CN105294819A - 一种用于治疗乳腺癌的新的柠檬苦素类化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗乳腺癌的新的柠檬苦素类化合物。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的柠檬苦素类化合物，可以从枳壳的干燥未成熟果实中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，具有体外抗乳腺癌效应，可以用来开发成治疗乳腺癌的药物。
Description
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及从枳壳的干燥未成熟果实中分离得到的一种具有治疗乳腺癌作用的柠檬苦素类化合物及其制备方法。
背景技术
枳壳为芸香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培变种的干燥未成熟果实。7月果皮尚绿时采收，自中部横切为两半，晒干或低温干燥。味苦、辛、酸。性微寒。归脾、胃经。具有理气宽中，行滞消胀之功效。用于胸胁气滞，胀满疼痛，食积不化，痰饮内停，脏器下垂。枳壳是中药典型的理气药之一，广泛应用于中医临床。
枳壳所含化学成分较为复杂，目前已知的有效成分主要有黄酮类、挥发油类、生物碱类、香豆素类和一些微量元素等。枳壳中黄酮类成分主要有：橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、柚皮芸香苷、异柚皮苷、陈皮素、柚皮素、川陈皮素、红橘素、5-O-去甲基川陈皮素、去甲川陈皮素、橙黄酮、4',5,7,8-四甲氧基黄酮、4-O-甲基黄芩素、3-羟基-3',4',5,6,7,8-六甲氧基黄酮和5,6-二羟基-7,4'-二甲氧基黄酮等。挥发油主要有柠檬烯、芳樟醇、2-十一烷酮、γ-松油烯。枳壳中所含的生物碱类活性成分主要有辛弗林、N-甲基酪胺、酪胺、大麦芽碱等。枳壳中所含的香豆素类成分主要有葡萄内酯、伞形花内酯、异前胡素、马明丙酮化合物、泼朗弗林、异米拉素、花椒毒酚、5-异戊烯氧基线呋喃香豆素、5-甲氧基线呋喃香豆素等。
枳壳中的橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和保肝等作用；柚皮苷具有抗炎镇痛、降血糖等作用；川陈皮素具有抗炎，抗病毒，抗氧化等药理作用；川陈皮素具有很好的抗肿瘤的作用；柚皮素具有抗抑郁、保肝、抗氧化、改善大鼠学习记忆障碍、抗血小板聚集的作用。枳壳挥发油的主要成分是柠檬烯。在临床上，柠檬烯胶囊已上市，主要用于胆囊炎、胆管炎、胆结石和胆道术后综合征等的治疗。在枳壳挥发油中，另一重要成分为芳樟醇，具有防腐、抗菌、抗病毒和镇静等作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从枳壳的干燥未成熟果实中分离得到的一种具有治疗乳腺癌作用的柠檬苦素类化合物及其制备方法。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将枳壳的干燥未成熟果实粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、45:1、25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
进一步地，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。
进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80％。
一种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
附图说明
图1为化合物(Ⅰ)结构式；
图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较；
图3为不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞增殖活力的影响；
图4为不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证
试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
制备方法：(a)将枳壳的干燥未成熟果实(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(172g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、10:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(65g)用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1(8个柱体积)、10:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(37g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(45mg)。
结构确证：白色无定形粉末。HR-ESIMS显示[M+Na]+为m/z463.2110，结合核磁特征可得分子式为C26H32O6，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据δH(ppm，DMSO-d6，500MHz)：H-1(6.68，d，J＝12.5)，H-2(5.79，d，J＝12.5)，H-5(2.22，dd，J＝13.2，4.0)，H-6(1.77，dd，J＝16.0，4.0)，H-6(1.57，ddd，J＝16.0，13.2，4.0)，H-7(4.54，s)，H-9(2.53，d，J＝4.0)，H-11(3.71，q，J＝4.0)，H-12(3.42，t，J＝6.5)，H-15(4.44，q，J＝3.5)，H-16(1.55，ddd，J＝12.0，10.5，3.5)，H-16(1.64，dt，J＝12.0，5.5)，H-17(3.19，dd，J＝10.5，5.5)，H-18(0.55，s)，H-19(1.26，s)，H-21(7.25，s)，H-22(6.34，s)，H-23(7.37，s)，H-28(1.18，s)，H-29(1.29，s)，H-30(1.42，s)，15-OH(4.73，d，J＝3.5)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：155.7(CH，1-C)，117.6(CH，2-C)，165.2(C，3-C)，83.4(C，4-C)，51.5(CH，5-C)，26.9(CH2，6-C)，80.8(CH，7-C)，43.6(C，8-C)，47.3(CH，9-C)，43.8(C，10-C)，73.4(CH，11-C)，80.2(CH，12-C)，48.5(C，13-C)，96.1(C，14-C)，75.0(CH，15-C)，36.6(CH2，16-C)，41.1(CH，17-C)，14.1(CH3，18-C)，17.6(CH3，19-C)，125.9(C，20-C)，139.3(CH，21-C)，112.2(CH，22-C)，141.3(CH，23-C)，29.7(CH3，28-C)，23.3(CH3，29-C)，17.4(CH3，30-C)；碳原子标记参见图1。红外波谱表明该化合物含有羟基(3464cm-1)，羰基(1728cm-1)和烯烃(1682cm-1)等基团；且在230nm处有紫外吸收，表明含有α,β-不饱和酯羰基部分。1HNMR谱显示五个甲基信号(δH1.42，1.26，1.29，1.18，0.55，各3H，s)，β型取代的呋喃环(δH7.37，7.25和6.34，各1H，s)，以及α,β-不饱和酯羰基部分〔δH6.68(1H，d，J＝12.5Hz)和5.79(1H，d，J＝12.5Hz)]。13CNMR，DEPT和HSQC谱中显示有26个碳信号，包括五甲基，两个亚甲基，十二个次甲基(四个含氧碳和五个烯烃碳)，以及七个季碳(一个个羰基碳，两个含氧季碳和一个烯烃碳)。以上功能片段再结合不饱和数表明该化合物为五环结构。上述数据表示，该化合物为柠檬苦素类化合物。HMBC谱中H-1与C-3，C-5和C-10；H-2与C-3；Me-28和Me-29与C-4；Me-19与C-1的相关性表明A环为α,β-不饱和七元内酯环。此外，两个含氧碳信号[δC73.4(CH，11-C)和80.2(CH，12-C)]和两个氢质子信号[δH3.71(q，J＝4.0Hz，H-11)和3.42(t，J＝6.5Hz，H-12)]的相关性表明C环存在一个11,12-环氧基团。HMBC谱中双峰质子信号δH4.73(d，J＝3.5Hz)与含氧次甲基碳δC75.0(C-15)的相关性，并且与H-15(δH4.44，q，J＝3.5Hz)有相同的耦合常数，表明C-15位连有一个羟基。通过HMBC谱中Me-18和Me-30的相关性可知C-14为含氧季碳。HMBC谱中H-7和C-14的相关性说明该化合物含有氧杂环丁烷部分。ROESY谱中H-7与Me-30，以及Me-30与15-OH的交叉峰表明氧杂环丁烷部分为α构型。通过HMBC谱中H-17与C-20，C-21和C-22；以及H2-16与C-20的相关性，可知呋喃环位于C-17位上。ROESY谱中，H-6β与Me-19，Me-19与Me-29，Me-19与Me-30，Me-30与H-7，Me-30与H-12和H-12与H-17的相关性表明H-7，H-12，H-17，Me-19，Me-29和Me-30为β构型。因此，H-6α与H-5；H-5与Me-28；H-5与H-9的相关性表明它们均为α构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和ROESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验
一、材料和仪器
DMEM/F12高糖培养液购于北京Hyclone公司。改良型RPMI-l640培养基购于北京Hyclone公司。标准胎牛血清购于天津TBD公司。CCK-8细胞活力检测试剂购于日本株式会社同仁化学研究所。AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购于上海炎彬化工科技有限公司。JC-1线粒体膜电位探针购于江苏碧云天生物技术研究所。二甲基亚矾(DMSO)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)购于Sigma公司产品。化合物(Ⅰ)自制，制备方法见实施例1，HPLC归一化纯度大于98％。
-70℃低温冰箱(FormaScientificInc.公司，美国)，电子天平(岛津AEL-200型，日本)，超净工作台(SW-CJ-IC型，苏州)，恒温振荡器(THZ-C型)，高压蒸汽消毒锅(YX-400B型)，CO2细胞培养箱(FormaSeriesⅡ，Thermalelectroncorp.，美国)，恒温水浴锅(BHW2-I型，国产)，倒置相差显微镜(CK40型，Olympus，日本)，显微镜(BX51型，Olympus，日本)，显微数码采集系统(DP71型，Olympus，日本)，多功能酶标仪(InfiniteM200型，TECAN，瑞士)，台式室温高速离心机(TGL-16G型，北京)，台式低温高速离心机(2K15型，sigma公司，美国)，BL60电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，LD4-40大容量离心机(北京京立离心机有限公司)，2K15高温低速冷冻离心机(sigma公司)，UV765紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，激光共聚焦扫描显微镜(MRC-1024型，Bio-Rad，英国)。
二、试验方法
1、细胞株及培养
选用乳腺癌MCF-7细胞(雌激素受体阳性ER+，人类表皮生长因子受体-2阴性HERZ/neu-)、乳腺癌MDA-MB-231细胞(ER-，HERZ/neu-)和乳腺癌MDA-MB-453(ER-，HERZ/neu+)细胞株，三种细胞株均来自于中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞培养于含10％标准胎牛血清的DMEM/F12高糖培养液中，MDA-MB-453细胞培养于含10％标准胎牛血清的RPMI-1640培养液中，以上细胞均于37℃、5％CO2条件下常规培养传代。三种乳腺癌细胞均为贴壁细胞，贴壁细胞的传代：待细胞贴壁生长2～3d至80％融合时，弃去旧培养液，用适量的0.1mol/LPBS(pH7.4)漂洗细胞2次后向瓶内加入适量0.25％的胰酶(pH7.4)的0.1mol/LPBS配制，过滤除菌。消化，以刚好盖住细胞培养瓶底部为宜，光镜下观察，待细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入新鲜的培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打，使细胞脱离瓶底形成细胞悬液；调整细胞浓度，吸取适量细胞悬液加入新培养瓶中，加入6mL新鲜培养基，显微镜下观察，放置于细胞培养箱。
2、细胞增殖活力检测
利用CCK-8法检测化合物(Ⅰ)对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响。CCK-8试剂盒(CellCountingKit-8)是由日本同仁化学研究所开发的检测细胞增殖的试剂盒，CCK-8试剂中含有WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-MethoxyPMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以2.5×105/mL细胞浓度接种于96孔细胞培养板内，每孔200μL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作6个平行孔，分别加入不同量的化合物(Ⅰ)，使其终浓度分别为200、150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，以PBS洗3次，加入新鲜培养液每孔200μL，然后每孔加入10μLCCK-8，培养4h收获细胞，以酶标仪检测450nm处光密度值[D(450)]，以蒸馏水空白调零，计算不同浓度化合物(Ⅰ)作用的增殖抑制率。
细胞增殖抑制率＝[对照D(450)一实验组D(450)]/对照D(450)×100％
3、细胞凋亡的检测
利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响。实验严格按照AnnexinV凋亡检测试剂盒操作说明进行。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以105/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好。实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物(I)，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4℃预冷的PBS(pH7.2)洗细胞3次，常规胰酶消化，制作单细胞悬液，离心，用250μL稀释的binding缓冲液重新悬浮细胞，并使其浓度为1×106/mL，取100μL的细胞悬液于5mL流式管中，加5μLAnnexinV/FITC溶液，静置5min，加入20μg/mL的PI溶液10μL，混匀后于室温避光放置10min，在反应管中加400μLPBS，利用流式细胞仪上机检测各组荧光状况。细胞根据AnnexinV和PI染色情况分别分至4个相，AnnexinV和PI染色均阴性细胞为正常存活细胞，PI染色阳性、AnnexinV染色阴性为机械损伤或破裂细胞，AnnexinV和PI染色均阳性为坏死或晚期凋亡细胞，AnnexinV染色阳性、PI染色阴性判定为早期凋亡细胞。
4、细胞线粒体膜电位的检测
利用细胞线粒体膜电位分子探针JC-1和激光共聚焦扫描显微镜检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MBA-MD-453线粒体膜电位的影响。具体操作为：将对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-453常规传代，细胞计数，以105/mL细胞浓度接种于6孔细胞培养板内，每孔5mL，培养过夜，待细胞贴壁且生长良好实验分5组，每组作3个平行孔，分别加入不同剂量的化合物(I)，使其终浓度分别为150、100、50mg/mL，对照组加等量蒸馏水，培养24h，弃掉培养液，用4℃预冷的PBS(pH7.2)洗细胞3次，加入1.0mLPBS，加入10μL2.5mmol/L的JC-l，使其终浓度为25μmol/L，在37℃、5％CO2培养箱内避光孵育20min，用PBS洗涤3次，激光共聚焦扫描显微镜检测分析。
5、数据的统计分析
所有数据均以平均数士标准差表示，采用SPSS12.0统计软件，对实验结果进行单因素方差分析，P<0.05认为两者间存在显著差异。
三、结果及结论
1、细胞增殖活力检测结果
利用CCK-8法检测不同浓度化合物(Ⅰ)作用对三种乳腺癌细胞增殖活力的影响，结果表明，化合物(Ⅰ)作用可使三种乳腺癌细胞增殖活性均降低，且随作用浓度的增加降低程度增加，显示出剂量-效应关系，100、150和200mg/mL组与对照组相比均出现显著性差异(P<0.05，P<0.01)，化合物(Ⅰ)作用可显著抑制乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453的增殖，显示出较强的体外细胞毒性，表明化合物(Ⅰ)具有较强的体外抗乳腺癌效应。结果见图3和表1。
2、细胞凋亡的检测结果
利用AnnexinV/PI双染流式细胞分析技术检测化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453凋亡的影响，凋亡分析结果显示，化合物(Ⅰ)作用24h可使三种乳腺癌细胞的凋亡率均升高，显示出促凋亡效应，且具有剂量-效应关系，100和150mg/mL组与对照组相比具有显著差异(P<0.05)表明化合物(Ⅰ)可显著诱导乳腺癌细胞凋亡，发挥抗肿瘤作用。结果见图4。
总结，本研究通过对化合物(Ⅰ)抗乳腺癌作用研究，发现化合物(Ⅰ)可使三种乳腺癌细胞增殖活性降低，显著抑制其增殖，显示出较强的体外细胞毒性，具有体外抗乳腺癌效应。
表1不同剂量化合物(Ⅰ)对乳腺癌细胞增殖的抑制率(％)
| 50mg/mL | 100mg/mL | 150mg/mL | 200mg/mL | |
| MDA-MB-453细胞 | 14.80 | 29.80 | 33.10 | 44.30 |
| MDA-MB-231细胞 | 11.40 | 24.00 | 30.60 | 37.50 |
| MCF-7细胞 | 10.30 | 20.20 | 26.20 | 35.10 |
实施例3
片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。
实施例4
口服液制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
实施例5
胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
实施例6
注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。
实施例7
无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (7)
1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，
2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将枳壳的干燥未成熟果实粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、45:1、25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。
3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。
4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80％。
5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。
6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
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