫双(5-硝基吡啶)修饰步骤d)获得的GLP-1(Ala8Gly)Cys，生成GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)；
f)纯化、冻干步骤e)获得的GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)；
g)GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)和人血清白蛋白偶联生成GLP-1(Ala8Gly)Cys-S-S-Cys-HSA；
h)离心除沉淀，上清液凝胶过滤收集GLP-1(Ala8Gly)Cys--S-S-Cys-HSA和GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)；
i)测定GLP-1(Ala8Gly)Cys(NPYs)的量，计算偶联率。
7.根据权利要求6所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物的方法，其特征在于：在所述步骤a)中，所用的树脂为RinkAmide树脂，替代值0.3-0.8mmoL/g，所述活化剂为NMM/HATU/HOBt。
8.根据权利要求6或7所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物的方法，其特征在于：所述步骤a)和b)中，脱除Fmoc基团用20％哌啶/80％DMF溶液。
9.根据本权利要求6或7所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物的方法，其特征在于：所述步骤c)中，裂解采用裂解试剂R进行裂解。
10.根据权利要求6或7所述的制备GLP-1(7-36)类似物与人血清白蛋白的复合物的方法，其特征在于：所述步骤d)和f)中，纯化采用反相高效液相色谱法，色谱柱为C18柱，柱温为40℃。
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