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CN105353137A - 一种快速检测色素苏丹红的方法 - Google Patents

一种快速检测色素苏丹红的方法 Download PDF

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CN105353137A
CN105353137A CN201510918063.XA CN201510918063A CN105353137A CN 105353137 A CN105353137 A CN 105353137A CN 201510918063 A CN201510918063 A CN 201510918063A CN 105353137 A CN105353137 A CN 105353137A
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CN
China
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plate
protein
sudan red
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microplate
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Application number
CN201510918063.XA
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董颖超
王莹
秦玉昌
牛力斌
李军国
刘薇
柳家鹏
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Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

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Abstract

本发明提供了一种快速检测色素苏丹红的方法，在酶标板的微孔中加入抗苏丹红特异性单克隆抗体之前，先加入蛋白G。与传统EL1SA检测方法相比，本方法不仅特异性强、灵敏度高、精确性和准确性高、操作简便等优点，还可提高抗体的利用率，节省包被抗体的用量。本发明还提供了一种包被蛋白G的苏丹红的ELISA检测试剂盒。

Description

一种快速检测色素苏丹红的方法
技术领域
本发明涉及一种快速检测色素苏丹红的方法，本发明还涉及一种包被蛋白G的苏丹红的ELISA检测试剂盒。
背景技术
苏丹红是一种人工合成的偶氮类、油溶性的化工染色剂，被大量地用在生物、化学等领域。
苏丹红为亲脂性偶氮化合物，外观呈暗红色或深黄色片状晶体，难溶于水，主要包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ等4种类型。其中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ均为I的化学衍生物。由于国际癌症研究机构(IARC)将苏丹红归为第3类可致癌物质，研究快速检测苏丹红的方法，很有必要。
目前，对苏丹红的检测一般采用高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法及液谱-质谱联用法等，但上述方法操作复杂，价格较高。
简单快速有效的检测方法是治理苏丹红滥用问题的关键。酶联免疫吸附测定法(ELISA)具有高效、灵敏、便于基层推广等优点，而且可以直接采样进行检测，与HPLC、GC-MS检测有较高的一致性，目前已有应用于苏丹红快速检测的报道，但常规的苏丹红ELISA快速检测试剂盒方法具有以下缺点：需要较高纯度的抗体，且抗体利用率低、同一板之内孔间变异较大。
一是抗体利用率低。现有技术方法是抗体直接与酶标板反应，由于抗体排列不规则，不能够保证与抗原有效相结合(见图1)。而且因为抗体利用率低，用量大，还需要较高纯度，造成检测成本较高；
二是，同一酶标板中的各孔间变异较大，影响检测结果的准确性。如图1所示。此外，现有ELISA检测方法是先包被抗原，然后加抗体，再加酶标二抗，然后再加显色剂。步骤较多，操作比较繁琐。
因此，如果能使得抗体Y排列较为整齐，保证抗体Y与抗原有效相结合，将能有效利用抗体。既提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果的准确性。
蛋白G(ProteinG)是从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取的能与IgGFc片段特异性结合的蛋白。利用了蛋白G的功能，蛋白G是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，并且具有很高的亲和力。通过克隆了蛋白G的基因序列，在大肠杆菌中表达出了与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G。将基因重组的蛋白G偶联到酶标板上后，再进行抗体包被。将基因重组的蛋白G偶联到酶标板上后，降低了空间位阻，增加了重组蛋白G与苏丹红抗体IgG的结合能力，从而使抗体的Fab端朝向外侧，空间位阻不对抗原结合区域构成干扰，对酶标板先经蛋白G处理后，再进行抗体包被，不仅可提高同一板内及不同板间的酶标孔的均一性，而且能提高抗体的利用率。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的ELISA试剂盒苏丹红抗体的需用量仅为通常制备方法下抗体的需用量的十分之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测色素苏丹红的方法。具体目的是提供一种提高抗体利用率，降低检测成本，又能提高检测结果准确性的ELISA检测方法和试剂盒。
本发明利用了蛋白G的功能。检测时，在酶标孔中先加蛋白G，蛋白G具有跟抗体上Fc部分特异结合的特点，所以将蛋白G偶联到酶标板上后，使抗体的Fab端朝向外侧，从而降低了空间位阻，不对抗原结合区域构成干扰，使抗体Y排列更加的整齐，增加了重组蛋白G与苏丹红抗体IgG的结合能力，能够保证Y有效的跟抗原相结合，提高抗体的利用率(见图2)。试验表明，在不影响检测性能的条件下，先经蛋白G预处理的ELISA试剂盒苏丹红抗体的需用量仅为通常制备方法下抗体的需用量的十分之一。
不仅如此，对酶标板先经蛋白G处理再进行抗体包被，还可提高同一酶标板内或不同酶标板中各孔间的均一性，提高检测的准确性。
所述蛋白G(ProteinG)是一种G型链球菌细胞壁上的蛋白，从链球菌A、C和G群很多菌株的细胞壁及培养上清中提取得到。蛋白G能特异性的与多种动物抗体的Fc部位相结合，并且具有很高的亲和力。
在实际应用中，所用的蛋白G也可以选用基因重组蛋白G，通过克隆蛋白G的基因序列，在大肠杆菌中表达出与抗体有高亲和力的基因重组蛋白G而获得。蛋白G可以通过市售方式，方便获得。
本发明的实施例1比较了传统的方法和采用本专利的方法检测苏丹红Ⅰ，由试验结果可以看出可以只用原来的抗体浓度的十分之一，即可达到传统方法的检测效果；
实施例1是采用和未采用蛋白G处理的试验比较，其中：
实验1采用蛋白G处理，抗体用量为100微升，抗体浓度为1：1000000；
实验2未采用蛋白G处理，抗体浓度稀释比为1：100000，为实验1的10倍。抗体用量未变，仍为100微升，
从结果可看出：采用蛋白G处理后，不仅节约了90％的抗体用量，而且每个批次的结果更加均匀，结果更一致。
传统ELISA检测方法的步骤为：空白酶标板——包被抗体——加入标准物质或样品与酶标化合物竞争反应；
本专利的步骤为：空白酶标板——包被一层proteinG——包被抗体——加入标准物质或样品与酶标化合物竞争反应；
本发明与传统方法相比，最大的特点就是：通过这一技术处理，可以节省抗体用量，减小板间板内的差异；同时通过优化抗体浓度以及酶标化合物可增加检测的灵敏度。
本发明建立的EL1SA检测方法的具体步骤如下：
1)制备包被有蛋白G的酶标板
第一步：包被蛋白G
用包被缓冲液将蛋白G稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到空白酶标板的微孔内，37℃孵育2h；
第二步：洗板
取出酶标板甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第三步：包被抗体
用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗苏丹红特异性单克隆抗体稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到酶标板的孔内，37℃孵育0.5h；
第四步：洗板
取出酶标板，甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第五步，封闭
用1％鱼皮明胶的封闭液，100～200μl/孔，37℃孵育2h；
第六步，干燥
取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；得到包被蛋白G的酶标板；
2)反应
操作步骤如下：在步骤1)制备的酶标板的各微孔中，或加入50μl系列浓度的苏丹红标准品，或加入50μl待测样品提取液；之后，每孔中再加入50μl酶标记苏丹红抗原，此时每微孔内含100μl溶液，25℃放置15min～60min；
3)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，洗涤酶标板孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩掉板内液体并拍干板孔；
4)加底物：加入底物显色液放置10～20min，底物显色液为含0.8mmol/L过氧化氢脲和0.4mmol/L四甲基联苯胺的pH7.9的磷酸缓冲液溶液；
5)终止：加入2mol/LH2SO4，50μl/孔；
6)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。
以上所述洗涤酶标板孔，是用PBST洗涤液洗涤酶标板孔，使用洗涤液200～400μl/孔；
所述系列浓度的苏丹红标准品，浓度为0～4.05ng/ml，用0.01mol/LPBS缓冲液配制；
所述酶标记苏丹红抗原的浓度是1:5000～25000。
为与传统EL1SA检测方法进行比较，本发明人按如下步骤进行了传统的EL1SA检测：
1)包被ELISA板：
第一步：用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗苏丹红特异性单克隆抗体稀释到0.1～1μl/ml，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育0.5h；
其余步骤与前述相同。
结果表明，与传统EL1SA检测方法相比，本方法不仅特异性强、灵敏度高、精确性和准确性高、操作简便等优点，还可提高抗体的利用率，节省包被抗体的用量。
本发明提供了一种苏丹红的ELISA检测试剂盒，包括有常规苏丹红ELISA检测试剂和酶标板，其特征是，还含有蛋白G。
所述常规苏丹红ELISA检测试剂包括苏丹红Ⅰ标准品、标记辣根过氧化物酶的苏丹红Ⅰ、样本稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
所述样本稀释液为pH为7.4的10mMPBS溶液。
洗涤液为含0.2％Tween20pH为7.4的0.6MPBS溶液。
底物显色液为含0.8mmol/L过氧化氢脲和0.4mmol/L四甲基联苯胺的pH7.9的磷酸缓冲液溶液；
终止液为含2mol/LH2SO4。
本发明试剂盒使用方法：
1.样本前处理
称取2g样本于离心管中，加入10mL乙腈，剧烈震荡10min，室温3000r/min以上离心10min。移取5mL上清液于50℃环境下氮气吹干。加入正己烷4mL涡动30S溶解干燥的残留物，加入1mL1MNaOH涡动15S，室温3000r/min离心10min，移取1mL上清液于50℃环境下氮气吹干，加入0.5mLDMF充分溶解干燥的残留物，取50加人950μL稀释好的复溶液充分混匀，得到待测样品溶液。
2.操作步骤
(1)分别在微孔中加入系列浓度的标准品和处理后的上样液50μL/孔，再加入酶标物50μL/孔，25℃放置30min；
(2)弃去液体，甩干。洗涤液每孔250μl，洗涤5次，每次20s，甩干；
(3)加底物溶液，每孔100μl，37℃避光显色15分钟；
(4)加终止液，每孔50μl，轻轻摇晃，迅速使用酶标仪在450nm主波长和630nm次波长下测各孔OD值；
(5)结果判定：
以标准品百分吸光率为纵坐标，以苏丹红标准品浓度(μg/kg)的对数值为横坐标，在半对数绘图纸上绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度。
包被蛋白G的苏丹红Ⅰ的ELISA检测试剂盒，使用蛋白G预处理酶标板，可快速有效的检测待检样本中苏丹红Ⅰ残留水平。基于ProteinG和IgG的特殊亲和力，ProteinG与抗体Fc片段结合后，Fab片段伸展在外，更容易抓取抗原。直接用抗体包板，抗体在板上的结合方向是随机的，而ProteinG板上的抗体具有一致方向性。抗体利用率更高，抗体的用量更少，制备得到酶标板板内、板间的差异更小。
附图说明
图1是抗体直接与酶标板反应的示意图,其中：
左图是现有技术方法中抗体直接与酶标板反应的示意图。可看出，由于抗体排列不规则，不能够保证与抗原有效相结合；
右图是将蛋白G偶联到酶标板上后，提高抗体Y与抗原相结合的示意图。可看出，抗体的Fab端朝向外侧，从而降低了空间位阻，不对抗原结合区域构成干扰，使抗体Y排列更加的整齐，增加了重组蛋白G与苏丹红Ⅰ抗体IgG的结合能力；
图2抗体包被前先经蛋白G处理的酶标板试剂盒的标准曲线图，拟合的方程为y＝1.94227-0.22146ln(x)，相关系数：r2＝0.99624。
图3抗体包被前未经蛋白G处理的酶标板试剂盒的标准曲线图，拟合的方程为y＝1.89597-0.21949ln(x)，相关系数：r2＝0.9898。
具体实施方式
试验材料和试剂
以下各实验中所用的蛋白G，购自北京华安麦科生物技术有限公司，产品编号为HSS098,纯度95％以上，包装容量为10mg。
抗苏丹红特异性单克隆抗体、酶标记苏丹红抗原由本发明人实验室制备或合成；
PBST洗涤液的配制：分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，加0.5ml吐温-20，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。
PBS缓冲液的配制:分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。
其他试剂购自北京市化学试剂厂。
实施例1本发明方法和传统方法制备的苏丹红Ⅰ检测的ELISA试剂盒比较实验目的：比较本发明方法和传统不经蛋白G处理的苏丹红检测方法
实验方法和结果：见如下
一、包被前先经蛋白G处理的苏丹红ⅠELISA检测试剂盒的制备
1.苏丹红Ⅰ单克隆抗体的获得
1.1免疫脾细胞的获得
1.1.1免疫动物
选择6周龄，雌性，BALB/C小鼠，将购买的苏丹红Ⅰ人工免疫原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射，免疫剂量为50μg，进行基础免疫。免疫前断尾取血，分离血清，保存在-20℃，作为正常对照小鼠的血清。隔4周，进行第二次免疫，抗原剂量同基础免疫，抗原与福氏不完全佐剂混合、乳化，对小鼠进行加强免疫。隔4周，进行第三次免疫，免疫条件同第二次。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。
1.2.2饲养细胞的获得
融合前一天，引颈处死小鼠，浸泡于75％酒精1min。将小鼠仰卧在解剖板上，剪开胸部皮肤，纵向拉开皮肤，暴露腹部，用注射器抽取5mL无血清培养液注入腹腔，轻柔腹部1～2min，吸出细胞悬液，移入离心管。用无血清培养液离心洗涤一次(1000rpm，5min)。弃去上清液，加入HAT培养液，均匀悬液，接种于96孔培养板，0.1mL/孔。置37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养备用。
1.2细胞融合和杂交瘤的筛选
1.2.1细胞融合
将50％PEG4000、无血清培养液、HAT筛选培养液置37℃CO2培养箱中预热。收获对数生长期的Sp2/0细胞，用无血清培养液洗涤3次(1000r/min离心10min)，作活细胞计数。无菌条件下分离脾细胞，作活细胞计数。将1×108脾细胞与1×107Sp2/0细胞在50mL尖底离心管中混匀，以1000r/min离心10min，弃去上清液，用食指轻弹管底，使细胞沉淀松散。将含有脾细胞和Sp2/0瘤细胞的50mL尖底离心管放于38℃融合水杯中，用1mL吸管吸取0.7mLPEG4000缓慢加入到细胞混悬液中(在1min内完成)，边加边轻轻地转动试管，使PEG与细胞充分混匀。静置90秒，在2min内加完15mL37℃预热的无血清培养液，以1000r/min离心10min，弃去上清液，加入37℃预温HAT培养液充分混匀。接种于前一天含有BALB/C饲养细胞的96孔培养板中，0.1mL/孔。置37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。
1.2.2杂交瘤细胞的筛选
融合5天观察有小集落后，用HAT筛选培养液换液，10天后换HT培养液，镜检96孔细胞培养板。观察12天，集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用的ELISA法检测阳性孔。OD450值大于1时，判定为阳性孔。将阳性孔细胞转至24孔含有巨噬细胞的培养板，待集落长至1/3～1/2孔时，取培养上清液，用的ELISA法检测特异性。检出无交叉阳性株，进行克隆化培养，同时转入培养瓶。
1.2.3杂交瘤细胞的克隆
采用有限稀释法分别对阳性的杂交瘤细胞株进行了3次克隆，用ELISA法筛选阳性率达到100％的细胞株，且OD450值最高的细胞株。扩大培养，冻存，建立细胞株系。
1.3腹水获得
将筛选得到的细胞株生产细胞复苏后，培养于含15％胎牛血清的RPMI1640完全培养液中进行扩增。于两周前给小鼠腹腔注射降植烷(0.5mL/只)。然后将扩增的杂交瘤细胞接种于用降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔内，每只小鼠腹腔内注射0.5mL(约1×106个细胞)。7～11天后小鼠开始产生腹水。采用一次收集的方法收集腹水，平均每只小鼠可获得3～5mL腹水。取小鼠腹水置于离心管中，3000r/min，离心15min，弃去上层油脂，吸取淡黄色腹水，分装，-20℃冻存备用。
1.4抗体的分离纯化和鉴定
纯化抗体；SDS-PAGE电泳法鉴定抗体纯度，抗体纯度良好；ELISA方法鉴定抗体活性，OD450值大于1，均合格；ELISA方法鉴定抗体特异性，检测单抗只针对该苏丹红Ⅰ抗原特异，与其它抗原不发生反应，具有较好的特异性。
1.5用于苏丹红Ⅰ检测的单克隆抗体特异性检测结果
测试1μg/ml的交叉反应药物，根据半数抑制浓度计算交叉反应率。
交叉反应率＝IC50(苏丹红Ⅰ)/IC50(交叉药物)×100％
表1用于苏丹红Ⅰ检测的单克隆抗体交叉反应率
结构近似药物名称 交叉反应(％)
苏丹红Ⅰ 100
苏丹红Ⅱ 5.8
苏丹红Ⅲ 6.2
苏丹红Ⅳ 7.4
对位红 17.6
日落黄 ＜0.05
柠檬黄 ＜0.05
2.酶标记苏丹红Ⅰ抗原
将4mgHRP溶于1ml水中，加入0.2ml1M过碘酸钠，制成活化HRP；用0.5MpH10CB将所述活化HRP的pH调至9.5，取2mg苏丹红Ⅰ-BSA，透析完成。
3.EL1SA检测方法的建立
1)包被ELISA板：
首先用包被缓冲液将蛋白G稀释到0.1～1μg/ml，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育2h；
洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液(PBST)洗涤板孔，200～400μl/孔，洗涤2次；
再用10mMpH7.4PBS缓冲液将抗苏丹红Ⅰ特异性单克隆抗体稀释到0.1～1μg/ml，100μl/孔；包被到ELISA微孔板内，37℃孵育0.5h；
2)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液洗涤板孔，200～400μl/孔，洗涤2次；
3)封闭：1％鱼皮明胶的封闭液，100～200μl/孔，37℃孵育2h；
4)干燥：取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；
5)反应时加入待测样品和酶标苏丹红Ⅰ抗原：每孔加入0.01mol/LPBS稀释液缓冲液配制的标准品0，0.15～4.05ng/ml，50μl/孔，再加入1:5000～25000浓度的酶标抗原，50μl/孔，25℃放置15min～60min；
6)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液(PBST)洗涤板孔，200～400μl/孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩掉板内液体并拍干板孔；
7)底物：加入底物放置10～20min；
8)终止：加入2mol/LH2SO4，50μl/孔；
9)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。
4、建立抗体包被前先经蛋白G处理的苏丹红ⅠELISA试剂盒标准曲线
表2抗体包被前先经蛋白G处理的苏丹红Ⅰ测定ELISA试剂盒标准曲线
标准曲线见图2。
5、蛋白G的苏丹红Ⅰ的ELISA检测技术重复性检测结果
样本加标50ng/g苏丹红，11份样品进行提取和检验，结果见表3。
表3抗体包被前先经蛋白G处理的苏丹红Ⅰ测定ELISA试剂盒重复性
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
50.4 48.2 47.9 46.2 44.6 46.6 48.8 43.6 48.7 46.8 45.4
11次重复测量的均值为47.02ng/g，方差2.02，变异系数4.29％。
(一)苏丹红Ⅰ单克隆抗体的获得
该制备步骤同一、(一)。
(二)包被前未经蛋白G处理的苏丹红ⅠELISA检测试剂盒检测方法的建立
1)用10mMpH7.4PBS缓冲液将抗苏丹红Ⅰ特异性单克隆抗体稀释到1:100000(为采用蛋白G包被酶标板的抗体量的10倍)，100μl/孔，37℃孵育0.5h；
其余步骤同一。
4、建立抗体包被前未经蛋白G处理的苏丹红ⅠELISA试剂盒标准曲线
表4包被前未经蛋白G处理的苏丹红Ⅰ测定ELISA试剂盒标准曲线
序号 浓度ppt Absorbance B/B0(％) calculated Deviation
1 0 2.103 100 - -
2 150 1.690 80.4 150 0.0
3 450 1.183 56.3 449.6 0.1
4 1350 0.582 27.7 1351.9 0.1
5 4050 0.200 9.5 4047.4 0.1
标准曲线见图3。
实验结论：由图2、图3可知，这两种方法得到的ELISA试剂盒标准曲线均可以大于99.8％，基本能满足日常检测的要求，经过蛋白G处理的ELISA试剂盒的线性更好。
实施例2抗体包被前是否经蛋白G预处理的试剂盒精密度与准确度试验
1、标准品溶液重复性试验
按照实施例2、3中的方法分别制备不同处理方法的酶标板中，每种处理方法中随机选三个酶标板的10个微孔，测定0.20ng/mL标准品溶液的吸光度值(OD值)，计算变异系数CV，结果见表5、表6。
表5经蛋白G处理ELISA试剂盒标液重复性试验结果
表6未经蛋白G处理ELISA试剂盒标液重复性试验结果
2、样本的可重复性实验
对小麦粉进行添加实验，添加终浓度为50ng/g。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复五次，分别计算变异系数，结果见表7，表8。
表7经蛋白G处理ELISA试剂盒小麦样品重复性试验结果
表8未经蛋白G处理ELISA试剂盒小麦样品重复性试验结果
实施例3样品检测试剂盒的准确度试验
为验证采用两种不同方式得到的试剂盒的准确度，对小麦粉、玉米蛋白粉、禽配合饲料进行添加回收试验，添加终浓度为0ng/g、10ng/g、20ng/g、50ng/g，每个浓度做三孔平行，计算其添加回收率。
样品的前处理方法为：称取5g经过粉碎的样品，加入25mL样品稀释液(浓缩样本稀释液按1:10稀释)，150r/min振荡20min，过滤(或于4000r/min离心10min)，取滤液或上清液，用样品稀释液按照1:19比例稀释，稀释后的溶液为上样液。两种不同方法制备的试剂盒的检测结果见表9。
表9两种检测试剂盒检测小麦粉、玉米蛋白粉、禽配合饲料样品的试验结果
根据实验结果，小麦粉、玉米蛋白粉及禽配合饲料的添加回收的检测结果见表8，包被前经蛋白G处理的ELISA检测的平均回收率是56.4-92.1％，变异系数5.3-11.2％；包被前未经蛋白G处理的ELISA检测的平均回收率是54.2-89.3％，变异系数9.7-15.2％。从总体回收率及变异系数上看，苏丹红Ⅰ抗体在包被酶标板前先经蛋白G处理，ELISA检测结果优于包被前未经蛋白G处理的ELISA检测结果。苏丹红抗体在包被酶标板前先经蛋白G处理的ELIAS试剂盒检测结果的准确度和精确度均符合实际检测要求，可用于苏丹红在饲料原料及产品中的快速筛查。
实施例4包被抗体前经蛋白G处理的ELISA稳定性试验
为考察包被抗体前经蛋白G处理的ELISA稳定性，将包被抗体前经蛋白G处理的试剂盒放置于2～8℃，分别取0、2、4、6、8、10、11和12个月的试剂盒，对苏丹红Ⅰ标准品(0.20ng/mL)的吸光度值、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。结果表明，经过低温下保存试验，苏丹红Ⅰ标准样品(0.20ng/mL)的吸光度值下降小于8.7％，且OD不低于1.0；批内变异系数小于8.4％；添加水平在50ng/g时，回收率在79.5～116.9％之间；各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。
实验结论：通过以上实验可以看出：经过蛋白G处理的检测苏丹红Ⅰ试剂盒在重复性、抗体的利用效率等方面优于未经处理的试剂盒。

Claims (9)

1.一种用酶联免疫吸附法测定苏丹红的方法，其特征是，在酶标板的微孔中加入抗苏丹红特异性单克隆抗体之前，在空白酶标板的微孔中先加入蛋白G。
2.权利要求1所述的方法，所述加入蛋白G，是将蛋白G用包被缓冲液稀释至0.1～1μl/ml，每个酶标板微孔加100μl，37℃孵育2h。
3.权利要求2所述的方法，所述包被缓冲液是0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液。
4.权利要求2所述的方法，步骤如下：
1)制备包被有蛋白G的酶标板
第一步：包被蛋白G
用包被缓冲液将蛋白G稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到空白酶标板的微孔内，37℃孵育2h；
第二步：洗板
取出酶标板甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第三步：包被抗体
用10nMpH7.4PBS缓冲液将抗苏丹红特异性单克隆抗体稀释到10～100μg/ml，按100μl/孔加到酶标板的孔内，37℃孵育0.5h；
第四步：洗板
取出酶标板，甩掉板内液体之后，洗涤酶标板孔，洗涤2次；
第五步，封闭
用1％鱼皮明胶的封闭液，100～200μl/孔，37℃孵育2h；
第六步，干燥
取出酶标板甩掉板内液体，排干，37℃烘干3h；得到包被蛋白G的酶标板；
2)反应
操作步骤如下：在步骤1)制备的酶标板的各微孔中，或加入50μl系列浓度的苏丹红标准品，或加入50μl待测样品提取液；之后，每孔中再加入50μl酶标记苏丹红抗原，此时每微孔内含100μl溶液，25℃放置15min～60min；
3)洗板：取出酶标板甩掉板内液体，洗涤酶标板孔，洗1～5次，每次间隔20s，甩掉板内液体并拍干板孔；
4)加底物：加入底物显色液放置10～20min，底物显色液为含0.8mmol/L过氧化氢脲和0.4mmol/L四甲基联苯胺的pH7.9的磷酸缓冲液溶液；
5)终止：加入2mol/LH2SO4，50μl/孔；
6)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔OD值。
5.权利要求4所述的方法，所述洗涤酶标板孔，是用PBST洗涤液洗涤酶标板孔，使用洗涤液200～400μl/孔；
所述PBST洗涤液的配制：分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，加0.5ml吐温-20，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存。
6.权利要求4所述的方法，所述系列浓度的苏丹红标准品，浓度为0～4.05ng/ml，用0.01mol/LPBS缓冲液配制；
所述PBS缓冲液的配制:分别称取NaCl8.0g、KCl0.2g、Na2HPO4·12H2O3.58gKH2PO40.24g至500ml烧杯中，适量双蒸水溶解，通过HCl调节pH值到7.4，用双蒸水定容至1L容量瓶中，4℃低温保存；
所述酶标记苏丹红抗原的浓度是1:5000～25000。
7.一种检测苏丹红的ELISA试剂盒，包括有苏丹红ELISA检测试剂和酶标板，其特征是，还有蛋白G。
8.权利要求7所述的试剂盒，所述苏丹红ELISA检测试剂包括苏丹红标准品、经辣根过氧化物酶标记的苏丹红、样本稀释液、洗涤液、底物液和终止液。
9.权利要求8所述的试剂盒，所述样本稀释液为pH为7.4的10mMPBS缓冲液；洗涤液为含0.2％Tween20pH为7.4的0.6MPBS溶液；终止液为含2mol/LH2SO4。
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