CN105267619B - 一种抑制ras原癌基因过表达的抗肿瘤中药复方提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中药复方提取物、及其制备方法和应用，该中药复方由人参、麦冬组成。已有研究表明约90%胰腺癌、50%结肠癌、30%‑40%肺腺癌及5%‑40%的白血病是由ras基因的过表达造成的，ras基因已成为公认的筛选抗癌药物的靶标。本发明公开的一种该中药复方提取物的制备工艺，与其水煎处理液相比，该工艺制备得到的中药复方提取物毒性低，抑制ras基因通路过度激活的效果更好。另外，本发明还提供了一种中药复方提取物的新用途，可在抑制ras原癌基因过表达中应用和在制备抑制ras原癌基因突变后过表达的抗肿瘤药物中应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药复方提取物及其制备工艺，具体的讲该中药复方由人参、麦冬组成，具体涉及中药复方提取物在抑制ras原癌基因过表达中的应用和在制备抑制ras原癌基因突变后过表达的抗肿瘤药物中的应用，属抗肿瘤药物领域。
背景技术
目前，恶性肿瘤已经成为人类的头号杀手，严重的危害着人类的健康，世界卫生组织的资料表明，每年全世界肿瘤的发病为1000万人，死亡约700万人，我国每年癌症每年的新发病例为200万，因癌症死亡的约为140万，我国居民死亡5人中，即有1人死于癌症。
约30％的人类肿瘤是由于ras原癌基因突变后激活导致RAS蛋白表达水平增高造成的。若RAS蛋白持续处于活化状态，可与下游的效应蛋白结合，将信号传递到下游信号元件，引起细胞的异常增殖，导致肿瘤的发生，以ras信号通路为靶标的抗肿瘤治疗已成为肿瘤治疗学的研究热点，因此，ras原癌基因已成为公认的筛选抗相关恶性肿瘤药物的靶标。
RAS蛋白在调控几种参与调节正常细胞增生的重要信号通路方面具有重要的作用，所以以RAS蛋白和RAS蛋白所调控的信号通路为靶标的肿瘤治疗，在治疗由ras原癌基因突变所导致的肿瘤中具有非常重要的价值。2005年12月20日美国FDA批准的晚期肾细胞癌治疗药Nexavar,其直接靶标就是Ras信号途径，可抑制Raf/MEK/ERK信号传导通路，直接抑制肿瘤生长；以ras效应子通路为靶标的激酶抑制剂如ID1839和OSI774，其可有效地阻断EGFR酪氨酸激酶的活性并在某种程度也能抑制ERBB蛋白家族的其它成员，但这些都不是直接针对ras的药物。以ras蛋白为靶标的法尼基化转移酶抑制剂也可以抑制其它大部分蛋白的法尼基化(可能包括一些正常人体蛋白)，但也存在特异性差的问题，因此，开发安全高效的治疗ras原癌基因过度激活的抗肿瘤药物是当务之急。
我国中药在临床肿瘤治疗方面取得了一定疗效，且毒性较低，为肿瘤的预防和治疗开辟了一条新路。
人参为五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根及根茎，主要活性成分为人参皂苷和人参多糖。人参具有大补元气、补脾益肺、生津安神益智，抗疲劳，抗肿瘤，抗休克，降血脂等功效。
麦冬是百合科多年生草本植物麦冬(Ophiopogon japonicus(Thumb)Ker-Gawl)的干燥块根。麦冬性微寒，味甘，微苦，具有，具有滋阴益精、养阴益气、清心除烦、润肠通便等功效，是常用中药之一。麦冬具有广泛的药理作用，例如抗心肌缺血，抗心律失常，抗衰老，抗肿瘤，免疫调节等作用。
迄今为止，没有文献报道过含有人参、麦冬的中药复方能够抑制ras原癌基因突变后的过表达，市场上也没有以含有人参、麦冬的为原料的中药复方提取物能够专性抑制由ras原癌基因突变后过表达导致的抗肿瘤药物。而本发明根据人参、麦冬的特性，经过艰苦努力，通过大量筛选分析，研制了一种治疗ras原癌基因过度激活的肿瘤的中药复方，该中药复方通过下调原癌基因Ras通路的过度激活，达到治疗肿瘤的目的，且毒性低，无致畸作用，适于在制备由ras原癌基因突变后过表达引起的相关抗恶性肿瘤药物中的应用，可以与任何一种药学上可以接受的辅料混合制成各种剂型，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
在制备该中药复方提取物的过程中发现，仅水煎处理就可以显著抑制ras基因通路的过度激活，但毒性大，安全性差。因此，该发明公开了一种该中药复方提取物的制备工艺，对该复方用无水乙醇进行回流提取，并且在醇提的基础上，通过大孔树脂对其进行进一步分离纯化，分离纯化后的成分不仅保留了水煎剂抑制ras原癌基因过表达的作用，并且大大降低了中药复方水煎剂的毒性，因此效果更好，可在制备抑制ras原癌基因过表达的抗相关恶性肿瘤的药物中应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种中药复方提取物的制备工艺，具体的讲该中药复方由人参、麦冬组成，以期提供一种抗肿瘤活性高，毒性小，廉价的中药复方提取物，本发明的另一目的是提供一种中药复方提取物的新用途，具体涉及该中药复方提取物在抑制ras原癌基因过表达中的应用和在制备抑制ras原癌基因突变后过表达的抗肿瘤药物中的应用。
本发明通过下述技术方案予以实施。
本发明所述的一种中药复方提取物，其中该中药复方由人参、麦冬组成，该中药复方提取物是由下列方法制备的：取人参、麦冬，加入乙醇溶液，浸泡，加热回流，过滤，减压浓缩，得总浸膏；将总浸膏用蒸馏水完全溶解，上大孔树脂柱，吸附24h，之后用洗脱液洗脱，洗脱液浓缩至稠膏，干燥，即得。
本发明所述的一种中药复方提取物，以人参、麦冬为原料制成，所述原料药的质量比为4.5～9：4.5～9。
本发明所述的一种中药复方提取物，以人参、麦冬为原料制成，所述原料药的质量比为9：4.5。
本发明所述的一种中药复方提取物，所述的回流提取时的乙醇溶液为无水乙醇。
本发明所述的一种中药复方提取物，所述的大孔树脂为D101型大孔树脂。
本发明所述的一种中药复方提取物，所述的中药复方总浸膏分离纯化洗脱时的洗脱量为10倍柱体积。
本发明所述的一种中药复方提取物，所述中药提取物总浸膏在分离纯化时所用的洗脱液是乙醇溶液。
本发明所述的一种中药复方提取物，所述中药提取物总浸膏在分离纯化时洗脱时的乙醇溶液是无水乙醇。此时，在保证中药复方提取物药效的同时，几乎不显示毒性。
本发明为中药复方提取物，所述的肿瘤是由ras原癌基因突变后过表达导致的。
本发明为中药复方提取物在抑制ras原癌基因过表达中的应用。
本发明所述的中药复方提取物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，可以将中药复方提取物添加药学上可接受的载体如填充剂、润滑剂、湿润剂、促进吸收剂、吸附载体、稀释剂、赋形剂等，必要时可加入甜味剂、香味剂等，制备成注射剂、散剂、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液、片剂等药物的多种剂型，这是本领域技术人员可以理解的。
有益效果：本发明提供一种治疗ras原癌基因过表达的肿瘤的中药复方提取物及其在制备治疗相关恶性肿瘤药物中的应用，和现有的技术相比有以下的优点：
(1)利用本发明中的制备工艺制备的中药复方提取物效果好，能显著降低毒性，使评估抑制ras原癌基因通路过度激活药物的模型秀丽隐杆线虫的死亡率降低，野生型比例升高。
(2)利用本发明中的制备工艺制备的中药复方提取物可以显著抑制ras原癌基因过表达，可在制备治疗由ras原癌基因过表达导致的肿瘤药物中应用。
(3)中药复方中人参、麦冬之间的组方配比可以根据中药组方原则合理改动，利用本发明中的制备工艺制备的中药复方提取物其仍然可以显著下调ras原癌基因过度激活，具有抗肿瘤活性。
(4)利用本发明中的制备工艺制备的中药复方提取物仅仅作用于过表达的突变体RAS蛋白，而对野生型RAS蛋白无影响。提示中药复方提取物在应用上安全，它仅作用于癌细胞，而不会作用于正常细胞。今后，我们有望将中药复方提取物应用在抗相关恶性肿瘤药物的制备中，其中，所述肿瘤是由ras原癌基因的过表达导致的，从而为此类肿瘤患者提供更好的治疗，为一些疑难癌症的治疗提供新的途径。
(5)中药复方提取物显著下调ras原癌基因过表达，并不是致突变引起的，不致畸。
(6)由于ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制ras原癌基因通路过度激活的抗肿瘤药物。因此，本发明采用了秀丽隐杆线虫突变株作为评估抑制ras原癌基因通路过度激活药物的模型，并得出了中药复方提取物对ras原癌基因过表达有明显下调作用、具有抑制ras原癌基因通路过度激活的结论。
该中药复方提取物可以特异性下调ras原癌基因突变后所致的过表达，可在制备治疗由ras原癌基因突变后过表达引起的相关恶性肿瘤药物中应用，提供了一种靶标明确的治疗肿瘤的药物。
具体实施方式
以下提供具体实施例来说明本发明，但不限于这些实施例。
实施例一 中药复方的制备
材料：人参、麦冬购自兰州黄河市场。
(1)中药复方水煎剂的制备
称取人参900g、麦冬450g；水煎，得总浸膏，溶于水，定容，最后将所得样品配制成1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml溶液备用。
(2)中药复方提取物的制备
称取人参900g、麦冬450g；加无水乙醇溶液浸泡，加热回流后过滤，减压浓缩得到中药复方总浸膏，将总浸膏溶于水，定容至定容100ml；用D101大孔树脂装填色谱柱，预处理，备用。取20ml浸膏液，上D101型大孔树脂柱，分别用0％、30％、50％、70％、无水乙醇溶液洗脱，10倍柱体积冲洗。
实施例二 中药复方提取物改善中药复方水煎剂毒性的效果
Ras是一种小分子蛋白，参与调控动物发育过程中的很多重要环节。ras信号通路从线虫到人高度保守，在秀丽隐杆线虫中let-60基因编码保守的RAS蛋白，它与人类的RAS蛋白相比具有83％的同源性。如果ras突变，在秀丽隐杆线虫中会引起线虫产生多阴门，在人类中则是引起细胞的恶性增殖，导致肿瘤的发生。因此，模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)Ras/MAPK信号通路过度激活型突变体被作为受试群体广泛应用于筛选抑制原癌基因ras通路过度激活的抗肿瘤药物。
MT2124是let-60/ras过度激活的秀丽隐杆线虫，会产生多阴门的表型。将中药复方稀释一定的浓度，作用于秀丽隐杆线虫MT2124，如果能够抑制受试线虫群体多阴门产生个体的比例，而只有一个真阴门的野生型线虫个体比例上升，则说明药物作用于ras通路，下调了该通路的过度激活，具有抗肿瘤活性。群体中野生型线虫的比例越高，则药物作用效果越显著。
1.实验材料
秀丽隐杆线虫株：秀丽隐杆线虫突变体MT2124，基因型为：let-60(n1046sd,gf)IV，购自CGC(Caenorhabditis Genetics Center)；
细菌株：尿嘧啶渗漏突变型大肠杆菌OP50，作为秀丽隐杆线虫的食物，购买于CGC。
2.试剂的配制
NGM培养基：NaCl1.5g，K2HPO41.3g，KH2PO48.5g，蛋白胨1.4g，琼脂粉8.5g，补充蒸馏水至500mL。灭菌后加入过滤除菌的500μL胆固醇(5mg/mL，无水乙醇配制)，高压蒸汽灭菌的500μL1mol/L MgSO4，500μL1mol/L CaCl2。
LB液体培养基：NaCl1g，蛋白胨1g，酵母膏0.5g，补充蒸馏水至100mL。溶解后用1MNaOH调节pH值为7.0，高温灭菌。
M9缓冲液：Na2HPO4·12H2O15.12g，KH2PO43g，NaCl5g，MgSO4·7H2O0.25g，高温灭菌。
S基础液配方(1L)：NaCl58.5g，K2HPO410g，KH2PO46g；补充蒸馏水至1000mL，高温灭菌。
1M柠檬酸钾(1L)：柠檬酸·H2O20g，柠檬酸钾·H2O293.5g，补充蒸馏水至1000mL，高温灭菌。
Trace(1L)：Sodium-EDTA1.86g，FeSO4·7H2O0.69g，MnCl2·4H2O0.2g CuSO4·5H2O0.29g，ZnSO4·7H2O0.025g，补充蒸馏水至1000mL，高温灭菌。
S液配方(1L)：S基础液1L，1M柠檬酸钾10mL，Trace10mL，1M CaCl23mL，1MMgSO43mL，5mg/mL胆固醇1mL，补充蒸馏水至1L，临用前配制。
3.仪器
高压灭菌锅 (上海申安医疗器械厂)
单人单面净化工作台 (苏州净化设备厂)
SPX智能型生化培养箱 (宁波江南仪器厂)
恒温培养摇床 (上海一恒科技有限公司)
隔水式恒温培养箱 (上海一恒科学仪器有限公司)
连续变倍体视显微镜 (上海一恒科学仪器有限公司)
电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司）
漩涡搅拌器 (上海精科仪器有限公司)
离心机 (CT15E，日立)
4.具体试验步骤
线虫的培养：将线虫接在涂有大肠杆菌OP50的固体NGM板上，然后将放在20℃的培养箱中培养，当线虫长到成虫时进行同步化处理。
线虫同步化：用M9缓冲液将平板上的线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清；加入裂解液(终浓度：3.2％NaClO和1M NaOH)；在涡旋仪上震荡7min，使线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1ml M9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。
药物作用：本实验在96孔板上进行，每个处理设置五个重复。先将经同步化得到的的L1期线虫浓度调整至80-100条/20μL。然后向每孔中加入140μL S液，20μL药液，20μL线虫液，20μL OP50。放到20℃恒温培养摇床中培养。培养至成虫后，在倒置显微镜下进行观察，计算野生型比率(％)＝100％×野生型线虫数/(野生型线虫数+突变体线虫数)。
5.中药复方水煎剂抑制ras通路过度激活生物活性及其对秀丽隐杆线虫突变体MT2124生长的影响
表1中药复方水煎剂抑制ras通路过度激活生物活性测定及其对秀丽隐杆线虫突变体MT2124生长的影响
表1表明中药复方水煎剂，可以作用于秀丽隐杆线虫ras突变体MT2124，显著抑制MT2124的多阴门表型，使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比例显著增加，并呈浓度依赖关系，说明中药复方水煎剂对ras原癌基因过度激活有明显下调作用，使突变体变为野生型。另外，由线虫死亡率可以看出中药复方水煎剂对秀丽隐杆线虫显示出了毒性，并随着浓度的增加毒性增大。
6.中药复方提取物抑制ras通路过度激活生物活性测定及其对秀丽隐杆线虫突变体MT2124生长的影响
表2中药复方提取物抑制ras通路过度激活生物活性测定及其对秀丽隐杆线虫突变体MT2124生长的影响
表2结果表明使用D101柱子对中药复方提取物进行分离纯化后，D101柱子洗脱的有效成分多集中在无水乙醇溶液洗脱段，可使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比例显著增加(P﹤0.05)，由空白对照组的5％升至77％，且有效成分几乎不显示毒性。
综合表1、表2的结果可以看出，中药复方水煎剂与中药复方提取物能显著抑制ras通路过度激活，提高线虫的野生型比例，但是，中药复方水煎剂的毒性大，引起线虫大量死亡，而本发明的中药复方提取物在保留中药复方水煎剂抑制ras通路过度激活效果的同时，毒性大大下降，几乎不会引起线虫死亡。因此，相比前者，本发明的中药复方提取物毒性更小，效果更好。
实施例四 中药复方提取物对秀丽隐杆线虫MT8189(lin-15突变失活)的作用
实验材料：秀丽隐杆线虫MT8189，多阴门表型，基因型:lin-15b(n765)X，购自CGC(Caenorhabditis Genetics Center)；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。
具体实验步骤：同实施例二。
在lin-15(n765)X位于ras的上游，正常情况下抑制ras基因的表达，MT8189线虫株系中该基因失活导致线虫呈多产卵器表型。
本实施例中药复方提取物对秀丽隐杆线虫MT8189(lin-15突变失活)的突变体比例比例为100％，说明中药复方提取物不能抑制lin-15(n765)X的多阴门表型，根据遗传上位的原则，中药复方提取物既然可逆转其下游的let60/ras原癌基因过度激活导致的多阴门表型，那么也抑制MT8189的多阴门表型，但本实验中未观察到预期结果，即中药复方提取物不能抑制let60/ras上游基因lin-15(n765)X的多阴门表型。这可能是由于lin-15(n765)X线虫中包含的是野生型let60/ras拷贝，中药复方提取物仅仅对过表达的let60/ras起作用，对野生型let60/ras不敏感，即中药复方提取物仅作用于过度激活的RAS蛋白，对野生型RAS蛋白不敏感，这说明该中药复方提取物仅仅作用于ras过度激活的引起肿瘤细胞，而不作用于正常的细胞。
实施例五 中药复方提取物对秀丽隐杆线虫CB1275(lin-1突变失活)的作用
实验材料：秀丽隐杆线虫基因型：lin-1(e1275)IV，购自CGC(CaenorhabditisGenetics Center)；大肠杆菌OP50，尿嘧啶渗漏突变株，作为秀丽隐杆线虫的食物，购自CGC。
具体实验步骤：同实施例二。
lin-1是ras下游的一个基因，是可被MAPK磷酸化的核转录因子，是阴门发育的负调节因子，调节let-60下游的阴门发育的信号通路。lin-1突变失活后，线虫为多阴门表型。由于lin-1为核转录因子，调节阴门细胞发育的过程。若药物对该基因失活突变的多阴门表型具显著的抑制作用，则说明药物可直接抑制阴门前体细胞的发育，阻止其形成多阴门而呈非特异的细胞毒作用。
本实施例中药复方提取物对秀丽隐杆线虫CB1275(lin-1突变失活)的突变率为100％，说明CB1275株系线虫的多阴门表型未受到中药复方提取物的影响，这表明药物作用于ras信号通路可抑制ras过度激活形成的假阴门，不能抑制lin-1突变失活形成的假阴门表型，说明中药复方提取物作用于ras而不作用于lin-1，证明药物下调了ras的过度激活而不是直接抑制了细胞的增殖起作用的，即中药复方提取物起作用是ras通路机制依赖，而非广泛的细胞毒作用。
通过以上实施例表明，中药复方通过水煎，可以显著显著抑制秀丽隐杆线虫ras突变体MT2124的多阴门表型，使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比例显著增加，并呈浓度依赖关系，说明中药复方对ras原癌基因过度激活有明显下调作用，使突变体变为野生型。但是仅用水煎，中药复方会随着浓度的增加对秀丽隐杆线虫毒性增大。本发明提供了一种中药复方提取物的制备工艺，使用D101柱子对中药复方提取物进行分离纯化后，中药复方提取物的有效成分多集中在无水乙醇溶液洗脱段，使秀丽隐杆线虫MT2124的野生型比例显著增加，且有效成分几乎不显示毒性。本发明还提供了中药复方提取物的新用途，可在抑制ras原癌基因过表达中应用和在制备抑制ras原癌基因突变后过表达的抗肿瘤药物中应用，有望开发成新一代的抗肿瘤药物。
Claims (3)
1.一种中药复方提取物，其特征在于，该中药复方由人参、麦冬组成，该中药复方提取物是由下列方法制备的：按质量比9:4.5取人参、麦冬，加入无水乙醇溶液，浸泡，加热回流，过滤，减压浓缩，得总浸膏；
将总浸膏用蒸馏水完全溶解，上D101型大孔树脂柱，吸附24h，之后用10倍柱体积50％的乙醇洗脱液洗脱，洗脱液浓缩至稠膏，干燥，即得。
2.如权利要求1所述的中药复方提取物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤是由ras原癌基因突变后过表达导致的。
3.如权利要求1所述的中药复方提取物在制备抑制ras原癌基因过表达药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |