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CN105296655A - 检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法 - Google Patents

检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法 Download PDF

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CN105296655A
CN105296655A CN201510845595.5A CN201510845595A CN105296655A CN 105296655 A CN105296655 A CN 105296655A CN 201510845595 A CN201510845595 A CN 201510845595A CN 105296655 A CN105296655 A CN 105296655A
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CN
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dna
cis
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methylates
enzyme
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李亚俊
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BEIJING INSTITUTE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Original Assignee
BEIJING INSTITUTE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法，该两种方法的出发点均属于一个总的发明构思，即靶向富集顺式作用元件，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以酶切前后的差异特征选取模板设计引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰位点或其有无甲基化修饰。该检测甲基化修饰位点的方法使用样本用量少、可减小或避免亚硫酸盐干扰后续数据分析以及实验误差较大的问题，实验结果可靠。检测有无甲基化修饰的方法简单可行，准确率高。

Description

检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及检测顺式作用元件有无甲基化修饰或其修饰位点的方法。
背景技术
转录因子(transcriptionfactor)是一群能与DNA顺式作用元件上特定序列专一性结合的反式作用因子，可保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达。顺式作用元件(cis-actingelement)是存在于基因非编码区能影响基因表达的序列。真核生物的顺式作用元件包括启动子、增强子、隔离子等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码蛋白质，它提供一个作用位点，通过与反式作用因子相互作用来调控基因表达。
顺式作用元件上常常发生DNA甲基化(DNAmethylation)，DNA甲基化是最为常见的一种表观遗传改变。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。人类细胞内，大约有1％的DNA碱基发生了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生于CpG双核苷酸(CpGdinucleotide)部位。其功能主要可归结为以下4个方面：维持基因组遗传物质的稳定性，调控基因的表达，建立表观遗传模式以及参与细胞及胚胎的分化、发育过程。DNA甲基化对正确控制基因表达及细胞身份——使得细胞具有相同遗传物质的细胞变为神经细胞、肌肉细胞或皮肤细胞，起至关重要的作用。
包括癌症在内的某些疾病与DNA甲基化模式发生改变有关联，研究顺式作用元件上的甲基化，可帮助我们了解转录因子与甲基化的关联，并帮助开发出一些新疗法。
目前针对已知特定基因的调控区进行高通量的甲基化分析方法主要是基于ChIP-sequencing法建立起来的。然而，该方法起始的ChIP-DNA至少需要100ng，如果样本较为珍稀，常常不容易获得足够多的量。此外，ChIP-sequencing在后续测序时也常常会运用到全基因组重亚硫酸盐测序技术，将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U(发生甲基化的C不受影响)，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰位点的C碱基区分开来，再结合高通量测序技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。然而该方法会引入大量的亚硫酸氢钠，虽然会经过脱盐处理，但也会不可避免的有亚硫酸氢钠残留，为后续的数据分析带来很多的干扰。
此外，采用甲基化芯片技术或者测序技术，对基因组上的DNA甲基化修饰位点、转录因子的特定结合分别进行测定，利用生物信息学手段对相关区域进行分析，也是目前针对已知特定基因的调控区进行高通量的甲基化分析的常用技术手段之一。但其缺点在于，这种方法不是用同一组样本走完所有流程，在一个表观遗传修饰位点分布异质的细胞群体内，观测到的DNA甲基化与转录因子的直接关联有较大误差。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，可解决传统方法中样本用量多、亚硫酸盐处理后数据分析难度大的问题，能高通量地鉴定出特定顺式作用元件甲基化修饰的所在位点。
本发明的第二目的在于提供一种检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，该方法易于操作，节约成本。
本申请的两种方法的出发点均属于一个总的发明构思，即靶向富集顺式作用元件，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以酶切前后的差异特征选取模板设计引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰修饰位点或其有无甲基化修饰。
为了实现以上目的，本发明特采用以下技术方案：
一种检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，所述方法包括如下步骤：
靶向富集顺式作用元件，在所述顺式作用元件的两端连接已知序列的小片段DNA，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以已连接的小片段DNA为模板设计的引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰位点。
由于对所富集顺式作用元件甲基化位点的信息均未知，且富集顺式作用元件的实验过程中常常需要经过将DNA超声随机打断，为了获取该顺式作用元件上所有甲基化位点的信息，需要将所有被打断的片段的两端均连接已知序列的小片段DNA，再以已连接的小片段DNA为模板设计的引物将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以保证所有包含甲基化位点的片段的信息均得到体现。
该方法经过DNA扩增过程放大信号，因而对初始DNA的用量要求较少；该方法从DNA的富集，到连接、酶切、扩增，直至上芯片杂交，所用的一直都是同一批样本，因而各组实验条件一致，稳定性好，可重复性强；本法毋须与全基因组重亚硫酸盐测序技术联用，没有亚硫酸盐残留。
优选的，如上所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，所述方法具体包括以下步骤：
1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件；
2)、在所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件两端连接已知序列的小片段DNA，分别得到Input-DNA与DNA-S；
3)、将DNA-S用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E；
4)、以步骤2)中已知序列的小片段DNA为模板设计引物，对Input-DNA、DNA-S、DNA-E进行扩增；
5)、将步骤4)中扩增得到的DNA进行标记并分别与DNA芯片杂交；
6)、扫描芯片并统计三组芯片的信号值，找到在Input-DNA组、DNA-S组中的信号强度均比DNA-E组中的信号强度有显著性升高的点，即得到特定转录因子结合的DNA元件甲基化修饰位点信息。
为了便于描述，上述Input-DNA指代的是全基因组DNA两端连接已知序列的小片段DNA后得到的产物；DNA-S指代的是富集后的特定顺式作用元件两端连接已知序列的小片段DNA后得到的产物；DNA-E指代的是将DNA-S用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切后得到的酶切产物。
根据所选芯片类型的不同，甲基化芯片上会覆盖数量不等的CpG位点信息，与甲基化芯片杂交的主要目的就是为了确定特定顺式作用元件甲基化修饰位点。其中，在对甲基化位点进行分析时，数据的比较主要在DNA-S组与DNA-E组中进行，DNA-E组由于酶切，无法扩增，所以信号会没有或比DNA-S组弱很多。Input-DNA组主要用于做阳性对照。
由于被甲基化的DNA片段被酶切，使得步骤2)中两端插入的已知序列的小片段DNA也分离，后续的扩增便无法进行。亦即在后续的DNA甲基化的芯片杂交过程中DNA-E组无信号或信号很弱，由此可判定特定顺式作用元件甲基化修饰位点。由于富集特定DNA顺式作用元件时常使用的是相关转录因子的抗体进行免疫沉淀，因而本发明可用来研究不同细胞模型中DNA调控序列、调控蛋白(常为转录因子)或组蛋白修饰与DNA甲基化修饰之间的关系。
优选的，所述靶向富集顺式作用元件的方法包括染色质免疫共沉淀技术、调控元件的甲醛辅助分离技术。
染色质免疫共沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。ChIP技术目前被广为采用，是一种较为成熟的靶向富集特定转录因子结合的DNA片段的方法。
调控元件的甲醛辅助分离技术(Formaldehyde-AssistedIsolationofRegulatoryElements,FAIRE)是近年来才建立的新技术，最初应用于酵母细胞，后被用于多细胞。FAIRE实验过程包括：细胞或组织培养、甲醛交联、细胞裂解、超声波打断染色质，然后进行酚氯仿抽提制备水相DNA。在FAIRE酚氯仿抽提过程中，蛋白未交联的DNA溶于水相，而蛋白结合型DNA则留在两相界面。
优选的，如上所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法：
在步骤2)中，所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件的浓度为1～10ng/μl，用量为30～100ng；
在步骤3)中，所述DNA-S的浓度为2～10ng/μl，用量为20～100ng；
在步骤5)中，用于标记的DNA浓度为4～20ng/μl，用量为1～5μg，且用于标记的三组DNA的浓度及用量相同。
该方法经过DNA扩增过程放大信号，因而对初始DNA的用量要求较少，传统ChIP-sequencing法需要初始DNA常常需要100ng以上，本法最低仅需要30ng初始DNA即可进行实验，大大降低了富集难度，节约了成本，更重要的是降低了实验难度，更适合于珍稀样本的分析与处理。
步骤5)所用DNA的量由后续具体所用的甲基化芯片类型确定，为确保实验严谨，用于标记的三组DNA浓度及用量应保持一致。
进一步优选的，在步骤3)中，所述限制性内切酶为McrBC。
McrBC是一种核酸内切酶，无论甲基胞嘧啶是在DNA的一侧链上还是在对侧链上，McrBC都能切割。对未甲基化的DNA，McrBC无作用。DNA上McrBC的识别位点为5’…PumC(N40-3000)PumC…3’，由两个(G/A)mC形式的半位点组成，这两个半位点之间的距离可以达到3kb，但是最佳的距离为55-103bp。McrBC的切割需要GTP，当存在不可水解的GTP的类似物时，该酶可以特异地结合到甲基化DNA上，但不能进行切割。McrBC作用于一对PumCG序列元件，以此检测高比例甲基化的CpGs，但是不能识别内部胞嘧啶甲基化了的HpaII/MspI位点(CCGG)。
应当注意的是，本发明中涉及的限制性内切酶只是优选为McrBC，这是因为该酶对于甲基化位点的识别与剪切具有一定的广谱性。本领域研究人员可根据具体的实验目的选取不同的更为特异的限制性内切酶。
优选的，在步骤5)中，所述标记DNA的方法为同位素标记或荧光物质标记。
通常标记的方法是经PCR扩增的方法标记上放射性32P/33P或荧光物质。目前用荧光物质标记的方法较为常用，优点是重复性好，操作安全简便。常见的荧光物质主要为Cy3/Cy5，二者均属于3H-吲哚菁类染料，Cy3标记发绿色荧光，Cy5标记发红色荧光。
优选的，如上所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，所述DNA芯片包括全基因组甲基化芯片、启动子芯片、CpG岛芯片或增强子芯片。
芯片的选择是根据实验目的来确定的，除商品化芯片外，也可用于个性化定制的甲基化芯片等。
一种检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，所述方法包括如下步骤：
靶向富集顺式作用元件，用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知该顺式作用有无甲基化修饰。
优选的，如上所述的检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，所述方法具体包括以下步骤：
1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件，得到DNA-S’；
2)、将DNA-S’用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E’；
3)、以步骤1)中所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物，对DNA-S’、DNA-E’进行扩增；
4)、将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和/或实时定量PCR分析是否存在甲基化修饰；
5)、扫描并统计两组电泳泳道的灰度值和/或ΔCT值，比较在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度有无显著性差异，由此判断该特定转录因子结合的DNA元件有无甲基化修饰。
为了便于描述，上述DNA-S’指代的是富集后的特定顺式作用元件；DNA-E’指代的是将DNA-S’用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切进行酶切后得到的酶切产物。
具体的，如果对所研究的顺式作用元件中的甲基化位点信息已知，则在步骤3)中以步骤1)中所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物时，只需选取所要研究的甲基化位点两端的DNA序列设计引物即可；
如果对所研究的顺式作用元件中的甲基化位点信息未知，在步骤3)中以步骤1)中所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物时，则需要以该顺式作用元件3’和5’末端的序列设计引物(或设计多对引物覆盖该顺式作用元件全长)，以保证所有位点上的甲基化状态都能检测到。
优选的，如上所述的检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法：
所述靶向富集顺式作用元件的方法包括染色质免疫共沉淀技术、调控元件的甲醛辅助分离技术；
所述限制性内切酶包括McrBC、Msp1、HpaII、DpnII，或Msp1、HpaII、DpnII与其相应的同工酶联用。
其中，McrBC为通用酶，无论所研究的顺式作用元件中的甲基化位点信息已知未知均可采用，由于发生甲基化的片段无法扩增，因而相应的结果判断方法为：如果在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度比较有显著性升高，则该特定转录因子结合的DNA元件有甲基化修饰；如两组无差异，则该特定转录因子结合的DNA元件无甲基化修饰。
Msp1、HpaII、DpnII只能用于位点信息已知的情况，且这些酶识别的是已知甲基化位点未被甲基化时的特定序列，由于只有未发生甲基化的片段无法扩增，因而相应的结果判断方法为：如果在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度比较有显著性升高，则该特定转录因子结合的DNA元件无甲基化修饰；如两组无差异，则该特定转录因子结合的DNA元件有甲基化修饰。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明与芯片技术联用，一次实验即可确定顺式作用元件上的多个甲基化位点；对初始DNA的用量要求较少，节约成本，且适用于珍稀样本的分析；从DNA的富集，到连接、酶切、扩增，直至上芯片杂交，所用的一直都是同一批样本，因而各组实验条件一致，稳定性好，可重复性强；可以在一个表观遗传修饰位点分布异质的细胞群体内，观测到的DNA甲基化与转录因子的直接关联；毋须与全基因组重亚硫酸盐测序技术联用，没有亚硫酸盐残留，对实验结果的分析更为准确可靠。
(2)本发明可作为用于检测特定顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，操作简单可靠，重复性强。
(3)由于富集特定DNA顺式作用元件时常使用的是相关转录因子的抗体进行免疫沉淀，因而本发明可用来研究不同细胞模型中DNA调控序列、调控蛋白(常为转录因子)或组蛋白修饰与DNA甲基化修饰之间的关系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例7步骤1.3中超声后DNA片段大小，其中左数第一泳道为marker，左数第二和第三泳道均为超声后的片段；
图2为实施例6步骤5用酶切的方法检测特定位点的DNA甲基化的结果，结果显示在所选择的细胞系中，HOXA9，LHX5，NKX2.5，PAX7等发生甲基化修饰的位点被酶切断，而活跃表达的管家基因GAPDH上因为没有甲基化修饰而依然保持了片段的完整性。
图3为实施例7步骤1.7中采用ChIP-realtimePCR的方法对ChIP结果进行验证；其中，IgG/NoAb为阴性对照，可以看到与SUZ12结合的DLL4、LHX5、PAX2及PAX7相对富集程度较高，而活跃表达的管家基因GAPDH上SUZ12的富集程度很低；
图4为实施例7步骤1.7中采用琼脂糖凝胶电泳的方法对ChIP结果进行验证；所示条带为HOXA9，LHX5，NKX2.5，PAX7DNA，其中；Input为阳性对照，IP为ChIP所沉淀的DNA；NAB为阴性对照；
图5为实施例7步骤6中芯片杂交结果图，其中左图为SUZ12的ChIP-chip结果，右图为SUZ12富集片段的甲基化修饰检测的芯片结果；黑色部分代表P<0.01的阳性信号位点，深灰色部分代表P<0.05的阳性信号位点；
图6为对实施例7中DNA甲基化结果的验证；空心点代表未发生甲基化修饰的碱基，实心点代表发生甲基化修饰的碱基。其中，5-AZA为DNA甲基化抑制剂，作为对照，使用该抑制剂后部分细胞的甲基化修饰被逆转。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
检测顺式作用元件甲基化位点的方法，所述方法包括如下步骤：
1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件；
2)、在所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件两端连接已知序列的小片段DNA，分别得到Input-DNA与DNA-S；
3)、将DNA-S用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E；
4)、以步骤2)中已知序列的小片段DNA为模板设计引物，对Input-DNA、DNA-S、DNA-E进行扩增；
5)、将步骤4)中扩增得到的DNA进行标记并分别与DNA芯片杂交；
6)、扫描芯片并统计三组芯片的信号值，找到在Input-DNA组、DNA-S组中的信号强度均比DNA-E组中的信号强度有显著性升高的点，即得到特定转录因子结合的DNA元件甲基化修饰位点信息。
实施例2
一种检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，所述方法具体包括以下步骤：
1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件，得到DNA-S’；
2)、将DNA-S’用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E’；
3)、以步骤1)中所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物，对DNA-S’、DNA-E’进行扩增；
4)、将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳并分析是否存在甲基化修饰；
5)、扫描并统计两组电泳泳道的灰度值，如果在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度比较有显著性差异，则该特定转录因子结合的DNA元件有甲基化修饰；如两组无统计学差异，则该特定转录因子结合的DNA元件无甲基化修饰；
实施例3
一种检测大鼠海马神经元中CRE(cAMPresponseelement，cAMP应答元件)基因甲基化修饰位点的方法，所述方法包括如下步骤：
1)、利用抗CREB抗体，从大鼠海马神经元基因组DNA中用染色质免疫技术靶向富集CRE-DNA；
2)、取大鼠海马神经元基因组DNA与富集后CRE-DNA各100ng(浓度为10ng/μl)，两端连接已知序列的小片段DNA，分别得到Input-DNA与DNA-S；
3)、取100ng(浓度为10ng/μl)的DNA-S用McrBC进行酶切，得到酶切产物DNA-E；
4)、以步骤2)中已知序列的小片段DNA为模板设计引物，对Input-DNA、DNA-S、DNA-E进行扩增；
5)、将步骤4)中扩增得到的DNA(各10μg，浓度20ng/μl)进行荧光物质标记并分别与启动子芯片杂交；
6)、扫描芯片并统计三组芯片的信号值，找到在Input-DNA组、DNA-S组中的信号强度均比DNA-E组中的信号强度有显著性升高的点，即得到的DNA元件甲基化修饰位点信息。
所述显著性升高所用阈值的设定因具体的研究对象，以及所选择的高通量检测策略而异。
实施例4
一种检测人单核巨噬细胞诱导分化过程中MEIS1基因调控元件有无甲基化修饰的方法(该基因甲基化位点未知)，所述方法包括如下步骤：
1)、于人单核巨噬细胞诱导分化前后从基因组DNA中用调控元件的甲醛辅助分离技术靶向富集具有潜在调控功能的DNA元件，获得DNA-S’；
2)、取100ng(浓度为10ng/μl)的DNA-S’用识别甲基化位点的McrBC进行酶切，得到酶切产物DNA-E’；
3)、以MEIS1基因上的目的序列DNA3’和5’末端的序列为模板设计引物，对DNA-S’、DNA-E’进行扩增；
4)、将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳并分析是否存在甲基化修饰；分析方法具体为：
统计两组电泳泳道的灰度值，如果在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度比较有显著性升高，则该特定转录因子结合的DNA元件有甲基化修饰；如两组无差异，则该特定转录因子结合的DNA元件无甲基化修饰。
实施例5
一种检测人骨髓瘤诱导分化过程中CD21基因调控元件有无甲基化修饰的方法(该基因甲基化位点已知)，所述方法包括如下步骤：
1)、于人单核巨噬细胞诱导分化前后从基因组DNA中用调控元件的甲醛辅助分离技术靶向富集具有潜在调控功能的DNA元件，获得DNA-S’；
2)、取50ng(浓度为5ng/μl)的DNA-S’用识别甲基化位点的Msp1及其同工酶EcoR1分别进行酶切，得到酶切产物DNA-E’1和DNA-E’2；
3)、以CD21基因上的甲基化位点两端的DNA序列为模板设计引物，对DNA-E’1、DNA-E’2进行扩增；
4)、将步骤3)中DNA-E’1、DNA-E’2扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳并分析是否存在甲基化修饰；分析方法具体为：
统计两组电泳泳道的灰度值，如果在DNA-E’1组中的信号强度与DNA-E’2组中信号强度比较有显著性升高，则该特定DNA元件上有甲基化修饰；如反之，则该特定DNA元件无甲基化修饰。
实施例6
一种检测人滤泡性淋巴瘤细胞中LHX5基因调控元件有无甲基化修饰的方法(该基因甲基化位点已知)，所述方法包括如下步骤：
1)、提取人滤泡性淋巴瘤细胞基因组DNA获得DNA-S’；
2)、取50ng(浓度为5ng/μl)的DNA-S’用识别甲基化位点的McrBC进行酶切，得到酶切产物DNA-E’；
3)、以LHX5基因上的甲基化位点两端的DNA序列为模板设计引物，对DNA-S’、DNA-E’进行扩增；
4)、将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所述。
分析是否存在甲基化修饰。分析方法具体为：统计两组电泳泳道的灰度值，结果显示在DNA-S’组(第二泳道)中的信号强度与DNA-E’组(第一泳道)中信号强度比较有显著性升高，则该特定转录因子结合的DNA元件有甲基化修饰；
同时将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行实时定量PCR。
分析是否存在甲基化修饰。分析方法具体为：统计两组ΔCT值，结果显示在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度比较有显著性升高，则该特定转录因子结合的DNA元件有甲基化修饰，该结果与电泳验证结果一致。
实施例7
滤泡性淋巴瘤细胞SUZ12结合位点的DNA甲基化高通量检测。
1、染色质免疫沉淀
1.1、细胞的交联
取大约5×106滤泡性淋巴瘤细胞(RL细胞)，用1％的甲醛固定10分钟，0.125M的甘氨酸处理5分钟，400g离心5分钟，PBS洗涤，400g离心5分钟。
1.2、细胞的裂解
于静音混合器上，用1ml细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)，4℃处理1小时，600g离心5分钟。250μl细胞核裂解液(含蛋白酶抑制剂)，4℃处理1小时。
1.3、超声
利用超声破碎仪，将染色质DNA打断至小于1000bp，主带在500bp左右，破碎后的电泳检测，检测结果如图1所示。
1.4、特异蛋白-DNA复合体的富集
取1/200的染色质DNA，作为Input保存。用抗SUZ12抗体在静音混合器上与染色质DNA孵育，4℃过夜。次日，用ProteinA/GAgarose富集特异的DNA片段。2000rpm离心。用梯度洗涤液洗涤，每次5分钟。重悬于TE缓冲液。用碳酸氢钠缓冲液处理2次，每次30分钟，12000rpm离心吸取上清。
1.5、解交联
分别将SUZ12富集的DNA，InputDNA，IgGDNA，加入pH6.5Tris，RNaseA，于65℃金属浴孵育5小时或者过夜，然后用蛋白酶K与37℃孵育2小时。
1.6、DNA的纯化
用Zymo公司的DNA浓缩纯化试剂盒(货号D4003)对DNA进行纯化。
1.7、DNA定量与验证
先后用NanoDrop和Picogreen对DNA进行定量；
用ChIP-PCR及琼脂糖凝胶电泳的方法对ChIP结果进行验证，验证结果如图2～3所示。
2、通用连接片段的连接
分别取10ng的InputDNA和30ng特异的富集DNA片段(浓度均1ng/μl)，按照试剂盒(Sigma，货号WGA2)说明，两端连入DNA片段，将得到的产物分别命名为Input与SUZ12-S。
3、酶切
取20ngSUZ12-S(浓度2ng/μl)，用限制性内切酶McrBC(NEB公司)于37℃孵育2小时。过柱纯化DNA(Invitrogen，货号K3100-01)，将得到的产物命名为SUZ12-E。
4、全基因组扩增
利用Sigma公司的全基因组扩增试剂盒(货号WGA2)将三组DNA进行扩增。
5、DNA片段的荧光标记与芯片杂交
利用Invitrogen试剂盒，针对Input/SUZ12-S，以及SUZ12-S/SUZ12-E，四个样品，分作两组，分别取5μg的DNA(浓度10ng/μl)，进行Cy5，Cy3的标记。将标记好的DNA成对加入Aglient双色芯片(货号G4492A)，置于杂交炉中过夜、洗涤。
6、芯片检测与分析
将杂交好的芯片扫描，并通过生物信息学手段进行统计分析。
在本例中，芯片经过扫描后所得到的结果，用ChIP分析软件分析，根据中心区域以及邻近片段的P(Xbar)和P(X)数值，在A)Input/SUZ12-S芯片中确定阳性位点，B)SUZ12-S/SUZ12-E确定阴性位点；SUZ12结合DNA上同时伴有甲基化的位点为在A)中阳性并且在B)中阴性的片段。对芯片杂交结果的分析图如图4所示。由于高通量检测通常存在假阳性结果，还需要对实施例7中DNA甲基化结果的验证，验证结果如图5所示。
本发明对初始DNA的用量要求较少，从DNA的富集，到连接、酶切、扩增，直至上芯片杂交，所用的一直都是同一批样本，因而各组实验条件一致，稳定性好，可重复性强；通过与甲基化芯片技术联用，一次实验即可确定顺式作用元件上的多个甲基化位点，且实验中没有亚硫酸盐残留，对后续的实验数据分析没有影响；本发明还可作为用于检测特定顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，操作简单可靠，是一种值得推广的检测顺式作用元件有无甲基化修饰及其修饰位点的方法。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
靶向富集顺式作用元件，在所述顺式作用元件的两端连接已知序列的小片段DNA，再用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以已连接的小片段DNA为模板设计的引物，将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知顺式作用元件甲基化修饰位点。
2.如权利要求1所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件；
2)、在所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件两端连接已知序列的小片段DNA，分别得到Input-DNA与DNA-S；
3)、将DNA-S用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E；
4)、以步骤2)中已知序列的小片段DNA为模板设计引物，对Input-DNA、DNA-S、DNA-E进行扩增；
5)、将步骤4)中扩增得到的DNA进行标记并分别与DNA芯片杂交；
6)、扫描芯片并统计三组芯片的信号值，找到在Input-DNA组、DNA-S组中的信号强度均比DNA-E组中的信号强度有显著性升高的点，即得到特定转录因子结合的DNA元件甲基化修饰位点信息。
3.如权利要求1或2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述靶向富集顺式作用元件的方法包括染色质免疫共沉淀技术、调控元件的甲醛辅助分离技术。
4.如权利要求2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于：
在步骤2)中，所述全基因组DNA与富集后的顺式作用元件的浓度为1～10ng/μl，用量为30～100ng；
在步骤3)中，所述DNA-S的浓度为2～10ng/μl，用量为20～100ng；
在步骤5)中，用于标记的DNA浓度为4～20ng/μl，用量为1～5μg，且用于标记的三组DNA的浓度及用量相同。
5.如权利要求1或2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为McrBC。
6.如权利要求2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，在步骤5)中，所述标记的方法为同位素标记或荧光物质标记。
7.如权利要求2所述的检测顺式作用元件甲基化修饰位点的方法，其特征在于，所述DNA芯片包括全基因组甲基化芯片、启动子芯片、CpG岛芯片或增强子芯片。
8.一种检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
靶向富集顺式作用元件，用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，随后以所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物将酶切与未酶切的DNA片段分别进行扩增，以放大差异信号，比较两组的差异信息即获知该顺式作用有无甲基化修饰。
9.如权利要求8所述的检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
1)、从全基因组DNA中靶向富集顺式作用元件，得到DNA-S’；
2)、将DNA-S’用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶进行酶切，得到酶切产物DNA-E’；
3)、以步骤1)中所述的顺式作用元件的DNA序列为模板设计引物，对DNA-S’、DNA-E’进行扩增；
4)、将步骤3)中DNA-S’、DNA-E’扩增得到的DNA进行琼脂糖凝胶电泳和/或实时定量PCR分析是否存在甲基化修饰；
5)、扫描并统计两组电泳泳道的灰度值和/或ΔCT值，比较在DNA-S’组中的信号强度与DNA-E’组中信号强度有无显著性差异，由此判断该特定转录因子结合的DNA元件有无甲基化修饰。
10.如权利要求8或9所述的检测顺式作用元件有无甲基化修饰的方法，其特征在于：
所述靶向富集顺式作用元件的方法包括染色质免疫共沉淀技术、调控元件的甲醛辅助分离技术；
所述限制性内切酶包括McrBC、Msp1、HpaII、DpnII，或Msp1、HpaII、DpnII与其相应的同工酶联用。
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