CN105358571A

CN105358571A - 方法

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Publication number: CN105358571A
Application number: CN201480037548.1A
Authority: CN
Inventors: I·艾尔曼亚维; D·西格莫德
Original assignee: CSL Behring AG
Current assignee: CSL Behring AG
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2014-07-01
Publication date: 2016-02-24
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Also published as: CN105358571B; AU2014286268A1; KR102382662B1; DK3016976T3; AU2014286268B2; JP6474798B2; ES2833100T3; HK1220983A1; KR20160027136A; US20160368970A1; WO2015000886A1; JP2016523877A; US10144774B2; EP3016976A1; EP3016976B1

Abstract

本发明涉及改良的方法，用于纯化IgG，改进每升起始物质的IgG的收率而不损害产品的质量。

Description

方法

本发明涉及用于纯化IgG的改进的方法。特别是所述改进的方法提供了比早前的方法更高的收率。

发明背景

公知的是，免疫球蛋白在哺乳动物的免疫系统中具有重要作用。它们通过B-淋巴细胞产生，被发现存在于血浆、淋巴和其它分泌体中。免疫球蛋白占人体中血浆蛋白质的大约20％。免疫球蛋白的基本单元为异四聚体，包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。这些链的每一个都具有形成抗原结合位点的在它们的N端的可变区和负责免疫球蛋白的效应子功能的恒定区。

存在具有不同的生化和生理性质的五种主要类型的免疫球蛋白：IgG(□重链)、IgA(α)、IgM(μ)、IgD(δ)和IgE(ε)。人IgG代表血浆中最大丰度的免疫球蛋白，而IgA代表在外部分泌物如呼吸道和肠道的唾液、泪液和粘液中的主要抗体类型。IgM是目前在人类循环系统中物理上最大的抗体，通常作为基本免疫球蛋白单元的五聚体存在，并且在感染过程早期出现。

最初，从人血浆制备IgG被成功地用于预防和治疗各种传染性疾病。早期的产品通过相对粗放的方法(乙醇分级)生产并且包含杂质和聚集体至仅能够肌内施用它们的程度。纯化方法方面的改进由于IgG制剂的改进的纯度和质量已产生适合于静脉内施用的IgG制剂(称为IVIG)，并且还已开发出用于皮下施用的制剂(称为SCIG)。

通常用于从血浆纯化IgG的工业方法基于由Cohn设计的原始方法(CohnE.,等人,(1946),JAmChemSoc,68,459-475,Oncley等人,(1949),JAmChemSoc,71,541-550)，其追溯到20世纪40年代并且依赖于血浆蛋白质的冷分级沉淀。在离子强度、pH和温度的受控条件下逐渐添加乙醇之后，该血浆分级法获得了治疗学上有用的血浆蛋白质(凝血因子、白蛋白、免疫球蛋白、抗凝血酶III)的经富集或经浓缩的级分。根据开发出经改变的乙醇分级方法的Kistler和Nitschmann，应用Cohn分级从级分II+III、I+II+III或相当的沉淀A(称为NA沉淀)获得了IgG(KistlerPandNitschmannHS,(1952),VoxSang,7,414-424)。

在20世纪60年代已显示短链脂肪酸(C6-C12)与α-和β-球蛋白形成不溶的络合物，而γ-球蛋白则不易沉淀(Chanutin等人,(1960)Arch.Biochem.Biophys.89；218)。

Steinbuch和Audran((1969)Arch.Biochem.Biophys.134,279-294)描述了采用辛酸盐(即辛酸盐，一种C8饱和脂肪酸)作为沉淀剂的IgG纯化方法。在用乙酸盐缓冲液稀释以达到4.8的最终pH之后，从人血浆中沉淀非免疫球蛋白。在强烈搅拌下添加辛酸盐之后，获得富集IgG的溶液。纯度和收率取决于辛酸盐的量、pH、缓冲液的摩尔浓度和稀释系数。

在弱酸性pH而不是低于pH4.5时最佳地获得大量非免疫球蛋白沉淀。将血浆用0.06M乙酸盐缓冲液(pH4.8)稀释(2:1)，然后用2.5重量％辛酸盐处理，以开始沉淀。将DEAE-纤维素上的上清液的分批吸附用于从经分离的IgG级分清除另外的杂质。Steinbuch等人的后期工作显示了辛酸沉淀存在于Cohn乙醇级分III中的大多数蛋白质和脂蛋白(而不是免疫球蛋白)的用途(Steinbuch等人,(1973),Prep.Biochem.3,363-373)。

将相同的方法应用至使用2.16重量％辛酸盐稀释的人血浆(Habeeb等人,(1984)Prep.Biochem.14,1-17)。Habeeb等人遵循采用在DEAE纤维素上分级的辛酸沉淀法。所产生的来源于血浆的IgG基本上不含聚集体、纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原。此外，所获得的IgG的抗补体活性低且在储存期间相对稳定。因此将辛酸盐沉淀步骤公认为非常有用，并且引入从血浆生产IgG的许多现代方法中。

除了醇、PEG和辛酸分级法以外，还将若干色谱法方法与基础分级法结合用于纯化IVIG。

最经常使用的色谱方法是离子交换色谱法，其利用了蛋白质和离子交换介质上的表面分布和电荷密度。阴离子交换树脂呈现带正电的表面。电荷密度对树脂是特异性的，并且通常独立于pH(在树脂的工作范围之内)。典型的阴离子交换剂将会结合具有净负电荷的蛋白质(即当溶液的pH高于蛋白质的等电点时)。在现实中，蛋白质的表面并不呈现单一的电荷；而是正电荷和负电荷以及中性区域的嵌合。表面结构对给定蛋白质是特异性的，并且将会受溶液条件如离子强度和pH影响。可以开发该独特性以确立单个蛋白质将结合阴离子交换树脂或从其释放的特定条件。通过确立这些条件，可以以高收率(>95％)有效地分离具有仅稍微不同的表面或电荷性质的蛋白质。

色谱法树脂载体结构方面的改进使得大型规模色谱法成为更常规的纯化方法的实践上的替代方案。刚性树脂允许快速(<5小时)处理大的体积，并且高的配体密度产生了对大体积处理所必需的加强的能力。与高的收率、产品纯度和处理简化结合的这些因素支持色谱法在大规模制造中的用途。

尤其是，已将阳离子和/或阴离子交换色谱法(有时在单独的步骤中或串联结合)用于血浆或其级分中纯化IgG(如WO99/64462中所描述)。在大多数方法中，以阴离子模式使用阴离子交换色谱法，即使用条件使得污染物蛋白质即IgA、IgM、白蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白能够结合，而在非吸附的级分中回收所述IgG。

辛酸盐沉淀法与之后的用于纯化IgG的离子交换色谱法的组合描述于许多出版物中。Steinbuch和Audran((1969)ArchBiochemBiophys134,279-284)描述了在用DEAE纤维素沉淀辛酸盐之后进一步纯化IgG。Lebing等人(US5,886,157)描述了串联使用用于除去IgM、IgA、白蛋白和其它杂质的两种阴离子交换柱。Lebing等人结合了辛酸盐介导的效应二者，即通过沉淀实质上减少非IgG蛋白质，由此使用病毒分配(partition)以及在单独的温育步骤中的脂肪酸的包裹的病毒灭活性质。从含IgG的糊状物/沉淀物在pH4.2的重构开始并且在将所述pH调节为5.2时随后添加辛酸盐的所谓的“pH波动”的重要性被强调为对于IgG富集程序而言是重要的，因此需要有效减少非IgG蛋白质。然后通过所提及的离子交换色谱法步骤减少一些其它杂质如IgA和IgM以及所述辛酸盐。

美国专利第5,164,487号涉及辛酸用于制造静脉内耐受的IgG制剂的用途，所述制剂不含聚集体、血管活性物质和蛋白水解酶。方法包括使含IgG的起始原料与0.4％至1.5％辛酸接触，然后用离子交换或疏水性基质色谱纯化。

由于纯化方法的连续改进，多年来存在IgG产品的演变。如上文所提及，第一类IgG产品仅适合于肌内使用，因为它们在静脉内施用时导致过多的不良事件。适合于静脉内使用的第一代IgG产品(IVIG)通过起始原料(Cohn级分II)的胃蛋白酶裂解制备，所述裂解的目的在于除去免疫球蛋白聚集体，所述聚集体导致严重的不良事件如补体激活，并且使得不可能静脉内施用早期的产品。所述方法中不包括柱色谱步骤。不得不冷冻干燥所述产品，从而在合理的时间期间保持稳定并在使用前立即溶解。

在八十年代中期引入了具有低抗补体活性和较高稳定性的基于未裂解和未修饰的免疫球蛋白分子的第二代IVIG，但其仍然呈冷冻干燥的产品的形式。该IVIG通过包括若干色谱法步骤的方法来纯化。避免了胃蛋白酶裂解，通过沉淀法除去了聚集体和颗粒，并且通过柱色谱离子交换法实现了进一步纯化。

对于第三代IVIG而言，方法中包括了专门的病毒灭活步骤。虽然纯化方法中的沉淀步骤特别除去了许多病毒，然而用血液产品治疗的一些患者仍被HIV感染，因此进一步需要采取专门的步骤来从这些产品中使病毒灭活并除去病毒。

所述方法被继续改善以进一步实现蛋白质的更佳的纯度和质量，从而使得可获得待制备的稳定的液体产品成为可能，并且改进这些产品对患者而言的安全性和耐受性。此外开发了皮下制剂。

现在将IgG产品用于许多临床应用中。除了用于治疗原发性或获得性免疫缺陷和传染性疾病的传统用途以外，已显示这些产品还在自身免疫性疾病和某些神经性疾病如CIDP的治疗中有效。还存在致力于IgG产品的另外的治疗用途的研究数量方面的显著增长。因此对于IgG产品的需求增加。IgG产品现在是世界市场上需求最大的血浆产品；在2008年，市场达到大约82公吨(包括美国37吨、欧洲21吨和亚洲17吨)，并具有以大约每年7％的速率增长的倾向(2013年的预期需求为110公吨)(TheWorldwidePlasmaFractionsMarket2008.TheMarketingResearchBureau,Inc.，2010年四月版)。由于人血浆是有价值的有限的资源，所以需要进一步改进用于从血浆纯化IgG的方法，以实现比目前可能的更高的收率，同时不损害产品的质量。目前的方法具有每升血浆3.7至4.2g的IgG的平均收率，这仅代表存在于血浆中的IgG的最多55％。

发明简述

本发明涉及从血浆或包含IgG和其它蛋白质的其它溶液中纯化IgG的改良的方法，所述方法改进了每升起始溶液(优选血浆)的IgG收率而不损害产品的质量。

本发明的第一方面是在纯化过程中从包含IgG、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的溶液增加IgG收率的方法，包括

(a)提供包含IgG、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的酸性溶液，所述酸性溶液具有3.5至5.2的pH和至少10g/l的总蛋白质浓度；

(b)将溶液调节至5.2至6.2的pH，同时保持低于1.5mS/cm的电导率；

(c)将所述溶液温育至少15分钟；和

(d)除去任何沉淀物。

优选地，包含IgG的溶液包含源自血浆的抗体，更优选地，包含IgG的溶液通过人血浆或人的冷沉淀物贫乏的(cryo-poorplasma)血浆的乙醇分级获得。在本发明的另一优选实施方案中，包含IgG的溶液为来自辛酸沉淀法的上清液。

典型地，步骤(a)中的溶液已通过超渗滤澄清。优选地，步骤(a)中的溶液的pH为3.9至5.0，更优选3.9至4.6，甚至更优选3.9至4.3。优选地，步骤(a)中的蛋白质浓度为10至50g/l，更优选20至25g/l。

在步骤(b)中，将pH调节至5.2至6.2的pH，优选调节至5.6至6.0的pH，更优选调节至5.8至6.0的pH。优选地，步骤(b)中的pH调节通过添加至少一种多羟基化的胺化合物来完成。优选地，所述pH调节采用浓度高于250mM，更优选高于500mM，甚至更优选高于750mM，最优选约1M的Tris来完成。优选地，所述pH调节在至少15分钟的时间期间内完成。步骤(b)中的电导率为低于1.5mS/cm，优选低于1.2mS/cm，更优选低于1.0mS/cm，甚至更优选低于0.8mS/cm，最优选0.2至0.5mS/cm。最优选地，将步骤(b)中的pH调节至pH5.6至6.0，且所述电导率为0.2至0.5mS/cm。

步骤(c)中的温育时间为至多72小时、至多48小时、至多24小时，优选至多12小时，更优选至多6小时，最优选15分钟至90分钟。优选地，步骤(c)中的温育在环境温度进行。

步骤(d)中的沉淀物优选通过深度过滤除去。用于除去所述沉淀物的其它方法也是可能的，例如其它过滤方法或离心。

在步骤(d)之后，可以进行另外的纯化步骤如色谱方法，例如离子交换色谱法。优选地，离子交换色谱法步骤在允许污染物结合至树脂但不允许IgG结合至树脂的条件下进行。优选地，所述离子交换色谱法是阴离子交换色谱法。优选地，不另外调节至溶液的电导率进行所述离子交换色谱法。

所述方法将另外包括病毒灭活步骤。优选地，所述病毒灭活步骤为低pH处理。优选地，用于病毒灭活步骤的低pH处理在步骤(a)之前进行。

发明详述

本发明涉及在纯化过程中从包含IgG抗体、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的起始溶液，优选目前的过程的中间体增加IgG收率的方法。所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含IgG、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的酸性溶液，所述酸性溶液具有3.5至5.2，优选4.0至5.0，更优选4.6至4.8的pH和至少10g/l，优选约10至50g/l，更优选约10至40g/l，甚至更优选15至30g/l，最优选20-25g/l的总蛋白质浓度。

包含IgG的组合物可以为任何物质，优选其为包含IgG的生物流体。优选地，包含IgG的组合物为血液、血浆或血清，或来源于血液、血浆或血清。然而，本发明中也可以使用其它包含IgG的起始物质。例如，还可以使用本发明的方法从其它生物流体，如细胞培养上清液富集IgG。

包含IgG的组合物可以为糊状物或沉淀物的溶液，优选来自冷乙醇分级法的级分，如(FII+III)、(FI+II+II)或FIII，如Cohn/Oncley等人的方法所描述，或其变型，或者沉淀物A(PPT-A)、沉淀物B(PPT-B)和沉淀物G(PPT-G)，如在所述Kistler和Nitschman方法所描述，或其变型。

然而优选地，包含IgG的溶液是在使用辛酸、聚乙二醇和/或硫酸铵沉淀法从上文所述的乙醇级分出发纯化IgG期间获得的中间溶液或中间沉淀物的溶液，或任何含IgG的中间体。当从血浆级分出发时，辛酸沉淀法是制备富集IgG的中间体的优选方法。可以将辛酸添加至中间体溶液，例如添加至经稳定化的乙醇沉淀物中，至大约5％(w/w)的最终浓度，如Steinbuch和Audran((1969)Arch.Biochem.Biophys.134,279-294)所述。也可以使用更高浓度的辛酸。应当在环境温度在限定的条件如pH、电导率和温育时间下缓慢添加所述辛酸。如果使用较高浓度的辛酸，则可以另外添加磷酸钙，然后是另外的温育期间。污染性蛋白质、脂质和辛酸盐形式的沉淀物，同时主要的免疫球蛋白，尤其是所述IgG保留在溶液中。沉淀的蛋白质、脂质和辛酸盐可以通过在环境温度(例如18℃至26℃)过滤除去。例如可以在助滤剂存在下使用深度过滤(例如使用硅藻土，但也可以使用其它助滤剂)。可以使用一般地流动过滤来过滤溶液。然而，也设想除去沉淀物和使溶液澄清的其它方法。然后可以使经澄清的溶液经受渗滤/超滤以调节pH、电导率和蛋白质浓度。

优选地，起始溶液是在上文所述的酸性条件下从血浆或血浆级分纯化IgG的过程期间通过超滤/渗滤澄清并且已经富集了免疫球蛋白的中间溶液。

如果将沉淀物用作起始物质，则可以通过将沉淀物在缓冲液中再悬浮若干小时从该沉淀物(过程级分(processfraction)或副级分(sidefraction))提取所述IgG。优选地，使用具有1至15mS/cm，更优选5至15mS/cm的电导率的溶液进行溶液化。用于溶液化的溶液的pH为3.5至6，优选4.0至5.5，更优选4.5至5.2，最优选大约4.8。例如，溶液化可以采用0.2M乙酸盐在pH4.8进行。然而，本领域技术人员能够确定另外的合适的缓冲液。缓冲液与沉淀物的比例可以为约1:5至1:10，但也可以使用其它比例。在强烈搅拌下使用合适的混合器将溶液化进行至少2小时，优选至少4小时。

在本发明的方法的下一步骤中，将步骤(a)的溶液的pH进一步调节至约5.2至6.2，优选5.4至6.0，更优选5.6至6.0，甚至更优选5.7至5.9，最优选大约5.8。该溶液的电导率独立于pH且为低于1.5mS/cm，例如0.2至1.5mS/cm，优选低于1.0mS/cm，例如0.2至1.0mS/cm，甚至更优选低于0.8mS/cm，例如0.2至0.8mS/cm，或者甚至低于0.5mS/cm，最优选0.2至0.5mS/cm。

优选地，用于调节pH和电导率的试剂为以下或包含以下：胺化合物，优选多羟基化的胺化合物，如2-氨基-1-乙醇(C₂H₇NO)、双(羟乙基)-胺(C₄H₁₁NO₂)、三(2-羟乙基)胺(C₆H₁₅NO₃)，优选(双(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷)(C₈H₁₉NO₅)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(C₆H₁₃NO₄)、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(C₁₁H₂₆N₂O₆)，最优选2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(C₄H₁₁NO₃)(Tris碱)。

本发明人已有利地发现，使用具有或不具有羧基的多羟基化的胺化合物导致在第二次pH调节(将IgG稳定化)期间的低的IgG损失。使蛋白质污染物沉淀，同时将电导率保持恒定在期望的值，例如0.2至0.5mS/cm。

在步骤(c)中，在强烈搅拌下使用合适的混合器将该包含IgG的溶液然后温育至少15分钟。本领域技术人员将能够按照用于混合的方法调节该步骤所需要的时间。温育时间可以为至多72小时，优选至多48小时，更优选12至24小时，最优选15分钟至12小时。然而，还可以使用其它温育时间；技术人员将意识到对于较长的温育时间而言，可能必须使用较低的温度，例如4-8℃，而对于较短的温育时间，可以选择环境温度。

在步骤(d)中，除去在步骤(c)的pH转换期间形成的经沉淀的蛋白质，例如通过在环境温度(例如18-26℃)深度过滤。所述深度过滤需要添加助滤剂，如技术人员已知那样。可以使用一般的流动过滤来过滤溶液。然而，也可以使用除去经沉淀的蛋白质的其它方法，例如其它过滤方法、离心。技术人员充分知道用于除去沉淀物的其它合适的方法。该步骤导致IgM和IgA的明显减少。

然后可以处理经澄清的溶液以进一步纯化IgG。一种优选的选项在于使该溶液经受离子交换色谱法。优选地，将溶液在允许残余的IgA、IgM和其它污染物结合，同时IgG保持在流通的条件下负载至阴离子交换剂上。优选地，可以将经澄清的溶液直接负载至柱上。有利地，不存在调节pH或电导率的需要。

用于该步骤的阴离子交换剂可以为强阴离子交换剂或弱阴离子交换剂。优选地，所述阴离子交换剂包括阴离子交换配体如季铵、季氨基乙基、二乙基氨基乙基、三甲基氨基乙基或二甲基氨基乙基。更优选地，所述阴离子交换剂选自DEAESepharoseFF、Q-Sepharose(HP和FF)、ANXSepharoseFF(低和高取代的)、CaptoQ、CaptoQXP、CaptoDEAE、Source30Q和15Q，最优选FractogelDEAE和MPHQ。

如上文所述，优选在允许残余的IgA、IgM和其它污染物结合至所述阴离子交换剂的条件下进行负载。典型地，通常采用两个缓冲液体系(平衡缓冲液1和2)在使用前平衡所述阴离子交换剂，由此在负载前使用平衡缓冲液2。平衡缓冲液是适于所使用的阴离子交换剂的普通缓冲液体系。所述平衡缓冲液1的电导率为10至20mS/cm，更优选11至15mS/cm。pH为7至8，更优选7.1至7.5。合适的缓冲液的实例为磷酸盐或乙酸盐缓冲液或其组合。优选地，缓冲液为磷酸盐混合物(一元和二元)。

所述方法中可以包括的其它步骤为病毒灭活/除去步骤，如纳滤、溶剂/去污剂处理、低pH处理或巴氏灭菌。技术人员将充分了解合适的病毒灭活和除去方法。这些步骤可以包括在方法中的任意合适的阶段。

典型地，可以加入药学上可接受的赋形剂如稳定化剂。

其中已成功实施的本发明的方法的一个特别优选的方法实例为这样的方法，包括冷乙醇分级和使用沉淀物A(根据Kistler和Nitschmann的碱级分的中间体)或根据Cohn等人获得的沉淀物II+III(PPTII+III)和/或根据Kistler-Cohn方法的变型获得的沉淀物I+II+III。

制备中间体基本上通过以下步骤处理：

(1)辛酸(OA)分级，

(2)低pH温育，

(3)pH-转换和深度过滤,

(4)阴离子交换色谱法，

(5)病毒过滤，和

(6)通过超滤/渗滤浓缩。

根据本发明的方法的变型包括以下的一个或多个

(i)通过在深度过滤之前改变pH(pH转换)的预纯化。该步骤在非常低的电导率进行，从而沉淀IgA和IgM的大部分，并在精制色谱法步骤之前使IgG的共沉淀最小化；

(ii)为阴离子交换色谱法步骤改变缓冲液体系。

有利地，(优选地)使用不增加溶液的电导率的三羟基氨基甲烷缓冲液进行pH转换；因此可以将在深度过滤之后所产生的滤液直接负载至已例如采用磷酸盐缓冲液合适地平衡的阴离子交换柱上。低的电导率对于在该步骤中减少IgG的沉淀而言是重要的。

使用所述方法中的变型二者，IgG收率与没有这些变型的相同方法相比增加至少5％。

实施例

现在将示例说明本发明。实施例意在阐释而非限制本发明。参考以下附图：

图1：显示步骤(b)中pH调节对蛋白质收率(浅灰色柱)和IgG收率(黑色柱)的效果的柱状图。

图2：显示对于三种不同的起始物质而言，用于将pH转换至pH5.8的Tris的浓度对IgG收率(黑色柱)或损失(灰色柱)的效果的柱状图：(a)来自回收的血浆的起始物质NAPPT，(b)来自源血浆的起始物质NAPPT，(c)来自源血浆的PPTII+III。

实施例1

(a)根据Steinbuch和Audran的现有技术方法((1969)Arch.Biochem.Biophys.134,279-294)。

将一部分冷冻的NA沉淀物(PPT)再悬浮在足量乙酸钠缓冲液中，将NAPPT悬浮液搅拌若干小时直至绝大部分IgG在环境温度溶解，同时将pH保持恒定在4.8。

通过将辛酸(OA)添加至悬浮液和随后温育240分钟进行脱脂。然后添加磷酸钙并将悬浮液搅拌另外的60至90分钟。将沉淀的蛋白质、脂质或脂蛋白复合物和沉淀的其它污染物在这些条件下通过过滤除去。

使OA-滤液经受超滤以达到3％的蛋白质浓度，然后相对于注射用水(WFI)渗滤。在渗滤期间用0.2mol/LHCl将pH连续转换至pH4.1。渗滤后将蛋白质溶液用WFI稀释至20g/L蛋白质，将pH调节至pH4.0±0.1，并添加23.5mg/kg聚山梨酸酯80(P80)。在过滤和过滤后洗涤之后，以约20g/L的蛋白质浓度在37℃将pH4.0温育进行若干小时。然后将pH4温育的物质冷却至室温。

用NaOH将pH增加至pH6.5，然后温育约90分钟。pH调节和温育通过过滤除去IgA和IgM的大部分。通过过滤除去沉淀的杂质。在调节电导率之后，将澄清溶液在线过滤(filteredinline)并施加至柱上，所述柱用10mM乙酸钠，pH6.5，调节和平衡，填充有强阴离子交换剂(MacroprepHighPerformance；MPHQ)。在给定条件下，残余IgA和IgM以及其他蛋白质杂质结合至所述阴离子交换(AIEX)树脂，同时在流通和洗涤级分中发现IgG。在收集期间，包含IgG的AIEX流通和洗涤级分的pH降低至并且保持在pH4.8±0.1。

通过0.1μm预过滤，然后在线纳滤实现病毒的除去。使用聚醚砜膜和相对于WFI渗滤将病毒滤液浓缩至2-3％蛋白质。在渗滤期间，将pH连续转换至pH4.1。之后将溶液浓缩至105–135g/L的蛋白质含量。将原料药稀释至100gIgG每升，用250mmol/LL-脯氨酸(最终浓度)稳定并将pH保持在4.80±0.10。配制剂本体(formulatedbulk)为通过0.2μm膜过滤器过滤的微粒。

(b)包括pH转换和优化色谱法缓冲液体系的改良的方法

根据本发明通过实施pH转换步骤和优化色谱法的缓冲液体系改进在(a)中所描述的方法。

如上文所述处理NAPPT，包括OA沉淀和低pH病毒灭活。

然后将低pH4温育的溶液的pH使用1MTris缓冲液调节至pH5.8。所述pH调节经90分钟的时间期间进行，然后在环境温度温育90分钟。然后通过过滤除去所形成的沉淀物。将pH和电导率如权利要求1的步骤(b)中所描述保持恒定在例如大约5.8的pH和大约0.2-0.5mS/cm的电导率。

在使用磷酸盐缓冲液(0.12M磷酸盐，pH7.3±0.2)调节和使用(5mM磷酸盐+10mM乙酸盐，pH6.0±0.1)平衡之后，将填充有强阴离子交换剂(MacroprepHighPerformance；MPHQ)的色谱柱以70–130cm/h的线性流速用≤180g蛋白质每升树脂负载。在给定条件下，残余的IgA和IgM以及其它蛋白质杂质结合至阴离子交换(AIEX)树脂，同时在流通和洗涤级分中发现IgG。在收集期间，包含IgG的AIEX流通和洗涤级分的pH降低至并且保持在pH4.8±0.1。

接下来的步骤如(a)中所述进行。

收率对比(现有方法对比改良的方法)

关于来自相同起始中间体的蛋白质收率的两种方法的对比示于表1至3中。将在低pH温育(pH4)之后的IgG收率设定为100％。

表1：现有技术与改良的方法之间的对比——由回收的血浆产生的起始物质NA

步骤	现有技术方法	改良的方法
			血浆当量(L)	11195	239.6
低pH温育之后
			蛋白质收率(％)	100	100
pH-转换和过滤之后
			蛋白质收率(％)	90.7	94.5
色谱法之后
			蛋白质收率(％)	78	84
本体制剂(bulk formulation)之后
			蛋白质收率(％)	77.6	83.3

表2：现有技术与改良的方法之间的对比——由源血浆产生的起始物质NA

表3：现有技术与改良的方法之间的对比——由源血浆产生的起始物质PPTII+III

步骤	现有技术方法	改良的方法
			血浆当量(L)	13494	304.2
低pH温育之后
			蛋白质收率(％)	100	100
pH-转换和过滤之后
			蛋白质收率(％)	96	100
色谱法之后
			蛋白质收率(％)	80	85
本体制剂之后
			蛋白质收率(％)	79	84

已显示，作为经过方法改变和收率增加的结果，在产物的纯度方面没有发生明显改变。

实施例2

该实施例证明了与现有的6.5的pH转换相比，使用Tris缓冲液的不同pH调节对IgG收率的影响。

从实施例1中所描述的PPT-NA出发，如上文所述产生低pH4温育的溶液。提取八份(每份1kg)，并将其用1MTris缓冲液调节至5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4的pH。根据现有技术方法使用0.2MNaOH调节最后一份的pH。在90分钟的时间期间内进行pH调节，然后如上文所述在环境温度温育90分钟。然后通过过滤除去所形成的沉淀物。然后将滤液负载至AIEX柱，如实施例1(b)所述。对比经不同负载的溶液的蛋白质和IgG收率。结果示于图1中。将在不同pH转换时的1MTris缓冲液与用于实施例1(a)中所描述的现有技术方法的0.2MNaOH比较对IgG收率的影响显示，随着使用1MTris缓冲液增加的pH转换(pH:5.2–6.2)，使IgG收率的损失最小化。

实施例3

该实施例显示了所使用的Tris缓冲液的浓度在期望的到5.8的pH转换的影响。从低pH4温育的溶液出发，分别使用1M、0.5M和0.25MTris缓冲液将pH从4转换至5.8。

结果示于图2中。独立于起始物质(源PPT-II+III、NA或回收的NA)，IgG损失随着所使用的Tris缓冲液的摩尔浓度的增加而降低。

实施例4

该实施例证明了用于在步骤(b)中调节pH的不同试剂(包括胺化合物，优选多羟基化的胺化合物)对IgG收率的影响。

使用以下试剂：2-氨基-1-乙醇(C2H7NO)、双(羟乙基)-胺(C4H11NO2)、三(2-羟乙基)胺(C6H15NO3)，优选双(2-羟乙基)-氨基-三(羟甲基)-甲烷(C8H19NO5)、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸(C6H13NO4)、1,3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷(C11H26N2O6)、2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(C4H11NO3)(Tris碱)以及这些试剂的组合。

从实施例1中所述的PPT-NA出发，如上文所述产生低pH4温育的溶液。提取八份(每份1kg)，并使用上述试剂的1M溶液将其调节至5.75至5.85的pH。根据现有方法使用0.2MNaOH调节最后一份的pH。在90分钟的时间期间内进行pH调节，然后如上文所述在环境温度温育90分钟。然后通过过滤除去所形成的沉淀物。对比不同滤液的IgG收率。

结果示于表4中。所述结果显示了使用用于步骤(b)中的pH转换的不同试剂(作为1M溶液)对IgG收率的影响与使用如现有技术方法中所用的0.2MNaOH对IgG收率的影响的比较。结果显示，与现有技术方法相比，采用不同的胺化合物增加了IgG收率。尤其有利的是使用多羟基化的胺化合物。

表4：与现有技术方法相比的，现有技术与使用不同中和试剂的改良的方法之间的对比——由源血浆产生的起始物质NA

Claims

1.在纯化过程中从包含IgG、其它免疫球蛋白和/或其它蛋白质污染物的溶液增加IgG收率的方法，包括

(b)将溶液调节至5.2至6.2的pH，同时保持低于1.5mS/cm的电导率；

(c)将所述溶液温育至少15分钟；和

(d)除去任何沉淀物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中包含IgG的溶液包含源自血浆的抗体。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中包含IgG的溶液通过人血浆或人的冷沉淀物贫乏的血浆的乙醇分级获得。

4.根据权利要求3所述的方法，其中包含IgG的溶液为来自辛酸沉淀法的上清液。

5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(a)中的溶液已通过超渗滤澄清。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(a)中的溶液的pH为3.9至5.0，优选3.9至4.6，最优选3.9至4.3。

7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(a)中的蛋白质浓度为10至50g/l，优选20至25g/l。

8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将步骤(b)中的pH调节至pH5.6至6.0，优选5.8至6.0。

9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)中的pH调节通过添加至少一种具有或不具有羧基的多羟基化的胺化合物来完成。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中采用浓度高于250mM，优选高于500mM，更优选高于750mM，最优选约1M的Tris调节步骤(b)中的电导率。

11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(b)中的电导率为低于1.0mS/cm，优选低于0.8mS/cm，更优选0.2至0.5mS/cm。

12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将步骤(b)中的pH调节至pH5.6至6.0，和电导率为0.2至0.5mS/cm。

13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(c)中的温育时间为至多72小时、至多48小时、至多24小时，优选至多12小时，更优选至多6小时，最优选15分钟至90分钟。

14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤(c)中的温育在环境温度进行。

15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将步骤(d)中的沉淀物通过深度过滤除去。

16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤(d)之后，在允许污染物结合至树脂但不允许IgG结合至树脂的条件下进行离子交换色谱法步骤。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述离子交换色谱法为阴离子交换色谱法。

18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中所述离子交换色谱法在没有对溶液的电导率另外进行调节的情况下进行。

19.根据前述权利要求任一项所述的方法，还包括病毒灭活步骤。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述病毒灭活步骤为低pH处理。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述低pH处理在步骤(a)之前进行。