CN105301086A - 一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备方法及其应用。该生物传感器包括有一基体电极，其感应端包覆孔雀石绿薄膜，膜上修饰有葡萄糖修饰酶。其制备方法为：先通过电聚合方法在玻碳电极上形成孔雀石绿膜，再在膜上利用滴涂方法修饰葡萄糖氧化酶即可。本发明方法制备的复合膜生物传感器，能够用于测定溶液中的葡萄糖浓度，这种复合薄膜酶电极对葡萄糖氧化有良好的响应。本发明方法制备步骤简单，所制得的生物传感器导电性好，选择性好，催化活性高，灵敏度高，在葡萄糖的催化和检测方面具有很好前景。
Description
技术领域
本发明属于酶生物传感器技术领域，特别涉及一种高灵敏度的葡萄糖氧化酶生物传感器的制备方法及其应用。
背景技术
生物传感器由于其快速敏锐的检测性能以及所需仪器价格低廉等优点而广泛应用于生命物质的电化学检测。开发用于检测体内葡萄糖浓度的微小变化的高灵敏度的葡萄糖酶生物传感器具有重要的科学意义和使用价值。
孔雀石绿属于三苯甲烷类染料，是一种新颖的修饰电极的材料，其优良的导电性能会很好地促进生物电活性分子的电子传递，应用于电化学传感器上能显著提高对检测物质的响应程度。与其他修饰的葡萄糖氧化酶的生物传感器相比，孔雀石绿薄膜修饰的葡萄糖氧化酶生物传感器制作简单，灵敏度高，反应速度快，抗干扰强，检测范围宽，必将为生物传感器的发展带来更大的进步。
葡萄糖氧化酶因为具有极其重要的催化活性而被广泛研究。而且其价格低廉，性质稳定，实用性强，常被人们用作制备生物传感器的理想分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备方法及其应用。
本发明的原理和思路：利用电聚合的方法将孔雀石绿溶液修饰在电极表面，形成一种载体薄膜，在薄膜表面滴加葡萄糖氧化酶溶液，在酶溶液中混合戊二醛、Nafion(全氟化高分子聚合物磺酸盐阳离子交换剂)使葡萄糖氧化酶更加稳固的与孔雀石绿薄膜交联在一起，形成一种对葡萄糖有特定响应的薄膜。利用这种修饰电极的表面葡萄糖氧化酶对葡萄糖进行催化氧化，生成葡萄酸、过氧化氢，通过循环伏安法能够准确的对葡萄糖进行定量分析。
具体步骤为：
(1)将基体电极在金砂相纸上用0.5μm的抛光粉粗磨，用超纯水冲洗干净后在麂皮布上用0.35μm的Al2O3抛光粉细磨，再用超纯水冲洗干净后置于体积比为1:3的HNO3/无水乙醇混合溶液和二次水中各超声清洗2min，再用超纯水冲洗干净，晾干，即制得预处理后的基体电极。
(2)以步骤(1)预处理后的基体电极为工作电极，在0.1mol/L的H2SO4中进行循环伏安法扫描，扫描电位范围为-1.0~1.4V；扫描速率为0.1V/s；扫描段数为20段，至循环伏安曲线稳定，即完成基体电极的活化。
(3)以步骤(2)活化后的基体电极作为工作电极，在15ml烧杯中依次加入2mL3×10-3mol/L的孔雀石绿溶液、5mL0.2mol/L的磷酸缓冲溶液和3mL1mol/L的NaNO3溶液，用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-1.4~1.8V；扫描速率为0.1V/s；扫描段数为30段，扫描完后，用超纯水冲洗干净基体电极，晾干，就在基体电极上制备了电聚合的孔雀石绿薄膜。
(4)取4mL的离心管依次加入10μL质量百分比浓度为2%的戊二醛水溶液、50μLpH值为6.0的PBS溶液和5mg葡萄糖氧化酶，然后用Nafion溶液定容至500μL，混合、摇匀，即制得葡萄糖氧化酶混合液。
(5)在经步骤(3)处理过的基体电极的表面滴涂20μL步骤(4)制得的葡萄糖氧化酶混合液，晾干后在电聚合的孔雀石绿薄膜上就形成了葡萄糖氧化酶层，即完成了电聚合孔雀石绿薄膜修饰的葡萄糖氧化酶生物传感器的制备。
所述基体电极为玻碳电极或铟锡氧化物电极。
所述PBS溶液是0.2mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液。
本发明制备的葡萄糖氧化酶生物传感器应用于对葡萄糖进行定量分析。
本发明方法制备步骤简单，所制得的生物传感器导电性好，选择性好，催化活性高，灵敏度高，在葡萄糖的催化和检测方面具有很好前景。
附图说明
图1为本发明实施例中的裸玻碳电极对空白溶液和葡萄糖溶液的响应图。
图2为本发明实施例中的电聚合孔雀石绿的玻碳电极对空白溶液和葡萄糖溶液的响应图。
图3为本发明实施例中的孔雀石绿/葡萄糖氧化酶修饰电极对空白溶液和葡萄糖溶液的响应图。
图4为本发明实施例中的孔雀石绿/葡萄糖氧化酶/nafion修饰电极对空白溶液和葡萄糖溶液的响应图。
图5为本发明实施例中的孔雀石绿修饰电极在不同圈数下的紫外吸收图。
图6为本发明实施例中经过电聚合在电极表面修饰孔雀石绿的吸收峰与孔雀石绿溶液的紫外吸收光谱。
图7为本发明实施例中电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡萄糖氧化酶生物传感器在不同扫描速率下对峰形的影响图。
图8为本发明实施例制得的电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡萄糖氧化酶生物传感器在不同扫描速率下与峰电流的线性关系图。
图9为本发明实施例制得的电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡萄糖氧化酶生物传感器在不同浓度葡萄糖体系下的循环伏安图。
图10为本发明实施例制得的电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡萄糖氧化酶生物传感器在不同浓度葡萄糖体系下与峰电流的函数关系图。
具体实施方式
以下将结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例：
(1)将玻碳电极在金砂相纸上用0.5μm的抛光粉粗磨，用超纯水冲洗干净后在麂皮布上用0.35μm的Al2O3抛光粉细磨，再用超纯水冲洗干净后置于体积比为1:3的HNO3/无水乙醇混合溶液和二次水中各超声清洗2min，再用超纯水冲洗干净，晾干，即制得预处理后的基体电极。
(2)以步骤(1)预处理后的基体电极为工作电极，在0.1mol/L的H2SO4中进行循环伏安法扫描，扫描电位范围为-1.0~1.4V；扫描速率为0.1V/s；扫描段数为20段，至循环伏安曲线稳定，即完成基体电极的活化。
(3)以步骤(2)活化后的基体电极作为工作电极，在15ml烧杯中依次加入2mL3×10-3mol/L的孔雀石绿溶液、5mL0.2mol/L的磷酸缓冲溶液和3mL1mol/L的NaNO3溶液，以Ag/AgCl电极作为参比电极，铂电极作为对电极，用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-1.4~1.8V；扫描速率为0.1V/s；扫描段数为30段，扫描完后，用超纯水冲洗干净基体电极，晾干，就在基体电极的感应端上制备了一层电聚合的孔雀石绿薄膜。
(4)取4mL离心管依次加入10μL质量百分比浓度为2%的戊二醛水溶液、50μLpH值为6.0的PBS溶液和5mg葡萄糖氧化酶，然后用Nafion溶液定容至500μL，混合、摇匀，即制得葡萄糖氧化酶混合液。
(5)在经步骤(3)处理过的基体电极的表面滴涂20μL步骤(4)制得的葡萄糖氧化酶混合液，晾干后在电聚合的孔雀石绿薄膜上就形成了葡萄糖氧化酶层，即完成了电聚合孔雀石绿薄膜修饰的葡萄糖氧化酶生物传感器的制备。
通过循环伏安法对本实施例的生物传感器制备过程中不同阶段进行表征，结果如附图所示。由图1可知裸玻碳电极对葡萄糖溶液几乎没响应；由图2可知只有孔雀石绿修饰的玻碳电极对葡萄糖溶液几乎没有响应；由图3可见孔雀石绿修饰的电极上滴涂了葡萄糖氧化酶后在-0.4V附近的还原峰的电流才减少；由图4可知在滴涂了葡萄糖氧化酶后再修饰上Nafion膜后，峰形要比没有时好很多。由图4可知过氧化氢抑制了还原峰，使得还原峰电流减少。
本实施例的电聚合孔雀石绿薄膜修饰电极在紫外吸收光谱法中的表征，图5为用不同圈数下，电聚合孔雀石绿薄膜修饰电极的吸收峰，可以看到，随着电聚合圈数的不断增加，电极表面的孔雀石绿薄膜厚度增加，紫外吸收增强，与此同时紫外吸收峰也发生了红移，这表明了孔雀石绿修饰玻碳电极是电聚合的过程，并不是吸附，因为吸附的不会导致吸收峰的变化，而发生电聚合时，聚合物由于双键共轭程度增加，导致吸收波长增大。图6是经过电聚合在电极表面修饰孔雀石绿的吸收峰与孔雀石绿溶液的紫外吸收峰相比发生了红移。这些事实可以表明孔雀石绿已经在玻碳电极表面形成了聚合物，并且经过电聚合被固定在了电极上。
本实施例中电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡萄糖氧化酶生物传感器在不同扫描速率下对峰形的影响，如图7中，随着扫描速率的不断增加，峰电流值也不断的增加，且仍能得到对称性良好的循环伏安图，表明固定在电极表面的孔雀石绿呈现出良好的可逆性。如图8中，峰电流与扫速成线性关系，线性方程为y=-7.5-185*x。这表明修饰电极在PBS中的电化学过程是受表面控制的。实验中，扫描速率控制在100mV/s。
利用本实施例的电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡萄糖氧化酶生物传感器对不同浓度的葡萄糖溶液进行测定。如图9和图10中，在修饰孔雀石绿电极的葡萄糖氧化酶浓度为2.4mg/mL、0.02mol/L且pH值为7的PBS缓冲溶液、0.1mol/LNaCl、静置时间为250秒的体系中，葡萄糖浓度在2×10-6～6×10-5mol/L时，还原峰电流的对数值与浓度的对数值成良好线性关系，线性回归方程和线性相关系数分别为C=-0.2988X+1.253；r=0.9996。
用本实施例制得的生物传感器对相同的4份血清样品中不同体积已知浓度的葡萄糖溶液，在10倍抗坏血酸和10倍尿酸存在时的体系进行样品测试及加标回收率的计算，结果如下表1所示。
表1测定血清样品及加标回收率
由上表1可见，本实施例制得的生物传感器对葡糖糖浓度的测定是准确有效的。本实施例制备的电聚合孔雀石绿薄膜修饰葡糖糖氧化酶生物传感器是一种较为理想的葡萄糖浓度检测装置，有望用于生命科学，临床医学的在线监测。
对血清样本的检测是考察该生物传感器的灵敏度、特异性及稳定性。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种葡萄糖氧化酶生物传感器的制备方法，其特征在于具体步骤为：
(1)将基体电极在金砂相纸上用0.5μm的抛光粉粗磨，用超纯水冲洗干净后在麂皮布上用0.35μm的Al2O3抛光粉细磨，再用超纯水冲洗干净后置于体积比为1:3的HNO3/无水乙醇混合溶液和二次水中各超声清洗2min，再用超纯水冲洗干净，晾干，即制得预处理后的基体电极；
(2)以步骤(1)预处理后的基体电极为工作电极，在0.1mol/L的H2SO4中进行循环伏安法扫描，扫描电位范围为-1.0~1.4V；扫描速率为0.1V/s；扫描段数为20段，至循环伏安曲线稳定，即完成基体电极的活化；
(3)以步骤(2)活化后的基体电极作为工作电极，在15ml烧杯中依次加入2mL3×10-3mol/L的孔雀石绿溶液、5mL0.2mol/L的磷酸缓冲溶液和3mL1mol/L的NaNO3溶液，用循环伏安法进行扫描，扫描电位范围为-1.4~1.8V；扫描速率为0.1V/s；扫描段数为30段，扫描完后，用超纯水冲洗干净基体电极，晾干，就在基体电极上制备了电聚合的孔雀石绿薄膜；
(4)取4mL的离心管依次加入10μL质量百分比浓度为2%的戊二醛水溶液、50μLpH值为6.0的PBS溶液和5mg葡萄糖氧化酶，然后用Nafion溶液定容至500μL，混合、摇匀，即制得葡萄糖氧化酶混合液；
(5)在经步骤(3)处理过的基体电极的表面滴涂20μL步骤(4)制得的葡萄糖氧化酶混合液，晾干后在电聚合的孔雀石绿薄膜上就形成了葡萄糖氧化酶层，即完成了电聚合孔雀石绿薄膜修饰的葡萄糖氧化酶生物传感器的制备；
所述基体电极为玻碳电极或铟锡氧化物电极；
所述PBS溶液为0.2mol/L的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述制备方法制备的葡萄糖氧化酶生物传感器的应用，其特征在于该葡萄糖氧化酶生物传感器应用于对葡萄糖进行定量分析。
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