CN105256036B - 一种检测血清中lncARSR的试剂盒及其在检测肾癌舒尼替尼耐药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学生物检测技术领域，提供了lncARSR在制备肾癌舒尼替尼耐药检测标志物中的应用，以及lncARSR在制备诊断肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用。本发明还建立了人血清中lncARSR的检测方法并提供了血清中lncARSR检测的试剂盒，通过对接受舒尼替尼治疗的肾癌病人血清的检测，发现在耐药病人血清中的lncARSR含量明显高于敏感病人。本发明有助于对临床舒尼替尼药物疗效的监测，避免进一步的无效治疗。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种检测血清中lncARSR的试剂盒及其在检测肾癌舒尼替尼耐药中的应用。
背景技术
肾癌(renal cell carcinoma，RCC)在中国的发病率位居泌尿系统肿瘤第二位。约20-30％的肾癌患者在诊断时已经处于晚期，原位肾癌患者术后复发、转移的发生率则高达30％。肾癌对传统放疗、化疗不敏感，对白介素-2、干扰素-α等细胞因子治疗的有效率也不到20％，且副作用明显。目前，以小分子抑制剂舒尼替尼为代表的受体型酪氨酸激酶(RTK)抑制剂是晚期肾癌的主要治疗手段。舒尼替尼是多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，主要靶向血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血小板源性生长因子受体(PDGFR)、干细胞生长因子受体(KIT)、FMS样酪氨酸激酶3(FLT3)等，具有抗血管生成和抑制肿瘤细胞生长的双重作用。虽然舒尼替尼能显著缩减肾癌肿瘤体积，但大部分患者在治疗6-15个月后会出现耐药，使舒尼替尼不能有效延长晚期肾癌患者的无进展生存期和总体生存期。因此，如果能在影像学检查之前及时监测舒尼替尼耐药的发生，可以避免进一步的无效治疗，及时采取其他联合治疗手段，提高治愈率。
近年来，血清学标志物的筛选鉴定和在临床诊疗中的应用是医学领域的研究热点。目前细胞因子和非编码RNA中microRNA作为血清学标志物的研究取得了很大进展，但是，长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在血清学标志物中的应用研究还较少。lncRNA是长度大于200个碱基、无蛋白编码功能的RNA。lncRNA参与调控肿瘤多方面的特征，包括肿瘤生长、凋亡、转移、代谢等。研究表明lncRNA还可以调控肿瘤耐药，但在舒尼替尼耐药中的作用尚不清楚。lncARSR(lncRNA Activated in RCC with Sunitinib Resistance，ENST00000424980)是本发明人在前期研究肾癌舒尼替尼耐药中鉴定的新的lncRNA，lncARSR位于人9号染色体，全长591个核苷酸。lncARSR作为血清学标志物的价值至今尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种长链非编码RNA lncARSR的用途，具体是lncARSR作为肾癌舒尼替尼耐药标志物的应用，以及在制备肾癌舒尼替尼耐药血清学检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种检测血清中lncARSR的试剂盒，及该试剂盒在肾癌舒尼替尼耐药的血清学检测中的应用。
本发明人在前期研究中，利用lncRNA芯片和RNAi技术筛选了与肾癌舒尼替尼耐药相关的lncRNA，结果发现lncARSR在耐药细胞中高表达，并且高表达lncARSR的肾癌患者对舒尼替尼反应性差。
进一步地，本发明人发现lncARSR可以通过外泌体的形式分泌出来，因此建立了人血清中lncARSR的检测方法和试剂盒，通过对接受舒尼替尼治疗的肾癌病人血清的检测，我们发现耐药病人血清中lncARSR表达水平明显高于未出现耐药的病人。因此，我们认为，lncARSR具备作为肾癌舒尼替尼耐药的血清学标志物的可能性。
本发明的第一方面，提供了一种长链非编码RNA lncARSR在制备肾癌舒尼替尼耐药诊断标志物中的应用。
本发明的第二方面，提供了lncARSR在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用。
特别是，lncARSR在制备肾癌舒尼替尼耐药的血清学检测试剂或检测试剂盒中的应用。
所述的检测试剂或检测试剂盒，是通过原位杂交、实时定量PCR技术等方法检测生物样品中lncARSR的表达量。
所述的检测试剂或检测试剂盒，包括：对lncARSR具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物等。
所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液等。优选为血清。
所述的检测试剂或试剂盒，优选为通过实时定量PCR技术检测血清中lncARSR的表达量。
所述的对lncARSR具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT(SEQ ID NO:1)；
下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA(SEQ ID NO:2)。
本发明的第三方面，提供了一种检测血清中lncARSR的试剂盒，该试剂盒的组成包括：
1.RNA抽提系统
由外源标准RNA(λpolyA+RNA-A)、mirVanaTMPARISTM Kit组成；
2.逆转录系统
由随机引物N6、dNTPs、逆转录体系缓冲液、逆转录酶和RNA酶抑制剂组成；
3.引物系统
由1对检测λpolyA的Real-time PCR引物和1对特异性检测lncARSR的Real-timePCR引物组成，lncARSR的引物序列为：
上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT(SEQ ID NO:1)；
下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA(SEQ ID NO:2)；
4.扩增系统
由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成。
本发明的第四方面，提供了上述用于检测血清中lncARSR的试剂盒的检测方法，具体步骤如下：
1.按常规方法抽血并取血清；
2.向血清中加入外源标准RNA工作液，然后抽提血清中的小RNA；
3.用逆转录系统将RNA逆转录成cDNA；
4.用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定lncARSR的含量。
本发明的第五方面，提供了上述的检测血清中lncARSR的试剂盒在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂盒中的应用。
本发明优点在于：
本发明提供了lncARSR作为肾癌舒尼替尼耐药的血清学标志物，为诊断肾癌舒尼替尼耐药提供了新的临床手段，有助于对临床舒尼替尼药物疗效的监测，避免进一步的无效治疗，具有良好的转化医学前景。
附图说明
图1为舒尼替尼耐药细胞7SuR(A)和ACSuR(B)干扰lncRNA后的IC50检测；
图2为舒尼替尼敏感与耐药肾癌病人血清中lncARSR的表达检测；
图3为血清lncARSR高水平与低水平的舒尼替尼治疗病人的无进展生存曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：lncARSR的筛选、鉴定
我们前期构建了舒尼替尼耐药的肾癌细胞株7SuR、ACSuR(保藏号：CCTCCC2014217，CCTCC C2014238)，并已申请了中国发明专利CN201510304372.8，发明名称为“肾癌舒尼替尼耐药细胞系及其构建方法”。
为了研究舒尼替尼耐药相关的lncRNA，我们对肾癌亲本细胞和耐药细胞采用lncRNA芯片分析，筛选到8条升高最显著的lncRNA。进一步地，我们采用RNAi技术对8条lncRNA进行功能验证，结果发现干扰lncARSR使耐药细胞恢复了对舒尼替尼的敏感性(图1)。以上结果提示了lncARSR在肾癌舒尼替尼耐药中的作用，也提示其在舒尼替尼耐药诊断标志物方面可能具有应用价值。
实施例2：血清样本的采集、处理及其中小RNA的提取
(1)血清样本收集：收集约6ml肾癌病人的外周血放入含EDTA的抗凝管中，静置约1小时。
(2)血清样本处理：采集的外周血样品4000rpm 4℃离心10min，取上清分装于EP管中，-80℃保存。
(3)提取血清中RNA：每个血清样品均取350μl，加入1μl外源标准RNA(λpolyA+RNA-A)(购买自TAKARA公司)，然后利用Ambion公司购买的mirVanaTMPARISTM Kit提取小RNA。
(4)逆转录成cDNA：每个样品取相同量RNA，用随机引物N6进行逆转录。按照5×M-MLV RT Buffer 5μl、M-MLV Reverse transcriptase 1μl、rRNasin 0.5μl(Promega公司)、dNTPs 1μl、随机引物N6(购买自TAKARA公司)1μl、步骤3提取的小RNA 15ul、DEPC水(补充H2O使总体积达到25μl)进行逆转录。以上步骤所用的tip头、EP管均经过RNA酶灭活处理。
实施例3：引物设计与验证
(1)引物设计：利用Ensemble数据库查得lncARSR的全长序列(ENST00000424980)，针对lncARSR的序列利用Primer Premier 5软件设计Real-time PCR的上下游引物1对，具体如下：
上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT(SEQ ID NO:1)；
下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA(SEQ ID NO:2)；
由上海生工公司负责引物合成。
(2)引物验证：采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和美国AppliedBiosystems公司的ViiA7Dx实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：
PCR条件：
按照上述Real-time PCR条件，利用8例前期制备的血清样本逆转录产物对lncARSR引物进行检测。每个样本均做2个复孔，取其平均值分析。结果该引物溶解曲线为单峰，将PCR产物送公司测序，测序结果经比对为lncARSR。
实施例4：舒尼替尼敏感与耐药肾癌病人血清中lncARSR的差异表达检测
按照实施例2、3相同的方法，用设计的引物对38例舒尼替尼敏感病人与33例舒尼替尼耐药病人(样本来源：中国人民解放军第二军医大学附属长海医院)治疗前和治疗两个疗程(90天)后血清中的lncARSR进行检测，结果发现与敏感病人相比，耐药病人的血清中lncARSR变化倍数明显增大(图2)。这一结果提示lncARSR可作为肾癌舒尼替尼耐药的血清学诊断标志物使用。
实施例5：血清lncARSR高水平与低水平的舒尼替尼治疗病人的无进展生存期分析
我们对71例接受舒尼替尼治疗的肾癌病人(样本来源：中国人民解放军第二军医大学附属长海医院)进行随访，记录肿瘤进展情况，对上述病人的血清进行lncARSR检测，按照治疗前血清lncARSR水平的中位数分为lncARSR高浓度组和lncARSR低浓度组，采用Kaplan–Meier法对两组病人的无进展生存期进行比较分析，结果发现lncARSR高浓度组病人无进展生存期更短(图3)，这一结果提示lncARSR高浓度能够指示舒尼替尼耐药的出现，再次提示lncARSR可作为肾癌舒尼替尼耐药的血清学诊断标志物使用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (8)
1.检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用；所述的lncARSR在Embl-EBI数据库中的编号为ENST00000424980。
2.根据权利要求1所述的检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒为血清学检测试剂或检测试剂盒。
3.根据权利要求1或2所述的lncARSR在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒用于检测生物样品中lncARSR的表达量。
4.根据权利要求1或2所述的检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的检测试剂或试剂盒包括：对lncARSR具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
5.根据权利要求3所述的检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
6.根据权利要求3所述的检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的生物样品为血清。
7.根据权利要求4所述的检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的对lncARSR具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT；
下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA。
8.根据权利要求1所述的检测lncARSR的试剂在制备肾癌舒尼替尼耐药的检测试剂或试剂盒中的应用，所述的试剂盒包括：
A、RNA抽提系统，由外源标准RNA λpolyA+RNA-A、mirVanaTMPARISTMKit组成；
B、逆转录系统：由随机引物N6、dNTPs、逆转录体系缓冲液、逆转录酶和RNA酶抑制剂组成；
C、引物系统，由1对检测λpolyA的Real-time PCR引物和1对特异性检测lncARSR的Real-time PCR引物组成，检测lncARSR的Real-time PCR引物序列为：
上游引物：TTTGAAATGCTCTTTGAGGGAT；
下游引物：TGCAGGTTGTCTGAAGTTGGA；
D、扩增系统，由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成。
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