CN1053012C

CN1053012C - 猪瘟病毒疫苗和诊断

Info

Publication number: CN1053012C
Application number: CN90101494A
Authority: CN
Inventors: 格来哥·梅伊尔; 迪尔曼·鲁麦纳普; 享茨-余尔根·歇尔
Original assignee: Akzo N
Current assignee: Intervet International BV; Akzo Nobel NV
Priority date: 1989-03-19
Filing date: 1990-03-19
Publication date: 2000-05-31
Anticipated expiration: 2005-03-19
Also published as: AU5145190A; DE69027339T2; CA2012414A1; DK0389034T3; DE69034218T2; EP0389034A1; ZA901719B; AU632545B2; DK0389034T4; KR900014587A; ES2063897T5; HU901571D0; DE69012386D1; NZ232947A; DE69034218D1; ES2063897T3; ES2091083T3; CA2012414C; EP0614979A1; DE69012386T2

Abstract

本发明涉及含有猪瘟病毒特征性多肽的猪瘟病毒疫苗。还涉及能够表达编码该多肽之核酸顺序的载体疫苗，所说的多肽和核酸顺序也能用于检测猪瘟病毒感染。

Description

猪瘟病毒疫苗和诊断

本发明涉及核酸顺序、含有该核酸顺序的重组核酸分子，含有这样一个重组核酸分子的重组表达系统、猪瘟病毒特有的多肽、含有这样一种多肽或重组表达系统的疫苗以及制备这种疫苗的方法。

在世界上许多国家，猪瘟(HC)一直是有着经济上重要性的猪疾病。在自然条件下，猪是已知的易感HC的仅有动物。猪瘟是有高度传染性的疾病，其可引起毛细血管壁的退化，导致内脏出血和坏死。发病初期，猪瘟的特征是发烧、厌食、呕吐和腹泻，进而出现以母猪不育、流产和仔猪发育不良为特征的慢性疾病过程。但几乎所有的猪均在早期出现症状后2周内死亡。

已证明猪瘟的病原体猪瘟病毒(HCV)在结构和血清学上与牛的病毒性腹泻病毒(BVDV)及羊的边地病病毒(BDV)有关。这些病毒属于披膜病毒科内的瘟病毒属。很早就知道瘟病毒的遗传物质是RNA，即缺乏重要聚腺苷酸化的正股RNA。HCV可能包含3-5种结构蛋白质，其中两种可能是糖基化的。尚不知道非结构病毒蛋白质的数目。

已经制成并且使用了对抗HC感染的修饰的HCV疫苗(包括减毒或杀死的病毒)。然而，因为在所说的修饰的病毒疫苗中，使用的是感染组织培养细胞所得到的HCV材料，故病毒产率很低而且病毒颗粒难于纯化。使用修饰的活病毒疫苗时，因使用了部分减毒的病原性HCV接种动物，故可因病毒仍有致病力而引起被接种动物或其子代患病，并可能在疫苗中污染其他病毒。另外，减毒的病毒还可能逆转成为强毒力状态的病毒。

使用失活的疫苗还有其他一些缺点，如存在因病毒部分地失活所造成的危险、只能达到低免疫水平而须追加免疫的问题、以及因失活处理改变了抗原决定基而造成失活病毒之免疫原性差的问题。

此外，使用修饰的HCV疫苗不适于根除治疗。

据我们所知，迄今为止还没有一种鉴别猪的HCV和BVDV感染的诊断试验。建立这一试验方法是很重要的，因为猪的BVDV感染没有HCV感染后果严重或受人重视，即意味着BVDV感染的猪还没有被消除。

含有必要和相关HCV免疫原性物质的疫苗，应能在不表现出上述修饰疫苗之缺点的情况下引发抗病原体的免疫反应。

根据本发明，现已找到了编码猪瘟病毒所特有之多肽的核酸顺序。所说核酸顺序或所说的多肽的片段也属于本发明范围之内。可使用该核酸顺序和多肽或其片段制备用于对抗HCV感染的、只含有必需和相关免疫原性物质的动物疫苗。“核酸顺序”是指核糖核酸顺序和脱氧核糖核酸顺序。

图2中显示了本发明的核酸顺序。如众所周知，鉴于遗传密码的简并性，可以在仍不改变被编码的氨基酸的情况下产生密码子中碱基的取代，如编码谷氨酸的密码子可以是GAT或GAA。因此，显然可以使用与图2中所示核酸顺序不同的核酸顺序(即具有可替代的密码子组成)来表达具有图2所示之氨基酸顺序的多肽。

包括于本发明范围内的还有在严格条件下与图2所示核酸顺序杂交的核酸顺序。这些核酸顺序与图2中所示者有关，但可能包括核苷酸取代、突变、插入、缺失等。并且可编码图2所示之多肽的功能上的等同物，即编码的相关多肽的氨基酸顺序与图2所示的氨基酸顺序不完全相同，但表现有HCV特有的相应免疫学性质。

本发明还包括由这些相关核酸顺序编码的多肽。

图2中所示的核酸顺序是由HCV的基因组RNA得到的CDNA顺序。该连续顺序长度为12284个核苷酸，其含有一个由364-366位ATG密码子开始，并终止在12058-12060位转译终止密码子TGA的长开放读码(ORF)。该ORF是由能编码435KD蛋白质的3898个密码子组成的。

在体内，HCV在被感染的细胞中复制期间，该蛋白质是作为多聚蛋白质前体分子合成的，继后经酶促裂解该前体分子而加工成片段多肽。经过可能的转译后修饰，这些片段形成病毒的结构或非结构蛋白质。优选的核酸顺序含有这种抗HCV免疫特性或HCV特有之免疫学性质的片段的遗传信息，或含有仍可表现抗HCV免疫特性或HCV特有之免疫学性质的该片段的一部分的遗传信息。

依据图2之多肽的片段多肽和其部分——其可用于免疫动物对抗HC或用于诊断HC——也构成本发明的一个部分。片段编码区位于氨基酸位序约1-249、263-487、488-688或689-1067之间。1-249区域基本上代表核心蛋白，而263-487、488-688和689-1067区域则基本上分别代表33KD、44/48KD和55KD糖蛋白。本发明还包括含有上述一个或多个编码区或其部分的遗传信息的核酸顺序。

掺入抗HCV感染之疫苗中的优选区域是相当于HCV之55KD蛋白质或其仍具有免疫活性之部分的区域。

此外，本发明可优先选用至少包括上述55KD蛋白质或其部分之编码顺序的核酸顺序。

再者，可使用具有病毒中和活性的抗55KD蛋白的单克隆抗体来分析HCV缺失突变体，以检测可用于免疫猪以对抗HCV感染的HCV55KD蛋白之优选部分。该部分包含约跨越氨基酸顺序812-859的抗原决定基，并且是由核苷酸顺序2799-2938编码的。至少包含所说氨基酸顺序的多肽或至少包含所说核苷酸顺序的核酸顺序也构成本发明的一部分内容。

可用于诊断猪的HCV感染并用于鉴别HCV和BVDV的本发明的核酸顺序可由编码55KD蛋白质的基因得到。

最好由核苷酸顺序2587-2619成2842-2880得到该核酸顺序，上述两顺序都是编码55KD蛋白质之基因的一部分。用于诊断目的的优选寡核苷酸是5′-CCT ACT AAC CAC GTT AAG TGC TGT GAC TTTAAA-3′或5′-TTC TGT TCT CAA GGT TGT GGG GCT CAC TGCTGT GCA CTC-3′

至少包含该寡核苷酸之亚顺序且仍可用于区分HCV和BVDV的核酸顺序也属于本发明的范围。

本发明还涉及用于检测试验的试验药盒，该试验药盒包含本发明的核酸顺序。

试验药盒最好包含上述寡核苷酸或至少含有其亚顺序的核酸顺序。

在仍保留同样免疫学性质的情况下，图2所示的多肽或其片段可以发生变异或修饰，如不同毒株或其他衍生物之间的自然变异。可根据整个顺序中氨基酸差异或所说多肽中氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或加入来证明这些变异。

此外，在使用DNA重组技术制备图2所示多肽或其片段的不同衍生物时，还可能因所得的单个或多个氨基酸取代、缺失、加入或置换(如借助基础DNA的位点特异性诱变)而发生不同的修饰。所有这些经修饰的图2所示多肽或其片段的衍生物，只要所说多肽或其片段的必需特有活性保持不变，也都包括在本发明的范围内。

从沉淀之病毒颗粒中分离RNA并用于合成CDNA。在噬菌体λgt11中克隆该CDNA，扩增个别CDNA库并用羊抗HCV抗血清筛选之。可鉴定出两个阳性克隆并证明具有两个大小为0.8Kb和1.8Kb的插入段。测定了0.8Kbλgt11插入段的部分顺序(见图3)并确定其位于HCV基因组上的约1.2和2.0Kb之间(见图2)。

根据本发明，可用于诊断动物的HCV感染并可用于鉴别HCV与BVDV的核酸顺序是由图2所示的核苷酸顺序5551-5793代表的。

至少包含所说核苷酸顺序的亚顺序，并仍可用于区分HCV和BVDV的核酸顺序也构成本发明的一个部分。

本发明还涉及用于检测分析的试验药盒，该试验药盒包含根据本发明的核酸顺序。

该试验药盒最好包含由图2所示的核苷酸顺序5551-5793所代表的核酸顺序，或至少包含上述其亚顺序的核酸顺序。

从病毒粒子沉淀物中分离RNA并用于合成CDNA。在噬菌体λgt11中克隆该CDNA，扩增个别CDNA库并用羊抗HCV抗血清筛选之。可鉴别出两个阳性克隆并证明其具有大小为0.8Kb和1.8Kb的插入段。测定0.8Kbλgt11插入段的部分核苷酸顺序(见图3)并确定其位于HCV基因组的约1.2和2.0Kb之间(见图2)。

可将本发明的核酸顺序连接到各种载体核酸分子如质粒DNA、噬菌体DNA或病毒DNA上，以形成重组核酸分子。该载体核酸分子最好含有启动、控制和终止转录与转译过程的DNA顺序。可使用携带于含有这种重组核酸分子之宿主内的重组表达系统，以使本发明的核酸顺序得以表达由该核酸顺序编码的多肽。上述重组表达系统的宿主可以是原核细胞，如大肠杆菌、枯草芽胞杆菌和假单胞菌等细菌，病毒如牛痘病毒和鸟痘病毒，或真核细胞如酵母或高等真核细胞如昆虫、植物或动物细胞。

可给动物使用本发明的多肽，作为所谓“亚单位”疫苗使动物获得抗HC免疫力。本发明的亚单位疫苗含有基本上纯的多肽，且还可含有医药上可接受的载体。

为了提高免疫原性，最好将小片段连接到载体分子上。适用的载体有大分子物质如天然聚合物(蛋白质，如锁孔血蓝蛋白、白蛋白、毒素)、合成的聚合物如多聚氨基酸(多聚丝氨酸、多聚丙氨酸)，或两性化合物胶束如皂角苷。另外也可以其聚合物且最好是线性聚合物的形式提供这些片段。可按本领域中已知的方法制备用于这种亚单位疫苗中的多肽，如由猪瘟病毒中分离所说的多肽，或用DNA重组技术或化学合成方法制备。

必要时可在体内或体外，通过糖基化、酰胺化、羧化或磷酸化等方式修饰用于疫苗中的根据本发明的多肽。

可替代亚单位疫苗的是所谓“载体”疫苗。可用重组技术将根据本发明的核酸顺序整合到其他微生物(如病毒或细菌)的遗传材料中以使该微生物能够表达本发明的多肽。当将这种重组表达系统用于被免疫的动物之后，它即可在被接种动物体内复制，并表达能刺激该动物之免疫系统的多肽。疫苗载体的适当例子有痘病毒(如牛痘、兔痘病毒)、禽痘病毒(如鸡痘病毒)、假狂犬病病毒、腺病毒、流感病毒、噬菌体或细菌(如大肠杆菌和沙门氏菌)。

在其核酸顺序中插入了依据本发明之核酸顺序的重组表达系统可以在细胞培养物中生长，需要时可以由被感染的细胞中收获之并制成冻干形式的疫苗。也可由用所说的微生物感染的活的动物体内收获上述经过遗传操作的微生物。还可在表达本发明之多肽的细胞培养物中增殖上述重组表达系统，然后由该培养物中分离出所需多肽。

可按本领域中已知的方法制备含有本发明之多肽或重组表达系统的疫苗。本发明的疫苗可由上述的整个宿主、宿主提取物、部分或完全纯化的多肽，或者部分或完全纯化的重组表达系统组成。

可按常规主动免疫程序使用本发明的疫苗：即以与剂量配方相适的方式或以治疗及预防上有效的量，一次或多次应用该疫苗。疫苗的给予途径包括皮内、皮下、肌肉内、静脉内或鼻内等、为进行胃肠道外给药，疫苗可另外含有水，盐水或缓冲溶液等适当载体，并可以加入或不加佐剂、稳定剂、增溶剂、乳化剂等。

疫苗可另外含有与其他疾病有关的免疫原或编码这些免疫原(如细小病毒、假狂犬病病毒、猪流感病毒、TGE病毒、轮状病毒、大肠杆菌、博德特氏杆菌、巴斯德氏菌、丹毒等的抗原)的核酸顺序，以产生多价疫苗。

本发明的多肽也可用于诊断方法中，以检测动物体内HCV抗原或抗体的存在。此外，可用依据本发明的核酸顺序生产用于上述诊断方法中的多肽，或用作检测样品中HCV核酸存在的杂交探针。

实施例1

CDNA克隆的免疫学鉴定

细胞的感染和病毒的收获：使pk15和38A₁ D细胞生长于加有10％FCS的DMEM中(体积为20-30ml，细胞浓度为5×10⁷/ml)，并用强毒力HCV病毒株Alfort，于37℃感染90分钟(用免疫荧光法测定m.o.i为0.01至0.001)然后将PK15细胞接种在组织培养皿(直径150mm)上，同时使悬浮细胞38A₁ D在瓶内于轻轻搅拌(TecnomaraSwitzerland)下保温。为完成CDNA合成，感染后48小时收获组织培养物上清液，以12,000g离心澄清，并在TFA20转子(Contron，Italy)中以54,000g离心12小时得到病毒沉淀物。

羊抗HCV血清的制备：用标准细胞培养技术，由年轻羊的皮肤活组织检查中建立一株成纤维细胞。细胞最初生长在含10％FCS的F-10培养基中，然后培养在含10％FCS的DMEM中。用HCV感染羊成纤维细胞。在腹腔注射后的最初26小时内，每8小时用PBS将细胞洗3次，然后在含有10％预免疫羊血清(PGS)的DMEM中保温。预免疫48小时，收获培养物上清并用作储备病毒。免疫前，对30个组织培养皿(150mm直径)中的羊细胞在加有10％PGS的培养基中进行3次传代，然后用储备病毒感染。预免疫48小时后，用X射线灭活的病毒沉淀物和被感染的细胞免疫羊。两者均在弗氏佐剂中乳化(基础免疫用完全佐剂，加强免疫用不完全佐剂)。然后作皮下注射。为了得到识别变性分子的抗体，注射前将抗原制剂在0.2％SDS、3mMDTT中于95℃保温5分钟。

RNA制备、CDNA合成和克隆：使用Chirgwin等人(1979)所述的硫氰酸胍方法由病毒粒子中分离RNA。将由离心沉淀的病毒粒子分离的RNA(5μg总RNA，约0.5μgHCV RNA)和0.1μg随机六核苷酸引物(Pharmacia，Sweden)在20μl水中于65℃加热10分钟，在冰上冷却，并调整到终体积达32μl的第一股链缓冲液(每毫升含50mMTris-HCl，PH8.3；30mM KCl；8mM MgCl₂1mM DTT、各1mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP及500单位RNAguard「Pharmacia，Sweden」)加入35单位AMV逆转录酶(Life Sciences Inc，uSA)。43℃保温1小时后，将该反应混合物加到含第二股链合成混合物(CDNA合成试剂盒，Pharmacia，Sweden)的小瓶内。第二股链合成，平头制备及EcoRI接头连接及磷酸化均按制造商推荐的方法完成。

用制备琼脂糖凝胶电泳法按大小分离CDNA。弃去凝胶中含小于0.5Kb之DNA分子的部分。倒置凝胶并电泳15分钟以浓缩余留的DNA，冷冻并用苯酚解冻3次后，由琼脂糖中提取之

在总体积为10μl的连接酶缓冲液(30mMTris-HCl PH7.4；10mMMgCl₂；10mMDTT；1mMATP)中用3单位T4DNA连接酶(Pharmacia，Sweden)连接乙醇共沉淀的CDNA和λgt11DNA(1μgECORI消化并去磷酸化的臂，Promega，USA)。按制造商推荐的方法用商品提取物(Packagene，Pramega，USA)体外包装，并用所得噬菌体感染大肠杆菌K12细胞(菌株Y1090)。按已述方法(Daviset al，1986)将文库扩增一次。

λgt11文库的筛选：按已述方法(Young andDavia，1983)使用购自Promega，USA(Huynhet al，1985)的Protoblot系统和10^-3血清稀释液进行筛选。为减少本底影响，用浓度为0.8mg/ml的大肠杆菌溶菌产物(菌株Y1090)处理羊抗ECV血清(Huynh etal.，1985)。分别鉴定出两个有0.8Kb和1.8Kb插入段的阳性克隆。

切口转译和Northern杂交：以切口转译法(切口转译试剂盒，Amersham Buchler，FRG)用「α³²P」dCTP(3000Ci/mM，Amersham Buchler，FRG)标记50ng0.8KbHCV核酸顺序，然后于68℃下以每毫升杂交混合物(每毫升含5×SSC：1×Denhardt′S：20mM磷酸钠PH6.8；0.1％SDS和100μg酵母tRNA「Boehringer-Mannheim，FRG」)5ng的浓度经12至14小时杂交到Northern滤膜上。然后按已述方法洗滤膜(Keil et al.，1984)并于-70℃下使用AgfaCurix MR800增光屏与Kodak X-Omat AR胶片接触不同时间。

0.8Kb核酸顺序不仅与完整的HCV RNA杂交，而且与其降解产物杂交。0.8Kb核酸顺序并不与1.8Kb核酸顺序杂交，此表明这两个核酸顺序相当于不位于基因组RNA之同一区域中的HCV基因组片段。

核苷酸顺序分析：按标准方法(Maniatis et al.，1982)将HCV特异性噬菌体DNA插入段再克隆到质粒PEMBL₁₈+中。按已述方法(Dente et al.，1985)制备重组PEMBL质粒的单股DNA。按制造商(Pharmacia，Sweden)推荐的方法进行双脱氧顺序测定反应(Sanger etal.，1977)。

实施例2

HCV基因组的分子克隆和核苷酸顺序

RNA制备，CDNA合成和克隆：RNA制备、CDNA合成、大小选择和共沉淀CDNA与λgt10 DNA的连接(1μg ECORI消化的去磷酸化的臂，Promega，USA)均按上述方法进行。使用Packagene(Promega，USA)体外包装噬菌体DNA并按制造商提供的方法在大肠杆菌菌株C600HFL上滴定噬菌体。将该DNA库扩增一次(Davis etal.，1986)，并使转移到硝酸纤维素膜(Amersham Buchler，FRG)上的复制物(Benton and Davis，1977)与上述用于Northern杂交的寡核苷酸杂交。按Benton和Davis(1977)所述方法用通过切口转译(切口转译试剂盒，Amersham Buchler，FRG)以「α³²P」dCTP标记的CDNA片段进行筛选。噬班纯化阳性克隆并将插入段再克隆到PEMBL质粒中(Maniatis et al.，1982；Dente et al.，1985；Davis et al.，1986)。

使用与编码氨基酸顺序Cys Gly Asp Asp Gly phe之RNA顺序互补的17碱基³²P5′端标记的寡核苷酸筛选λgt10CDNA库。该与HCV的约12Kb基因组RNA杂交的寡核苷酸，除鉴别一个有0.75Kb插入段的克隆外，还可与HCV RNA杂交。将这个代表HCV基因组的片段的0.75Kb核酸顺序连同0.8Kbλgt11核酸顺序插入段进一步用于DNA库筛选，得到一组其相对位置和限制性位点图如图1所示的交迭HCV核酸顺序。HCV基因组的这些核酸顺序片段位于下列核酸位置之间：

4.0Kb片段：27-4027

4.5Kb片段：54-4494

0.8Kb片段：1140-2002

4.2Kb片段：3246-7252

5.5Kb片段：6656-11819且存在于大约如下示的核酸位置内：

3.0Kb片段：8920-11920

1.9Kb片段：10384-12284

0.75Kb片段：10913-11663

核苷酸顺序分析：为完成核苷酸顺序测定，使用核酸外切酶III和核酸酶S1(Boehringer Mannheim，FRG)建立得自已再克隆到PEMBL18+或19+质粒中之CDNA插入段之HCV的缺失库(Hennikoff，1987)。使用T7聚合酶顺序分析试剂盒(Pharmacia，Sweden)对单股(Dente etal.，1985)或双股DNA模板进行双脱氧DNA顺序分析(Sanger et al.，1977)。

来自CDNA片段的长度为12284核苷酸的连续顺序如图2中所示。该顺序含有一个由364-366位的ATG密码子开始，并终止在12058-12060位之TGA密码子(作为转译终止密码子)的长的开放读码(ORF)。该ORF由能编码有图2所示氨基酸顺序的435KD蛋白质的3898个密码子组成。由于病毒群体的可能的异源性，而出现若干核苷酸顺序的差异，故测得存在3处核苷酸互换，其中有两个导致了推测的氨基酸顺序的改变(图2)。

综上可见，已按上述方法克隆了几乎全部HCV基因组并测定了它们的顺序。

部分地测定了编码可用抗HCV血清鉴定之免疫原性HCV多肽的0.8Kbλgt11核酸顺序(见图3)，结果表明该顺序位于HCV RNA上1.2和2.0Kb之间。

实施例3

HCV之融合蛋白质的分子克隆和表达

在PEX系统(Strebel，K.et al.，1986)中作为融合蛋白质表达得自HCV基因组的两个区域，即编码氨基酸262-546(见图2)之实施例1的0.8Kbλgt11插入段和编码氨基酸747-1071(见图2)之核酸顺序的CDNA片段。

用SDS-PAGE方法分离细菌提取物并按标准方法染色，然后试验其在Western印迹分析中与羊抗HCV血清(实施例1)的反应活性。

经SDS-PAGE法部分纯化HCV特异性融合蛋白质，然后转移到硝酸纤维素膜上并与羊抗HCV血清一起保温。洗脱后得到抗所说融合蛋白质的特异性抗体。

对上述融合蛋白质特异的抗体被用于放射免疫沉淀分析中。

结果

与羊抗HCV血清反应后，明确证明在PEX系统中表达的两种融合蛋白质均是对HCV特异的。

抗两种融合蛋白质的单一特异性抗血清可沉淀HCV糖蛋白。

对262-546融合蛋白质特异的抗体沉淀病毒感染之细胞的44/48KD和33KD蛋白质，对747-1071融合蛋白质特异的抗体则沉淀病毒感染之细胞的55KD蛋白质。

实施例4

结构蛋白质的分子克隆和其通过牛痘病毒的表达

制备图1所示的在HinfI限制性位点(核苷酸372)处开始并在人工EcoRI位点(核苷酸4000)处终止的4.0Kb克隆的片段(PHCK11)(Maniatis et al.，1982)。为连接5′端而合成一寡核苷酸接头，其含有一个与BamHI相适应的突出部分、作为转译起始密码子的起始信号ATG(364-366)及一个在3′端可与HinfI相配合的突出末端。

5′GATCCACCATGGAGTT HinfI

BamHI GTGGTACCTCAACTTA 5′

在构建物的3′末端，通过用绿豆核酸酶删除EcoRI突出末端而引入转译终止密码子并连接到平端StuI/EcoRI接头残留部分中：

5′GCCTGAATTC 3′EcoRI

CGGACTTAAG(Maniatis et al.，1982)。

将上述HCV顺序插入牛痘病毒之前，将该异源基因克隆到重组载体内。为此而使用在4.9Kb胸苷激酶顺序内P7.5K启动子下游含有克隆位点的PGS62质粒(Cranage，M.P.etal.，1986)。克隆位点包括三个独特的限制性酶切点，即BamHI、SmaI和EcoRI。将所述的HCV顺序(372-4000)连同接头一起连接到BamHI/EcoRI消化的PGS62中即构成重组载体PGS62-3.8。

基于该质粒得到一组15个缺失突变体。经用核酸外切酶III处理(Hennikof et al.，1987)，结果由3′端缩短了HCVCDNA。除去约100bp后，所有缺失位于编码HCV55KD蛋白的区域内；在终止于核苷酸2589的突变体15中丢失了55KD蛋白的大部分。将E_XOIII剪短的CDNA克隆连接到PGS62中，得到PGS62-3.8E_XO1-15(图4)。

用牛痘病毒(Copenhagen病毒株，TS7突变体)感染CVI细胞(MOI为0.1)。感染3小时后，用Ca₃(PO₄)₃沉淀法转染PGS62-3.8DNA及牛痘WR DNA并保温2天。收获病毒子代并在溴-脱氧尿苷(100μg/ml)存在下根据143tk细胞上的tk表型选择之，至少进行两次选择，然后再作两次噬班纯化。

牛痘-HCV重组体的鉴定

于MOI为2-10时用牛痘-HCV重组体感染CVI细胞并保温8-16小时。固定细胞后，使用对HCV55KD蛋白特异的单克隆抗体或多价抗HCV抗血清进行间接免疫荧光分析。所有情况下均可证实胞浆荧光的存在。

对牛痘病毒重组体感染的细胞进行放射免疫沉淀和Wegtern印迹分析后，检测四种HCV特异性蛋白质。经用「³H」葡糖胺标记，显示其中三种蛋白质是已糖基化的。这些蛋白质的表观分子量与用HCV特异性血清检测到的HCV感染之细胞的蛋白质表观分子量相同，即分别为20KD(核心)、44/48KD、33KD和55KD。

因为通过牛痘病毒经表达而产生的HCV蛋白与HCV感染之细胞中的蛋白质有相同的表观分子量，所以其蛋白水解加工和修饰作用显然是可靠的。

在小鼠体内诱导抗HCV中和抗体

用下列纯化的病毒经腹腔内注射一次感染四组小鼠(每组3只)：

a.牛痘WR野生型(每只5×10⁶Pfu)WR

b.牛痘3.8重组体(每只5×10⁷Pfu)VAC3.8

c.牛痘3.8E_XO4

(55KD缺失的)(每只5×10⁷Pfu)VAC3.8E_XO4

d.牛痘3.8E_XO5(每只5×10⁷Pfu)VAC3.8E_XO5

e.牛痘3.8E_XO15

(55KD缺失的)(每只5×10⁷Pfu)VAC3.8E_XO15

3周后放血。经系列稀释后，在使用HCV(Alfort)的病毒中和检测法中检测血清对PK「15」细胞的反应活性(RümenapfT.et al.，1989)。

中和效价

a.WR ＜1∶2

b.VAC3.8 1∶96

c.VAC3.8E_XO4 1∶96

d.VAC3.8E_XO5 ＜1∶2

e.VAC3.8E_XO15 ＜1∶2

由以上结果可以看出，含有编码所有结构蛋白质的遗传信号之核酸顺序的牛痘病毒(VAC3.8)能够诱导小鼠产生病毒中和抗体，而不完整的构建体VAC3.8E_XO5-15和WR则不能。

因为所有缺失都位于编码IICV55KD蛋白的区域内(大部分55KD蛋白在终止于核苷酸2589处的突变体15中丢失)，并且其他结构蛋白仍可由重组牛痘病毒表达，所以HCV中和抗体显然是由55KD蛋白诱导产生的。

实施例5

用VAC3.8免疫猪

用野生型牛痘病毒(WR病毒株)感染三头小猪(重约20Kg)中的一只(28号)，并用重组VAC3.8感染另外两头(26和27号)(分别为腹腔注射、静脉注射和皮内注射)。每个动物感染相当于1×10⁸Pfu的牛痘病毒。

牛痘感染过程中的临床征象为在划痕侧出现红斑并在感染后6天发烧(41℃)。

抗牛痘和猪瘟病毒的效价

感染后三天检测抗牛痘(WR对CVI细胞)和抗HCV(Alfort对PK15细胞)血清的反应活性。

血清经系列稀释后，通过检查完全没有CPe(牛痘)或在免疫荧光试验中的特异信号(HCV)来测定各自的中和效价(Rumenapf，T.et al.，1989)。

抗牛痘病毒的中和效价：

28号猪(WR) 1∶8

26号猪(VAC3.8) 1∶16

27号猪(VAC3.8)1∶16

抗HCV的中和效价：

28号猪(WR) ＜1∶2

26号猪(VAC3.8) 1∶32

27号猪(VAC3.8) 1∶16

用HCV攻击

用牛痘病毒免疫后四周，每头猪各用5×10⁷TCID50HCV Alfort攻击。按照自然感染途径，经口鼻给予病毒。使用病毒量差不多为猪的强制致死量。

攻击后第5天，28号猪出现发烧(41.5℃)并持续到第12天。在表现有急性猪霍乱的典型临床征象时杀死该垂死的动物。

用VAC3.8免疫的两头猪(26和27号)，在用HCV攻击的14天后仍未显示任何病征。

实施例6

55KD蛋白表达载体的构建

按标准技术用限制性酶SacI和HpaI消化克隆PHCK11。

分离所得到的位于核苷酸2672(AGCTC)和3971(GTT)之间(其包含大部分HCV55KD蛋白的编码顺序)的1.3Kb片段，并克隆到假狂犬病病毒(PRV)gX基因中(Maniatis et al.，1982)。

简单地说，用SalI和ApaI消化已克隆的gX顺序。用Klenow片段将ApaI5′突出末端填补成平头。连接后假定的gX先导肽编码顺序正好位于被插入之HCV55KD顺序的上游。

经用BglII消化(BglII酶切点，3936-3941)后在转译终止密码子下游导入HCV顺序，并在用Klenow片段填补突出端后重新连接。该构建体位于PRV gX启动子的下游(克隆16/4-1.3)。用DEAE葡聚糖法(Maniatis et al.，1989)将克隆16/4-1.3转染到MDBK细胞中。16小时后用PRV(m.o.i＝1)感染细胞。感染后4小时用冷(-20℃)甲醇/丙酮的混合物固定细胞。用抗HCV55KD蛋白单克隆抗体(MAb)所作的间接免疫荧光分析表明，有5-10％的细胞中显示特异性信号。PRV感染的细胞没有转染，而且在该项检测中只有用克隆16/4-1.3转染的细胞没有显示任何信号。

附图说明

图1显示不同的HCV衍生之CDNA克隆的物理图及它们相对于RNA基因组的位置(上面一行)。第二行显示了用抗体探针(0.8Kb克隆)或筒并的寡核苷酸探针(0.75Kb克隆)筛选后分离的两个HCV衍生的CDNA克隆。下面示出的是根据核苷酸顺序分析结果选出的CDNA片段。所有数字均代表DNA片段的大小(Kb数)。限制性切点：B＝Bgl П∶E＝EcoRI∶H＝Hind III∶K＝KpnI∶S＝SalI∶Sm＝SmaI。

图2显示HCV的核酸顺序及长开放读码的推断的氨基酸顺序。指出了不同CDNA克隆间的核苷酸互换及所导致的相应氨基酸顺序的改变。下划横线的部分顺序相当于用于筛选的寡核苷酸。

图3显示由λgt11克隆之0.8KbHCV插入段的一部分衍生的CDNA顺序及由之推断的氨基酸顺序(以一字母代号表示)。

图4显示克隆到PGS62载体中之HCV DNA长度。经用核酸外切酶III处理建立衍一组衍生于CDNA克隆PHCK11的15个缺失突变体，并克隆到PGS62载体中产生PGS62-3.8E_XO1-15。其中标出了3′端核苷酸序号。

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Claims

1.一种制备猪瘟病毒疫苗的方法，该方法包括将具有图2所示氨基酸序列689-1067的多肽，或具有图2所示氨基酸序列263-487的多肽，或含有编码任一种所述多肽的核酸序列的重组病毒，与药物上可接受的载体组合的步骤。