CN105307666A

CN105307666A - 菜蓟属的提取物及其用途

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Publication number: CN105307666A
Application number: CN201480031308.0A
Authority: CN
Inventors: 瓦伦蒂诺·梅尔卡迪
Original assignee: A Boka-Agricola Common Shares Co
Current assignee: A Boka-Agricola Common Shares Co
Priority date: 2013-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2016-02-03
Also published as: JP2016521689A; HK1223282A1; AU2014272656A1; US20160120923A1; MX2015016270A; AU2014272656B2; ITRM20130312A1; EA030986B1; CA2913709A1; EP3003336A1; WO2014191954A1; EA201592037A1; US10383905B2

Abstract

本发明涉及一种菜蓟属的提取物且还涉及包括用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活为特征的药理症状的所述提取物的组合物和试剂盒。

Description

菜蓟属的提取物及其用途

技术领域

本发明涉及一种菜蓟属的提取物，还涉及包括用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活为特征的药理症状的所述提取物的组合物和试剂盒。

背景技术

近几十年来，文献中的许多证据表明属于STAT家族的转录因子在多种病理学(如在促进肿瘤的炎症病理学)及肿瘤自身中的基本作用。STAT蛋白为胞浆转录因子，该胞浆转录因子的磷酸化/激活(在JAK家族或Janus激酶蛋白的作用下在丝氨酸和/或酪氨酸的特定残基上)决定了两个STAT单体的二聚化、该二聚体在细胞核中的易位、与STAT-特异性靶基因的DNA的成分结合、以及诱导基因转录。STAT因子家族由七个具有包括在分化、增殖、发育、凋亡和细胞炎症中发挥作用的多种生物学功能的成员(由基因STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6编码)组成。由这些基因编码的蛋白质的一个特征是具有双重作用，更具体地，在细胞质中转导信号的作用和在细胞核中转导转录因子的作用。特别地，组成性激活STAT3和较小程度组成性激活STAT5与多种新生肿瘤形成有关并伴随着一些细胞内通路的失调，包括那些参与肿瘤存活和参与肿瘤细胞增殖，以及参与肿瘤自身的血管生成和转移的过程。

YuH等人于2009年在自然杂志上发表的综述中报道称STAT3的持续激活诱导了促进癌症的炎症并调节了对炎症和肿瘤微环境至关重要的基因。上述工作的表1和2中显示了由STAT3激活的基因，还描述了如雪胆素乙(curcubitacin)、白藜芦醇、肉盘菌内酯和靛玉红的天然物质中STAT3激活的一些抑制剂，然而需要指出的是这些物质发挥作用的作用机制是未知的。

在任何情况下，上述工作表明调控STAT3对治疗癌症来说是一种新的、更有效的和非常有益的方法，报道称在多种肿瘤模型中敲除STAT3基因导致了肿瘤生长的抑制。

据报道，在包括乳腺癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病、脑肿瘤、结肠癌、尤文肉瘤、胃癌、食管癌、卵巢癌、鼻咽癌、胰腺癌(下表1)的大量肿瘤中组成性激活STAT3。对于许多类型的癌症，高水平的激活的STAT3已与较差的预后相关联。STAT3的激活阻断了细胞凋亡并增加了细胞增殖和细胞存活，从而促进血管生成和转移并抑制抗肿瘤免疫应答。组成性激活STAT3的肿瘤细胞株需要持续激活STAT3，其已被定义为“依赖致癌基因”的表型(JohnstonPA和GandisRG，MolInterv；11(1)；18-26：2011)。

恶性胸膜间皮瘤(MPM)是来源于胸腔的间皮细胞的侵袭性肿瘤，尽管化疗(通常如果使用了培美曲塞)提高了患有不可手术的MPM的患者的存活时间，但全球平均存活时间仅为12个月。近期有报道称一种用于MPM的潜在分子治疗靶点为由存在于患有MPM的患者的胸液中高水平的白细胞介素-6信号(IL-6)激活的IL-6信号通路(IL-6)/JAK/STAT3。IL-6与其受体的结合导致了引发JAK激活的受体的构象变化，该构象变化反过来引发STAT3转录因子的二聚化，且STAT3二聚体在细胞核中易位，从而确定了引发多种靶基因的反式激活。

这条通路对造血作用、免疫应答和肿瘤生成的发生是关键的。此外，还表明JAK/STAT3系统的功能紊乱参与了肿瘤的发展。

据文献中报道暴露于石棉是间皮瘤的病因之一。

还预计，在接下来的15年内在发达国家间皮瘤的发病率会升高，且一些项目已经预测出在1998和2018之间每年的hMPM病例会翻倍。还预计间皮瘤在第三世界的急剧上升，特别是在印度，在那里石棉的使用继续呈指数上升而没有采取必要的预防措施。目前，间皮瘤的病例每年在美国引起大约3000例死亡，以及在欧洲引起大约5000例死亡。尽管石棉消除的方案，但间皮瘤的频率在过去20年内没有发生显著变化，且据估计在未来25年内间皮瘤在欧洲国家每年会上升5％至10％。

世界卫生组织(WHO)估计出大约有1.25亿人在工作场所暴露于石棉中。

在美国，在过去50年间男性人口中间皮瘤病例的总预测数估计等于71000。

在欧洲，石棉的商业化使用已经被禁止了数年，第一次分析已经预测出男性人口中由间皮瘤引起的死亡会继续上升，在2020年左右达到最大峰值，或根据最近的预测，在2015左右达到最大峰值(考虑44.6年的平均潜伏期)。

该疾病的年发病率根据国家的不同而不同，然而怀疑在新兴市场中，由于石棉矿山缺乏监管以及石棉在工业和国内水平的使用的增长，病例数将会急剧上升。

hMPM通常被分为4个亚组，且已确定出多种预后因素。目前的治疗方法包含外科手术、放疗、化疗和多模式治疗，但到现在为止产生了令人失望的结果。间皮瘤很少适合根治性手术切除，且文献中经常报道其对化疗和对放疗的耐药性。从确诊起的存活时间为8-18个月。

此外，文献中还总是出现STAT3在肿瘤的发展和进展中所发挥作用的广泛性描述。在血液肿瘤(多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤)和固体肿瘤(黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌和肾细胞癌、胰腺癌、肺癌和脑癌)中均已观察到STAT3的组成性激活。为了更加深入，取自TurksonJ和JoveR，Oncogene；19(56)；6613-26：2000的下表3表明许多肿瘤与STAT3的异常激活直接相关。特别地，这种异常激活似乎是由转化如v-src、v-ros、v-fps、Etk/BMX和Lck的酪氨酸激酶的作用引起的，或由细胞因子的自分泌释放或旁分泌释放诱导的异常信号引起的。STAT3的组成性激活导致编码细胞凋亡的抑制因子(例如Bcl-xL、Mcl-1)、细胞周期的调节因子(例如细胞周期素D1/D2、cMyc)和血管生成的诱导因子(例如VEGF：血管内皮生长因子)的基因的更强表达。最后，最近已经证明除了在肿瘤生成中具有关键作用，这种转录因子的组成性激活对抗由化疗药物诱导的死亡(AggarwalB.B等人.Ann.N.Y.Acad.Sci.1091；151-69：2006)。

各种临床研究已表明体内固体肿瘤在使肿瘤自身对细胞死亡信号不敏感并对放疗治疗和化疗治疗耐药的低水平氧气环境中生长和发展；另一方面，缺氧促进血管生成、增殖和转移能力。在这种情况下，肿瘤的侵袭性似乎通过缺氧和通过STAT3的超活化与HIF-1α因子的激活和稳定有关。

为此，基于靶向因子STAT3的抗癌治疗是非常可取的(NiuG.等人.MolCancerRes，6(7)；1099-105：2008)。

如下所示，表1是取自AggarwalB.B.等人于2006的工作并显示了表达组成性激活的STAT3、STAT3的活化因子、由STAT3调控的基因和STAT3的抑制因子的肿瘤的列表。

表1

关键词：STAT，信号转导与转录激活因子；CLL，慢性淋巴细胞白血病；CML，慢性粒细胞白血病；AML，急性骨髓性白血病；SCCHN，头颈部鳞状细胞癌；HTLV，人类T细胞嗜淋巴细胞病毒；EBV，爱泼斯坦-巴尔病毒；奈非那韦，HIV-1蛋白酶抑制因子；R115777，法尼基转移酶抑制因子；AG490和白皮杉醇，酪氨酸激酶抑制因子；PIAS，激活的STAT3的蛋白抑制因子；GQ-ODN，G-四寡核苷酸；SOCS，细胞因子信号转导抑制因子；GRIM，与类视黄醇-IFN-诱导的死亡率相关的基因；EGCG，表没食子儿茶素-3-没食子酸酯；SSI，STAT-诱导的STAT抑制因子；PTPεC，蛋白酪氨酸磷酸酶εC；DN，显性阴性；EKb-569，EGF-R抑制因子；DIF-1，分化诱导因子-1；JAB，含有SH2结构域的蛋白质；IL，白细胞介素；TNF，肿瘤坏死因子；MDA，黑色素瘤分化抗原；MCP，单核细胞趋化蛋白；GCSF，粒细胞集落刺激因子；LIF，白血病抑制因子；OSM，抑瘤素M；IFN，干扰素；MIP，巨噬细胞炎性蛋白质；RANTES，受激活调节正常T细胞表达和分泌因子；EGF，表皮生长因子；LPS，脂多糖；VEGF，血管内皮生长因子；MMP，基质金属蛋白酶；hTERT，人端粒酶逆转录；SLF，青灰(steel)因子，HCV，丙型肝炎病毒

表2是取自JohnstonPA和Gr和isRG2011且与多种肿瘤的STAT3相关，证实STAT3对于抗癌治疗是有效的感兴趣的靶标。

表2

取自TurksonJ和JoveR2000的表3表明与STAT3的异常激活直接有关的多种肿瘤。

表3

特别地，关于STAT3，以下已在许多出版物展示：

1)STAT3通常在许多人类癌症(如多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、肺癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌，和其他肿瘤类型)细胞中是组成性激活的(磷酸化)。

2)由生长因子(例如EGF、TGF-α、IL-6、IL-10、IL-23、IL-21、IL-11、HGF)、激酶致癌因子(例如Src)来激活STAT3。

3)STAT3介导增殖基因(例如c-myc、细胞周期素D1)、细胞凋亡抑制因子基因(例如Bcl-XL和存活素)、细胞因子编码基因以及促进血管生成的基因(例如VEGF)的表达，从而当STAT3被激活时，细胞增殖、血管生成和抑制细胞凋亡增强。

4)STAT3的激活还与化学耐药性和抗辐射的现象有关。

5)在STAT3的持续激活增加了各种人类癌症中的增殖、存活、血管生成和转移并抑制了抗肿瘤免疫。

还已知在某些器官中或在某些位点的慢性炎症促进了恶性转化，并且已知STAT3对于导致癌症的炎症的外在和内在通路是至关重要的，事实上已知STAT3引导与慢性炎症相关的恶性特征。

由于STAT3在肿瘤生成中的关键作用，STAT3的抑制因子在癌症的预防和治疗中具有巨大的潜力。也许最著名的STAT3激活抑制因子之一是抑制了JAK2激活的AG490。STAT3的其它抑制因子包括短肽、寡核苷酸和小分子。一些作者已经确定了阻断STAT3的磷酸化/激活的肽，STAT3的磷酸化/激活是介导结合到DNA和基因调节的活性以及细胞转化的机制。各种阻断STAT3的小分子包含PGJ2、铂的络合物、乙醇、水杨酸钠、维甲酸、阿替莫德、PS-341和他汀类药物。已经鉴定出许多植物多酚抑制STAT3激活的能力。这些植物多酚包含姜黄素、白藜芦醇、葫芦素、白皮杉醇、欧苷菊、flazopiridol(黄酮类抗肿瘤药)、厚朴酚和表没食子儿茶素-3-没食子酸酯。这些分子成功抑制STAT3、激活的方式并不完全清楚。例如，已经证明了姜黄素抑制JAK2、Src、Erb2和EGFR(全部参与STAT3的激活)的效果，还下调Bcl-xL、细胞周期素D1、VEGF和TNF(Bcl-xL、细胞周期素D1、VEGF和TNF的表达受STAT3调节)的表达(AggarwalB.B.等人.Ann.N.Y.Acad.Sci.1091；151-69：2006)。

因此存在各种可能干预STAT3信号级联的策略和机制：抑制STAT3的磷酸化/激活、抑制涉及STAT3的分子间相互作用、抑制STAT3的细胞核输入/输出、抑制由STAT3介导的转录。除了已经提到的抑制STAT3的化疗药物，还有已经报道了不同疗效的其他化疗药物(西妥昔单抗、吉非替尼、埃罗替尼等)：适度的功效、耐药性的发展、骨髓抑制、胃肠水平的毒性以及包括心血管毒性在内的各种不良反应(见表4)

以下取自JohnstonPA和GrandisRG2011的表4报道了对STAT3信号的治疗性干预的策略和结果。

表4

在直接参与到肿瘤进展的细胞亚群中依靠以更特异性方式抑制特异性靶标分子的化合物进行靶向治疗的疗法代表了癌症治疗中的新观点。控制细胞增殖和死亡的分子，如用于生长因子的受体酪氨酸激酶(RTK)，是这种类型的治疗方法的最佳目标。随着曲妥单抗、用于治疗转移性乳腺癌的抗HER2单克隆抗体和慢性粒细胞白血病中imatibin(BCR-ABL抑制因子)的批准开启了靶向治疗的时代。尽管对这些治疗疗效最初的热情，医生不得不立即面对复发的问题，因为那些患有癌症的患者常由于替代通路的激活而发展出对药物的耐药性。由于肿瘤以经常失调的更多的机制和更多基因靶标为特征，采用联合治疗将是有利的，其是癌症治疗的标准，因为这会导致合理的策略以增加响应和耐受性并降低耐药性。目前对旨在通过使用较低的药物剂量来使功效最大化、全身毒性最小化的抗肿瘤药物的联合的兴趣正在增加。

因此，能够阻断STAT3的组成性激活或可诱导激活的药理学上安全和有效的治疗药物，如天然来源的分子，在癌症的治疗中具有潜在效力，因为越来越多的试验得出结论，通过药理学阻断包括Src和JAK的上游分子来抑制STAT3的磷酸化可以减少肿瘤的形成，同样导致减少化疗药物的必要剂量的可能性。

另外，因为STAT3的激活还与对化疗和放疗的耐药性相关，该激活的抑制因子对限制这种耐药性和优化化疗和放疗的效果来说具有很大的兴趣。

发明内容

本发明的作者已经表明朝鲜蓟(菜蓟属)的提取物能够选择性地调节，基本上抑制蛋白STAT3的磷酸化，从而预防作为转录因子在细胞内的后续作用。如将在本申请的实验部分可以看到的，本发明的作者在大量的实验和对恶性胸膜间皮瘤的不同细胞株上已经证明本文所描述的提取物是STAT3激活(磷酸化)的有效抑制剂，并因此

-表明对肿瘤细胞株的有效细胞毒性作用，

-能够抑制肿瘤细胞的再生，从而作为细胞抑制剂，

-诱导肿瘤细胞凋亡，

-与多数化疗药物具有附加以及协同效应，从而导致与那些单独使用化疗药物或单独使用提取物进行治疗相比，肿瘤细胞的活性降低

-以不同的方式对恶性胸膜间皮瘤细胞和未转化的间皮细胞起发挥作用。

从该提取物对STAT3因子的效果的观点来看，本发明的作者还通过实验的方式证明本文所描述的菜蓟属提取物能够防止STAT3结合到DNA，并因此预防由磷酸化的STAT3正常激活的基因的表达的改变。

换句话说，已证明所述提取物能够调节，基本上抑制磷酸化形式的蛋白质STAT3，预防所述蛋白质作为转录因子在细胞内的后续作用。特别地，本发明的发明人已经证明菜蓟属的提取物能够抑制STAT3的组成性激活或异常激活并能够诱导MPM肿瘤细胞培养物中细胞凋亡再激活。另外，本发明的作者还证明，在对MPM肿瘤细胞的培养实验中，菜蓟属提取物抑制了伤口愈合，实际上预防肿瘤细胞的M1型巨噬细胞。另外，本发明的作者用小鼠中植入肿瘤细胞的实验还证明了本发明的提取物在体内发挥对MPM细胞的抗肿瘤作用。

在本发明的所有实施方式中，MPM可以用术语hMPM代替。

因此，本发明的第一个主题是一种菜蓟属的提取物，用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

本发明的第二个主题是一种菜蓟属的提取物，用于与一种或多种化疗药物联合预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状的中。本发明的第三个主题是一种包括菜蓟属的提取物和载体和/或稀释剂和/或赋形剂的组合物，用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

在一个实施方式中，所述组合物还包括一种或多种具有抗凋亡组分的组分。

本发明的第四个主题是一种组合物，包括菜蓟属的提取物与一种或多种具有抗肿瘤和/或抗炎组分的组分以及载体和/或稀释剂和/或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

本发明的第五个主题是一种试剂盒，用于伴随给药或相继给药菜蓟属的提取物和一种或多种化疗药物，所述试剂盒包括：一等分或多等分的菜蓟属的提取物；或者一等分或多等分的组合物，所述组合物包括菜蓟属的提取物和一个或多个单独等分的一种或多种包括化疗药物的组合物，所述试剂盒与化疗药物联合用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

本发明的第六个主题是一种治疗方法，用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状，所述方法包括对需要它的个体给药治疗有效量的菜蓟属提取物，任选地与一种或多种具有抗肿瘤和/或抗肿瘤活性的组分联合的步骤。

所有描述的主题可以特别地涉及其中所述病理症状与恶性胸膜间皮瘤的形成相关或所述病理症状是恶性胸膜间皮瘤的病例。

附图说明

注释：在本图中，所使用菜蓟属提取物通常由缩写ABO-1表示。

图1：对STAT3，p-STAT3(Y705)磷酸化的抑制作用

图1A从用100微克/毫升的菜蓟朝鲜蓟提取物处理24小时的MSTO211H获得的细胞裂解物的蛋白质印迹分析。通过与肌动蛋白对照相比较进行定量。

图1B对MSTO211H细胞用蛋白质印迹法得到的数据的柱形图。p-STAT3(磷酸化STAT3)用黑色表示，STAT3用灰色表示。

该图显示了相比于对照组所述提取物抑制p-STAT3的形成。

图2：p-STAT3行中为用25-50-75微克/毫升的菜蓟朝鲜蓟提取物处理的MSTO211H细胞的细胞裂解物以及位于其下的肌动蛋白对照的蛋白质印迹分析。该图显示出所述提取物抑制了STAT3磷酸化并显示了这种抑制作用是剂量依赖性的。

图3：用不同剂量的菜蓟朝鲜蓟提取物对人类恶性胸膜间皮瘤的细胞株进行的克隆生成实验(条件见实验部分)

曲线图3a.对人类间皮瘤细胞株MSTO211H进行的实验

曲线图3b.对人类间皮瘤细胞株NCI-H28进行的实验

曲线图3c.对人类间皮瘤细胞株MPP-89进行的实验

曲线图3d.对人类间皮瘤细胞株NCI-H2052进行的实验

图4：本发明的提取物以剂量依赖性的方式影响了3种不同的炎症肿瘤株(HCT116，MDA-MB-231EDU145)而独立形成了其同型菌落的能力。

曲线图4a.对结肠肿瘤细胞株HCT116进行的实验

曲线图4b.对前列腺肿瘤细胞株DU145进行的实验

曲线图4c.对乳腺肿瘤细胞株MDA-MB-231进行的实验

图5：利用ATPlite测试对恶性胸膜间皮瘤细胞株(MSTO211H、MPP-89、NCI-H28)进行的细胞活性实验。该实验表明在各种间皮瘤细胞株中的细胞活性被本发明的菜蓟朝鲜蓟提取物以剂量依赖性的方式抑制。

图6：图5的三条活性曲线相比于用菜蓟朝鲜蓟提取物处理正常间皮瘤细胞(HMC)得到的增殖曲线的比较(图6aMSTO211H、图6b的MMP-89、图6cNCI-H28)。恶性间皮瘤细胞株(MPM)清楚地显示出相比于HMC，菜蓟朝鲜蓟提取物的抗增殖效果。

图7：用不同浓度的朝鲜蓟提取物(50-600微克/毫升)对铺满的前列腺腺癌细胞株DU-145处理不同处理时间(24和48小时)的细胞活性实验，用菜蓟苦素提取物的含量作为指示。细胞的融合增加了组成性激活的STAT3的水平，使细胞本身很大程度上对死亡耐受。通过WST-1实验对所述活性进行分析(WST-1测试，条件见实验部分)。该图显示出提取物以时间依赖性和剂量依赖性的方式抑制活性。正方形显示在24小时内提取物剂量从0至600微克/毫升的趋势，圆圈显示在48小时内提取物剂量从0至600微克/毫升的趋势，且不同浓度的菜蓟苦素提取物中各自的含量均用微克/毫升和μM表示。

具有高水平激活的STAT3的细胞：所得到的结果显示出所述提取物在24小时抑制细胞活性具有EC₅₀＝380微克/毫升，和在48小时抑制细胞活性具有EC₅₀＝100微克/毫升。

图8：用不同浓度的菜蓟苦素(0-70μm)对铺满的前列腺腺癌细胞株DU-145处理不同处理时间(24或48小时)的细胞活性实验。融合增加了组成性激活的STAT3的水平，使细胞很大程度上对死亡耐受。通过WST-1实验对所述活性进行分析(WST-1测试，条件见实验部分)。该图显示出菜蓟苦素以时间依赖性和剂量依赖性的方式抑制了细胞活性。正方形显示在24小时内用不同浓度：10、20、30、40、50、60μM的菜蓟苦素的趋势，三角形显示在48小时内用不同浓度：10、20、30、40、50、60μM的菜蓟苦素的趋势。

呈现的数据表明菜蓟苦素不如朝鲜蓟提取物有效。该图显示出，相比于朝鲜蓟提取物，菜蓟苦素以时间依赖性和剂量依赖性的方式抑制了细胞活性和增殖的有效性小得多(作为比较参见图8)。例如：为了具有等于大约90％的降低活性的效果，相比于0.94-2.82μM，当菜蓟苦素被包含在冻干提取物中时需要用50μM处理48小时。

图9：用不同浓度的朝鲜蓟提取物对未铺满的细胞株DU-145(由此具有低水平的组成性激活的STAT3)处理不同处理时间(24-48-72小时)的细胞活性实验。通过WST-1实验对所述活性进行分析(WST-1测试，条件见实验部分)。圆圈表示用50微克/毫升的菜蓟朝鲜蓟的处理，正方形表示用100微克/毫升的菜蓟朝鲜蓟的处理，以及三角形表示用200微克/毫升的菜蓟朝鲜蓟的处理。该图显示出200微克/毫升的菜蓟朝鲜蓟如何高度损害细胞株DU145的细胞活性。所得到的结果表明200微克/毫升的提取物在24小时的时间抑制60％的细胞活性。如可以看到的，与图8相比，就有关具有高水平激活的STAT3的细胞的实验而言，该实验的EC₅₀是相当低的(在24小时380微克/毫升，EC₅₀大约为200)，由此表明本发明的提取物在具有低水平激活的STAT3细胞(未铺满)中具有更大的功效。因此该实验确定STAT3被激活的细胞具有更大的恶性程度。抑制STAT3的磷酸化的是降低细胞活性的主要机制。

图10：用朝鲜蓟提取物联合培美曲塞(PMTX)对间皮瘤细胞株MPM进行处理(图11aMSTO211H和图11bNCI-H2052)并对间皮瘤细胞转化(图11cHMC)后的细胞活性实验(ATPlite实验)。与PMTX联合对MPM细胞进行的处理是具有细胞毒性的且对非肿瘤细胞具有更高的毒性。用本发明的提取物加上PMTX对细胞进行的共处理在MPM细胞株中对细胞活性具有显著效果，同时降低在未转化的细胞(HCM)中由培美曲塞引起的死亡率。因此，显然本发明的朝鲜蓟提取物只使肿瘤细胞对培美曲塞敏感。

图11用朝鲜蓟提取物联合各种化疗药物：多柔比星、紫杉醇、顺铂(条件见实验部分)对人类前列腺肿瘤细胞株DU145进行处理后的细胞活性实验WST-1。通过WST-1实验对细胞活性进行分析(WST-1测试，条件见实验部分)。图11显示用两种不同剂量的朝鲜蓟提取物(100和200微克/毫升)进行处理、只用10微克/毫升的顺铂进行处理以及用朝鲜蓟提取物(100和200微克/毫升)联合10微克/毫升的顺铂进行处理24小时后的细胞活性。

图11b显示用两种不同剂量的朝鲜蓟提取物(100和200微克/毫升)进行处理、用1微克/毫升的多柔比星进行处理、用两种不同剂量的朝鲜蓟提取物(100和200微克/毫升)联合1微克/毫升的多柔比星对人类癌细胞DU145处理24小时后的细胞活性。

图11c显示用两种不同的朝鲜蓟提取物(100和200微克/毫升)、用300nM的紫杉醇、和用朝鲜蓟提取物(100和200微克/毫升)联合300nM的紫杉醇对人类癌细胞DU145处理24小时后的细胞活性。

在所有的实验中，形成本发明的基础的提取物增强了三种化疗药物的细胞毒性，在顺铂的例子中具有更大的效力。

图12在用朝鲜蓟提取物和顺铂的联合对人类癌细胞DU145进行处理后的细胞活性实验(条件见实验部分)。该图显示了用朝鲜蓟提取物(黑色)、顺铂(浅灰色)和朝鲜蓟+顺铂(白)以不同浓度的朝鲜蓟提取物和15微克/毫升固定浓度的顺铂进行的处理间的比较。

图中示出了菜蓟苦素的相对浓度。

形成本发明的基础的提取物增强了顺铂的细胞毒性，在200微克/毫升的剂量时具有较大的效力。

图13在用朝鲜蓟提取物和多柔比星的联合对人类癌细胞DU145进行处理后的活性实验(条件见实验部分)。该图显示了用朝鲜蓟提取物(黑色)、多柔比星(浅灰色)、和朝鲜蓟+多柔比星(白)以不同浓度的朝鲜蓟提取物和2微克/毫升固定浓度的多柔比星进行的处理间的比较。

菜蓟苦素的相对浓度与图13中报道的相同。

形成本发明的基础的提取物增强了多柔比星的细胞毒性，在200微克/毫升的剂量时具有较大的效力。

图14在用菜蓟苦素和顺铂的联合对人类癌细胞DU145进行处理后的活性实验(条件见实验部分)。该图显示了用菜蓟苦素(黑色)、顺铂(浅灰色)、和菜蓟苦素+顺铂(白)以不同浓度的菜蓟苦素和15微克/毫升的固定浓度的顺铂进行的处理间的比较。

应当理解的是，为了获得降低细胞活性低于20％的效果，比存在于朝鲜蓟提取物中的摩尔浓度大40倍的菜蓟苦素的摩尔浓度是必要的(参见图12)。

图15在用菜蓟苦素和多柔比星的联合对人类癌细胞DU145进行处理后的活性实验(条件见实验部分)。该图显示了用菜蓟苦素(黑色)、多柔比星(浅灰色)、和菜蓟苦素+多柔比星(白)以不同浓度的菜蓟苦素和2微克/毫升的固定浓度的多柔比星进行的处理间的比较。

应当理解的是，为了获得降低细胞活性低于20％的效果，比存在于朝鲜蓟提取物中的摩尔浓度大25倍的菜蓟苦素的摩尔浓度是必要的(参见图12)。

图16：关于人类间皮瘤细胞株MSTO221H的伤口愈合实验(条件见实验部分)。

图表16a显示了在只有载体和6微克/毫升的浓度的产物的对照板中在36小时的伤口愈合，而图像16b显示了有关在所示时间用本发明的提取物和用载体进行处理的闭合伤口功效的条状图(用％量化细胞数)。

图17：菜蓟朝鲜蓟提取物调节了DU145细胞中STAT3通路：特别地，该图显示了提取物抑制了DU-145细胞中STAT3的组成性激活且还抑制了STAT3结合到DNA。

17a)蛋白质印迹：用菜蓟朝鲜蓟提取物(200微克/毫升)处理2-4小时后抑制了STAT3的磷酸化，而没有改变该蛋白质的表达。

17b)EMSA，

EMSA：用菜蓟朝鲜蓟提取物(200微克/毫升)对DU-145细胞株处理2-4小时后抑制了STAT3结合到DNA(图17b)。

图18：菜蓟朝鲜蓟提取物调节了KARPAS细胞中STAT3通路：特别地，该图显示了所述提取物抑制了KARPAS细胞中STAT3的组成性激活且还抑制了STAT3结合到DNA。

18a)蛋白质印迹：用菜蓟朝鲜蓟提取物(200微克/毫升)对KARPAS细胞株处理2-4小时后抑制了STAT3的磷酸化，而没有改变该蛋白质的表达。

18b)EMSA：用菜蓟朝鲜蓟提取物(200微克/毫升)对在KARPAS细胞株处理2-4小时后抑制了STAT3结合到DNA。

所使用的菜蓟朝鲜蓟提取物包含0.181％的菜蓟苦素，因此200微克/毫升的提取物包含1.2μM的菜蓟苦素。

图19：菜蓟苦素调节了DU-145细胞中STAT3通路。

菜蓟苦素抑制了DU-145细胞中STAT3的磷酸化和其结合到DNA的能力，具有EC₅₀＝25μM(25μM的菜蓟苦素＝约0.74微克/毫升)

蛋白质印迹：25μM的菜蓟苦素抑制了DU-145细胞中STAT3的磷酸化(图19a)

EMSA：25μM的菜蓟苦素抑制了DU-145细胞中STAT3结合到DNA(图19b)。

图20：菜蓟苦素调节了KARPAS细胞中STAT3通路。

菜蓟苦素抑制了KARPAS细胞中STAT3的磷酸化和其结合到DNA的能力，具有EC₅₀＝25μM(25μM的菜蓟苦素＝约0.74微克/毫升)

蛋白质印迹：菜蓟苦素(25μM)抑制了KARPAS细胞中STAT3的磷酸化(图19a)

EMSA：菜蓟苦素(25μM)抑制了KARPAS细胞中STAT3结合到DNA(图19b)。

图21：菜蓟朝鲜蓟的提取物对细胞周期(FACS法)的影响的评估。用所述提取物处理48小时(图21a)后和72小时(图21b)后以增加在sub-G1期细胞％的方式诱导了MPM细胞(MSTO211H)的死亡。

图22对诱导细胞凋亡进行评估的实验(蛋白质印迹法)。本发明的提取物以100微克/毫升的剂量诱导如由诸如MSTO211H细胞株中PARP、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7的裂解形式的某些凋亡标志物水平的升高所表明的细胞凋亡。

图23通过测量膜联蛋白V的水平来对诱导细胞凋亡进行评估的实验。如通过膜联蛋白V染色所确定，本发明的提取物以时间依赖性和剂量依赖性的方式诱导了细MSTO211H胞株的细胞凋亡。

图24用不同浓度的菜蓟苦素处理后，谷胱甘肽(GSH)的细胞内浓度的分析(条件见实验部分)：三角形12.5μM、正方形25μM、菱形50μM。

菜蓟苦素确定了GSH的细胞内浓度的时间依赖性和剂量依赖性降低。

图25STAT3的谷胱甘肽化实验(条件见实验部分)。菜蓟苦素确定了STAT3的谷胱甘肽化。泳道1为对照，泳道2为1mM的GSH，泳道3为0.5mM的二酰胺，泳道4为谷胱甘肽(GSSG)，泳道5为12μM的菜蓟苦素，泳道6为25μM的菜蓟苦素。

在该实验中得到的数据表明菜蓟苦素降低了GSH的细胞内浓(图26)还表明氧化还原态的变化诱导了STAT3的谷胱甘肽化，防止其磷酸化(图27)。通过用谷胱甘肽乙烯酯预处理对GSH的生理值的恢复逆转了菜蓟苦素抑制STAT3磷酸化的能力。

图26和27涉及在6-7周龄的裸鼠雌性CD1小鼠进行的(植入MPM肿瘤)朝鲜蓟提取物对MSTO211H细胞株抗肿瘤活性的评估。

图26：朝鲜蓟对植入MPM细胞株的作用

用朝鲜蓟对MSTO211H进行预处理24小时。然后，将它们接种于裸鼠CD1小鼠。用朝鲜蓟提取物进行的预处理影响了肿瘤的植入并诱导了肿瘤体积的显著统计学差异(P＝0.01)。

图27：朝鲜蓟提取物对MPM细胞移植的影响。用日益增加量的朝鲜蓟提取物对MSTO异种移植的CD1小鼠治疗3周。观察到朝鲜蓟提取物的治疗剂量依赖性效应。培美曲塞(PMTX)以已知的治疗浓度被用作阳性对照。该图显示了相比于已知治疗浓度的培美曲塞，本发明的提取物的功效，*p<0,0。

具体实施方式

因此，本申请涉及一种菜蓟属提取物在预防和/或治疗存在STAT3因子的组成性激活或异常激活的病理中的用途。如之前所指出的，所述异常激活或组成性激活似乎在于该因子的异常磷酸化或组成性磷酸化，结果在血液和组织中均产生炎症和/或肿瘤生成作用。

在下面的描述中，在权利要求和在附图中，术语“STAT3”表示信号的转导因子和STAT3转录的激活(信号转导子和转录激活因子3)。通常，涉及基因的地方用大写斜体字母，而蛋白质是由非斜体大写字母表示。

在文献中已知，炎症和肿瘤与致癌通路和环境通路紧密相连，且STAT3因子的磷酸化(信号转导子和转录激活因子3)导致其激活并导致在它作为许多细胞因子、趋化因子和与炎症有关的其他调节因子的转录激活因子的细胞核中的位移，从而促进癌症。

因此STAT3激活的抑制剂是对所有存在STAT3因子的组成性激活的这些病理具有预防性和/或治疗效果的因子。本发明首次公开了菜蓟属提取物对STAT3的特异性的抑制作用。

为了本发明的目的的朝鲜蓟或菜蓟属是指属于菜蓟类(菜蓟属)的植物，特别是菜蓟刺亚种朝鲜蓟。

为了实现本发明的目的，所述提取物可以是新鲜的或干燥的叶和/或花头或其混合物的提取物。

术语“花头”是指由植物，例如朝鲜蓟自身(部分常用作食物)，产生的花的头。所述提取物可以是液体提取物，或者冻干的或通过已知的干燥技术干燥的提取物。所述提取物可通过用下列溶剂萃取获得：水、乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇，在每种情况下以纯的形式或彼此的化合物。所述醇可以是甲醇、乙醇、异丙醇且优选乙醇。所述乙醇可用于以纯的形式或与水以下列百分比混合：96％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％。在本发明的非限制性的实施方式中，用于萃取的溶剂可能是由乙醇和水按50:50的比例形成的混合物。所述液体提取物可由通过从1:2至1:100且优选1:10的比例的朝鲜蓟叶与药物/溶剂的渗滤/消化的水醇萃取来制备。所述萃取的持续时间为本领域技术人员通常所用的持续时间且可以是，例如从至少4小时至约8小时。萃取温度通常被控制且可以优选地为，例如大约50℃的温度。从水醇提取物中蒸发醇且随后可以通过冷冻干燥或干燥对水溶性浓缩物进行干燥以提供冻干的提取物或干燥的提取物。

这些提取物的制备对本领域的技术人员来说通常是公知，且不需要在本发明中特别详细地描述。为了实现本发明的目的，可以使用任何根据常规方法制备的上述那些提取物。

特别地，为了本发明的目的，所述提取物还可以是如本文所述的提取物的一部分。

在这种情况下，标准过程包括存在于酒精度为50的所述醇提取物中的醇进行蒸发，通过以4000rpm离心1-5分钟去除在醇中不溶的物质，水溶性溶液的引入(水性浓缩物)，从而导致包含吸附树脂的色谱柱。

上述水性浓缩物可以反过来通过使干燥的或冻干的朝鲜蓟提取物以1:10p/p的比例悬浮在水中而得到。

树脂的进料液体在1°Bix必须具有指示性地包括在0.2之间的悬浮的固体，进料范围介于1和4BV/小时且优选地为2BV/小时。收集相应的液体洗脱液并通过冷冻干燥或干燥的方式进行干燥，被吸附进树脂的物质用96％的乙醇或甲醇或丙酮，优选96％的乙醇洗脱。在最后这种情况下，在以1:1体积/体积的比例加入最后这种情况的水和醇洗脱液并使乙醇蒸发后对醇洗脱液进行干燥或进行冷冻干燥。

根据本发明，如上所定义的菜蓟属提取物可用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的病理。

这样的疾病可以是，例如以及如文献中所指出的，炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤类型的疾病。

为了本发明的目的，以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的病理状态可以是由包含幽门螺杆菌感染、乙型肝炎病毒感染、HPV(人类乳头状瘤病毒)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染的病毒感染(如2009年Yu等人所报道)引起的。

正如已经提到的，术语“STAT3”因此表示在人类中由STAT3基因编码的人类转录因子“信号转导子和转录激活子3”。

本发明涉及在本说明书(例如以下)中详细定义的人类病理状态，其中这个基因在任何情况下被组成性地或异常地激活。

存在STAT3的组成性激活或异常激活的预肿瘤病理状态可以是肿瘤切除之后的病理状态，并由此预肿瘤在某种意义上来说肿瘤可以重新形成，或如在文献中报道的部分细胞上存由炎症向获得恶性特征的转化的病理状态。

根据本发明，所述肿瘤病理状态可以是在现有技术中报道的以STAT3的组成性激活或异常激活为特征的任何肿瘤，如：前列腺癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、脑肿瘤、红白血病、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、间皮瘤(指的是恶性胸膜间皮瘤或MPM)。

特别地，本发明可以适用于治疗暴露于石棉及因此具有恶性胸膜间皮瘤的风险的人群，和用于减少间皮瘤在这样患者群中产生。

更具体地，所述脑肿瘤可以是例如神经胶质瘤、脑脊膜瘤、髓母细胞瘤，所述淋巴瘤可能是Sezary综合征、EBV相关的Buckitt淋巴瘤、松鼠猴HSV-依赖性淋巴瘤、皮肤T细胞有关的淋巴瘤；所述白血病为HTLV-I依赖性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、巨核细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)。

根据本发明的非限制性实施例，如上所定义的菜蓟属提取物可以用于预防和/或治疗以上表1中所列的STAT3的组成性激活或异常激活为特征的病理状态中的任一种。

根据本发明的术语“组成性激活”或“异常激活”可以理解为与STAT3有关的文献中(例如在参考书目中列出的)归于该术语的意思的含义，或根据本发明的术语“组成性激活”或“异常激活”为通常在健康细胞中不存在的该因子的持续激活。

鉴于本发明的提取物在抑制STAT3的激活和STAT3的活性所显示出的特异性，因此本发明的提取物可以用于治疗对用不抑制STAT3的化疗药物治疗耐药的肿瘤病理。不抑制STAT3的化疗药物的非限制性实施例由用于间皮瘤的化疗药物为代表，间皮瘤是具有组成性激活的pSTAT3和高度化疗耐药的肿瘤。常用的试剂的实施例包括胸苷酸合成酶的抑制剂培美曲塞；二氢叶酸还原酶的竞争性和可逆抑制剂氨甲喋呤，在嘧啶核苷酸的生物合成通路中作为假性底物抑制DNA的合成的吉西他滨；结合到微管蛋白的单体上抑制形成微管的抗有丝分裂药物长春瑞滨；以在DNA中形成丝间和丝外交联的方式结合到DNA而能够干扰细胞周期的所有阶段的试剂顺铂。

以下呈现出的以及附图中获得的有关已知STAT3组成性激活的肿瘤细胞株的实验数据还显示了根据本发明的菜蓟属提取物有利地可以与一种或多种抗肿瘤药物联合，从而提高也可协同药物本身的抗肿瘤功效。

因此，根据本发明的实施方式，如本文所描述的菜蓟属提取物可以与一种或多种具有抗肿瘤活性的化合物和/或一种或多种具有抗炎症作用的化合物联合用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

根据一个实施方式，具有抗肿瘤活性的化合物可以是化疗药物且可以选自包括顺铂、多柔比星、培美曲塞、甲氨蝶呤、长春瑞滨、吉西他滨和紫杉醇的组。

因此，本发明包括如在本文所定义的菜蓟属提取物联合一种或多种化疗药物用于预防和/或治疗以STAT3的组成性激活或异常激活为特征的肿瘤或预肿瘤病理状态的用途。

与一种或多种化疗药物联合可以是伴随联合或相继联合，或者可以同时(一次给药或分开给药)或在一段时间或几分钟的时间内给药所述提取物和所述化疗药物，或者可以在一天的过程或治疗性治疗期间的不同时间相继给药，彼此分开超过几分钟。

给药方式由主治医生根据患者的性别、年龄、疾病状态、体重和病史来确定。

无论单独还是联合，如上所述，所述治疗例如在感染以可能具有如上面所指出的那些致瘤效果的已知病理中，或在肿瘤切除以预防肿瘤重新形成的病例中可以是预防性的。

根据本发明的提取物可以配制成可用于如上所述的相同目的的组合物。

因此本发明还涉及一种组合物，包括作为活性成分的菜蓟属提取物和载体和/或稀释剂和/或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

如上面所指出，为了本发明的目的的朝鲜蓟或菜蓟属提取物可以是属于按照示例和上述提供的定义的菜蓟类(菜蓟属)的植物提取物。

所述组合物可以包含作为活性成分的如上所定义的以冻干提取物、干燥提取物或液体提取物的形式的提取物。如已经指出的，所述提取物可通过对无论是新鲜的或干燥的朝鲜蓟的叶或朝鲜蓟的花头或前述部分的混合物进行萃取而获得。保持温度被控制在50℃，通过渗滤-消化来进行萃取，例如以水、96％的乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇以原样或以混合物作为萃取的溶剂。然后可以对所获得的液体提取物进行蒸发，并继而进行冷冻干燥或干燥以提供冻干提取物或干燥提取物。根据本发明，如上述所定义的组合物可用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的病理。

这样的疾病可以是例如和如文献中所指出的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤疾病。本发明的组合物可以用于的各种病理状态的定义与与本发明的提取物的治疗用途有关的上述指定的病理状态的定义是一样的。

为了本发明的目的，所述组合物可以治疗如上述已经定义的以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的病理状态、如上述已经定义的以STAT3的组成性激活或异常激活为特征的肿瘤病理状态、和如在本说明书的范围内已经事先说明的存在STAT3的组成性激活或异常激活的预肿瘤病理状态。

根据本发明的非限制性实施例，如本文所定义的组合物可以用于预防和/或治疗上表1中所列的以STAT3的组成性激活或异常激活为特征的病理状态中的任一种。

另外，根据其他实施方式，如本文所描述的本发明的组合物还可以包括作为活性成分的一种或多种抗肿瘤剂和/或一种或多种抗炎剂。

因此本发明还涉及一种组合物，包括作为活性成分的菜蓟属提取物和一种或多种具有抗肿瘤和/或抗炎活性化合物，所述组合物用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

根据一个实施方式，具有抗肿瘤活性的这些化合物可以是例如选自顺铂、多柔比星、培美曲塞、甲氨蝶呤、长春瑞滨、吉西他滨和紫杉醇的化疗药物。

本发明的组合物可以由主治医生配制成单位剂量或以可剂量(dosable)的方式从而使得治疗适合于每个患者的个体需要。

因此，本发明包含：包括如本文所定义的菜蓟属提取物任选地联合一种或多种具有抗肿瘤活性的其它活性成分和/或一种或多种具有抗炎活性的其它活性成分的组合物的用途，所述组合物用于预防和/或治疗以STAT3的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理状态。

这样的其它活性成分可以是例如化疗化合物，以及所述病理状态可以预肿瘤或肿瘤病理状态。

给药方式由主治医生根据患者的性别、年龄、疾病的状态、体重和病史来确定。

无论单独还是联合，如上所述，所述治疗例如在感染以可能具有如上面所指出的那些致瘤效果的已知病例中，或在肿瘤切除以预防肿瘤重新形成的病例中可以是预防性的。

具有一种或多种如上所述的活性成分的组合物(菜蓟属的提取物任选地联合一种或多种抗肿瘤剂和/或一种或多种抗炎剂)可以明显地包括专门用于常见药学或化妆品实践或食品工业中的一种或多种赋形剂或佐剂。所使用的赋形剂可以属于稀释剂、增溶剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、滑剂和防粘剂的类别。

如果需要，所述组合物还可以含有在药学、化妆品和食品工业中通常所用的调味剂、着色剂和防腐剂。

根据本发明的组合物可以根据本领域技术人员已知的技术，并使用如上所定义的菜蓟属提取物、任选地一种或多种抗肿瘤剂和属于上述类别的一种或多种赋形剂来制备。

所述组合物可以为本领域技术人员认为适合用于口服给药(例如粉剂、颗粒剂、硬或软明胶胶囊、片剂、糖浆剂，滴剂、溶液和口服乳液)、吸入(例如气溶胶、液体和粉末喷雾剂)、局部给药(凝胶剂、软膏剂、乳剂、膏剂、泡沫剂，用于局部应用的无水固体形式、和贴剂)和根据目前使用的和本领域技术人员已知的技术(例如用于皮下使用、肌内使用、静脉内使用或皮内使用)进行的胃肠外给药的任何制剂。通过基于那些通常用于药学实践的物质对待使用的物质进行选择来确定所使用的工艺赋形剂或佐剂。

在基于菜蓟属提取物联合或未联合具有抗肿瘤活性的试剂的制剂的制备过程中，为了获得适合在治疗中使用的稳定制剂，本领域技术人员可以使用根据现有技术认为有用的任何赋形剂。通过举例的方式，在稀释剂的类别中，可以使用固体制剂的稀释剂，例如糖类、多元醇类(例如乳糖、甘露醇、山梨醇)、纤维素类、无机酸盐类(例如磷酸氢钙)、包括钠、钾和钙盐形式的柠檬酸盐、碳酸盐和碳酸氢盐滴定的有机酸盐类，或液体形式的稀释剂类，例如水、用于口服使用(葵花油、橄榄油、玉米油、甜杏仁油、坚果油)或用于局部制剂的(霍霍巴油，短链、中链或长链甘油三酯)食用油类、多元醇类(甘油、丙二醇、己二醇)。

在崩解剂类的类别中，可以使用例如天然淀粉类或改性淀粉类(玉米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉)，交联羧甲基纤维素(croscaramellose)钠、羧甲基淀粉钠、交聚维酮；可以使用的可能的粘合剂包含橡胶类的天然产物(瓜尔胶、黄原胶、阿拉伯树胶)、蔗糖以及包括聚乙烯吡咯烷酮和纤维素的半合成衍生物的合成产物。

使用硬脂酸及其包括镁盐的盐，乙二醇、甘油三酯的聚合物以及天然或合成的蜡作为润滑剂类已被证明是有效的。

表面活性剂用于使包含在所述制剂中形成本发明的基础的一种或多种活性成分与水更可溶性或用水可清洗，这些活性成分单独发挥作用或通过一种或多种稀释剂发挥作用。例如，可以引用山梨醇酯、聚氧乙烯山梨酯、蔗糖酯和硫酸月桂酸钠。

滑剂可以选自例如胶体二氧化硅、沉淀二氧化硅，而可以使用的防粘剂包括例如滑石或淀粉。

在可注射制剂的制备中，可以选择那些允许活性物质有效的溶解或分散的赋形剂。以举例的方式，为了获得适于以注射方式给药的pH和摩尔渗透压浓度的目，可以与水一起使用其它如聚醇和有机酸盐类或无机酸盐类的水溶性载体。

在特定情况下，可以使用非水溶性载体，如油，或通常批准用于注射使用的合成的物质。

本领域技术人员可以使用他所已知的制备方案制备所有的制剂。

仅通过举例的方式，可以通过预先研磨菜蓟属提取物，将得到的粉末与一种或多种抗肿瘤剂以及选定的用来制备所述制剂的赋形剂(例如选自上述那些或市场上可用的以及批准用于口服使用的稀释剂、崩解剂、润滑剂和滑剂)一起在普通的混合器中混合来制备胶囊制剂。

在片剂的情况下，可能有必要对部分或全部的混合物与预先溶解在水中或引入混合物中并用水作为根据现有技术的造粒方法的佐剂的粘合剂进行造粒。

为了根据本领域技术人员已知的获得适于获得片剂的混合物的目的，可以将颗粒被干燥、过筛并进一步与其它粉末混合。

在肠胃外使用的情况下，所述组合物还可以具有在单独容器中的根据具体操作要求方便易混合的活性成分。

为便于使用本文所描述的组合物的目的，这些可以以含有本文所描述的可以有效用于预防和/或治疗于以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的特定病例症状的活性成分(菜蓟属提取物和任选地一种或多种抗肿瘤剂和/或一种或多种抗炎剂)之一的单位剂量的形式呈现。

本发明还涉及一种试剂盒，用于伴随给药或相继给药菜蓟属提取物和一种或多种具有抗肿瘤活性的化合物和/或一种或多种具有抗炎活性的化合物，所述试剂盒用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状，所述试剂盒包括一等分或多等分的如本说明书中所定义的菜蓟属提取物，和一等分或多等分的一种或多种具有抗肿瘤活性的化合物和/或一等分或多等分的一种或多种具有抗炎活性的化合物。

可选地，所述试剂盒可以包括一等分或多等分的含有作为活性成分的如本说明书中所定义的菜蓟属提取物和一等分或多等分的一种或多种具有抗肿瘤活性的化合物和/或一等分或多等分的一种或多种具有抗炎活性的化合物的所述组合物。

如上所述，该化合物可以是选自例如顺铂、多柔比星、培美曲塞、甲氨蝶呤、长春瑞滨、吉西他滨和紫杉醇的化疗药物。

使用本发明的试剂盒或组合物可以治疗或预防的病理是在上述描述中已经指出的那些，以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的病理状态可以由例如包含幽门螺杆菌感染、乙型肝炎病毒感染、HPV(人类乳头状瘤病毒)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染(如在Yu等人2009中所报道)的病毒感染(如文献中指出的)，或由现有技术中所报道的以STAT3的组成性激活或异常激活为特征的任何肿瘤所表示的肿瘤病理状态引起。

该肿瘤的非限制性实施例包括：

前列腺癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、红白血病、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、间皮瘤。

更具体地，所述脑肿瘤可以为例如胶质瘤、脑脊膜瘤、髓母细胞瘤，所述淋巴瘤可以为Sezary综合征、EBV相关的Buckitt淋巴瘤、松鼠猴HSV-依赖性淋巴瘤、皮肤T细胞有关的淋巴瘤；所述白血病可以为HTLV-I依赖性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、巨核细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)。

存在STAT3的组成性激活或异常激活的预肿瘤病理状态可以是肿瘤切除之后的病理状态，并由此预肿瘤在某种意义上来说肿瘤可以重新形成，或如在文献中报道的部分细胞上存在由炎症向获得恶性特征的转化的病理状态。

最后，本说明书还涉及一种治疗方法，用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状，所述方法包括对需要它的个体给药治疗有效量的菜蓟属提取物或包括任选地与一种或多种抗肿瘤和/或抗炎化合物联合的菜蓟属提取物的药物组合物的步骤。

形成本发明基础的所述方法可以通过对存在以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状的受试者给药治疗有效剂量的如本文所定义的所述提取物，任选地与一种或多种抗肿瘤和/或抗炎药物联合来进行；或通过给药治疗有效剂量的如本文所定义的组合物，任选地进一步包括一种或多种抗肿瘤和/或抗炎药物的所述组合物来进行；或通过使用如本文所定义的所述试剂盒给药所述提取物和一种或多种抗肿瘤和/或抗炎药物来进行。

如上所述的给药可以根据由医生选择的给药方式伴随进行或相继进行。

已经报道的大量的实验数据表明根据本发明的所述提取物的功效。

使用的细胞株

-L428人类淋巴瘤细胞株。购自DSMZACC197

-具有组成性激活的STAT3的KARPAS人类淋巴瘤细胞株。购自澳大利亚细胞库#6072604

人类T-细胞淋巴瘤细胞株，于1986年从25岁的具有非霍奇金T-细胞淋巴瘤细胞的人类的外周血建立，现在归为淋巴母细胞淋巴瘤细胞株。卡帕斯(Karpas)299在酪氨酸705和丝氨酸727中表达磷酸化的Stat3。

-具有组成性激活的STAT3的MSTO211H人类肺双相间皮瘤细胞株。购自ATCC#CLR-2081

人类间皮瘤细胞株，从患有间皮瘤(双相恶性)而没有过任何前期治疗的62岁的人类的胸膜泄漏建立。细胞株MSTO211H表示高水平的pSTAT3的。(Tsao等人.Inhibitionofc-Srcexpressionandactivationinmalignantpleuralmesotheliomatissuesleadstoapoptosis，cellcyclearrest，anddecreasedmigrationandinvasion.MolCancerTher2007，6：1962-1972.)

-购自ATCC#HTB-81的DU-145人类癌细胞株

相比于具有高转移潜力的PC3细胞株，细胞株DU145是具有中度转移潜力的人类前列腺癌症细胞株。DU145细胞不是激素敏感的并且不表达PSA(前列腺特异性抗原)。细胞株DU145表达组成性方式的pSTAT3。

-HCT116人类结肠癌细胞株。购自ATCC#CCL-247。

-MDA-MB-231人类乳腺腺癌细胞株。购自ATCC#HTB-26。

-NCI-h28人类4期间皮瘤细胞株。购自ATCC#CRL-5820。

-MPP-89人类间皮瘤细胞株。购自CABRI，登录号ICLCHTL00012。

下面的实施例说明了本发明的菜蓟朝鲜蓟提取物如何能够：

-以剂量依赖性的方式降低间皮瘤细胞的活力(MSTO211H、MPP-89、NCI-H2052、NCI-H28)，对未转化的间皮细胞株(HMC)作用不太强；

在相同细胞株的克隆存活实验中降低形成菌落的能力；

在凋亡实验中诱导恶性间皮瘤细胞MM细胞死亡；

在伤口愈合实验中抑制MM细胞的迁移和增殖；

使MM细胞对用化疗药物(如培美曲塞)进行的连续治疗敏感；

诱导MM细胞中DNA损伤而不诱导对HMC细胞的DNA损伤；

降低MSTO细胞对用所述提取物预处理的细胞的肿瘤移植能力；

在MSTO的异种移植治疗中具有剂量依赖效应。

实施例

1.通过蛋白质印迹法对STAT3的磷酸化进行分析。结果在图1-3中报道。

1.1细胞裂解和蛋白质印迹法

将细胞于冰上在补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(5mM的PMSF，3mM的氟化钠，1mM的DTT，1mM的NaVO4)的裂解缓冲液NP40(50mM的Tris-HClpH7.4，150mM的NaCl，1％的NP-40，1mM的EGTA，1mM的EDTA)中裂解30分钟。等量的蛋白质总提取物(30微克)在8％的聚丙烯酰胺凝胶中通过变性电泳(SDS-PAGE)分解并向硝酸纤维素膜转膜2小时。所述膜用5％的溶解在TBS-吐温_200.05％中的牛奶溶液封闭1小时并用特异性一抗进行孵育。使用以下一抗：抗-β肌动蛋白(A-2228，SIGMA)，抗-pSTAT3的(酪氨酸-705)(sc8059，SantaCruz)和抗-STAT3(sc7179，SantaCruz)。二抗为络合的过氧化物酶(SantaCruz)，和ECL试剂(Amersham,GEHealthcare,Piscataway,NJ,USA)被用于化学发光。

1.2用菜蓟朝鲜蓟提取物处理MPM细胞株和正常商业化间皮细胞(HMC)

MPM细胞株(MSTO-211H、NCI-H28、NCI-H2052、MPP89)从ATCC(Rockville，MD)获得，而HMC(人类间皮细胞)从Tebu-Bio(法国)获得。所有的细胞株在37℃和5％的二氧化碳的特定培养基中单层生长。所述朝鲜蓟提取物方便地溶解在用于可注射溶液的水和乙醇以1:1的比例起始浓度为30毫克/毫升的溶液中。为了测试抗肿瘤特性，然后将产物直接添加到使用不同浓度和不同时间的不同细胞株的培养基中，如附图所示。

1.3结果

在图1至图3中所示的结果显示了相比于未用所述提取物处理的对照组，所述经过实验的提取物如何抑制STAT3的磷酸化。

图1和2显示了在用根据本说明书的菜蓟属提取物处理的MSTO211H细胞上得到的数据。

图1显示了只用载体和菜蓟属提取物、100微克/毫升的培养基处理24小时的对照组的数据(肌动蛋白对照组)，并且图2显示了用不同浓度：25微克/毫升、50微克/毫升、75微克/毫升的菜蓟属提取物处理24小时的细胞的数据。

如对于图1，示出了只用载体和菜蓟属提取物、100微克/毫升的培养基处理24小时的对照组的数据(肌动蛋白对照组)。

2.菜蓟朝鲜蓟提取物和菜蓟苦素抑制了DU-145细胞和KARPAS细胞中STAT3的激活：

如在图17-20中可以看出，菜蓟朝鲜蓟提取物和菜蓟苦素均对STAT3发挥作用。200微克/毫升的包含0.181％的菜蓟苦素的提取物包含1.2μM的菜蓟苦素。这些图显示用25μM的菜蓟苦素所观察到的效果等于用200微克/毫升的具有等于0.181％的菜蓟苦素滴定度，即包括1.2μM菜蓟苦素的提取物所观察到的效果。由于所用提取物的剂量包含1.2μM的菜蓟苦素，所得到的数据显示出所述提取物比菜蓟苦素更有效。

3.恶性胸膜间皮瘤(MPM)细胞的克隆生成实验

以每孔200个细胞接种MPM细胞(MSTO211H、NCI-H28、MPP-89、NCI-H2052)并用不同生长浓度(对照组只用载体处理；12.5微克/毫升；25微克/毫升；50微克/毫升；100微克/毫升，200微克/毫升)的根据本说明书的菜蓟朝鲜蓟提取物处理。每个点在6孔多层板中被分在两板中。形成的菌落15-21天后用结晶紫进行染色。也被称为克隆生成实验的菌落形成实验是一种用于评估抗肿瘤化合物就肿瘤细胞从单个细胞形成菌落的能力而言的效力的技术。菌落被认为是源自单一细胞的50个或更多个细胞(克隆)的组。

所述实验的结果，在图3a-3d中示出，显示了本发明的提取物以剂量依赖的方式抑制所测试的所有MPM细胞株中菌落形成的剂量依赖性能力。

还对HCT116结肠癌细胞、DU145前列腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞进行了相同的实验。在这种情况下，在图4a、4b、4c中所示的数据同样显示出来自本发明的提取物以剂量依赖的方式抑制菌落形成的功效。

4.ATPlite^TM细胞活性实验

按照生产商的说明利用ATPlite^TM检测(PerkinElmer)对暴露于不同浓度的本发明的提取物之后的不同细胞株的活性进行评估。其中指出，术语“载体”指的是治疗中使用的相同体积的浓度为1:1的可注射溶液的水和乙醇的溶液。

ATPLite^TM是一种用于根据萤火虫(北美萤火虫)萤光素酶的活性监测三磷酸腺苷(ATP)的水平的系统。该发光实验是比色，荧光和放射性同位素测试的另一种选择，用于对经过用在该培养基中包含的可能的物质处理的培养的哺乳动物细胞的增殖进行定量评价。ATP的监测实际上是用于评价广泛范围内的药物、生物学反应的调节剂和生物化合物的细胞抑制和抗增殖作用。ATPLite^TM测试系统是基于由添加ATP荧光素酶和D-荧光素的反应的所引起的光的产生。所发射的光在一定范围内与ATP的浓度成正比。细胞中ATP的量与细胞活性相关。

在用不同浓度的根据本发明的提取物(对照组只用载体处理；12.5微克/毫升；25微克/毫升；50微克/毫升；100微克/毫升，200微克/毫升)处理后对各种类型的MPM细胞株(MSTO211H、MPP89、NCI-H28、NCI-H2052)和HMC细胞(由愿意捐助者提供的未转化的间皮细胞)的细胞活性进行分析。

显示了所述实验结果的图5中的曲线图显示出所述提取物能够以剂量依赖的方式显著降低细胞活性。

还对未转化的间皮细胞(HMC)的细胞活性的影响进行了测试，相比于肿瘤细胞株，形成本发明的基础的所述提取物对未转化的间皮细胞的细胞活性的影响表现出较低的细胞毒性(图6A-6C)。

5.细胞活性和增殖的WST实验，本发明的提取物和菜蓟苦素之间的细胞毒素效力的比较。

通过WST实验(WST＝水溶性四唑盐)对细胞毒性进行测定，并利用线粒体脱氢酶的能力将四唑环从黄色的WST分子(四唑鎓盐)上分离以得到橙色的甲臜盐。用被测物质处理细胞后所产生的甲臜的量用分光光度法进行测量且与活细胞的数量成正比。WST-1和特别地WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑鎓)相对于MTT是有利的，因为它们降低在细胞外与作为电子介体的PMS联合产生水溶性的甲臜。最后，所述WST实验：(1)可被直接读取(与需要溶解相的MTT相比)，(2)且给出比MTT更有效的信号，和(3)降低对细胞的毒性(与产生在细胞内积累的不可溶的甲臜的MTT相比)对比。

以下进行WST实验：

6.1图9中示出用50、100、200毫克/毫升的菜蓟朝鲜蓟提取物在24-48-72小时对细胞株DU145进行的WST-1实验

6.2在24和48小时对细胞株DU145进行的WST-1实验，0-100-200-300-400-500-600毫克/毫升的菜蓟朝鲜蓟提取物(菜蓟苦素＝1.361％)以时间依赖性和剂量依赖性方式抑制DU-145细胞的活性。显示了所述实验的图7，还显示了所分析的提取物在100毫克/毫升；200毫克/毫升；300毫克/毫升；400毫克/毫升；500毫克/毫升的浓度(分别包括0.47μM；0.94μM；1.41μM；1.88μM；2.35μM和2.82μM的菜蓟苦素)时的菜蓟苦素含量。菜蓟苦素的含量用微克/毫升和μM表示。

6.3在24和48小时对细胞株DU-145进行的WST-1实验，0-10-20-30-40-50-60μM的菜蓟苦素以时间依赖性和剂量依赖性方式抑制DU-145细胞的活性。结果示于图8

通过比较图7和8可以看出，所分析的提取物比菜蓟苦素更有效40倍以上。

7.与化疗药物协同处理的细胞活性实验

用细胞株MSTO211HNCI-H2052来评估菜蓟朝鲜蓟提取物+抗肿瘤药物联合的效果。

图10中所示的实验通过ATPlite^TM测试(PerkinElmer)按照生产商的说明来进行。

使用与用于治疗的体积相同的浓度为1:1的可注射溶液的水和乙醇的溶液。

试剂：

按照生产商的说明进行稀释的培美曲塞(Alimta,Lilly)。

7.1用ATPliteTM检测菜蓟属提取物和培美曲塞的联合

图10显示了用培美曲塞处理72小时后和用培美曲塞联合菜蓟属提取物处理72小时后MSTO211H的活性曲线。曲线图A显示用非细胞毒性剂量(6微克/毫升)的所述提取物和培美曲塞对MSTO211H细胞进行处理，而曲线图B显示用非细胞毒性剂量(6微克/毫升)的所述提取物和用培美曲塞(不同浓度)对NCI-H2052细胞进行处理，和曲线图C显示用非细胞毒性剂量(6微克/毫升)的所述提取物和用培美曲塞(不同浓度)对未转化的HMC细胞进行处理。所分析的化合物的浓度绘制在横坐标上，而以百分比表示的细胞活性绘制在纵坐标上。

图10A和B显示用提取物处理如何使肿瘤株对用培美曲塞处理敏感。在用双重处理的曲线中，很清楚仅10μM浓度的培美曲塞是如何足以降低所测试的细胞株的细胞活性。有趣的是，在非肿瘤株中，所述提取物对培美曲塞具有保护作用。

7.2用WST实验对细胞活性进行评估

用可变剂量的菜蓟苦素代替所述提取物来实施所述实验以比较所述提取物的功效和菜蓟苦素的功效。

图10显示了通过用顺铂(曲线图A)、多柔比星(曲线图B)和紫杉醇(曲线图C)，只用载体(对照)，用两种不同浓度的菜蓟朝鲜蓟(abo-1)提取物与只用药物以及用两种不同浓度的菜蓟朝鲜蓟(abo-1)提取物联合所述药物培养DU145细胞所得到的数据。

图11中所示的实验中所用的提取物具有0.181％的菜蓟苦素含量。因此所述图显示具有100和200微克/毫升的提取物的菜蓟苦素的浓度等于0.18和0.36微克/毫升的菜蓟苦素。

图11显示了浓度不断增长的菜蓟朝鲜蓟提取物(菜蓟苦素＝1.361％)与15微克/毫升的固定浓度的顺铂之间的联合，且图12显示菜蓟朝鲜蓟提取物(菜蓟苦素＝1.361％)与2微克/毫升的固定浓度的多柔比星之间的联合。

该图还显示了只用提取物(黑色)或只用药物(白色)处理的值。

类似于图11和12，图13和图14显示用菜蓟苦素代替本发明的提取物所进行的相同实验的结果，且显示所述提取物比菜蓟苦素多么显著更有效。

因此图14显示浓度不断增长的菜蓟苦素与15微克/毫升的固定浓度的顺铂之间的联合，且图14显示菜蓟苦素与2微克/毫升的固定浓度的多柔比星之间的联合。

该图还显示了只用菜蓟苦素(黑色)和只用药物(白色)处理的值。

8.伤口愈合实验

所述伤口愈合实验(图16)简单、廉价且是为研究体外定向细胞迁移而开发的第一种方法之一。这种方法模拟体内伤口愈合期间的细胞迁移。基本步骤包括在细胞单层创建“伤口”，然后在闭合“伤口”所必须的细胞迁移过程的开始和适当的时间间隔通过捕获图像监测“伤口”的特定区域。将培养至具有95％融合的MSTO211H细胞接种于6孔纺织板以及用10微升无菌吸管穿刺以除去细胞而制造“伤口”(或切口)。创伤之后在指定的时间产生数字显微照片。最终的柱形图显示了用载体或ABO1处理的切口(以％量化细胞的数目)在指定时间的闭合的功效。

9.评估诱导细胞凋亡的实验

参见图(26-27)

9.1蛋白质印迹

使用如在要点1.1中所描述的相同的技术，且使用以下一抗：抗-β肌动蛋白(A-2228，SIGMA)、抗-半胱天冬酶-3(31A1067，Alexis)、抗-半胱天冬酶-7(#9492，CellSignalling公司)和抗-PARP(#9542S，CellSignalling公司)。

9.2流式细胞仪分析(FACS)以及PI染色和PI/膜联蛋白V染色分析

为了确定本发明的提取物对细胞周期的影响，进行FACS分析。

为了用碘化丙锭(PI)染色，将细胞以10⁴细胞/毫升的密度接种于6孔板中。24小时后，用指定浓度的本发明的提取物对肿瘤细胞处理不同时间间隔。将细胞收集在悬浮液中并将粘附的细胞在PBS中洗涤，用冷冻乙醇(70％体积/体积)固定并在-20℃储存。为了分析，将细胞在1×PBS中洗涤并悬浮在PBS1Z、PI(25毫克/毫升)和RNasiA(200毫克/毫升)的溶液中。

为了PI/膜联蛋白V双重染色，将处理过的细胞收集并重悬在结合缓冲液(HEPESpH7.4、2.5mM的氯化钙、140mM的氯化钠)中。每15分钟将等分的细胞与膜联蛋白VFITC和PI(5毫克/毫升)(Invitrogen)孵育。

在所有的FACS分析期间，对每个样品分析10⁵事件(event)。在GuavaEasyCyte8HT(Millipore)的流式细胞仪上进行流式细胞仪分析。

如在图25中可以看出，如由膜联蛋白V染色所确定的，本发明的提取物以时间依赖性和剂量依赖性的方式诱导了MSTO211H细胞的细胞凋亡。

11.谷胱甘肽的实验

由还原的和氧化的谷胱甘肽之间比例的变化引起的细胞氧化还原状态的变化确定了STAT3的谷胱甘肽化，防止其在酪氨酸中磷酸化及因此其激活(ButturiniE等人.PLoSOne.2011：6(5)：e20174)。

11.1谷胱甘肽(GSH)的细胞内分析。

谷胱甘肽的细胞内浓度通过比色法来进行评价。通过10％的三氯乙酸脱蛋白的细胞提取物用二硫代硝基苯(DTNB)处理，且在与GSH反应后释放的TNB的量通过分析在412nm处的吸光度进行评估。

11.2STAT3的谷胱甘肽化

通过用抗-STAT3抗体过夜孵育蛋白质细胞提取物进行STAT3的免疫沉淀。得到的蛋白质在非还原条件通过SDS-PAGE进行分离并转膜至PVDF膜上。使用抗-GSH抗体识别谷胱甘肽化的STAT3。

图24和25中所示出的数据表明菜蓟苦素降低了细胞内的GSH浓度(图24)以及氧化还原状态的变化诱导STAT3的谷胱甘肽化，防止其磷酸化(图25)。通过用谷胱甘肽乙烯酯预处理对GSH的生理值的恢复逆转了菜蓟苦素抑制STAT3磷酸化的能力。

12.用本发明的提取物处理或未处理的肿瘤细胞的移植

第一次植入实验的描述。

所述MSTO211H细胞用50微克/毫升浓度的朝鲜蓟处理24小时。收集2×10⁶个细胞在PBS/基质胶(BDBiosciences)中的悬浮液被并接种于4周龄的裸鼠雌性小鼠的右髋部。每周对肿瘤的体积监测两次直到第21天。处死小鼠并取出肿块。

13.小鼠内肿瘤细胞的移植以及用菜蓟朝鲜蓟和培美曲塞的处理

第二次植入实验的描述。

植入之前对细胞进行扩增并对它们的活性和污染进行评估，即进行计数并以20×10⁶/毫升的浓度重悬于PBS中。向所述悬浮液中加入基质胶以获得最终浓度为10×10⁶细胞/毫升的PBS基质胶1/1。在48只小鼠皮肤下接种MSTO细胞。

当肿瘤达到60立方毫米的平均体积时，将小鼠分成每组由6只小鼠形成的8组，接受不同的处理。

两组在三周期间一周7天接收饮用水中的朝鲜蓟；其他组在三周期间一周5天腹膜内接收培美曲塞。

随着肿瘤的增长的出现(即当肿瘤达到60立方毫米时)，按如下给药Abo1和培美曲塞而开始处理：连续5天腹膜内以88毫升/小鼠给药100毫克/千克剂量的培美曲塞，饮用水中朝鲜蓟提取物的浓度为25、50和75微克/毫升并在3周期的期间内每隔一天进行测量。

每日对小鼠进行监测以评估任何症状；每周对体重进行两次监测。

在实验结束时(接种后42天)，收集肿瘤块并固定在10％的福尔马林中(24小时后转移到70％的乙醇中)。

每周用三丰(Mitutoyo)卡尺对肿瘤直径测量两次。

参考文献

-AggarwalB.B.等人.Ann.N.Y.Acad.Sci.1091；151-69:2006

-JohnstonPAeGrandisRG,MolInterv；11(1)；18-26:2011

-NiuG.等人.MolCancerRes,6(7)；1099-105:2008

-TurksonJ.JoveR.“STATproteins:novelmoleculartargetsforcancerdrugdiscovery”Oncogene.2000Dec27；19(56):6613-26

-Yu.H.等人“STATsincancerinflammationandimmunity:aleadingroleforSTAT3”NatureReviewsCancer9,798-809(2009年11月)

Claims

1.一种菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

2.根据权利要求1所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，其中所述提取物为菜蓟叶、花头或两部分混合物的干燥或冻干或液体提取物。

3.根据权利要求1或2任一项所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，用于与一种或多种抗肿瘤和/或抗炎化合物联合预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

4.根据权利要求3所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，其中所述联合通过所述提取物与所述一种或多种抗肿瘤和/或抗炎化合物的伴随给药或相继给药来进行。

5.根据权利要求3或4任一项所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，其中所述一种或多种抗肿瘤化合物为选自包括顺铂、多柔比星、培美曲塞、甲氨蝶呤、长春瑞滨、吉西他滨和紫杉醇的组。

6.根据权利要求1至5任一项所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，其中所述病理状态为选自包括前列腺癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、红白血病、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、恶性胸膜间皮瘤的组的肿瘤病理状态。

7.根据权利要求6所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，其中所述脑肿瘤为胶质瘤、脑脊膜瘤、髓母细胞瘤，其中所述淋巴瘤为Sezary综合征、EBV相关的Buckitt淋巴瘤、松鼠猴HSV-依赖性淋巴瘤、皮肤T细胞有关的淋巴瘤；其中所述白血病为HTLV-I依赖性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、巨核细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)。

8.根据权利要求1至7任一项所述的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物，其中所述病理症状为对用不抑制STAT的化疗药物进行治疗耐药的肿瘤。

9.根据权利要求1至4任一项所述的菜蓟属提取物，其中所述炎症症状为由如幽门螺杆菌感染、乙型肝炎病毒感染、HPV(人类乳头状瘤病毒)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染的病毒感染引起的炎症。

10.一种组合物，包括作为活性成分的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物和载体和/或稀释剂和/或赋形剂，所述组合物用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状。

11.根据权利要求10所述的组合物，还包括作为活性成分的一种或多种抗肿瘤和/或抗炎化合物。

12.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述一种或多种抗肿瘤化合物为选自包括顺铂、多柔比星、培美曲塞、甲氨蝶呤、长春瑞滨、吉西他滨和紫杉醇的组。

13.根据权利要求10至12任一项所述的组合物，其中所述病理症状为选自包括前列腺癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、红白血病、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、恶性胸膜间皮瘤的组的肿瘤病理症状。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述脑肿瘤为胶质瘤、脑脊膜瘤、髓母细胞瘤，其中所述淋巴瘤为Sezary综合征、EBV相关的Buckitt淋巴瘤、松鼠猴HSV-依赖性淋巴瘤、皮肤T细胞有关的淋巴瘤；其中所述白血病为HTLV-I依赖性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、巨核细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)。

15.根据权利要求10至14任一项所述的组合物，其中所述病理症状为对用不抑制STAT3的化疗药物进行治疗耐药的肿瘤。

16.根据权利要求10或11所述的组合物，其中所述炎症症状为由如幽门螺杆菌感染、乙型肝炎病毒感染、HPV(人类乳头状瘤病毒)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染的病毒感染引起的炎症。

17.一种试剂盒，用于伴随给药或相继给药菜蓟刺亚种朝鲜蓟提取物与一种或多种具有抗肿瘤活性的化合物和/或一种或多种具有抗炎活性的化合物，所述试剂盒用于预防和/或治疗以STAT3转录因子的组成性激活或异常激活为特征的炎症和/或预肿瘤和/或肿瘤病理症状，所述试剂盒包括：一等分或多等分的菜蓟刺亚种朝鲜蓟的提取物；和一等分或多等分的一种或多种抗肿瘤化合物和/或一等分或多等分的一种或多种抗炎化合物。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述一种或多种抗肿瘤化合物为选自包括顺铂、多柔比星、培美曲塞、甲氨蝶呤、长春瑞滨、吉西他滨和紫杉醇的组。

19.根据权利要求17或18任一项所述的试剂盒，其中所述病理为选自包括前列腺癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、肾细胞癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、红白血病、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌、恶性胸膜间皮瘤的组的肿瘤病理。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述脑肿瘤为胶质瘤、脑脊膜瘤、髓母细胞瘤，其中所述淋巴瘤为Sezary综合征、EBV相关的Buckitt淋巴瘤、松鼠猴HSV-依赖性淋巴瘤、皮肤T细胞有关的淋巴瘤；其中所述白血病为HTLV-I依赖性白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、巨核细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病(LGL)。

21.根据权利要求17至20任一项所述的试剂盒，其中所述病理症状为对用不抑制STAT3的化疗药物进行治疗耐药的肿瘤。

22.根据权利要求17或18所述的试剂盒，其中所述炎症和/或预肿瘤可以为由如幽门螺杆菌感染、乙型肝炎病毒感染、HPV(人类乳头状瘤病毒)感染、爱泼斯坦-巴尔病毒感染的病毒感染(如文献中指出的)引起的炎症。