CN105301141B - 多糖结合疫苗中残余cdap的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
1‑氰基‑4‑二甲氨基‑吡啶四氟化硼(CDAP)能够活化多糖形成氰酸酯，而被用于多糖结合疫苗的制备工艺中；本发明提供一种多糖结合疫苗中残余CDAP的高效液相色谱检测方法，包括步骤：用CDAP标准品配制对照品溶液；将待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；供试品溶液和对照品溶液CDAP分别上样于高效液相色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；根据对照品溶液CDAP浓度及其色谱峰面积，供试品溶液CDAP色谱峰面积，采用外标法计算试样中CDAP的浓度。本发明方法简单、操作方便、精确度高，可准确、快速实现多糖结合疫苗中残余CDAP的有效监控。
Description
技术领域
本发明属于测试分析领域，具体为一种利用高效液相色谱测定CDAP的方法。
背景技术
多糖结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，抗原类型从胸腺非依赖性抗原转变为胸腺依赖性抗原，能激发2岁以下儿童、老年人和免疫缺陷者体内产生有效的免疫应答，并产生免疫记忆，诱导产生的保护性抗体主要为免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)G，比多糖疫苗诱导产生的IgM更有效，且能维持较长时间，具有多糖疫苗不可比拟的优势。
在多糖结合疫苗的制备工艺中，通常采用活化剂如溴化氰对细菌多糖进行活化。与溴化氰一样，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)能够活化多糖形成氰酸酯(-O-C≡N)。但相比于溴化氰，CDAP具有较强的活化效率且安全性高，被广泛的应用在多糖结合疫苗的制造领域。虽然该物质毒性低，但为了对结合疫苗中残余CDAP进行有效监控，准确测定多糖结合原液疫苗中CDAP的残留量对疫苗产品质量控制具有重要意义。
目前，国外采用薄层色谱法(TLC)，仅能用来测定CDAP的纯度，国内尚无文献报道多糖结合疫苗中CDAP残留量的测定方法，因此如何对多糖结合疫苗中CDAP残留量的测定仍是一个技术难点。
发明内容
本发明的目的是提供一种多糖结合疫苗中残余CDAP高效液相色谱的检测方法。通过该方法，可准确、快速实现多糖结合疫苗中残余CDAP的有效监控。
本发明所述的多糖结合疫苗中残余CDAP高效液相色谱测定方法，包括如下步骤：
(1)用CDAP标准品配制对照品溶液；
(2)待检样品用超滤离心管进行离心，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；
(3)供试品溶液和对照品溶液CDAP分别上样于高效液相色谱柱，上样后进行洗脱，记录色谱图；
(4)根据对照品溶液CDAP浓度及其色谱峰面积，供试品溶液CDAP色谱峰面积，根据外标法计算试样中CDAP的浓度。
CDAP浓度计算公式如下所示：
C2＝(A2÷A1)×C1 (1)
式中：
C2-试样中CDAP含量，ng/ml；
A2-供试品中CDAP色谱峰面积；
A1-对照品中CDAP色谱峰面积；
C1-对照品中CDAP含量，ng/ml。
CDAP含量计算公式如下所示：
F＝(C2÷C0) (2)
式中：
F试样中CDAP含量，ng/mg；
C2-试样中CDAP含量，ng/ml；
C0-试样中多糖含量，mg/ml；
本发明的有益效果如下：
本发明提供的多糖结合疫苗中残余CDAP的高效液相色谱检测方法，在试样处理中，用3KD的超滤管5000g离心20分钟排除了细菌多糖对CDAP测定的干扰，试样中CDAP能得到良好分离和准确定量。两组加标样品中CDAP的回收率分别为94.9％和95.8％。本发明方法简单、操作方便、精确度高，为试样中CDAP的测定提供了良好的条件，可以用于流脑、HIB及肺炎等多种多糖结合疫苗中CDAP残余的测定。
附图说明
图1为专属性测定结果
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不应用来限制本发明的范围。
实施例1
A群流脑多糖衍生物中CDAP残余的测定：
1.精密制取2000ng/ml CDAP标准溶液作为样品1；
2.A群流脑多糖衍生物用3KD的超滤管5000g离心20分钟，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；测定A群流脑多糖衍生物样品的糖浓度，为4.67mg/ml(C0)，取待检的A群流脑多糖衍生物作为样品2；
3.样品1，样品2分别按照色谱条件进行上样检测；
色谱条件的设定：
3.1流动相：乙腈-水-三氟乙酸(60∶40∶0.1)；
3.2色谱柱：C18，TSKgel ODS-100V(4.6mm×250mm，5μm)，购自东曹生物科技有限公司；
3.3检测器：PDA检测器；
3.4检测方法：色谱峰面积外标定量法；
3.5进样体积：15μl，
3.6色谱柱温度：30℃；
3.7流速：1ml/min。
4.样品1，样品2的峰面积分别为：196778，259714；
根据公式(1)计算试样中CDAP的浓度：
C2＝(A2÷A1)×C1＝(259714÷196788)×2000＝2639.5ng/ml。
根据公式(2)计算A群多糖衍生物中CDAP的含量：
F＝C2÷C0＝2639.5÷4.67＝565.20ng/mg。
实施例2
A群流脑多糖结合物原液中CDAP残余的测定：
1.精密制取2000ng/ml CDAP标准溶液作为样品1；
2.A群流脑多糖结合物原液用3KD的超滤管5000g离心20分钟，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；测定A群流脑多糖结合物原液样品的糖浓度，为0.24mg/ml(C0)，取待检的A群流脑多糖结合物原液作为样品2；
3.样品1，样品2分别按照色谱条件进行上样检测；
色谱条件的设定：
3.1流动相：乙腈-水-三氟乙酸(60∶40∶0.1)；
3.2色谱柱：C18，TSKgel ODS-100V(4.6mm×250mm，5μm)，购自东曹生物科技有限公司；
3.3检测器：PDA检测器；
3.4检测方法：色谱峰面积外标定量法；
3.5进样体积：15μl，
3.6色谱柱温度：30℃；
3.7流速：1ml/min。
4.样品1，样品2的峰面积分别为：204992，368；
根据公式(1)计算试样中CDAP的浓度：
C2＝(A2÷A1)×C1＝(368÷204992)×2000＝3.59ng/ml。
根据公式(2)计算A群多糖衍生物中CDAP的含量：
F＝C2÷C0＝3.59÷0.24＝14.96ng/mg。
本发明方法的方法学验证：
专属性验证：
由于在制备结合物过程中主要涉及以下化学物质，因此在进行方法专属性研究时分别用10μg/ml浓度的CDAP标准品、水空白、乙腈、1mg/ml氯化钠、lmg/ml碳酸氢钠、1mg/mlADH以及0.1％的三乙胺按照实施例1中的方法进行检测，测试结果见附图1：
10μg/ml浓度的CDAP在2.526min明显单峰(见图1)，而氯化钠、碳酸氢钠、ADH以及0.1％的三乙胺成分在此位置未出现任何吸收峰，因此说明该方法对CDAP进行检测专属性良好。检测限、定量限验证：
分别配制20-140ng/ml低浓度的CDAP标准样品，按照实施例1中方法进行进样检测，结果如表1所示：
表1不同浓度CDAP信噪比(S/N)测定结果
当CDAP浓度为35ng/ml时S/N＝8，满足信噪比至少为3∶1，初步确定为CDAP的检测限；当CDAP浓度为40ng/ml时，信噪比约为10∶1，确定40ng/ml的浓度为CDAP检测的定量限。线性验证：
分别配制160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1μg/ml、2μg/ml及4μg/ml 6个浓度的CDAP对照品溶液，按照实施例1中方法进行进样检测，实验结果如表2所示：各个样品在2.5分左右均出现洗脱峰，线性回归方程为y＝109769x-2203.1，R2＝0.9999(n＝6)，线性成立。
表2标准曲线测定值
精密度验证：
取A群多糖衍生物试样，按照实施例1的方法平行测定测定5次CDAP的含量，计算精密度。测试结果如下表3所示：
表3精密度测定表
相对标准偏差为0.17％，说明精密度良好。
回收率测定：
在A群多糖衍生物样品中分别添加320ng/ml和640ng/ml的CDAP标准品各三份，按照实施例1的方法测定试样中CDAP的含量。测定量与加入量相比为CDAP的回收率。测定结果如下表4所示：
表4A 群多糖衍生物中CDAP回收率
两组加标样品回收率分别为95.8％和94.9％，测定结果显示了该方法用于测定多糖衍生物中CDAP残留量具有良好的准确度。
Claims (1)
1.多糖结合疫苗中残余CDAP高效液相色谱测定方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)用CDAP标准品配制对照品溶液；
(2)待检样品采用3KD超滤离心管进行离心，转速5000g，离心20分钟，收取滤过液用0.45μm膜过滤作为供试品溶液；
(3)供试品溶液和对照品溶液CDAP按照色谱条件分别上样洗脱，记录色谱图；色谱条件如下：
流动相：乙腈-水-三氟乙酸，流动相比例60∶40∶0.1；
色谱柱：C18，TSKgel ODS-100V，色谱柱规格4.6mm×250mm，5μm；
检测器：PDA检测器；
进样体积：15μl；
色谱柱温度：30℃；
流速：1ml/min；
(4)根据对照品溶液CDAP浓度及其色谱峰面积，供试品溶液CDAP色谱峰面积，采用外标法计算试样中CDAP的浓度。
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