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CN105259235A - 一种基于点击化学的电化学dna生物传感器及其制备方法 - Google Patents

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CN105259235A
CN105259235A CN201510781238.7A CN201510781238A CN105259235A CN 105259235 A CN105259235 A CN 105259235A CN 201510781238 A CN201510781238 A CN 201510781238A CN 105259235 A CN105259235 A CN 105259235A
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CN
China
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dna
electrochemical
click chemistry
reaction
preparation
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Pending
Application number
CN201510781238.7A
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English (en)
Inventor
孔金明
胡琼
梅亚琦
何玟辉
张学记
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University of Science and Technology
Original Assignee
Nanjing University of Science and Technology
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其包括金电极、与目标DNA互补的发夹DNA以及电化学活性标记物，将一段与目标DNA互补的巯基化发夹DNA固定在金电极表面作为捕获探针，与目标DNA杂交后，发夹环打开，在点击化学的作用下将电化学活性标记物连到电极表面，用电化学方法对连接在电极表面的标记物进行检测，即可实现对目标DNA的高灵敏度、高选择性响应和检测。该传感器结构简单、制备工艺简便、灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、重复性好，可用于医学诊断等领域中特异性DNA序列的快速、低成本检测。

Description

一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，涉及一种生物传感器及其制备方法，具体涉及一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，应用于核酸检测领域。
背景技术
脱氧核糖核酸(DNA)是遗传信息的携带者，DNA分子中碱基序列的改变与许多人类疾病有关。因此，对特定DNA序列进行分析和检测在遗传疾病的早期诊断和治疗方面具有十分重大的意义和应用前景。传统的DNA检测方法主要包括荧光测定法和紫外分光光度法等光学方法，但都具有灵敏度低、选择性差、设备复杂或检测成本高等缺点；相比之下，电化学方法用于DNA检测时具有灵敏度高、选择性好、检测成本低、检测时间短和设备简单等优良特性，因而在近年来获得了相当广泛的应用。
分子信标技术以其操作简单、灵敏度高、特异性强、可对核酸进行实时定量测定，甚至可以用于活体分析等特点不仅在生物学研究中有着广泛的应用，而且在疾病基因检测与诊断等生物医学基础和临床研究中也将充当重要的角色。文献(10.1073/pnas.1633515100)报导了一种基于分子信标的电化学DNA生物传感器，该传感器结构简单，实用性强，然而这是一种信号减弱型生物传感器，易产生假阳性结果。此外，文献(10.1021/ja800554t)报导了一种信号增强型生物传感器，该传感器灵敏度高，选择性好，然而制备过程相当复杂，成本高昂，实用性差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法。本发明的传感器结构简单、制备工艺简便、灵敏度高、选择性好、抗干扰能力强、重复性好，为医学诊断等领域中特异性DNA提供了一种快速、低成本的检测方法。
实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将含目标DNA的溶液滴加到巯基化发夹DNA探针修饰的金电极表面，杂交反应结束后，将电极表面清洗干净；
步骤二、将步骤一所得电极表面浸泡在含电化学活性标记物的标记溶液中，反应一段时间后，即得电化学DNA生物传感器。
步骤一中，巯基化发夹DNA探针的末端修饰有参与点击化学反应的官能团。
步骤一中，杂交反应时间为0.25～5h，杂交反应温度为20～50℃。
步骤一中，所述的巯基化发夹DNA探针修饰的金电极是将洁净的金电极浸泡在含有巯基化发夹DNA探针的溶液中进行修饰，再用巯基己醇对电极表面残余的位点进行封闭后得到。
进一步的，含有巯基化发夹DNA探针的溶液中，巯基化发夹DNA探针的浓度为0.01～10μM，修饰温度为20～50℃，修饰时间为0.25～24h，巯基己醇浓度为0.1～10mM。
步骤二中，电化学活性标记物含有与修饰在巯基化发夹DNA探针的末端的官能团发生点击化学反应所需的官能团，反应时间为0.25～24h。
所述的点击化学反应为环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
①本发明通过采用一段与目标DNA互补的巯基化发夹DNA作为捕获探针，提高了DNA电化学生物传感器的选择性及其在复杂临床样品中的实用性；
②通过点击化学将电化学活性标记物连到电极表面，具有反应条件温和、反应速率快、连接效率高、可控性强、选择性好、抗干扰能力强以及对空气和水不敏感等优良特性，同时也可以显著缩短检测时间、降低检测成本；
③本发明的电化学DNA生物传感器，体系简单，成本低廉，不易产生假阳性结果，实用性强。
附图说明
图1是本发明一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器的制备过程示意图。
图2是本发明电化学DNA生物传感器对不同浓度目标DNA的差分脉冲伏安响应曲线(A)及其响应峰电流的校准曲线(B)。
图3是本发明电化学DNA生物传感器对不同DNA的电化学响应。
图4是本发明电化学DNA生物传感器在血清样品中的电化学响应。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：如附图1中所示步骤，制备本发明电化学DNA生物传感器。
(1)电极表面的预处理及捕获探针的固定化
将金电极表面依次用0.3和0.05μm的抛光粉打磨至镜面，清洗干净后，在水虎鱼酸(98％H2SO4/H2O2，3:1，v/v)中浸泡处理10min，清洗后，在0.5M的稀硫酸中用循环伏安法对电极表面进行电化学处理，清洗干净后即得洁净的金电极；将已经洁净处理过的金电极在含有1μM末端标记有叠氮基团的巯基化发夹DNA探针(序列：5’-SH-(CH2)6-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-N3-3’)的溶液中在37℃下浸泡1.5h，再用2mM巯基己醇对电极表面残余的位点进行封闭，即得到发夹DNA探针修饰的金电极。
(2)杂交
将含目标DNA(序列：5’-GGGGTTGACCCACAAG-3’)的溶液滴加到修饰后所得的电极表面，在37℃下杂交反应1.5h，将电极表面清洗干净。
(3)标记电化学活性物质
将杂交后所得电极表面浸泡在含1.4mg/mL乙炔基二茂铁、0.1mM硫酸铜和0.2mM抗坏血酸的标记溶液中，在室温下反应1.5h，即得电化学DNA生物传感器。
(4)电化学检测
用差分脉冲伏安法对连接在电极表面的二茂铁进行检测。
实施例2：本发明电化学DNA生物传感器对不同浓度目标DNA的电化学响应特性。
采用本发明所述方法，以末端标记有叠氮基团的巯基化发夹DNA(序列：5’-SH-(CH2)6-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-N3-3’)作为捕获探针，与不同浓度的目标DNA(序列：5’-GGGGTTGACCCACAAG-3’)进行杂交反应。所有操作步骤及条件均如同上述实施例1，其中，通过改变目标DNA的浓度(1，5，10，50，100，500和1000pM)，检测本发明电化学DNA生物传感器的电化学响应特性。其检测结果如附图2所示，从图中可以看出，氧化电流随着目标DNA浓度的增长而线性增长，其线性范围为1～1000pM(R2＝0.9995)，检测下限为0.296pM。
实施例3：本发明电化学DNA生物传感器对不同DNA的电化学响应。
采用本发明所述方法，以末端标记有叠氮基团的巯基化发夹DNA(序列：5’-SH-(CH2)6-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-N3-3’)作为捕获探针，与相同浓度的目标DNA(序列：5’-GGGGTTGACCCACAAG-3’)、单碱基错配DNA(序列：5′-GGGGTCGACCCACAAG-3′)、三碱基错配DNA(序列：5′-GGGGTCGTCGCACAAG-3′)和对照DNA(序列：5′-TTCAGCTCTATCAATC-3′)进行杂交反应。所有操作步骤及条件均如同上述实施例1，其中，所有DNA的浓度均为50pM，检测本发明电化学DNA生物传感器对不同DNA的电化学响应。其检测结果如附图3所示，从图中可以看出，单碱基错配DNA、三碱基错配DNA和对照DNA的响应信号分别为目标DNA响应信号的28.9％，12.4％和7.6％，说明本发明电化学DNA生物传感器对于不同DNA具有很好的选择性。
实施例4：本发明电化学DNA生物传感器在血清样品中的电化学响应。
采用本发明所述方法，以末端标记有叠氮基团的巯基化发夹DNA(序列：5’-SH-(CH2)6-CCACGCTTGTGGGTCAACCCCCGTGG-N3-3’)作为捕获探针，与不同样品中的目标DNA(序列：5’-GGGGTTGACCCACAAG-3’)进行杂交反应。所有操作步骤及条件均如同上述实施例1，其中，样品分别为TE缓冲液、1％的血清样品、5％的血清样品，目标DNA的浓度为50pM，检测本发明电化学DNA生物传感器在血清样品中的电化学响应。其检测结果如附图4所示，从图中可以看出，1％的血清样品和5％的血清样品中的响应信号分别为TE缓冲液中响应信号的93.5％和88.6％，说明本发明在临床实验分析中具有很好的实用性。

Claims (7)

1.一种基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将含目标DNA的溶液滴加到巯基化发夹DNA探针修饰的金电极表面，杂交反应结束后，将电极表面清洗干净；
步骤二、将步骤一所得电极表面浸泡在含电化学活性标记物的标记溶液中反应，反应结束后即得电化学DNA生物传感器。
2.如权利要求1所述的基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，步骤一中，所述的巯基化发夹DNA探针修饰的金电极是将洁净的金电极浸泡在含有巯基化发夹DNA探针的溶液中进行修饰，再用巯基己醇对电极表面残余的位点进行封闭后得到。
3.如权利要求2所述的基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，含有巯基化发夹DNA探针的溶液中，巯基化发夹DNA探针的浓度为0.01～10μM；修饰温度为20～50℃；修饰时间为0.25～24h；巯基己醇浓度为0.1～10mM。
4.如权利要求1所述的基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，巯基化发夹DNA探针的末端修饰有参与点击化学反应的官能团。
5.如权利要求1所述的基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，步骤一中，杂交反应时间为0.25～5h，杂交反应温度为20～50℃。
6.如权利要求1所述的基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，步骤二中，电化学活性标记物含有与修饰在巯基化发夹DNA探针的末端的官能团发生点击化学反应所需的官能团，反应时间为0.25～24h。
7.如权利要求4或6所述的基于点击化学的电化学DNA生物传感器及其制备方法，其特征在于，点击化学反应为环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学以及碳碳多键的加成反应。
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