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CN105301240A - 一种鸭细小病毒间接elisa检测试剂盒 - Google Patents

一种鸭细小病毒间接elisa检测试剂盒 Download PDF

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CN105301240A
CN105301240A CN201510603584.6A CN201510603584A CN105301240A CN 105301240 A CN105301240 A CN 105301240A CN 201510603584 A CN201510603584 A CN 201510603584A CN 105301240 A CN105301240 A CN 105301240A
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China
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duck
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duck parvovirus
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parvovirus
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CN201510603584.6A
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刁有祥
陈浩
窦砚国
冯强
郑肖强
牛晓宇
杨晶
于相龙
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Shandong Agricultural University
Original Assignee
Shandong Agricultural University
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G—PHYSICS
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Abstract

本发明涉及兽医病原抗体检测技术领域，具体涉及一种鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，发明人首先提供了一种鸭细小病毒的VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQ？ID？No.1所示，表达该蛋白的核苷酸序列，如SEQ？ID？No.2所示。研究表明，该蛋白具有良好的免疫反应原性，可以用于DPV抗体的检测，进而利用该蛋白提供了鸭细小病毒抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒具有快速、稳定、特异性高、灵敏度强，能够快速检测血清中鸭细小病毒的抗体水平，为该病的预防和控制具有明显的推动作用。

Description

一种鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明涉及兽医病原抗体检测技术领域，提供了一种鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒。
背景技术
鸭细小病毒是细小病毒的一种，主要侵害1～3周龄的雏鸭，临床以腹泻、呼吸困难和脚软为主要症状，一年四季均有发生，给鸭饲养带来极大的经济损失，是鸭饲养中主要的疾病之一，发病率和死亡率也较高。
2015年3月以来，我国山东、江苏和安徽等地肉鸭群出现了一种疾病，经验证为鸭细小病毒，该病以鸭喙发育不良，舌头外伸为特征，本病主要发生在14日龄以上的商品鸭，鸭群发病率为10％-20％，最高可达50％，大群感染率最高可达100％，但该病不造成患鸭死亡。患鸭发育迟缓，体温略升高，喙短，弹性降低，舌肿胀，外伸，感染后期患鸭胫骨和翅骨易发生骨折。该病主要导致鸭群料肉比上升，养殖成本升高，鸭出栏合格率降低。对肉鸭养殖业造成巨大的经济损失。
细小病毒属(Parvovirus)是一种核酸为单股线状的DNA病毒，病毒结构多肽有3种，分别为VP1、VP2、VP3，其中VP3为主要的结构多肽。该病毒不能凝集鸡红细胞，是构成细小病毒外部的主要蛋白，含有能保护机体抵抗DPV感染的中和性抗原表位，利用含有中和抗原表位的重组病毒蛋白建立ELISA检测试剂盒对于该病的诊断具有重要的意义。
发明内容
针对上述情况，本发明的发明人提供了一种鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，发明人首先提供了一种鸭细小病毒的VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，表达该蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNo.2所示。研究表明，该蛋白具有良好的免疫反应原性，可以用于DPV抗体的检测，进而利用该蛋白提供了鸭细小病毒抗体ELISA检测试剂盒，该试剂盒具有快速、稳定、特异性高、灵敏度强，能够快速检测血清中鸭细小病毒的抗体水平，为该病的预防和控制具有明显的推动作用。
发明人首先提供了一种鸭细小病毒的VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，表达该蛋白的核苷酸序列，如SEQIDNo.2所示。研究表明，该蛋白具有良好的免疫反应原性，可以用于DPV抗体的检测。
在此基础上，发明人获得了鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括：鸭细小病毒VP3重组蛋白包被的ELISA板，酶标二抗，阳性对照，阴性对照，洗涤液，样品稀释液，显色液和终止液；
其中酶标二抗为辣根过氧化物标记羊抗鸭单克隆抗体，所述阳性对照为自然感染鸭细小病毒GT2015株鸭血清；所述阴性对照为正常鸭血清，所述重组VP3蛋白包被量为150ng/well。
所述的包被液，洗涤液，封闭液，样品稀释液，显色液和终止液的组分及配比如下：
包被液：1×碳酸盐缓冲液：Na2CO30.2756g，NaHCO30.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.5-9.7，4℃保存；
PBS溶液：NaCl4.25g，NaH2PO4·2H2O0.178g，Na2HPO4·12H2O1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500mL，pH值7.1-7.3；
洗涤液：每1LPBS加入Tween-200.5mL，充分混匀；
封闭液，稀释液：将5gdrymilk溶解于100mLPBST稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃；
酶标二抗：Peroxidase-LabeledAntibodyToDuckIgG(H+L),ProducedinGoat；
TMB显色液:可溶型单组分TMB底物溶液；
终止液为3mol/L硫酸溶液。
其中所述的作为酶标板包被抗原的鸭细小病毒VP3蛋白的重组蛋白制备，包括以下步骤：利用苯酚-氯仿法抽提病鸭组织中的病毒DNA，用PCR技术进行检测，将PCR扩增片段(SEQIDNo.2)进行胶回收纯化，用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后转入PET-28a(+)载体，转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞中，经菌液PCR鉴定为阳性克隆子，震荡培养16小时提取质粒测序。将阳性质粒转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，鉴定为阳性的进行IPTG诱导表达，用尿素法进行洗涤纯化，然后分别用SDS-PAGE和Westernblot验证蛋白(SEQIDNo.1)纯化结果和免疫原性结果。结果显示目的条带为本发明诱导表达的鸭细小病毒VP3蛋白。
发明人进一步提供了上述鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒的使用方法，具体如下：
1、ELISA检测程序
(1)以150ng/well重组鸭细小病毒VP3蛋白包被ELISA反应板，4℃过夜孵育，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(2)以5g/100mL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37℃，封闭1h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(3)将待检血清用5g/100mL脱脂奶粉溶液做1:10倍w/v稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1.5h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(4)将羊抗鸭IgG-HRP按100μL/well加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(5)将100μL底物显色液加入ELISA反应板，避光37℃显色15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪450nm波长下读取OD值。
2、间接ELISA方法判定标准的确定
用酶标仪读取酶标板的OD450nm值，计算出阴性血清平均值(`X)+标准差(SD)，得到阴阳性临界值为0.239，结果判定标准为X≥0.25,可判断为阳性，即待检样品中含有鸭细小病毒抗体，否则为阴性。
综上所述，本发明提供的鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒及其使用方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度强，能够快速检测血清中鸭细小病毒的抗体水平，为该病的预防和控制具有明显的推动作用。
保藏信息
保藏时间：2015年8月28日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心CCTCC
保藏编号：CCTCCNO：V201527
保藏单位地址：中国武汉大学
分类命名:鸭细小病毒GT2015
附图说明
图1为鸭细小病毒VP3蛋白的重组蛋白SDS-PAGE电泳图，
图中M为BlueIIProteinMarker，1为未诱导表达重组蛋白，2为4h诱导表达重组蛋白，3为纯化后重组蛋白，
从图中可以显现出未诱导蛋白1没有目的蛋白，只有部分大肠杆菌蛋白；诱导未纯化蛋白2有目的蛋白，但同时也有很多大肠杆菌自身的蛋白；而纯化的重组蛋白3只有目的蛋白没有其他杂蛋白。
具体实施方式
实施例1纯化重组鸭细小病毒VP3蛋白的获得
A、病毒DNA的提取：取部分患鸭肝脏匀浆悬液消化后，采用酚氯仿法进行总DNA的提取，最后用50μLddH2O溶解，置于-20℃保存；
B、引物的设计与合成：根据已发表的鸭细小病毒全基因组序列，结合我们对多株鸭细小病毒分离株VP3测序结果，利用PrimerPremier5.0设计1对引物并加上限制性内切酶BamHI和HindIII酶切位点，F1:5’-CGGATCCAAGGAAGTCACAACGCAGGAT-3’其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示,R1:5’-CAAGCTTGCCATCAGTCTTCGGTATT-3’其核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；
C、PCR扩增：PCR反应体系为：2×EsTaqMasterMix10μL，上、下游引物F1/R1(20μmol/L)各1μL，1μL病毒DNA模板，加ddH2O至总体积为20μL。
PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min；
D、阳性质粒标准品的制备：将PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，在921bp处切下目的条带，用胶回收试剂盒进行目的DNA的纯化；纯化产物连接到pMD18-T载体，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性克隆子，37℃震荡培养18h，送上海生工生物工程有限公司测序。采用质粒小量提取试剂盒提取测序正确的克隆子质粒，最后用50μL洗涤液洗脱；
E、重组质粒的诱导表达及纯化：将提取的质粒转入BL21大肠杆菌感受态细胞鉴定为阳性的进行IPTG诱导表达，用尿素法进行洗涤纯化；
F、SDS-PAGE蛋白质电泳：将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，验证是否为表达的重组蛋白，结果显示表达的重组蛋白为鸭细小病毒的VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。
实施例2鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒的组装
重组蛋白包被：将纯化的重组蛋白定量测其浓度，取适量重组蛋白于10mL1×碳酸盐缓冲液中混匀，使其终浓度为1.5ng/L，然后加入96孔酶标板孔底，每孔100μL。盖上封板膜，4℃孵育过夜。
试剂盒中包括以下试剂：96孔酶标板1块，30×PBST洗涤液20mL，1×碳酸盐缓冲液(PH＝9.6)10mL，脱脂奶粉2.5g，GoatAnti-DuckIgG-HRP10mL，可溶型单组分TMB底物显色液10mL，终止液(3mol/LH2SO4)10mL，封板膜4张。2-8℃保存6个月
其中所述的包被液，洗涤液，封闭液，样品稀释液，显色液和终止液的组分及配比如下：
包被液：1×碳酸盐缓冲液：Na2CO30.2756g，NaHCO30.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.5-9.7，4℃保存；
PBS溶液：NaCl4.25g，NaH2PO4·2H2O0.178g，Na2HPO4·12H2O1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500mL，pH值7.1-7.3；
洗涤液：每1LPBS加入Tween-200.5mL，充分混匀；
封闭液，稀释液：将5gdrymilk溶解于100mLPBST稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃；
酶标二抗：Peroxidase-LabeledAntibodyToDuckIgG(H+L),ProducedinGoat；
TMB显色液:可溶型单组分TMB底物溶液；
终止液为3mol/L硫酸溶液。
实施例3鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒的使用方法
所述使用方法具体步骤如下：
1、ELISA检测程序
(1)以150ng/well重组鸭细小病毒VP3蛋白包被ELISA反应板，4℃过夜孵育，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(2)以5g/100mL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37℃，封闭1h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(3)将待检血清用5g/100mL脱脂奶粉溶液做1:10倍w/v稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1.5h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(4)将羊抗鸭IgG-HRP按100μL/well加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBST洗涤ELISA反应板3次；
(5)将100μL底物显色液加入ELISA反应板，避光37℃显色15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪450nm波长下读取OD值。
2、间接ELISA方法判定标准的确定
用酶标仪读取酶标板的OD450nm值，计算出阴性血清平均值(`X)+标准差(SD)，得到阴阳性临界值为0.239，结果判定标准为X≥0.25,可判断为阳性，即待检样品中含有鸭细小病毒抗体，否则为阴性。

Claims (3)

1.一种鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所采用的包被抗原为鸭细小病毒的重组VP3蛋白，该蛋白氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，表达该蛋白的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
2.根据权利要求1所述的鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：鸭细小病毒VP3重组蛋白包被的ELISA板，酶标二抗，阳性对照，阴性对照，洗涤液，样品稀释液，底物液A，底物液B和终止液；
其中酶标二抗为辣根过氧化物标记羊抗鸭单克隆抗体；所述阳性对照为自然感染鸭细小病毒GT2015株鸭血清；所述阴性对照为正常鸭血清，所述重组VP3蛋白包被量为150ng/well。
3.根据权利要求2所述的鸭细小病毒间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的包被液，洗涤液，封闭液，样品稀释液，显色液和终止液的组分及配比如下：
包被液：1×碳酸盐缓冲液：Na2CO30.2756g，NaHCO30.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，pH值9.5-9.7，4℃保存；
PBS溶液：NaCl4.25g，NaH2PO4·2H2O0.178g，Na2HPO4·12H2O1.386g，用蒸馏水溶解并定容至500mL，pH值7.1-7.3；
洗涤液：每1LPBS加入Tween-200.5mL，充分混匀；
封闭液，稀释液：将5gdrymilk溶解于100mLPBST稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃；
酶标二抗：Peroxidase-LabeledAntibodyToDuckIgG(H+L),ProducedinGoat；
TMB显色液:可溶型单组分TMB底物溶液；
终止液为3mol/L硫酸溶液。
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