CN105358686A

CN105358686A - 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

Info

Publication number: CN105358686A
Application number: CN201480038903.7A
Authority: CN
Inventors: F.W.拉斯马森; R.T.伦哈德; M.D.G.P.托斯卡诺; E.P.弗里斯; S.E.拉森; J.C.F.诺特泽尔; M.鲍尔
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 2013-07-29
Filing date: 2014-07-28
Publication date: 2016-02-24
Also published as: EP3611260A1; WO2015014790A3; RU2670946C9; EP3611260B1; US20160208234A1; US10752890B2; EP3027748B1; RU2016106668A; WO2015014790A2; CN117904081A; CN117165561A; US20190040376A1; US10150957B2; RU2670946C2; EP3611260C0; EP4477734A3; EP4477734A2; EP3027748A2

Abstract

本发明涉及多种蛋白酶变体以及用于获得蛋白酶变体的多种方法。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请含有一个计算机可读形式的序列表，将该序列表通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及相对于亲本蛋白酶在一种或多种特性中展示出改变的多种新颖蛋白酶变体，所述特性包括：洗涤性能、洗涤剂稳定性和/或储存稳定性。本发明的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。

相关技术说明

几十年来已经在洗涤剂工业中使用多种酶作为洗涤配制品的部分。从商业视角看，蛋白酶在这样的配制品中是最相关的酶，而其他酶(包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或多种酶的混合物)也是通常使用的。为了改进蛋白酶的成本和/或性能，对具有改变的性质，如在低温下增加活性、增加的稳定性、在给定的pH下增加比活性、改变的Ca²⁺依赖性、在存在其他洗涤剂成分(例如漂白剂、表面活性剂等)的情况下增加的稳定性等的蛋白酶进行着持续搜寻。常用于洗涤剂中的一个蛋白酶家族是枯草杆菌酶。这个家族先前已经进一步由西埃泽恩(Siezen)RJ和洛因伊森(Leunissen)JAM，1997，蛋白质科学(ProteinScience)，6，501-523被分组为6个不同亚组。这些亚组之一是枯草杆菌蛋白酶家族，它包括枯草杆菌酶，例如BPN’、枯草杆菌蛋白酶309(诺维信公司(NovozymesA/S))、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)(诺维信公司(NovozymesA/S))、枯草杆菌蛋白酶S41(来自嗜冷的南极芽孢杆菌TA41的一种枯草杆菌酶，戴韦尔(Davail)S等人1994，生化杂志(TheJournalofBiologicalChemistry)，269(26)，99.17448-17453)和枯草杆菌蛋白酶S39(来自嗜冷的南极芽孢杆菌TA39的一种枯草杆菌酶，纳林克斯(Narinx)E等人1997，蛋白质工程(ProteinEngineering)，10(11)，第1271-1279页)。TY145是来自芽孢杆菌属物种TY145(NCIMB40339)的一种枯草杆菌酶，其首次描述于WO92/17577(诺维信公司(NovozymesA/S))以及后来的申请WO2004/067737(诺维信公司(NovozymesA/S))(公开了三维结构和使用蛋白质工程来改变一种TY-145枯草杆菌酶的功能性)。

发明概述

本发明涉及在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变的多种蛋白酶变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且其中该变体具有与SEQIDNO:2的成熟多肽或与SEQIDNO:3至少75％一致的氨基酸序列。

本发明涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括向一种亲本蛋白酶在SEQIDNO:3的一个或多个位置171、173、175或179上引入取代，其中该变体具有与SEQIDNO:3至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、以及宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

序列表综述

SEQIDNO:1＝是从芽孢杆菌属物种分离的TY-145蛋白酶的DNA序列。

SEQIDNO:2＝是如从SEQIDNO:1推导的氨基酸序列。

SEQIDNO:3＝是成熟TY145的氨基酸序列。

定义

术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。它包括任何属于EC3.4酶组的酶(包括其13个亚类中的每一种)。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(AcademicPress)的1992年酶命名法，分别包括出版于欧洲生物化学期刊(Eur.J.Biochem.)1994，223，1-5、欧洲生物化学期刊1995，232，1-6、欧洲生物化学期刊1996，237，1-5、欧洲生物化学期刊1997，250，1-6、以及欧洲生物化学期刊1999，264，610-650的增刊1-5。术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是蛋白酶亚组，其特征为在活性位点上具有丝氨酸，与底物形成了共价加合物。另外，枯草杆菌酶(以及丝氨酸蛋白酶)的特征为除了丝氨酸以外，还具有两个活性位点氨基酸残基，即一个组氨酸和一个天冬氨酸残基。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。术语“蛋白酶活性”意指蛋白质分解活性(EC3.4)。本发明的蛋白酶是内肽酶(EC3.4.21)。存在若干蛋白酶活性类型：三种主要的活性类型是：胰蛋白酶样，其中在Arg或Lys后在P1处存在酰胺底物的切割；糜蛋白酶样，其中切割发生在P1处，在疏水性氨基酸中的一个之后；以及弹性蛋白酶样，具有在P1处Ala之后的切割。出于本发明的目的，根据以下“材料与方法(MaterialsandMethods)”所述的程序确定蛋白酶活性。本发明的这些蛋白酶变体具有SEQIDNO:3的成熟多肽的至少20％、例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。

术语“亲本”或蛋白酶亲本意指对其做出改变以产生本发明的酶变体的一种蛋白酶。因此，亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的一种蛋白酶。应理解的是，在上下文中的“具有一致的氨基酸序列”的表达是相对于100％的序列一致性。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。在一个具体实施例中，该亲本是与具有SEQIDNO:3的多肽具有至少70％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6或100％的一致性的蛋白酶。

术语“蛋白酶变体”意指具有蛋白酶活性的相比于其亲本在一个或多个(或一个或若干个)位置处包括一个改变即取代、插入、和/或缺失(优选取代)的蛋白酶，该亲本是具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有所述改变的蛋白酶。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加氨基酸，例如1至10个氨基酸，优选1-3个氨基酸。

术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一个方面，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的，至少10％纯的，至少20％纯的，至少40％纯的，至少60％纯的，至少80％纯的，以及至少90％纯的，如通过SDS-PAGE所确定的。

术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一个方面，如通过琼脂糖电泳法确定的，该分离的多核苷酸是至少1％纯的、例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的、或其任意组合。

术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

术语“基本上纯的变体”意指包含按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料的制剂，这些其他多肽材料是与其天然或重组地相关的。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的这些变体优选以一种基本上纯的形式存在。例如，这可通过经由众所周知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。

术语“野生型蛋白酶”意指由天然存在的有机体(例如在自然界中发现的细菌、古生菌、酵母、真菌、植物或动物)表达的一种蛋白酶。野生型蛋白酶的一个实例是TY-145，即SEQIDNO:2的成熟多肽，即氨基酸1至311，或具有SEQIDNO:3的成熟多肽。

术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，该成熟多肽与具有SEQIDNO:3的氨基酸序列对应。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，基于预测SEQIDNO:1的核苷酸1至81是信号肽的SignalP(尼尔森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程学(ProteinEngineering)10：1-6)]，该成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸331至1263。

术语“cDNA”意指可以通过从得自原核或真核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子反转录来制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

术语“编码序列”意指直接指明其多肽产物的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架通常以ATG起始密码子或替代性起始密码子(例如GTG和TTG)开始，并且以终止密码子(例如TAA、TAG、和TGA)结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组的多核苷酸。

术语“核酸构建体”意指从天然存在的基因中分离的、或以自然界中不会另外存在的方式被修饰成包含核酸片段的、或合成的单链或双链的核酸分子。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”含义相同。

术语“可操作地连接”意指一种配置，其中一个控制序列相对于一种多核苷酸的编码序列放置在一个适当位置处，以使得控制序列指引编码序列的表达。

术语“控制序列”意指对于表达编码本发明变体的多核苷酸所必需的所有部件。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的或外源的，或者彼此可以是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种变体的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

术语“表达载体”意指包括编码一种变体的一种多核苷酸并可操作地连接至提供其表达的额外核苷酸的线性或环形DNA分子。

术语“转录启动子”用于指为促进特定基因的转录的一个DNA区域的启动子。转录启动子典型地位于它们所调节的基因附近，在相同链上并且在上游(朝向有义链的5’区域)。

术语“转录终止子”用于指标记基因结束的基因序列区段或者供转录的基因组DNA上的操纵子。

术语“宿主细胞”意指对于用包括本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行的转化、转染、转导等是易感的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性的程度。所使用的这些任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子DNA以及或者35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在60℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2XSSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

术语“改进的特性”意指与一种变体有关的特征，该特征相比于亲本、或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶、或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶有所改进。此类改进的特性包括但不限于洗涤性能、蛋白酶活性、热活性曲线、热稳定性、pH活性曲线、pH稳定性、底物/辅因子特异性、改善的表面特性、底物特异性、产物特异性、增加的稳定性、在存储条件下的改进的稳定性、以及化学稳定性。

术语“改进的蛋白酶活性”在此被定义为例如通过增加的蛋白质转化而相对于(或相比于)亲本蛋白酶、或相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶、或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶的活性展示活性改变的蛋白酶变体的改变的蛋白酶活性(如上文所定义的)。

术语“稳定性(stability)”包括储存稳定性和在使用过程中的稳定性，例如在清洗过程中的稳定性，并且反应了作为时间函数的根据本发明的蛋白酶变体的稳定性，例如当蛋白酶变体置于溶液中时，尤其是在洗涤剂溶液中时，能够保留多少活性。这种稳定性受到许多因素的影响，例如pH、温度、洗涤剂组合物，例如助洗剂的量、表面活性剂等等。可使用在实例2中所描述的测定来对蛋白酶稳定性进行测量。术语“改进的稳定性”或“增加的稳定性”在此处被定义为一种变体蛋白酶相对于该亲本蛋白酶的稳定性、相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或更多个所述指定位置上具有改变的蛋白酶或相对于SEQIDNO:3显示在溶液中增加的稳定性。术语“改进的稳定性”和“增加的稳定性”包括“改进的化学稳定性”、“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”。

术语“改进的化学稳定性(improvedchemicalstability)”在此定义为变体酶在一种或多种化学物存在下表现为在孵育一段时间之后仍保留酶活性，这种或这些种化学物是天然存在的或是合成的，可降低亲本酶的酶活性。改进的化学稳定性还可使得这些变体在这类化学物存在下能更好地催化反应。在本发明的一个特别的方面，这种改进的化学稳定性是洗涤剂的，尤其是液体洗涤剂的一种改进的稳定性。术语“洗涤剂稳定性”或“改进的洗涤剂稳定性”具体地是当本发明的一种蛋白酶变体被混合到一种液体洗涤剂配制品(尤其是根据表1的液体洗涤剂配制品)中并且然后保存在15℃和50℃之间的温度(例如20℃、30℃或40℃)下时，蛋白酶活性的改进的稳定性。

术语“改进的热活性”意指一种变体在特定温度下相对于亲本或相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶的温度依赖的活性曲线展示改变的温度依赖的活性曲线。热活性值提供了变体在一定温度范围内增强水解反应的催化的效率的测量。一种具有较大热活性的变体将引起一种酶组合物在增强底物水解速率方面的增加，从而减少所需要的时间和/或降低活性所需要的酶浓度。可替代地，具有减小的热活性的一种变体将在比由亲本的温度依赖活性曲线定义的亲本的最佳温度更低的温度下提高酶促反应。

术语“改进的洗涤性能”在此被定义为根据本发明的一种蛋白酶变体例如通过增强的去污而相对于亲本蛋白酶的洗涤性能、相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或者相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有改变的蛋白酶展示改进的洗涤性能。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。洗涤性能可以被量化，如在此的“洗涤性能”定义下所描述的。

除非另有说明，术语“洗涤剂组合物”包括颗粒状或粉状的全效或重垢清洗剂，尤其是清洁洗涤剂；液体、凝胶或糊状的全效清洗剂，尤其是所谓的重垢液(HDL)类型；液体细薄织物洗涤剂；手洗餐具清洗剂或轻垢餐具清洗剂，尤其是高泡沫型的那些；洗碗机洗碗剂，包括用于居家及机构使用的多种片型、颗粒型、液体型以及冲洗助剂型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌洗手液类型、清洁棒、皂条、漱口液、义齿清洁剂、汽车或地毯清洁剂、浴室清洁剂；洗发香波和护发素；沐浴露、沐浴露；金属清洗剂；以及清洁助剂，如漂白剂添加剂和“去污棒”或预处理类型。就预期用于脏物体清洁的洗涤介质中的混合物而言，使用术语“洗涤剂组合物”和“洗涤剂配制品”。在某些实施例中，就洗涤织物和/或衣服而言，使用该术语(例如，“衣物洗涤剂”)。在替代的实施例中，该术语是指例如用于清洁餐具、刀具等等的那些的其他洗涤剂(例如“餐具清洗洗涤剂”)。它并不意图使本发明限于任何特定的洗涤剂配制品或组合物。术语“洗涤剂组合物”不旨在限于包含表面活性剂的组合物。其意图是，除了根据本发明的变体以外，该术语涵盖了可能包含以下各项的洗涤剂：例如表面活性剂、助洗剂、螯合剂(chelator)或螯合试剂(chelatingagent)、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物调理剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防腐蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶激活剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂、以及增溶剂。

术语“织物”涵盖任何纺织材料。因此，其意图是，该术语涵盖衣服，连同织物、纱线、纤维、非织造材料、天然材料、合成材料以及任何其他纺织材料。

术语“纺织品”是指织造织物，连同适于转化为或用作纱线、织造、针织以及非织造织物的短纤维和长丝。该术语涵盖制自天然以及合成(例如，制造的)纤维的纱线。术语“纺织材料”是纤维、纱线中间体、纱线、织物以及制自纤维的产品(例如，衣服以及其他物品)的通用术语。

术语“非织物洗涤剂组合物”包括非纺织品表面洗涤剂组合物，包括但不限于用于硬表面清洁的组合物，例如餐具洗涤洗涤剂组合物、口服洗涤剂组合物、义齿洗涤剂组合物以及个人清洁组合物。

术语“酶的有效量”是指在特定应用中，例如在定义的洗涤剂组合物中达到所需的酶活性所必需的酶量。此类有效量可以由本领域的普通技术人员容易地确定并且基于多种因素，如使用的具体酶、清洁应用、洗涤剂组合物的特定组成以及是否需要液体或干燥(例如，颗粒状、棒状)组合物等。术语蛋白酶变体的“有效量”是指例如在定义的洗涤剂组合物中达到希望水平的酶活性的在上文描述的蛋白酶变体量。

如在此使用的术语“水硬度”或“硬度(degreeofhardness)”或“dH”或“°dH”是指德国硬度(degreeofhardness)。一度被定义为10毫克氧化钙/升水。

在此使用术语“相关洗涤条件”指示在洗涤剂细分市场中实际用于家用的条件，具体是洗涤温度、时间、洗涤力学、洗涤剂浓度、洗涤剂类型以及水硬度。

术语“辅料”意指针对希望的具体类型的洗涤剂组合物和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、棒状、糊状、喷雾、片、凝胶或泡沫组合物)选择的任何液体、固体或气体材料，这些材料也优选地与用于该组合物中的蛋白酶变体可相容。在一些实施例中，颗粒状组合物处于“压缩”形式，而在其他实施例中，液体组合物处于“浓缩”形式。

如在此使用的术语“去污酶(stainremovingenzyme)”描述帮助从织物或硬表面除去污物或污垢的酶。去污酶对特定底物起作用，例如蛋白酶对蛋白质起作用、淀粉酶对淀粉起作用、脂肪酶和角质酶对脂质(脂肪和油)起作用、果胶酶对果胶起作用并且半纤维素酶对半纤维素起作用。污物通常是具有不同组分的复杂混合物的沉积物，这导致材料自身局部变色或这在物体上留下一个粘性表面，该粘性表面可以吸引溶解于洗涤液中的污物从而导致玷污的区域变色。当一种酶对存在于污物中的其特定底物起作用时，该酶降解或部分降解其底物，从而帮助在洗涤过程中除去与底物相关的污垢和污物组分。例如，当一种蛋白酶对草渍起作用时，它降解草中的蛋白组分并且允许在洗涤过程中释放绿色/棕色。

在此背景下，术语“减少的量”意指在其他方面相同的条件下，该组分的量小于将用于参比过程中的量。在一个优选实施例中，该量被减少例如至少5％，如至少10％、至少15％、至少20％或如另外在此所述的。

术语“低洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在少于约800ppm的洗涤剂组分。亚洲(例如，日本)洗涤剂典型地被认为是低洗涤剂浓度体系。

术语“中洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在约800ppm与约2000ppm之间的洗涤剂组分。北美洲洗涤剂通常被认为是中洗涤剂浓度体系。

术语“高洗涤剂浓度”体系包括以下洗涤剂，其中在洗涤水中存在大于约2000ppm的洗涤剂组分。欧洲洗涤剂通常被认为是高洗涤剂浓度体系。

变体命名惯例

出于本发明的目的，在SEQIDNO:3中披露的成熟多肽用于确定另一种蛋白酶中相对应的氨基酸残基。将另一种蛋白酶的氨基酸序列与SEQIDNO:3中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定与SEQIDNO:3中所披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。

另一种蛋白酶中对应的氨基酸残基的鉴别可以通过使用若干计算机程序使用其对应的缺省参数比对多个多肽序列来确定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数期望值的多序列比较；3.5版或更新版本；埃德加(Edgar)，2004，核酸研究(NucleicAcidsResearch)32：1792-1797)；MAFFT(6.857版或更新版本；加藤(Katoh)和库玛(Kuma)，2002，核酸研究30：3059-3066；加藤等人，2005，核酸研究33：511-518；加藤和朝都(Toh)，2007，生物信息学(Bioinformatics)23：372-374；加藤等人，2009，分子生物学中的方法(MethodsinMolecularBiology)537：_39-64；加藤和朝都，2010，生物信息学26：_1899-1900)；以及采用ClustalW的EMBOSSEMMA(1.83版或更新版本；汤普森(Thompson)等人，1994，核酸研究22：4673-4680)。

当其他酶与SEQIDNO:3的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(林达尔(Lindahl)和埃洛弗松(Elofsson)，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)295:613-615)，可应用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中的更大灵敏度可以使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表示(特征曲线)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(阿特休尔(Atschul)等人，1997，《核酸研究》25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族在蛋白结构数据库中具有一个或多个代表，则可以实现甚至更大的灵敏度。程序如GenTHREADER(琼斯(Jones)，1999，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)287:797-815；麦古芬(McGuffin)和琼斯，2003，生物信息学(Bioinformatics)19:874-881)利用来自不同来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，高夫(Gough)等人，2000，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评定此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问的并且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(奥尔姆(Holm)和桑德(Sander)，1998，蛋白质(Proteins)33:88-96)或组合延伸(辛迪亚洛夫(Shindyalov)和伯恩(Bourne)，1998，蛋白质工程(ProteinEngineering)11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，奥尔姆和帕克(Park)，2000，生物信息学(Bioinformatics)16:566-567)。

在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用公认的IUPAC单字母或三字母氨基酸缩写。氨基酸位置是用#₁、#₂等指示。

取代：对于氨基酸取代，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，在位置#₁处的丝氨酸被色胺酸取代表示为“Ser#₁Trp”或者“S#₁W”。多个突变由加号(“+”)或逗号(，)分开，例如，“Ser#₁Trp+“Ser#₂Pro”或S#₁W，S#₂P，分别代表在位置#₁和#₂处丝氨酸(S)被色氨酸(W)和脯氨酸(P)取代。如果在给定的位置多于一个氨基酸可以被取代，则在括号中列出这些，如[X]或{X}。因此，如果根据本发明Trp和Lys两者都可以被取代，代替占据位置#₁的氨基酸，这被表示为X#₁{W，K}或X#₂[W，K]，其中X表明不同蛋白酶可以是亲本，例如像SEQIDNO:3的蛋白酶或与其具有至少70％一致性的一种蛋白酶。因此在一些情况下，这些变体被表示为#₁{W、K}或X#₂P，表明待被取代的氨基酸依赖于亲本而变化。

缺失：对于氨基酸缺失，使用以下命名法：初始氨基酸、位置、^*。因此，在位置#₁处的丝氨酸缺失表示为“Ser#₁*”或者“S#₁*”。多个缺失由加号(“+”)或逗号分开，例如“Ser#₁*+Ser#₂*”或“S#₁*，S#₂*”。

插入：额外的氨基酸残基的插入，例如像在G#₁后插入赖氨酸可以表示为：Gly#₁GlyLys或G#₁GK。可替代地，额外的氨基酸残基的插入，如在G#₁后插入赖氨酸可以表示为：*#₁aL。当插入多于一个的氨基酸残基，例如像在#₁后插入Lys和A1a时，这种插入可以表示为：Gly#₁GlyLysAla或G#₁GKA。在此类情况下，还可以通过将小写字母添加到在一个或多个插入的氨基酸残基前的氨基酸残基位置号处来对一个或多个插入的氨基酸残基进行编号，在这个实例中：*#₁aK*#₁bA。

多个改变：包括多个改变的变体由加号(“+”)或逗号(，)分开，例如，“Ser#₁Trp+Ser#₂Pro”或“S#₁W，S#₂P”，如上所述分别代表在位置#₁和#₂处丝氨酸被色氨酸和脯氨酸取代。

不同的改变：可以在一个位置上引入不同的改变时，这些不同的改变由一个逗号分开，例如“Ser#₁Trp，Lys”或S#₁W，K代表在位置#₁处的丝氨酸被色氨酸或赖氨酸取代。因此，“Ser#₁Trp，Lys+Ser#₂Asp”表示以下变体：“Ser#₁Trp+Ser#₂Pro”、“Ser#₁Lys+Ser#₂Pro”或S#₁W，K+S#₂D。

发明详细说明

本发明涉及蛋白酶变体，包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中的一个或多个氨基酸的取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少75％并且小于100％的序列一致性，并且其中该变体具有蛋白酶活性。先前没有预料到的是，发明人发现包含对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个取代的蛋白酶变体相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有该一个或多个取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有在洗涤剂中改进的稳定性。对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的氨基酸形成对应于SEQIDNO:3的位置170至180的活性位点环的部分，该环限定了该S1底物结合凹座的部分，参见图1。因此，本发明提供了多种蛋白酶变体，这些蛋白酶变体在对应于位置171、173、175或179的一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代，其中该变体具有蛋白酶活性。在环区域170-180(SEQIDNO:3编号)中含有一个或多个取代的新的蛋白酶变体产生并且针对在洗涤剂中的稳定性进行测试，如描述于“材料和方法”中，并且发明人证明在对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置171、173、175或179的位置处的一个或多个氨基酸的一个或多个取代相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶显著改进了洗涤剂稳定性。

令人惊讶地，除了改进的稳定性，根据本发明的变体还具有改进的洗涤性能。因此，在一个优选实施例中，相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶，根据本发明的变体具有改进的洗涤剂稳定性和/或改进的洗涤性能。在一个优选实施例中，该蛋白酶变体在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中包括一个或多个氨基酸的取代，其中该变体与具有SEQIDNO:3(芽孢杆菌属物种TY145)的蛋白酶具有至少70％一致性。因此，本发明的一个方面涉及一种蛋白酶变体，该变体包括对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个位置处的取代，其中该变体具有与SEQIDNO3至少75％一致的氨基酸序列；并且回收该变体。因此，本发明涉及此类变体，该变体在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中包括一个或多个氨基酸的取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6但小于100％的序列一致性。在一个实施例中，该变体是由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或者编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少70％的一致性的多核苷酸编码的一种多肽。在一个实施例中，根据本发明的变体是由以下多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多核苷酸具有至少70％一致性，例如，像至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6但小于100％的序列一致性。

一个具体实施例涉及一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体包括对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个位置处的取代，其中该变体是一种亲本蛋白酶的一种变体，与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％，例如至少75％，例如像至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、或100％的序列一致性。在一个具体实施例中，该蛋白酶变体是一种TY-145(SEQIDNO3)变体，该变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中的一个或多个氨基酸的取代。在另一个实施例中，本发明涉及在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175、179或180的两个、三个、四个或五个位置处包括取代的一种变体。一个优选实施例涉及一种蛋白酶变体，该变体在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中包括一个或多个氨基酸的取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6但小于100％的序列一致性。一个特别优选的实施例涉及一种蛋白酶变体，该变体在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中包括选自下组的一个或多个氨基酸的取代，该组由以下各项组成：Cys、Val、Gln、Thr、Glu、His、Lys、Met、Asn、Tyr、Ala、Pro和Trp。一个具体实施例涉及一种蛋白酶变体，该变体在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中包括选自下组的一个或多个氨基酸的取代，该组由以下各项组成：Cys、Val、Gln、Thr、Glu、His、Lys、Met、Asn、Tyr、Ala、Pro和Trp，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％一致性，例如与SEQIDNO:3具有至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6但小于100％的序列一致性。另一个特别优选的实施例涉及一种蛋白酶变体，该变体包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：SEQIDNO:3的S171{W，K，E，N}；S173P；S175{A，V，P}或G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％一致性，例如与SEQIDNO:3具有至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6但小于100％的序列一致性。一个甚至更优选的实施例涉及一种蛋白酶变体，该变体包括SEQIDNO:3的取代173P和/或S175P中的一个或两个，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％一致性，例如与SEQIDNO:3具有至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6但小于100％的序列一致性。

在一个方面，该蛋白酶变体包括在位置171处的取代，在一个优选方面，该变体包括在位置171处被W、K、E或N取代，在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的W，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171W，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的K，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171K，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的E，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171E，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的N，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171N，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。

在一个另外的方面，该变体包括在位置171处被W、K、E或N取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的W，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171W，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的K，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171K，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的E，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171E，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的N，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171N，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在一个甚至另外的方面，该变体包括在位置171处被W、K、E或N取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的W，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171W，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的K，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171K，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的E，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171E，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置171处的N，在又另一个优选方面，该变体包括取代S171N，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在一个方面，该蛋白酶变体包括在位置173处的取代，在一个优选方面，该变体包括在位置173处被P取代，在另一个优选方面，该变体包括取代S173P，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽，在另一个优选方面，该变体包括在位置173处的P，在又另一个优选方面，该变体包括取代S173P，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在一个甚至另外的方面，该变体包括在位置173处被P取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代S173P，其中该变体与SEQIDNO:2具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在一个方面，该蛋白酶变体包括在位置175处的取代，在一个优选方面，该变体包括在位置175处被A、V或P取代，在另一个优选方面，该变体包括在位置175的A，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175A，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的V，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175V，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的成熟多肽。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的P，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175P，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。

在一个另外的方面，该变体包括在位置175处被A、V或P取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的A，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175A，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的V，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175V，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的P，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175P，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在一个甚至另外的方面，该变体包括在位置175处被A、V或P取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的A，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175A，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的V，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175V，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置175处的P，在又另一个优选方面，该变体包括取代S175P，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的C，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179C，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被C取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179C，其中该变体与SEQIDNO:2具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被C取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179C，其中该变体与SEQIDNO:2具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的V，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179V，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被V取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179V，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置179处被V取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179V，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的Q，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179Q，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被Q取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179Q，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被Q取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179Q，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的S，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179S，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被S取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被S取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的T，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179T，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被T取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179T，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被T取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179T，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的E，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179E，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被E取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179E，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被E取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179E，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的H，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179H，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被H取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179H，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被H取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179H，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的K，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179K，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被K取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179K，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被K取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179K，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的M，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179M，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被M取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179M，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被M取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179M，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一个优选方面，该变体包括在位置179处的N，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179N，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被N取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179N，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被N取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179N，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一优选方面，该变体包括在位置179处的A，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179A，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被A取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179H，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被A取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179A，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一优选方面，该变体包括在位置179处的Y，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179Y，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置179处被Y取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179Y，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个方面，该变体包括在位置179处被Y取代，在又另一个优选方面，该变体包括取代G179Y，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在一个方面，该蛋白酶变体进一步包括在位置180处的取代，在一个优选方面，该变体进一步包括在位置180处被Y取代，在另一个优选方面，该变体进一步包括取代F180Y，其中该亲本是具有SEQIDNO:3的多肽。在一个另外的方面，该变体包括在位置180处被Y取代，在又另一个优选方面，该变体进一步包括取代F180Y，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％。在另一个优选方面，该变体包括在位置180处的Y，在又另一个优选方面，该变体进一步包括取代F180Y，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％序列一致性，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％，并且当在实例2中如在“材料和方法”下所述进行测试时，相对于具有SEQIDNO:3的蛋白酶或具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的稳定性。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171和173的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171和175的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置173和175的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置173和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置173和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置175和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置175和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、173、和175的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、173、和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、173、和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、175、和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、175、和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、179、和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置173、175、和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置173、175、和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置175、179、和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、173、175、和179的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、173、175、和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置173、175、179和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一方面，该变体包括在对应于位置171、173、175、179和180的位置处的取代，如以上所描述的那些。

在另一个方面，该变体包括选自下组的一个或多个(若干个)取代，该组由以下各项组成：S171{W，K，E，N}、S173{P}、S175{A，V，P}或G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。在另一个方面，以上提及的变体进一步包括取代F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175A+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175V+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175A。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175V。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175P。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175A+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175V+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S173P+S175P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175V+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175V+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175V+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175V+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175P+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175A+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175V+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171W+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171K+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171E+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

在另一个方面，该变体包括具有SEQIDNO:3的多肽的取代S171N+S173P+S175P+G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}+F180Y。

该变体可以进一步包括在一个或多个(若干个)其他位置处的取代。例如，这些变体可以包括与选自下组的位置相对应的位置处的改变，该组由以下各项组成：SEQIDNO3的39、40、70、74、81、102、121、132、137、144、155、159、162、174、176、177、241、247、256、274、286、297。在一个实施例中，本发明的变体包括以下取代中的一个：Y39D；T40{D，P}；Q70N；T74M；L81{F，H，V}；A102T；I121{V，T}；G132{I，E}；I137{M；E}；S144{Q，R}；D155N；G159S；V162R；G174{S，T}；N176G；T177S；T241P；I247M；H256F；S274I；V286Q；T297P，其中每个位置对应于SEQIDNO:3的位置。

在另一个方面，根据本发明的变体在对应于位置171、173、175或179的一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代。在另一个方面，根据本发明的变体在对应于位置171、173、175、179和180中任一个的两个位置处包括取代。在另一个方面，根据本发明的变体在对应于位置171、173、175、179和180中任一个的三个位置处包括取代。在另一个方面，根据本发明的变体在对应于位置171、173、175、179和180中任一个的四个位置处包括取代。在另一个方面，根据本发明的变体在对应于位置171、173、175、179和180的每个位置处包括取代。

这些变体在一个或多个(例如，若干个)其他位置上可进一步包括一个或多个额外的改变。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；较小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见的取代包括：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Asn/Gln、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Glu/Gln、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu以及Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

例如，这些变体可以在对应于位置171、173、175或179中任一个的位置处包括取代并且进一步在选自下组的位置中任一个处包括改变，该组由以下各项组成：位置39、40、70、74、81、102、121、132、137、144、155、159、162、174、176、177、180、241、247、256、274、286、297。在一个优选的实施例中，在选自由39、40、70、74、81、102、121、132、137、144、155、159、162、174、176、177、180241、247、256、274、286、297组成的组的位置中任一个处的改变是取代。在一个特别优选的实施例中，根据本发明的变体包括以下取代中任一个：SEQIDNO:3的S171{W，K，E，N}、S173P、S175{A，V，P}或G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}，其中该变体进一步包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：Y39D；T40{D，P}；Q70N；T74M；L81{F，H，V}；A102T；I121{V，T}；G132{I，E}；I137{M；E}；S144{Q，R}；D155N；G159S；V162R；G174{S，T}；N176G；T177S；F180Y；T241P；I247M；H256F；S274I；V286Q；T297P。

在本发明的一个实施例中，根据本发明的变体包括与SEQIDNO:3相比的以下取代中任一个：

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴别对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。对于TY-145(SEQIDNO:3)，包括氨基酸D35、H72以及S251的催化三联体对于酶的蛋白酶活性是必需的。

在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有提高的催化活性。

在一个实施例中，该变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的稳定性，其中如在此的“材料和方法”所述的在实例2中测量稳定性。

在一个实施例中，根据本发明的变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述指定位置上不具有取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的稳定性。

亲本蛋白酶

蛋白酶变体

术语“变体”和术语“蛋白酶变体”是如以上所定义的。

同源蛋白酶序列

两个氨基酸序列之间的同源性是在出于本发明的目的由参数“一致性”描述的背景下，两个氨基酸序列之间的一致性程度是使用如上所述的尼德曼-翁施算法来确定的。来自程序的结果除了氨基酸比对之外还计算两个序列之间的“一致性百分比”。

基于本描述，对于本领域的技术人员而言，鉴别可以根据本发明来修饰的适当同源蛋白酶是相当简单的。

基本上同源的亲本蛋白酶变体可以具有一个或多个(若干个)氨基酸取代、缺失和/或插入，在此背景下，术语“一个或多个”与术语“若干个”是互换使用的。这些改变优选地具有微小的性质，即，不会显著地影响蛋白或多肽的三维折叠或活性的如上所述的保守氨基酸取代以及其他取代；小的缺失，典型的是1至约30个氨基酸的缺失；以及小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基、包括最多约20-25个残基的小接头肽、或有利于纯化的小延伸(亲和标记物)，如聚组氨酸序列(tract)或蛋白A(尼尔逊(Nilsson)等人，1985，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)4：1075；尼尔逊等人，1991，酶学方法(MethodsEnzymol.)198：3。通常还参见福特(Ford)等人，1991，蛋白表达纯化(ProteinExpressionandPurification)2：95-107。

尽管如上所述的这些改变优选地具有微小的性质，这类改变还可以是实质性的，如均作为氨基末端或羧基末端延伸的最多达300个氨基酸或更多个氨基酸的较大的多肽的融合。

亲本蛋白酶可以包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有蛋白酶活性的片段，或由其组成。在一个方面，该亲本蛋白酶包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或由其组成。

亲本蛋白酶可以是(a)一种与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；(b)由在中严格或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的一种序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；或(c)由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％序列一致性的一种多核苷酸编码的一种多肽。

在一个方面，该亲本蛋白酶与具有SEQIDNO:3的多肽具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、或100％的序列一致性，该亲本蛋白酶具有蛋白酶活性。

在一方面，该亲本蛋白酶的氨基酸序列与具有SEQIDNO:3的成熟多肽的相差不多于10个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸。

在另一个方面，该亲本包括SEQIDNO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一个方面，该亲本包括SEQIDNO:2的氨基酸1至311或由其组成。

在另一个方面，该亲本蛋白酶是由在非常低严格条件下、低严格条件下、中严格条件下、或高严格条件下、或非常高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的多核苷酸编码的(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第2版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。

可以使用SEQIDNO:1的多核苷酸或其子序列、连同SEQIDNO:3的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或种的菌株的亲本进行编码的DNA。具体而言，可以根据标准DNA印迹程序，使用这类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与上文所述的探针杂交并编码一个亲本的DNA来筛选由这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自这类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下项的标记的核酸探针杂交：(i)SEQIDNO:1；(ii)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列；(iii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列；(iv)其全长互补体；或(v)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一方面，核酸探针是SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列。在另一个方面，该核苷酸探针是SEQIDNO:1的80至1140个核苷酸长片段，例如长度为90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或1100核苷酸。在另一方面，核酸探针是编码以下项的多核苷酸：SEQIDNO:2的多肽；它的成熟多肽；或它的一个片段。在另一个方面，该核酸探针是SEQIDNO:1或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列。

在另一个实施例中，该亲本是由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少70％，例如至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6或100％的序列一致性。

该多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

亲本可以是融合多肽或可裂解融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。

该亲本可以从任何属的有机体中获得。出于本发明的目的，如在此结合一种给定的来源使用的术语“从...中获得”应意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。

该亲本可以是细菌蛋白酶。例如，该亲本可以是一种革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)蛋白酶；或一种革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)蛋白酶。

在一个方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)蛋白酶。

在一个方面，该亲本是芽胞杆菌属物种蛋白酶，例如具有SEQIDNO:3的蛋白酶或SEQIDNO:2的成熟多肽。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures,CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该亲本。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样本的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得编码亲本的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克等人，1989，见上文)。

变体的制备

本发明还涉及用于获得一种具有蛋白酶活性的变体的方法，该方法包括：(a)在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个(例如，若干个)位置处向亲本蛋白酶引入取代，其中该变体具有蛋白酶活性；并且(b)回收该变体。

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过使用涉及含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化该质粒与该寡核苷酸的限制酶是相同的，以允许该质粒的粘性末端以及插入片段彼此连接。参见，例如，谢勒(Scherer)和戴维斯(Davis)，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76:4949-4955；以及巴顿(Barton)等人，1990，核酸研究(NucleicAcidsRes.)18:7349-4966。

还可以通过本领域已知的方法体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公开号2004/0171154；斯道瑞希(Storici)等人，2001，自然生物技术(NatureBiotechnol.)19:773-776；卡伦(Kren)等人，1998，自然医学(Nat.Med.)4:285-290；以及凯利萨诺(Calissano)和马奇诺(Macino)，1996，真菌遗传学简讯(FungalGenet.Newslett.)43:15-16。

在本发明中可以使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的很多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要体外合成一种设计的多核苷酸分子以编码一种感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由田(Tian)等人(2004，自然(Nature)432:1050-1054)所描述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625所披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；US5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多个方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是，利用合成的多核苷酸片段的一个过程结合PCR技术。因此，基因的限定的区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以经受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

因此，本发明还涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个位置处向亲本蛋白酶引入取代；并且回收该变体。

另一个实施例涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中的一个或多个氨基酸的取代，尤其是如在以上所述的一种方法，其中该亲本蛋白酶是选自下组，该组由以下各项组成：与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％或至少99.6％的序列一致性的一种多肽；

由在中严格或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；

由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或者编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少70％的一致性的多核苷酸编码的一种多肽；和

SEQIDNO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

因此，一个具体方面涉及一种用于获得一种蛋白酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中向亲本蛋白酶引入一个或多个氨基酸的取代，其中在SEQIDNO:3中进行该一种或多种取代，并且其中这些取代选自下组，该组由以下各项组成：S171{W，K，E，N}、S173{P}、S175{A，V，P}或G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}。另外，可以在对应于SEQIDNO:3的180的位置处引入一个另外的取代，尤其该取代是F180Y。

本发明的一个方面涉及产生根据本发明的这些变体的方法，其中该方法包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中至少一个氨基酸的取代，其中(a)该变体与SEQIDNO:3具有至少70％并且小于100％的序列一致性，并且(b)该变体具有蛋白酶活性。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体在对应于SEQIDNO:3的位置171的位置处包括取代，并且在对应于SEQIDNO:3的位置173、175、179和180的一个或多个位置处进一步包括取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体在对应于SEQIDNO:3的位置173的位置处包括取代，并且在对应于SEQIDNO:3的位置171、175、179和180的一个或多个位置处进一步包括取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体在对应于SEQIDNO:3的位置175的位置处包括取代，并且在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、179和180的一个或多个位置处进一步包括取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体在对应于SEQIDNO:3的位置179的位置处包括取代，并且在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175和180的一个或多个位置处进一步包括取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体在对应于SEQIDNO:3的位置180的位置处包括取代，并且在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175和179的一个或多个位置处进一步包括取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置171的位置处被选自{W，K，E，N}的氨基酸取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置173的位置处被P取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置175的位置处被选自{A，V，P}的氨基酸取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体包括在对应于SEQIDNO:3的位置179的位置处被选自{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}的氨基酸取代。

在一个实施例中，根据所述方法产生的变体可进一步包括在对应于SEQIDNO:3的位置180的位置处被Y取代。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。

核酸构建体

本发明还涉及包括编码本发明的一种变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的一种多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在一种适合的宿主细胞中的表达。

可以按多种方式来操纵该多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是一个启动子，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种多核苷酸。启动子包含介导该变体的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子序列被可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的3’末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是信号肽编码区，编码与变体的N-端连接的信号肽，并且引导该变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地包含信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地置换天然信号肽编码序列，以便增加变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化裂解或自动催化裂解前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻该变体的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节该变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调节化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac、以及trp操纵子系统。

表达载体

本发明还涉及包括编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该变体的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到一个宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的一种多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码该变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在重组产生一个变体中有用的任何细胞，例如一个原核细胞或一个真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟球菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不局限于产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(布拉格(Praha))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生该变体的一种营养培养基中培养这些宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果该变体被分泌到该营养培养基中，则该变体可直接从该培养基中回收。如果该变体没有分泌，则它可从细胞裂解液中回收。

使用本领域已知的对具有蛋白酶活性的这些变体特异的方法可以检测该变体。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用一种酶测定来确定该变体的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从该营养培养基中回收该变体，这些常规程序包括但不局限于收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发、或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见，例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代方面，没有回收该变体，而是将表达该变体的本发明的宿主细胞用作该变体的一个来源。

组合物

在某一个方面，根据本发明的变体相比于亲本酶或者相比于具有与所述变体一致的氨基酸序列但不具有在一个或多个所述指定位置上的取代的蛋白酶或者相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的在洗涤剂中的稳定性，其中如在此的“材料和方法”所述的在实例2中测量稳定性。

除了酶，这些洗涤剂组合物可以包括其他组分。另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。组分的选择可以包括(用于织物保养)有待清洁的织物的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

本发明的洗涤剂组合物

可以将本发明的变体以对应于以下各项的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升洗涤液0.001-100mg的蛋白质，例如0.01-100mg的蛋白质，优选是0.005-50mg的蛋白质，更优选是0.01-25mg的蛋白质，甚至更优选是0.05-10mg的蛋白质，最优选是0.05-5mg的蛋白质，并且甚至最优选是0.01-1mg的蛋白质。

本发明的变体可以使用稳定剂来稳定，这些稳定剂可以是选自下组，该组包含丙二醇、甘油、一种糖、一种糖醇、乳酸、硼酸、硼酸盐和苯基硼酸衍生物，例如如下的那些，其中在该苯基硼酸衍生物中的残基R是一个C₁-C₆烷基基团，并且在这些中，更优选CH₃、CH₃CH₂或CH₃CH₂CH₂。该苯基硼酸衍生物中的残基R还可以是氢。苯基硼酸衍生物的一个实例是具有以下式的4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)：

苯基硼酸衍生物可以另外在苯基环上具有其他化学修饰，并且具体地，它们可以含有一个或多个甲基、氨基、硝基、氯、氟、溴、羟基、甲酰基、乙基、乙酰基、叔丁基、茴香基、苄基、三氟乙酰基、N-羟基琥珀酰亚胺、叔丁氧羰基、苯甲酰基、4-甲基苄基、硫代茴香基(thioanizyl)、硫代甲苯基(thiocresyl)、苄氧基甲基、4-硝基苯基、苄氧基羰基、2-硝基苯甲酰基、2-硝基苯基氧硫基、4-甲苯磺酰基、五氟苯基、二苯基甲基、2-氯苄氧基羰基、2,4,5-三氯苯基、2-溴苄氧基羰基、9-芴基甲基氧基羰基、三苯基甲基、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基残基或基团或其组合。所有的稳定剂可以按所有质子化或去质子化形式存在于该洗涤剂组合物中。此外，所有这些化合物(特别是其去质子化形式)可以与阳离子相关。在这方面优选的阳离子是单价或多价的(特别是二价的)阳离子，特别是Na离子(Na⁺)、K离子(K⁺)、Li离子(Li⁺)、Ca离子(Ca²⁺)、Mg离子(Mg²⁺)、Mn离子(Mn²⁺)和Zn离子(Zn²⁺)。该洗涤剂组合物可以包括两种或更多种稳定剂，例如像选自下组的那些，该组由以下各项组成：丙二醇、甘油、4-甲酰基苯基硼酸和硼酸盐。一个实例是包括4-甲酰基苯基硼酸和/或硼酸盐的一种洗涤剂组合物。该苯基硼酸衍生物可以按从0.00001至5.0wt％，优选地从0.0001至3.0wt％、从0.001至2.0wt％、从0.005至1.0wt％、从0.01至0.5wt％、从0.02至0.3wt％的量包含在该洗涤剂组合物中。优选地，该硼酸/硼酸盐是按从0.001至5.5wt.％，并且愈加优选地从0.01至4.5wt.％、从0.05至3.5和从0.1至3、0.4至2.49、0.5至1.5wt.％的量包含在该洗涤剂组合物中。添加硼酸盐和4-甲酰基苯基硼酸的一种组合已经被发现是特别有效的，导致在洗涤剂组合物中酶稳定性的高的增加。优选地，该硼酸/硼酸盐是按从0.001至5.5wt.％，并且愈加优选地从0.075至4.5wt.％、从0.09至3.5和从0.1至2.49wt.％的量被包含在内，并且该苯基硼酸衍生物是按从0.001至0.08wt.％，并且愈加优选地从0.003至0.06wt.％、从0.005至0.05wt.％、从0.007至0.03wt.％和从0.009至0.01wt.％的量包含在一种洗涤剂组合物中。特别优选的是添加1.0至2.0wt％的量的4-甲酰基苯基硼酸，与1.0wt％硼酸盐组合。

根据本发明的变体还可以使用例如描述于WO2005/105826和WO2009/118375中的肽醛或酮来稳定。本发明的变体还可以掺入到WO97/07202(通过引用结合在此)中所披露的洗涤剂配制品中。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、二甲基双十八烷基氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、以及其组合、烷基季铵化合物、烷氧基化的季铵(AQA)。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、以及磺基甜菜碱、以及其组合。

助水溶剂

助水溶剂是一种化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)(2007)的综述，胶体&界面科学新见(CurrentOpinioninColloid&InterfaceScience)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包括极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物、ADW和硬表面清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA)、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以只包括共助洗剂，或结合一种助洗剂，例如沸石助洗剂。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、氨基乙磺酸-N、N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US5977053中。

漂白系统

该洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如约1％至约5％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物、ADW和硬表面清洁洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预成型过酸及其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidicacid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。漂白活化剂在此指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、3,5,5三甲基己酰氧基苯磺酸钠、双过氧化十二酸、4-(十二烷基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(3,5,5-三甲基己酰氧基)苯磺酸盐(ISONOBS)、四乙酰乙二胺(TAED)和4-(壬酰氧基)苯磺酸盐(NOBS)，和/或WO98/17767中披露的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像特雷森(Triacin))具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三乙酸甘油酯在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，如6-(酞酰基氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有下式的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、WO2007/087242中。合适的合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(乙烯亚胺)、羧甲基菊糖(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚对苯二甲酸乙二酯和聚氧乙烯对苯二甲酸乙二酯的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

这些洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如当配制在洗涤剂组合物中时，可以在织物与包括所述洗涤剂组合物的洗涤液体接触时沉积在所述织物上从而通过可见光吸收/反射来改变所述织物色彩的染料或色素。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。合适的着色剂还披露于例如WO2007/087257、WO2007/087243中。

(另外的)酶

在一个实施例中，将根据本发明的变体与一种或多种酶，例如至少两种酶，更优选是至少三种、四种或五种酶组合。优选地，这些酶具有不同的底物特异性，例如蛋白质分解活性、淀粉分解活性、脂质分解活性、溶半纤维活性或溶果胶活性。

洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包括一种或多种额外的酶，例如碳水化合物活性酶，如糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、或蛋白酶、脂肪酶、角质酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：

适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例是例如描述于WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及WO99/001544中的那些纤维素酶变体。

其他纤维素酶是具有一种序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO2002/099091的SEQIDNO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％一致性，或一种家族44木葡聚糖酶，该木葡聚糖酶具有一种序列，该序列与WO2001/062903的SEQIDNO:2的位置40-559具有至少60％一致性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(NovozymesA/S))、CarezymePremium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM和PuradaxHA^TM(杰能科国际公司(GenencorInternationalInc.))以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

甘露聚糖酶

适合的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或基因修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是一种来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、耐盐嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉。合适的甘露聚糖酶在WO1999/064619进行了描述。一种可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。

蛋白酶：

适合的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物起源的那些，例如植物或微生物起源。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。它可以是一种碱性蛋白酶，例如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶可以例如是来自例如家族M4的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，例如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据斯艾森(Siezen)等人，蛋白质工程学(ProteinEngng.)4(1991)719-737和斯艾森等人，蛋白质科学(ProteinScience)6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的一个亚类。枯草杆菌酶可以划分为6个亚部，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶(Thermitase)家族、蛋白酶K家族、羊毛硫抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如描述于US7262042和WO09/021867中的迟缓芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌；和描述于WO89/06279中的枯草杆菌蛋白酶迟缓(lentus)、枯草杆菌蛋白酶诺和(Novo)、枯草杆菌蛋白酶嘉士伯(Carlsberg)、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO93/18140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO92/175177、WO01/016285、WO02/026024以及WO02/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢菌蛋白酶(描述于WO89/06270、WO94/25583和WO05/040372中)，以及衍生自纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶(描述于WO05/052161和WO05/052146中)。

进一步优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM5483的碱性蛋白酶(如在例如WO95/23221中所述)、及其变体(在WO92/21760、WO95/23221、EP1921147以及EP1921148中描述的)。

金属蛋白酶的实例是如描述于WO07/044993(杰能科国际公司(GenencorInt.))中的中性金属蛋白酶，例如衍生自解淀粉芽孢杆菌的那些。

有用的蛋白酶的实例是于以下各项中的变体：WO92/19729、WO96/034946、WO98/20115、WO98/20116、WO99/011768、WO01/44452、WO03/006602、WO04/03186、WO04/041979、WO07/006305、WO11/036263、WO11/036264，尤其是在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：3、4、9、15、27、36、57、68、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、106、118、120、123、128、129、130、160、167、170、194、195、199、205、206、217、218、222、224、232、235、236、245、248、252以及274，使用BPN’编号。更优选地，这些蛋白酶变体可以包括以下突变：S3T、V4I、S9R、A15T、K27R、*36D、V68A、N76D、N87S,R、*97E、A98S、S99G,D,A、S99AD、S101G,M,RS103A、V104I,Y,N、S106A、G118V,R、H120D,N、N123S、S128L、P129Q、S130A、G160D、Y167A、R170S、A194P、G195E、V199M、V205I、L217D、N218D、M222S、A232V、K235L、Q236H、Q245R、N252K、T274A(使用BPN’进行编号)。

适合的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：Duralase^Tm、Durazym^Tm、Ultra、Ultra、 Ultra、 Ultra、以及(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：PurafectPreferenz^Tm、PurafectPurafectPurafectEffectenz^Tm、以及(丹尼斯克/杜邦公司(Danisco/DuPont))、Axapem^TM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-BrocasesN.V.))、BLAP(序列示于US5352604的图29中)及其变体(汉高股份(HenkelAG))以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)。

脂肪酶和角质酶：

适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO95/06720&WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO12/137147)。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508以及WO09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE7家族的过水解酶(WO09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(HuntsmanTextileEffectsPteLtd)的商业产品GentlePowerBleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。

淀粉酶：

可以与本发明的变体一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程处理的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO95/10603中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO94/18314、WO97/43424以及WO99/019467的SEQIDNO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO02/010355中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO2006/066594的SEQIDNO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQIDNO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO99/019467中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO96/023873的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的那些或其与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7具有90％序列一致性的变体。使用WO96/023873的SEQID2用于编号，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置，例如181和182、182和183、或位置183和184具有缺失的那些。SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO08/153815中的SEQIDNO:2、WO01/66712中的SEQIDNO:10的淀粉酶或其与WO08/153815的SEQIDNO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQIDNO:10具有90％序列一致性的变体。WO01/66712中的SEQIDNO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO09/061380中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:2具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQIDNO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQIDNO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO13184577中的SEQIDNO:1的淀粉酶或其与SEQIDNO:1具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQIDNO:1的更优选变体是以下位置：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K和G477K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQIDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

其中这些变体任选地进一步在位置241处包括取代和/或在位置178和/或位置179处包括缺失。

另外的适合的淀粉酶是具有WO10104675中的SEQIDNO:1的淀粉酶或其与SEQIDNO:1具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:1的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQIDNO:1的更优选变体是以下位置：N21D、D97N、V128IK177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K和G478K中的一个或多个中具有取代和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQIDNO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N21D+D97N+V128I

其中这些变体任选地进一步在位置200处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO01/66712中的SEQIDNO:12的α-淀粉酶或与SEQIDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQIDNO:12的以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有R118K、N195F、R320K及R458K的取代的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO2011/098531、WO2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、特妙淀粉酶^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、LiquozymeX及BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、PreferenzS1000、PreferenzS100及PreferenzS110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(GenencorInternationalInc./DuPont))。

过氧化物酶/氧化酶：

适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602、以及WO98/15257中描述的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

其他酶：

根据本发明的蛋白酶变体还可以与另外的酶例如果胶裂解酶(例如Pectawash^TM)、叶绿素酶等组合。本发明的蛋白酶变体可以与任何另外的酶混合。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包含一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。可以将洗涤剂添加剂即独立添加剂或组合添加剂配制为例如颗粒、液体、浆液等等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆体。

非尘颗粒可以例如如在US4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16-50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；具有15至80个环氧乙烷单位的乙氧基化脂肪族醇，其中醇含有12至20个碳原子；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的单-和双-和三甘油酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

分散剂-这些洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker)。

染料转移抑制剂-这些洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂-洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在该组合物中可以使用适合在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基茋-磺酸衍生物型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4’-双(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)茋-2.2’-二磺酸盐；4,4’-双(2-苯胺基-4(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双(4-苯基-2,1,3-三唑-2-基)茋-2,2’-二磺酸盐；4,4’-双(2-苯胺基-4(1-甲基-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)茋-2,2’-二磺酸盐和2-(茋基-4”-萘并-1.,2’:4,5)-1,2,3-三唑-2"-磺酸盐。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-GeigyAG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4’-双-(2-吗啉基-4苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2’-双-(苯基-苯乙烯基)二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的ParawhiteKX，由派拉蒙矿物与化学(ParamountMineralsandChemicals)，孟买，印度供应。适合使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物-该洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，任意接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO2006/108856以及WO2006/113314中(将其通过引用结合在此)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP1867808或WO2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂：这些洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他合适的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂、用于液体清洁剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制品

该洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如棒、均匀的片剂、具有两层或更多层的片剂、规则或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则压缩或浓缩的液体。

洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋，对比用于机器给药单位的形式。

袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及，羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混物组合物，该共混物组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州盖里(Gary,Ind.,US)的克里斯克拉夫特工业产品公司(ChrisCraftIn.Prod.)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US2009/0011970A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

这些形式的定义/特征：

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0-30％的有机溶剂。

液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO09/092699、EP1705241、EP1382668、WO07/001262、US6472364、WO04/074419或WO09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO09/124162、WO09/124163、WO09/117340、WO09/117341、WO09/117342、WO09/072069、WO09/063355、WO09/132870、WO09/121757、WO09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO09/087033、WO09/050026、WO09/047125、WO09/047126、WO09/047127、WO09/047128、WO09/021784、WO09/010375、WO09/000605、WO09/122125、WO09/095645、WO09/040544、WO09/040545、WO09/024780、WO09/004295、WO09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO09/074403、WO09/068501、WO09/065770、WO09/021813、WO09/030632以及WO09/015951。

WO2011025615、WO2011016958、WO2011005803、WO2011005623、WO2011005730、WO2011005844、WO2011005904、WO2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO2011005905、WO2011005910、WO2011005813、WO2010135238、WO2010120863、WO2010108002、WO2010111365、WO2010108000、WO2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO2010033746、WO2010033747、WO2010033897、WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO2010024470、WO2010025161、WO2010014395、WO2010044905、

WO2010145887、WO2010142503、WO2010122051、WO2010102861、WO2010099997、WO2010084039、WO2010076292、WO2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO2010057784、WO2010054986、WO2010018043、WO2010003783、WO2010003792、

WO2011023716、WO2010142539、WO2010118959、WO2010115813、WO2010105942、WO2010105961、WO2010105962、WO2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO2010072456、WO2010069905、WO2010076165、WO2010072603、WO2010066486、WO2010066631、WO2010066632、WO2010063689、WO2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO2010000636。

方法和用途

本发明的蛋白酶变体可被添加到一种洗涤剂组合物中并因此成为该洗涤剂组合物的组分，其中所述变体在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的环中包括一个或多个氨基酸的取代，并且其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％或至少99.6％的序列一致性。洗涤剂组合物通常用于清洁过程中，例如衣物洗涤和/或硬表面清洁，例如餐具洗涤。一种洗涤剂组合物可以包括至少一种变体，其中所述变体包括以下取代中一个或多个：SEQIDNO:3的S171{W，K，E，N}、S173{P}、S175{A，V，P}或G179{C，V，Q，S，T，E，H，K，M，N，A，Y}，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少70％，例如至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％一致性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如与SEQIDNO:3具有至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％或至少99.6的序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。该至少一种蛋白酶变体优选地相对于亲本或相对于具有与所述变体一致的氨基酸序列但是在一个或多个所述位置上不具有取代的蛋白酶具有增加的洗涤剂稳定性。

另外，任何上述蛋白酶变体还可以包含在位置F180Y处的取代。

洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。

清洁过程或者纺织品保养过程可以例如是衣物洗涤过程、餐具洗涤过程或硬表面(如浴室砖、地板、桌面、排水管、水槽以及脸盆)清洁。衣物洗涤过程可以例如是家用洗涤，但是它也可以是工业洗涤。用于洗涤织物和/或衣物的过程可以是如下的一个过程，该过程包括用包含一种洗涤剂组合物和至少一种蛋白酶变体的洗涤溶液处理织物。例如，可以在机器洗涤过程中或者在手动洗涤过程中进行清洁过程或纺织品保养过程。洗涤溶液可以例如是含有洗涤剂组合物的水洗溶液。

经过洗涤、清洁或者纺织品保养过程的织物和/或衣物可以是常规的可洗涤衣服，例如家庭洗涤衣服。优选地，衣物洗涤的主要部分是衣物和织物，包括针织品、编织物、斜纹粗棉布、非编织物、毛毡、纱线、以及毛布巾。这些织物可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻、亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维；或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维或其共混物。这些织物还可以是非纤维素基的，如天然聚酰胺，包括羊毛、骆驼毛、羊绒、马海毛、兔毛或丝；或者合成聚合物，如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯以及斯潘德克斯弹性纤维(spandex)/弹性纤维；或其共混物以及纤维素基和非纤维素基纤维的共混物。共混物的例子是棉和/或人造丝/纤维胶与一种或几种伴随材料的共混物，该伴随材料例如是羊毛、合成纤维(例如聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚亚胺酯纤维、聚脲纤维、芳族聚酰胺纤维)以及含纤维素的纤维(例如人造丝/纤维胶、苎麻、亚麻/亚麻布、黄麻、醋酸纤维素纤维、莱赛尔纤维)。

最近几年，人们对替换洗涤剂中的组分的兴趣逐渐增加，这源于用可再生生物组分如酶和多肽替换石油化学产品而不损害洗涤性能。当洗涤剂组合物的组分改变新酶活性或者相比于常用洗涤剂酶(如蛋白酶)具有替代和/或改进的特性的新酶时，需要脂肪酶和淀粉酶来实现与传统洗涤剂组合物相比时相似或改进的洗涤剂性能。

蛋白酶及其变体可用于蛋白质性质污物去除过程。蛋白质污物可能是如食品污物等污物，如婴儿食品、皮脂、可可、蛋、血、牛奶、墨水、草、或其组合。

典型的洗涤剂组合物包含除酶之外的各种组分，这些组分具有不同的作用，一些组分像表面活性剂降低洗涤剂的表面张力，这允许正清洁的污物被提起和分散并随后被洗涤出来，其他组分像漂白系统通常通过氧化除去颜色并且很多漂白剂还具有强杀菌特性，并且用于消毒和灭菌。其他组分像助洗剂和螯合剂例如通过从液体中除去金属离子来软化洗涤水。

这些酶组合物可以进一步包括以下中至少一种或多种：表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、衣物洗涤或餐具洗涤中的漂白系统或漂白组分。

表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量相比于在未添加本发明的蛋白酶变体情况下使用的表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的量可以有所减小。优选地，是一种表面活性剂、增效剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统和/或漂白组分的该至少一种组分以以下量存在：比在不添加本发明的蛋白酶变体的情况下组分在系统中的量(例如，此组分的常规的量)少1％、如少2％、如少3％、如少4％、如少5％、如少6％、如少7％、如少8％、如少9％、如少10％、如少15％、如少20％、如少25％、如少30％、如少35％、如少40％、如少45％、如少50％。洗涤剂组合物还可以是如下的组合物，该组合物不含至少一种组分，该组分是一种表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分和/或聚合物。

洗涤方法

洗涤剂组合物理想地适用于在衣物洗涤应用中使用。这些方法包括一种洗涤织物的方法。该方法包括将有待洗涤的织物与包括一种洗涤剂组合物的清洁洗衣溶液接触的步骤。织物可以包括能够在常规消费者使用条件下被洗涤的任何织物。该溶液优选具有从约5.5至约11.5的pH。可在溶液中以以下浓度使用组合物：从约100ppm、优选500ppm至约15,000ppm。水温的范围典型地是从约5℃至约95℃，包括约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃、约85℃以及约90℃。水与织物之比典型地是从约1:1至约30:1。

在多个具体实施例中，在以下pH下执行该洗涤方法：从约5.0至约11.5、或者从约6至约10.5、约5至约11、约5至约10、约5至约9、约5至约8、约5至约7、约5.5至约11、约5.5至约10、约5.5至约9、约5.5至约8、约5.5.至约7、约6至约11、约6至约10、约6至约9、约6至约8、约6至约7、约6.5至约11、约6.5至约10、约6.5至约9、约6.5至约8、约6.5至约7、约7至约11、约7至约10、约7至约9、或者约7至约8、约8至约11、约8至约10、约8至约9、约9至约11、约9至约10、约10至约11，优选约5.5至约11.5。

在多个具体实施例中，在以下硬度下执行该洗涤方法：从约0°dH至约30°dH，例如约1°dH、约2°dH、约3°dH、约4°dH、约5°dH、约6°dH、约7°dH、约8°dH、约9°dH、约10°dH、约11°dH、约12°dH、约13°dH、约14°dH、约15°dH、约16°dH、约17°dH、约18°dH、约19°dH、约20°dH、约21°dH、约22°dH、约23°dH、约24°dH、约25°dH、约26°dH、约27°dH、约28°dH、约29°dH、约30°dH。在典型欧洲洗涤条件下，硬度是约16°dH，在典型美国洗涤条件下，是约6°dH，并且在典型亚洲洗涤条件下，是约3°dH。

用于在上述方法中使用的组合物可进一步包括至少一种如以上“其他酶“部分列出的额外的酶，如选自下组的酶，该组由水解酶(如蛋白酶)、脂肪酶和角质酶、糖酶(如淀粉酶)、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、以及果胶酶或其组合组成。

通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。

实例

材料与方法

用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)

为了评定洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行衣物洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子针对所有缝开口强力挤压洗涤样品(有待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“特定方法实施例(Specialmethodembodiments)“段落。

将洗涤性能作为所洗涤纺织品颜色的亮度进行测量。亮度也可以表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(KodakiQsmart(柯达(Kodak))，Midtager29，DK-2605(丹麦)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

I n t = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}} .

表1：标准洗涤剂和测试材料的组成

模型洗涤剂和测试材料如下：

常规分子生物学方法：

除非另外提及，使用标准分子生物学方法(萨姆布鲁克(Sambrook)等人(1989)；奥苏贝尔(Ausubel)等人(1995)；哈伍德(Harwood)和卡廷(Cutting)(1990))进行DNA操纵和转化。

蛋白酶活性测定：

1)Suc-AAPF-pNA活性测定：

蛋白水解活性可以通过采用Suc-AAPF-PNA底物的一种方法来确定。Suc-AAPF-PNA是N-琥珀酰基-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺的缩写，并且它是可以通过内切蛋白酶切割的一种封闭肽。在切割后，一个游离PNA分子被释放出来，并且它具有黄色颜色并且因此可以通过可见光分光光度法在波长405nm进行测量。Suc-AAPF-PNA底物是通过巴亨(Bachem)(目录号L1400，溶解在DMSO中)制造。

待分析的蛋白酶样品被稀释在残余活性缓冲液中(100mMTrispH8.6)。通过转移60μl的稀释的酶样品至96孔微量滴定板并添加140μl底物工作溶液(0.72mg/ml于100mMTrispH8.6中)进行该测定。将该溶液在室温混合并且在OD405nm经5分钟每20秒测量吸收。

在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的蛋白酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。应该将蛋白酶样品稀释至其中斜率为线性的水平。

实例1：蛋白酶变体的制备和测试

变体的制备和表达

根据本发明构建TY145蛋白酶(SEQIDNO:3)的定点变体，该变体在N-末端侧上170至180区域中包括特定的插入/缺失/取代。这些变体是通过传统的克隆DNA片段制得(萨拉布鲁克(Sambrook)等人，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第2版，冷泉港，1989)，使用PCR连同正确地设计的诱变寡核苷酸，这些寡核苷酸在所得序列中引入了所希望的突变。对应于希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列合成诱变的寡核苷酸，其由限定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离。以此方式，构建并产生下表2a中所列的变体。

变体发酵

可以通过本领域熟知的或如以下的方法进行发酵。将具有相关表达质粒的枯草杆菌菌株划线接种在具有相关抗生素(6μg/ml氯霉素)的LB-琼脂板上，并在37℃下生长过夜。

将菌落转移到含有丰富培养基(例如PS-1:100g/L蔗糖(丹尼斯克目录号109-0429)、40g/L大豆壳(大豆粉)、10g/LNa₂HPO₄.12H₂O(默克(Merck)目录号6579)、0.1ml/L普朗尼克(Pluronic)PE6100(BASF102-3098))的500ml摇瓶中补充有相关抗生素的100mlPS-1培养基上。典型地在30℃下在220rpm的振摇下进行4天的培养。通过在4500rpm下离心20-25分钟从发酵液中除去细胞和其他未溶解的材料。然后，过滤出上清液以获得澄清溶液。

实例2：

在这个实例中，使用上述PNA-Suc-AAPF测定来确定在液体洗涤剂存在下孵育后的残余蛋白酶活性。在一般情况下，在液体洗涤剂(最终浓度为90％)中于指定的温度和孵育时间孵育后确定残余蛋白酶活性，并且然后将活性与在4℃非应激孵育的活性相比。为了确定在洗涤剂中的蛋白酶稳定性，通过稀释于酶稀释缓冲液(100mMTrispH8.6、0.0225％(w/V)Brij-35、2mMCaCl₂)来将待测试的酶调节到0.15mg/ml的酶蛋白的浓度。以4个重复将30μl的蛋白酶溶液和270μl液体洗涤剂(标准液体洗涤剂)转移至一个96孔微量滴定板(Nunc96UPP)。在每个孔中放置一个小磁体(5×2mm)，并且于室温下在磁力搅拌器上混合该共混物30分钟。在混合后转移20μl至新的96孔微量滴定板并在4℃孵育24小时(非应激样品)。小心地用铝箔热密封微量滴定板并在指定的温度孵育24小时(应激样品)。孵育后，如PNA-Suc-AAPF测定中描述的，分析各板上的样品的蛋白酶活性以确定残余蛋白酶活性。应注意，为了减少其他洗涤剂成分相比于该酶对该测定的干涉，非应激和应激样品均被稀释至相同的蛋白质浓度。孵育后，抽取20μl的应激样品并且添加150μl残余活性缓冲液(100mMTrispH8.6)，并使用磁力搅拌器混合5分钟。转移60μl稀释样品至新的96孔微量滴定板。在使用之前，制备在残余活性缓冲液(0.72mg/ml于100mMTrispH8.6)中的PNA-Suc-AAPF底物工作溶液。添加140μl底物工作溶液至稀释样品，混合并立即在室温下每20秒持续5-10分钟测量405nm处的吸光度。仅使用来自动力学曲线的线性范围的Vmax。通过添加150μl残余活性缓冲液(100mMTrispH8.6)至具有20μl非应激样品的微量滴定板(在4℃孵育)，并使用磁力搅拌器混合5分钟来测量非应激样品的重复残余活性。转移60μl稀释样品至新的96孔微量滴定板。添加140μl底物工作溶液至稀释样品，混合并立即在室温下每20秒持续5-10分钟测量405nm处的吸光度。仅使用来自动力学曲线的线性范围的Vmax。

应保证在所有实验中，参照蛋白酶至少一次包括在所有测试微量滴定板上。

残余活性(％RA)被计算为％RA＝100*Vmax(应激样品)/Vmax(非应激样品)。

计算半衰期(T1/2(h))：T1/2(小时)＝T(小时)*LN(0.5)/LN(％RA/100)，其中T是孵育时间(小时)，并且％RA是残余活性。

表3a：在35℃下测量的变体稳定性

表3b：在35℃下测量的变体稳定性

表4a：在42℃下测量的变体稳定性

表4b：在42℃下测量的变体稳定性

表5a：在47℃下测量的变体稳定性

表5b：在47℃下测量的变体稳定性

表6：在52℃下测量的变体稳定性

实例3:

使用自动机械应力测定，使用一种液体洗涤剂测试蛋白酶变体对3种不同的技术污物的洗涤性能。

如在AMSA中针对衣物洗涤方法所描述的，使用单循环洗涤程序，用描述于表1中的洗涤剂组合物和小块布样执行实验，并且实验条件如下表7中所指定。

表7：用于表7a至7f的AMSA的实验条件

通过添加CaCl₂、MgCl₂和NaHCO₃(对于PC-03，(Ca²⁺:Mg²⁺:CO₃ ^2-)＝5:1:6，并且对于C-05则为5:1:11)至测试系统将水硬度调整至16°dH。

在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表7a单种和两种蛋白酶变体对巧克力、牛奶、烟尘污点的洗涤性能，参考酶是TY-145(SEQIDNO3)

表7b蛋白酶变体对巧克力、牛奶、烟尘污点的洗涤性能，参考酶是TY-145(SEQIDNO3)

表7c单种和两种蛋白酶变体对血液、牛奶、墨水污点的洗涤性能，参考酶是TY-145(SEQIDNO3)

表7d蛋白酶变体对血液、牛奶、墨水污点的洗涤性能，参考酶是TY-145(SEQIDNO3)

实例4：

通过使用以下标准污物确定变体在洗涤剂中的洗涤性能：

A：棉布上的血液、牛奶、墨水：产品号C-05，可从如下获得：CFT(测试材料中心(CenterforTestmaterials))B.V.，弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰，

B：棉布上的花生油、颜料、浓牛奶：产品号C-10，可从如下获得：CFT(测试材料中心)B.V.，弗拉尔丁恩，荷兰，

C：棉布上的草屑：产品号E164，可从如下获得：Material-undPrüfanstalt(EMPA)TestmaterialienAG[联邦材料与测试机构，测试材料(Federalmaterialsandtestingagency,Testmaterials)]，圣加仑州(St.Gallen)，瑞士(Switzerland)。

将具有以下组成的液体洗涤剂用作基本配制品(所有的值都以重量百分比计)：0％至0.5％黄原胶、0.2％至0.4％消泡剂、6％至7％甘油、0.3％至0.5％乙醇、0至7％FAEOS(脂肪醇醚硫酸酯)、10％至28％非离子型表面活性剂、0.5％-1％硼酸、1％至2％柠檬酸钠(二水合物)、2％至4％苏打、0至16％椰子脂肪酸、0.5％HEDP(1-羟基乙烷-(1,1-二磷酸))、0至0.4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、0至0.05％光学增亮剂、0至0.001％颜料、剩余部分为去离子水。

基于这种基本配制品，通过添加如表8a&b中所指示的对应的蛋白酶来制备不同洗涤剂。参考是具有描述于图2和WO03/055713的SEQIDNO:3中的氨基酸序列的蛋白酶，该参考蛋白酶已经显示出良好的洗涤性能(尤其在液体洗涤剂中)。以基于总蛋白质含量(5mg/l洗涤液体)的相同量添加蛋白酶。

液体洗涤剂的剂量之比是4.7克/升洗涤液体，并且在20℃和40℃的温度下进行60分钟洗涤程序，水具有15.5与16.5°(德国硬度)之间的水硬度。

白度(即污物的增白)被光度测定地确定为洗涤性能的指示。使用美能达(Minolta)CM508d分光仪装置，该装置事先使用提供有单位的白标准进行校准。

获得的结果是使用洗涤剂获得的缓解单位(remissionunit)与使用含有参考蛋白酶的洗涤剂获得的缓解单位之间的差值。因此，正值指示洗涤剂中变体的改进的洗涤性能。从表8a(在40℃的结果)和表8b(在20℃的结果)明显看出，根据本发明的变体显示改进的洗涤性能。

表8a：按照下表，具有与TY-145(SEQIDNO:3)相同的氨基酸序列(除了取代以外)的蛋白酶变体对棉布(A)上的血液、牛奶、墨水污点的洗涤性能；参考是具有描述于图2和WO03/055713的SEQIDNO.3中的氨基酸序列的蛋白酶。

表8b：蛋白酶变体对如下项的洗涤性能：棉布(A)上的血液、牛奶、墨水污点，棉布(B)上的花生油、颜料、浓牛奶；棉布(C)上的草屑；参考是具有描述于图2和WO03/055713的SEQIDNO.3中的氨基酸序列的蛋白酶。

实例5：

如以上在实例4中所述的并且根据以下方案，测试定义于实例4中的变体2和一种非蛋白酶类酶(甘露聚糖酶)在液体洗涤剂组合物中的稳定性：

1.酶制剂：将恰当％的酶制剂添加至配制品中并且然后将该配制品在30℃储存8周。

2.蛋白酶活性：可根据本领域中已知的方法测量酶活性。酶活性测定对于本领域技术人员是熟知和常规使用的。蛋白酶活性测定是例如披露在表面活性剂(Tenside)，第7卷(1970)，第125-132页中。蛋白酶活性可以进一步使用Suc-AAPF-pNA活性测定来确定，其测量对硝基苯胺(pNA)从底物suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的释放。pNA的释放引起在410nm处消光的增加，其中随时间变化的曲线是酶活性的测量(参见德尔玛(DelMar)等人，1979)。该测量是在25℃的温度，pH8.6和波长410nm下进行。测量周期是5分钟，测量间隔为20s至60s。优选地，以PU(蛋白酶单位)表示蛋白酶活性。

3.甘露聚糖酶活性：在储存后，测量剩余的甘露聚糖酶活性，如描述于“使用贝亚特安南酶片(BeatAnnanaseTablet)进行的内切-1,4-β-甘露聚糖酶的测定“(Fa.麦格酶(Megazyme))。将酶样品用在0.2MTrisHCl(pH8.2)中的天青精交联的轴节半乳糖甘露聚糖进行孵育。使用分光镜在590nm追踪该反应。

4.计算：所有活性表示为相对活性，或者相对于起始值或者相对于该对照非-“稀释“颗粒混合物的赋范活性。

如以上在实例4中描述的，在该液体洗涤剂组合物中测试变体2的稳定性。为了评估硼酸盐和4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)对变体2的稳定性的作用，将这两个组分单独地或按照以下表9a以不同浓度组合添加到该液体洗涤剂组合物中。

表9a：变体2在含有不同浓度的硼酸盐和4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)的液体洗涤剂组合物中的稳定性。

在包含变体2的液体洗涤剂制剂中通过将0.00001％的活性甘露聚糖酶(诺维信的Mannaway^TM)添加到该组合物中测试一种非蛋白酶类酶的稳定性。

表9b：甘露聚糖酶在包含变体2和不同浓度的硼酸盐和4-甲酰基苯基硼酸(4-FPBA)的一种液体洗涤剂组合物中的稳定性。

甘露聚糖酶稳定性	不含硼酸盐	含1％w/w硼酸盐
			0.9％w/w变体2(2％(w/w)4-FPBA)	30％	85％
0.9％w/w变体2(0％(w/w)4-FPBA)	0％	81％
			0.9％w/w变体2(1％(w/w)4-FPBA)	15％	85％

Claims

1.一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体包括对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个位置处的取代，其中该变体与SEQIDNO:3具有至少75％并且小于100％的序列一致性，并且该变体具有蛋白酶活性。

2.如权利要求1所述的蛋白酶变体，其中

a)在对应于SEQIDNO:3的位置171的位置处的氨基酸是选自下组，该组由以下各项组成：Trp、Lys、Glu、Asn，和/或

b)在对应于SEQIDNO:3的位置173的位置处的氨基酸是Pro，和/或

c)在对应于SEQIDNO:3的位置175的位置处的氨基酸是Ala、Val、Pro，和/或

d)在对应于SEQIDNO:3的位置179的位置处的氨基酸是选自下组，该组由以下各项组成：Cys、Val、Gln、Ser、Thr、Glu、His、Lys、Met、Asn、Tyr和Ala。

3.如权利要求1-2中任一项所述的变体，该变体在对应于位置171、173、175、179、以及180中任一个的两个位置处包括改变。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的变体，其中在对应于SEQIDNO:3的位置180的位置处的氨基酸是Tyr。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的变体，其中在对应于SEQIDNO:3的位置175的位置处的氨基酸是Pro。

6.如权利要求1-5中任一项所述的变体，该变体进一步包括选自下组的一个或多个取代，该组由以下各项组成：Y39D；T40{D，P}；Q70N；T74M；L81{F，H，V}；A102T；I121{V，T}；G132{I，E}；I137{M；E}；S144{Q，R}；D155N；G159S；V162R；G174{S，T}；N176G；T177S；T241P；I247M；H256F；S274I；V286Q；T297P。

7.一种蛋白酶变体，该蛋白酶变体包括相比于SEQIDNO:3的以下取代中的任一个：

8.如权利要求1-7中任一项所述的变体，该变体相比于该亲本或相比于具有SEQIDNO:3的蛋白酶具有改进的洗涤剂稳定性。

9.如权利要求1-8中任一项所述的变体，其中该变体是选自下组，该组由以下各项组成：

a)与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的一种多肽；

b)由在中严格或高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、(ii)编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列、或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体杂交的一种多核苷酸编码的一种多肽；

c)由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或者编码SEQIDNO:2的成熟多肽的序列具有至少75％的一致性的多核苷酸编码的一种多肽；以及

d)SEQIDNO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

10.如权利要求1-9中任一项所述的变体，其中该变体与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％的序列一致性。

11.如权利要求1-10中任一项所述的变体，其中相比于SEQIDNO3的改变的总数是1-20个，例如1-10个和1-5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

12.一种用于获得蛋白酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的位置171、173、175或179的一个或多个位置处向亲本蛋白酶引入取代，其中该变体具有与SEQIDNO:3至少70％一致的氨基酸序列，并且回收该变体。

13.如权利要求11所述的方法，其中该变体包括对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置171、173、175、179或180的两个、三个、四个或五个取代。

14.根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体是通过以下方法获得的，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置171的位置处的选自由Trp、Lys、Glu、Asn组成的组的一个氨基酸的取代。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体是通过以下方法获得的，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置173的位置处的Pro的取代。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体是通过以下方法获得的，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置175的位置处的选自由Ala、Val、Pro组成的组的一个氨基酸的取代。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体是通过以下方法获得的，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置179的位置处的选自由Cys、Val、Gln、Ser、Thr、Glu、His、Lys、Met、Asn、Ala、Tyr组成的组的一个氨基酸的取代。

18.根据权利要求12所述的方法，其中该蛋白酶变体是通过以下方法获得的，该方法包括在对应于SEQIDNO:3的成熟多肽的位置180的位置处的Tyr的取代。

19.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其中该蛋白酶变体与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、但小于100％的序列一致性。

20.根据权利要求11-18中任一项所述的方法，其中该亲本蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：

a)与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少75％序列一致性的一种多肽；

d)SEQIDNO:2的成熟多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。

21.根据权利要求11-19中任一项所述的方法，其中该亲本蛋白酶与SEQIDNO:3具有至少75％，例如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，例如至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6、或100％的序列一致性。