CN105385636A - 一株产细菌素的肠膜明串珠菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株产细菌素的肠膜明串珠菌，保藏号为：CCTCC？M？2015639。本菌种产生的细菌素对单增李斯特菌有抑菌活性，且具有良好的热稳定性和pH稳定性，对蛋白酶敏感；这株菌的发酵上清液可以直接用作细菌素粗品，采用阳离子交换层析对发酵上清液进行分离纯化后可以得到较纯的细菌素产品；干燥后可以得到粉末状粗品或较纯品；将细菌素溶液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的单增李斯特菌。本菌种与化学防腐剂和抗生素相比，细菌素为蛋白类物质，可被蛋白酶完全酶解，具有无残留、不产生抗药性和安全等特点。

Description

一株产细菌素的肠膜明串珠菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株能够抑制单增李斯特菌生长的产细菌素的乳酸菌。

背景技术

食品的保藏问题至今为止仍是食品行业中一个亟待解决的关键问题，食品中的腐败菌、病原菌在保藏过程中需要严格控制，因此防腐剂是食品中不可缺少的。但是近年来，食品安全恶性事件不断发生，大部分是食品添加剂过量使用而带来的新的食品安全问题，化学防腐剂作为一类食品添加剂具有一定的安全隐患，对人体健康不利，因此迫切需要寻找即可以抑菌，又无毒副作用、无残留的天然食品防腐剂。乳酸菌产生的细菌素在这方面具有独特的优势。细菌素是细菌通过核糖体合成的一类蛋白质或肽类物质，因其具有抑菌活性而受到广泛关注。与化学防腐剂相比，细菌素作为一种蛋白类物质，可被蛋白酶水解而不会残留于人或动物体内，不易产生耐药性，因此具有较高的安全性，可广泛应用于天然食品防腐剂、抗菌剂及医药领域。

乳酸菌是人和动物体内以及一些环境中存在的一类重要的微生物，其中绝大部分是人体内必不可少的且具有重要生理功能的益生菌，广泛存在于人体肠道中。乳酸菌作为益生菌在食品领域中已经应用多年。乳酸菌能分泌乳酸，使pH值降低，从而能抑制其它细菌的生长。而一些乳酸菌还产生其它的抗菌成分，其中最重要的就是细菌素。乳酸菌产生的细菌素能够抑制单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌等食品腐败菌、病原菌，其中由乳酸乳球菌产生的细菌素Nisin已被FDA批准用于食品生物保鲜中。但由于Nisin仅对部分革兰氏阳性菌有抑制作用，且在中性条件下溶解性差，稳定性较低，因而限制了Nisin在食品防腐保鲜中的应用。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一株产细菌素的肠膜明串珠菌及其应用。本发明从中国传统发酵食品泡菜中筛选并提供了一株产细菌素的乳酸菌，可以有效控制食源性病菌单增李斯特菌的生长并有效控制食品体系中的单增李斯特菌污染，相对于化学防腐剂和抗生素而言，具有无残留、不产生抗药性和安全等特点。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的乳酸菌为肠膜明串珠菌K7(LeuconostocmesenteroidesK7)，其特征在于保藏号为：CCTCCNO：M2015639，保藏日期为2015年10月23日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，中国，武汉，武汉大学。

这株乳酸菌为能够产生细菌素的乳酸菌，从韩式泡菜中分离得到，为兼性厌氧型，在MRS固体培养基30℃培养48h后，菌落扁平，革兰氏染色呈阳性，经16SrDNA鉴定为肠膜明串珠菌。

这株菌于MRS液体培养基中培养后的发酵上清液即为细菌素粗品，对单增李斯特菌具有良好的抑菌活性。将细菌素粗品通过阳离子交换层析纯化后，得到较纯的细菌素产品。经冷冻干燥或喷雾干燥后，得到粉末状细菌素粗品和较纯品。

由这株菌制备的细菌素粗品和较纯品具有良好的热稳定性和pH稳定性。80℃加热30min后保留全部活性，100℃加热30min后仍能保留一半活性；在pH2～6下保存2h保留全部活性，在pH7～10下保存2h仍能保留一半活性。由这株菌制备的细菌素粗品和较纯品对蛋白酶敏感，能够被胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解而完全失去活性。该细菌素产品随食品摄入人体后，可以被消化道内的酶类降解，并吸收、再利用，不会对人体产生任何毒副作用。

当细菌素粗产品以不低于1.0AU/10⁷cfu的添加量添加到单增李斯特菌溶液中，可使单增李斯特菌的OD₆₀₀值降低1.9～2.3，对其它细菌则没有影响；当以不低于2AU/10⁶cfu的添加量添加到染菌食品中，在1天内可将单增李斯特菌的数量降低1～2个数量级，抑菌效果明显。纯的细菌素产品以不低于20μg/mL的浓度添加到单增李斯特菌培养物中，能够有效抑制其生长。

附图说明

图1为肠膜明串珠菌细菌素对单增李斯特菌的抑制效果。

具体实施方式

本乳酸菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCCNO：M2015639，分类学命名：肠膜明串珠菌K7(LeuconostocmesenteroidesK7)。下列所述实施例中各原料和操作仪器均为普通市售。

实施例1：产细菌素乳酸菌的筛选和鉴定

MRS培养基的配制：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾2g，七水硫酸镁0.58g，一水硫酸锰0.25g，吐温-801mL，加蒸馏水至1L，pH6.4。

TSBYE培养基的配制：将Tryptonesoyabroth(TSB)30g，酵母提取物6g，加蒸馏水至1L，pH7.2～7.4。

固体培养基的配制：在液体培养基中添加1.5％～2.0％琼脂。

(1)乳酸菌的分离与纯化

本发明所用泡菜材料均为内蒙古通辽市科尔沁左翼中旗保康镇农村家庭自制，其制作方法为：将蔬菜(白菜、豆角、白萝卜)洗干净，与食盐、辣椒、香料混匀，放入泡菜缸中密封，置于阴凉干燥处，20℃左右发酵约一周，即得到泡菜。在无菌条件下，吸取100μL泡菜汁，进行梯度稀释，得到10^-5、10^-6、10^-7的梯度稀释液。取不同梯度的稀释液100μL，分别加入到MRS固体平板上，并将菌悬液均匀涂布于平板表面，置于30℃培养48h。根据菌落形态的差异，用枪头挑取各种典型菌落，在另一MRS固体平板上进行划线，置于30℃培养48h。挑取单菌落重新划线两次，直至菌落完全纯化。

(2)产细菌素乳酸菌的筛选

将步骤(1)得到的纯菌株分别接种于MRS液体培养基中，置于30℃静置培养24h，得到发酵液，经20℃、10000rpm离心10min，得到发酵上清液。用5MNaOH将发酵上清液pH值调至5.5～6.0，置于80℃水浴加热10min，得到乳酸菌待测样品。

将过夜培养的单增李斯特菌稀释到10⁶cfu/mL，取100μL涂布于TSBYE固体平板，在表面放入几个牛津杯，在每个牛津杯中各加入100μL乳酸菌待测样品或MRS液体培养基，37℃下静置培养12h，通过牛津杯扩散法筛选出能够产生抑菌圈的乳酸菌待测样品，并保存对应的乳酸菌菌株。对于筛选出的乳酸菌待测样品，用终浓为2mg/mL的胰蛋白酶于37℃处理2h，再通过牛津杯扩散法检测处理后样品是否产生抑菌圈，若抑菌圈消失，则说明该菌株为产细菌素的菌株。

(3)产细菌素乳酸菌的鉴定

将筛选出的一株产细菌素的乳酸菌菌株K7培养至对数生长期，提取其基因组DNA。利用细菌16SrDNA通用引物(正向引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物ACGGCTACCTTGTTACGACTT)扩增出它的16SrDNA片段，连接到pMD19-T载体，测序，序列全长为1473bp(见序列表)。通过序列比对，证明为肠膜明串珠菌，命名为肠膜明串珠菌K7。

实施例2：肠膜明串珠菌K7细菌素的生化特性

细菌素活力的测定方法为连续二倍稀释法，指示菌为单增李斯特菌。一个活力单位(AU)定义为能使指示菌产生清晰透明圈的最少细菌素量。溶液的细菌素活力(AU/mL)＝2ⁿ×(1000/x)。n表示使指示菌产生抑菌圈的细菌素溶液的最大连续二倍稀释的次数；x表示每孔中添加的细菌素溶液的体积(μL)。测定活力所用的稀释液为20mMpH6.0的柠檬酸盐缓冲液。

接种肠膜明串珠菌K7至5mLMRS液体培养基中，30℃培养24h，以3％接种量转接至50mLMRS液体培养基中，30℃培养24h，发酵液经20℃、10000rpm离心10min，得到发酵上清液。用5MNaOH将发酵上清液pH值调至6.0，置于80℃水浴加热10min，得到发酵上清液样品。

为了了解样品对蛋白酶的敏感性，将发酵上清液样品分别用终浓为2mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶于37℃水解2h，再通过牛津杯扩散法测定其残余活力。为了了解样品的热稳定性，将发酵上清液样品在不同温度(25℃、60℃、80℃、100℃、121℃)下加热不同时间(20min、30min、60min)，立即置于4℃，再通过牛津杯扩散法测定其残余活力。为了了解样品的pH稳定性，将发酵上清液样品用5MNaOH或4MHCl调至不同pH值(pH2～10)，置于25℃下保存2h，回调至pH6.0，再通过牛津杯法测定其残余活力。结果见表1所示。发酵上清液样品对各类蛋白酶均敏感，易被降解；具有良好的热稳定性，100℃加热30min后仍能保留一半活性；对pH不敏感，在pH7～10下保存2h仍能保留一半活性。

表1肠膜明串珠菌细菌素的生化特性

实施例3：肠膜明串珠菌K7细菌素的抑菌谱

首先制备涂布有不同细菌的指示平板。分别接种单增李斯特菌CMCC54005、单增李斯特菌NB、单增李斯特菌2、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC6538、痢疾志贺氏菌CMCC51334、阪崎肠杆菌ATCC51329于TSBYE液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，稀释到一定浓度后涂布于TSBYE固体平板，使其菌落数约为10⁶cfu。分别接种植物乳杆菌SHC096、短乳杆菌CC085、粪肠球菌WX108、粪乳杆菌MT133、弯曲乳杆菌ATCC51436于MRS液体培养基中，30℃培养过夜，稀释到一定浓度后涂布于MRS固体平板，使其菌落数约为10⁶cfu。接种大肠杆菌ATCC8099于LB液体培养基，37℃、200rpm培养过夜，稀释到一定浓度后涂布于LB固体平板，使其菌落数约为10⁶cfu。

在不同指示平板上通过牛津杯扩散法检测肠膜明串珠菌K7的发酵上清液样品对不同细菌的菌苔是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈直径。结果见表2所示。K7的发酵上清液样品对三株单增李斯特菌都有较强的抑菌活性，抑菌圈均超过15mm，而对其他指示菌无抑菌活性。

表2肠膜明串珠菌细菌素的抑菌谱

牛津杯孔径大小为8mm；-：无抑菌圈；+：抑菌圈直径为8～10mm；++：抑菌圈直径为10～15mm；+++：抑菌圈直径>15mm。

实施例4：肠膜明串珠菌K7细菌素对单增李斯特菌CMCC54005的抑制效果

通过SPSepharoseFastFlow阳离子交换层析柱对肠膜明串珠菌K7的发酵上清液样品进行分离纯化，得到较纯的细菌素产品，测定其最小抑菌浓度(MIC)为28.2μg/mL。

将过夜培养的单增李斯特菌CMCC54005按初始OD₆₀₀值为0.2接种于20mL新鲜的TSBYE液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD₆₀₀值约为1.0时，加入终浓为MIC的细菌素较纯品和经蛋白酶处理后失活的细菌素较纯品，测定单增李斯特菌CMCC54005菌液OD₆₀₀值随时间变化的曲线，结果见图1所示。加入失活细菌素3h后，单增李斯特菌的OD₆₀₀从1.0快速增加至3.3～3.5；而加入细菌素后，单增李斯特菌的OD₆₀₀仅缓慢增加至1.2～1.4。说明肠膜明串珠菌K7细菌素能够有效地抑制单增李斯特菌的生长。

实施例5：细菌素较纯品对牛奶中病原菌的控制效果

取3mL牛奶加入到10mL的无菌试管中，加入10⁹cfu/mL的单增李斯特菌溶液0.1mL，然后加入终浓度为2～5AU/10⁶cfu的细菌素纯品，放置到4℃下，每6h测一次液体里面的活菌数，对比实验中加入等体积的无菌水代替。

结果表明，细菌素纯品作用于牛奶1天后，活菌数维持在0.3～0.5×10⁸cfu/mL，随后的几天活菌数会逐渐增加至0.8×10⁸cfu/mL；而对比实验中活菌数则增长至在0.5～1.2×10⁹cfu/mL，细菌素纯品可将牛奶中单增李斯特菌的数量降低1～2个数量级，抑菌效果明显。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一株肠膜明串珠菌(LeuconostocmesenteroidesK7)，其特征在于保藏号为：CCTCCM2015639，保藏日期为2015年10月23日，保藏地点为中国典型培养物保藏中心，中国，武汉，武汉大学。

2.一种权利要求1所述的肠膜明串珠菌的应用，其特征在于所述菌株产生的细菌素对单增李斯特菌具有有效的抑制作用。

3.一种权利要求1所述的肠膜明串珠菌的应用，其特征在于将所述肠膜明串珠菌培养液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的单增李斯特菌。

4.一种权利要求1所述的肠膜明串珠菌制备细菌素的方法，其特征在于将所述菌株接种于MRS液体培养基于30℃培养16～48h，收集发酵上清液，得到细菌素粗品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于将所述细菌素粗品通过阳离子交换层析纯化后，得到纯的细菌素产品。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于将所述细菌素经冷冻干燥或喷雾干燥后得到粉末状细菌素。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述细菌素对单增李斯特菌有良好的抑菌活性，且具有良好的热稳定性和pH稳定性，对蛋白酶敏感。

8.一种权利要求4所述的方法制备得到的细菌素的应用，其特征在于将所述细菌素的溶液直接喷涂于固体食品的表面，或混合于含菌食品中，用于抑制食品中的单增李斯特菌；所述细菌素在含菌料中的添加量为不低于2AU/10⁶cfu。

9.一种权利要求5所述的方法制备得到的细菌素的应用，其特征在于将所述纯的细菌素产品以不低于20μg/mL的浓度添加到单增李斯特菌培养物中，能够有效抑制其生长。