CN105200530A - 一种适用于高通量全基因组测序的多样品混合文库的构建方法 - Google Patents
一种适用于高通量全基因组测序的多样品混合文库的构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种适用于高通量全基因组测序的多个样本混合测序文库的构建方法，将多个样品的基因组DNA分别打断集中带分布在500bp，打断后样品同时进行5’末端修复和3’末端添加碱基A，将不同样品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有不同条形码序列的接头相连，对连接产物进行低循环PCR，扩增产物纯化、混合，获得适用于高通量全基因组测序的多个样本混合测序文库。该方法的优点在于通量高、成本低、耗时短，产生的文库测序质量高，适用于大规模多样本测序文库的构建，在实现高通量SNP检测及标记开发、遗传图谱绘制、全基因组关联分析等研究中具有非常广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物信息学领域，具体地说，涉及一种适用于高通量测序的多样品混合测序文库的构建方法。
背景技术
二代测序中，通常所用的Illumina、NEB或Vazyme试剂盒建库流程成熟稳定，样品打断完成后，后续进行的DNA链末端修复、3’端加碱基A步骤均不需要纯化，即可进行下一步反应，因此建库过程简便快捷，而且建库成功率高；但是针对多个样品建库，按照常规的试剂盒建库，则操作繁琐，尤其是后期的文库片段选择，需要将单个样品分别进行电泳切胶筛选片段或者利用磁珠筛选片段，导致建库成本昂贵，需要消耗大量的时间及建库费用。另外现有技术的高通量简化基因组测序文库构建方法主要针对没有参考基因组的样品，通过酶切预测进行酶切打断，构建文库，随机性不够好，再通过去除重复序列和其他冗余序列，将剩下的数据进行分析，得到相关关联区域，准确性不够高。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于高通量全基因组测序的多样品混合测序文库的构建方法，以弥补现有技术中构建该类文库耗时较长、操作繁琐的不足。
本发明提供的适用于高通量全基因组测序的多样品混合测序文库的构建方法，包括以下步骤：
(1)不同样品的基因组DNA打断，获得集中带分布在500bp的DNA片段；
(2)同时对打断后的样品DNA进行5’磷酸化平末端修复和3’末端添加碱基A，获得具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；
(3)分别将不同样品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有可以区分样品的唯一条形码序列的接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；
(4)对含有不同条形码的连接产物分别进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，纯化，定量，混样；混合后的PCR产物进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成适于高通量全基因组测序的多个样本混合测序文库。
本发明方法中，步骤(1)所述的基因组DNA浓度为20～100ng/μL。所述基因组DNA是经过琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计法检测的。
其中，步骤(1)的样品基因组DNA打断后还包括磁珠纯化步骤。
本发明方法中，步骤(2)的反应体系为：
其中，步骤(2)的反应条件为：20℃30min，65℃30min。
本发明方法中，步骤(3)接头的序列含有8碱基条形码序列的正链和8碱基条形码序列的负链。
步骤(3)所述接头，其序列为：
正链5’-3’:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
负链5’-3’:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
其中：正链中的XXXXXXXX代表正链条形码序列，负链中的YYYYYYYY代表负链条形码序列。
上述正、负链的条形码序列是A、T、C、G四种碱基的随机组合，可以根据本领域技术人员的实际需要进行设计；正、负链的条形码序列需同时使用来区分样品。
步骤(4)中，PCR扩增所用的引物序列为：
P1:5’-3’：AATGATACGGCGACCGAGATCTACAC
P2:5’-3’:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
本发明方法中，步骤(4)的PCR反应程序为：95-98℃3min；95-98℃10sec，65℃30sec，72℃30-40sec，共10个循环；72℃5min。
步骤(4)混合后的PCR产物进行琼脂糖凝胶分离纯化是切取650bp上下边缘的片段进行纯化。
本发明提供了上述构建方法在多样品基因组关联分析中的应用。
本发明方法的步骤(4)中，纯化后扩增产物的定量检测方法可以是紫外分光光度计法、核酸荧光定量法、琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明方法是在Vazyme试剂盒建库方法上的改进，针对批量样品进行建库的方法，样品打断后进行磁珠纯化，之后DNA末端修复、3’端加碱基A步骤均于96孔板上操作，大大提高通量及效率，在连接接头时，同时加上可以识别不同样品的双端Index，PCR进行富集，然后将不同PCR扩增后的文库进行混合，最后通过电泳切胶进行文库片段选择。该方法与传统方法相比，96孔板批量操作可以大大提高通量，最终多个样品混样后成为一个文库，在后续的切胶选择片段步骤上节约大量试剂成本、人力成本及时间。该方法特别适用于基因组小的生物基因组重测序及测序深度低的基因组重测序。
本发明的技术方案能够带来以下有益效果：
(1)样品起始量要求降低。在现有技术中，常规单个文库构建需要至少5μg样品，因此对样品的需求量较高，导致部分稀有样品因为总量较少达不到建库标准，本发明建库流程中纯化步骤的减少，可以将起始量由原来的5μg降低至2.5μg，此水平的DNA起始量，既降低了对样品的要求，同时也满足对后续数据的产出和分析，而起始量的降低同时使建库试剂成本降低；
(2)针对有参考基因组序列的样品，进行机械随机打断，构建文库，最终文库数据覆盖全基因组，随机性较好；将测序所得全部数据通过与参考基因组进行比对分析，因此对结果分析的SNP位点、Indel位点准确性更高；
(3)在混样之前，每个样品先进行PCR扩增，即得到PCR富集产物，再进行定量和混样，如果先进行混样，首先会由于不同样品的含量不同而导致混样不匀，而这种样品间的差异会被混样后的PCR过程进一步放大，因此对后期不同样品数据量的产出影响较大，而本发明先对每个样品进行PCR扩增，然后再进行混样，此操作会避免混样误差在PCR扩增后而被进一步放大，使样品的均一性较好；
(4)PCR扩增具有偏好性，在PCR扩增过程中，引物可能会偏向于结合基因组的某段区域，大量扩增此段区域，因此获得的产物会出现对基因组的覆盖不均匀，进而使测序数据出现冗余度高，所以，在实验过程中，为了避免后期数据冗余度过高而导致的对基因组的覆盖度降低，本发明将PCR扩增的循环数设计低于10个循环，这样，可以有效降低PCR扩增带来的偏好性，保证了数据分析的有效性；
(5)常规建库流程中单个样品需要分别切胶筛选片段，每一个样品从点样、电泳跑胶、染胶、切胶到纯化耗费时间长，针对多样品更是费时费力，而本设计方案将样品进行混合后进行切胶，例如，100个样品的切胶时间，完全可以利用本发明将所需时间降至1个样品的时间，因此大大降低了单个样品电泳切胶的时间与成本。
针对100个样品的文库构建，按照常规方法建库，建库周期长达10个工作日，而利用本发明方法可将100个样品的建库周期缩短至4个工作日，大大节省了建库时间。另一方面，针对基因组小的生物基因组重测序及测序深度低的基因组重测序，根据现有常规技术单独构建文库，不仅对基因组DNA起始量要求比较高，而且建库试剂成本较高，利用本发明方法，降低了建库的DNA起始量，同时通过降低试剂使用量而使建库成本降低。
附图说明
图1为本发明实施例1测序后数据分析插入片段的分布图。
图2为本发明实施例2测序后数据分析插入片段的分布图。
图3为本发明实施例3测序后数据分析插入片段的分布图。
图4为本发明高通量测序的多样品混合测序文库构建的流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所用的生化试剂均为市售。
以下各实施例中，使用的接头其序列为：
正链5’-3’:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
负链5’-3’:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
其中：正链中的XXXXXXXX代表正链条形码序列，负链中的YYYYYYYY代表负链条形码序列。
以下各实施例中，PCR扩增所用的引物序列为：
P1:5’-3’：AATGATACGGCGACCGAGATCTACAC
P2:5’-3’:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
实施例120个水稻样品混样文库的构建方法(1)
选择20个水稻样品，文库构建包括如下步骤：
1、基因组DNA片段化及纯化分别取20个水稻样品基因组DNA5μg移入1.5mL低吸附离心管，用ddH2O补至总体积55μL，利用超声破碎仪对样品进行机械打断，打断时间为5min，电泳检测集中带位于500bp。剩余打断产物在确定片段范围正确后取一半打断产物(25μL)，用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用18μLddH2O进行回溶。
2、末端修复，向第1步纯化后的打断产物中加入试剂，反应体系如下：
将反应体系置于恒温金属浴中20℃孵育30min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用17μLddH2O进行回溶。
3、3’-末端加A反应，向第2步纯化后的产物中加入试剂，反应体系为：
反应体系置于恒温金属浴中37℃孵育30min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
4、连接接头反应，向第3步纯化后的产物中加入试剂，其中C4-N为带有Index的接头，合成于Takara)反应体系如下：
反应体系置于恒温金属浴中20℃孵育30min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(72μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
5、PCR扩增PCR反应体系：
按照下列设定的程序进行PCR扩增：98℃3min；98℃10sec，65℃30sec，72℃30sec，10个循环；72℃5min。
取5μLPCR产物，用100bpDNALadderMarker进行电泳(1.8％琼脂糖凝胶)，检测500bp-700bp间是否有弥散。用1倍体积的AMpure磁珠(40μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
6、浓度检测及混样
取2μL上述步骤纯化后的PCR产物进行Nanodrop检测。根据检测结果进行混样。将样品统一稀释到样品中的最小浓度值，每个样品取150ng进行混样。
7、切胶回收取600ng混合后的PCR纯化产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳分离，切取650bp上下边缘的片段。利用QIAquickGelExtractionKit纯化切胶片段，35μLElutionBuffer洗脱。
8、加入相应试剂：Q5E为Q5超保真DNA聚合酶。
按照下列设定的程序进行PCR扩增：98℃3min；98℃10sec，65℃30sec，72℃30sec，10个循环；72℃5min。
取5μLPCR产物，用100bpDNALadderMarker进行电泳(1.8％琼脂糖凝胶)，检测片段大小是否为650bp左右，用1倍体积的AMpure磁珠(40μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
9、文库质量控制将第8步获得的测序文库在Agilent2100Bioanalyzer上进行质量检测，片段范围基本符合切胶范围。
10、测序将第9步中通过质检的文库稀释成适当浓度进行测序，测序平台为IlluminaHighSeq2500，测序长度为双端125bp，测序产生的Reads插入片段大小分布见图1。由图1可以看出插入片段主峰分布在400-500bp之间，但是在150-400bp之间出现大量小片段，原因可能是两次PCR的总循环数过多，小片段过度扩增所导致，另外，PCR扩增循环数过多会导致数据冗余度高，基因组覆盖度低(见表1)，1X数据的冗余度高达70％，基因组覆盖度平均仅为20％，不足以进行遗传图谱分析，因此，进行实施例2，对流程进行优化，省去第二步PCR过程，降低总的PCR循环数。
表1单个样品测得数据量，数据冗余度及基因组覆盖度
本实施例中，由于PCR扩增循环数过多，导致后期数据分析插入片段异常，数据冗余度高，覆盖度低，不足以进行遗传图谱分析。
实施例220个水稻样品混样测序文库构建方法(2)
本实施例选择20个水稻样品，在实施例1方法的基础上，对流程进行优化，省去第二步PCR过程，从而降低总的PCR循环数。文库构建包括如下步骤：
1、基因组DNA片段化及纯化
取基因组DNA5μg移入1.5mL低吸附离心管，用ddH2O补至总体积55μL，利用超声破碎仪对样品进行机械打断，打断时间为5min，电泳检测集中带位于500bp，剩余打断产物在确定片段范围正确后取一半打断产物(25μL)，用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用18μLddH2O进行回溶。
2、末端修复，向第1步纯化后的打断产物中加入试剂，反应体系如下：
将反应体系置于恒温金属浴中20℃孵育30min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用17μLddH2O进行回溶。
3、3’-末端加A反应，向第2步纯化后的产物中加入试剂，反应体系为：
反应体系置于恒温金属浴中37℃孵育30min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
4、连接接头反应，向第3步纯化后的产物中加入试剂，反应体系如下：
反应体系置于恒温金属浴中20℃孵育30min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(72μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
5、PCR扩增加入相应试剂：
按照下列设定的程序进行PCR扩增：98℃3min；98℃10sec，65℃30sec，72℃30sec，10个循环；72℃5min。
取5μLPCR产物，用100bpDNALadderMarker进行电泳(1.8％琼脂糖凝胶)，检测500bp-700bp间是否有弥散，用1倍体积的AMpure磁珠(40μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
6、浓度检测及混样
取2μL上述步骤纯化后的PCR产物进行Nanodrop检测。根据检测结果进行混样。将样品统一稀释到样品中的最小浓度值，每个样品取150ng进行混样。
7、切胶回收取600ng混合后的PCR纯化产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳分离，切取650bp上下边缘的片段。利用QIAquickGelExtractionKit纯化切胶片段，35μLElutionBuffer洗脱。
8、文库质量控制
将第7步获得的测序文库在Agilent2100Bioanalyzer上进行质量检测，片段范围基本符合650bp大小。
9、测序将第8步中通过质检的文库稀释成适当浓度进行测序，测序平台为IlluminaHighSeq2500，测序长度为双端125bp。本实施例中插入片段的主峰位于400-500bp左右，符合理论值，见图2，同时，从表2中可以得出结论，数据的冗余度仅为1％，说明基因组上相同区域的重复较低，因此所测数据在基因组上分布较均匀，基因组覆盖度高，
满足遗传图谱的构建。但是，在本实施例文库构建过程中，末端修复、加A反应和加接头反应分别进行，同时每一步之后都需要进行纯化，不仅耗费操作时间，也使DNA在每一步纯化步骤中进一步损失，因此针对上述不足，进行实施例3，对混样建库的流程进行进一步优化。
表2单个样品测得数据量、数据冗余度及基因组覆盖度
实施例3本发明的20个水稻样品混合测序文库的构建方法
选择与前两个实施例相同的20个水稻样品，文库构建包括如下步骤：
1、基因组DNA片段化及纯化
取基因组DNA2.5μg移入1.5mL低吸附离心管，用ddH2O补至总体积55μL，利用超声破碎仪对样品进行机械打断，打断时间为5min，电泳检测确定片段集中范围为500bp，剩余打断产物用1.8倍体积的AMpure磁珠(45μL)进行纯化，最终用27μLddH2O进行回溶。
2、末端修复，向第1步纯化后的打断产物中分别加入试剂，反应体系如下：
吹吸混匀并瞬时离心，按照下述程序在PCR仪上进行反应。反应结束后，立即进行下一步接头连接。20℃30min；65℃30min。
3、连接接头反应，向第2步反应产物中加入试剂，反应体系如下：
反应体系置于恒温金属浴中20℃孵育15min，用1.8倍体积的AMpure磁珠(96μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
4、PCR扩增按照下表加入相应试剂：Q5E为Q5超保真DNA聚合酶。
按照下列设定的程序进行PCR扩增：98℃3min；98℃10sec，65℃30sec，72℃30sec，10个循环；72℃5min。
取5μLPCR产物，用100bpDNALadderMarker进行电泳(1.8％琼脂糖凝胶)，检测500bp-700bp间是否有弥散，用1倍体积的AMpure磁珠(40μL)进行纯化，最终用30μLddH2O进行回溶。
5、浓度检测及混样取2μL上述步骤纯化后的PCR产物进行Nanodrop检测。根据检测结果进行混样。将样品统一稀释到样品中的最小浓度值，每个样品取150ng进行混样。
6、切胶回收将混合后的PCR纯化产物进行琼脂糖凝胶(2％)电泳分离，切取650bp上下边缘的片段。利用QIAquickGelExtractionKit纯化切胶片段，35μLElutionBuffer洗脱。
7、文库质量控制将第6步获得的测序文库在Agilent2100Bioanalyzer上进行质量检测，片段范围基本符合650bp大小。
8、测序将第7步中通过质检的文库稀释成适当浓度进行测序，测序平台为IlluminaHighSeq2500，测序长度为双端125bp。
本发明经过实施例1-3的逐渐优化，最终得到实施例3中针对多样品全基因组测序文库构建的方法，流程图见图4。本发明方法(实施例3)相对于实施例1和2，在文库制备的步骤方面，更加节省操作时间，数据方面，插入片段大小正常，见图3，数据冗余度降低，基因组覆盖度较高(见表3)，满足进行遗传图谱的构建。
表3单个样品测得数据量、数据冗余度及基因组覆盖度
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种适用于高通量全基因组测序的多个样本混合测序文库的构建方法，包括以下步骤：
(1)不同样品的基因组DNA打断，获得集中带分布在500bp的DNA片段；
(2)同时对打断后的样品DNA进行5’磷酸化平末端修复和3’末端添加碱基A，获得具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段；
(3)分别将不同样品的具有5’磷酸化和3’粘性末端A的DNA片段与含有可以区分样品的唯一条形码序列的接头相连，获得可以区分样品来源的连接产物；
(4)对含有不同条形码的连接产物分别进行PCR扩增，获得含有不同条形码序列的扩增产物，纯化，定量，混样；混合后的PCR产物进行琼脂糖凝胶分离纯化，纯化产物构成适于高通量测序的多个样本混合测序文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)所述的基因组DNA浓度为50～100ng/μL。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的反应体系为：
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)的反应条件为：20℃30min，65℃30min。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)接头的序列含有8碱基条形码序列的正链和8碱基条形码序列的负链。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述接头，其序列为：
正链5’-3’:
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACXXXXXXXXTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
负链5’-3’:
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATYYYYYYYYGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT；
其中：正链中的XXXXXXXX代表正链条形码序列，负链中的YYYYYYYY代表负链条形码序列。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，PCR扩增所用的引物序列为：
P1:5’-3’：AATGATACGGCGACCGAGATCTACAC
P2:5’-3’:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT。
8.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)的PCR反应程序为：95℃-98℃3min；95℃-98℃10sec，65℃30sec，72℃30-40sec，共10个循环；72℃5min。
9.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)混合后的PCR产物进行琼脂糖凝胶分离纯化是切取650bp上下边缘的片段进行纯化。
10.权利要求1-9任一所述的构建方法在多样品基因组关联分析中的应用。
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Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105861700A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-08-17 | 湖州昂朴医学检验有限公司 | 一种针对神经肌肉病的高通量检测方法 |
| CN105926043A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-09-07 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种提高孕妇血浆游离dna测序文库中胎儿游离dna占比的方法 |
| CN105950612A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 北京全式金生物技术有限公司 | 一种高效的dna接头连接方法 |
| CN105985949A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-10-05 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种rna高通量测序文库构建方法 |
| CN106086189A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-11-09 | 杭州和壹基因科技有限公司 | 一种提高数据均一性的rad建库方法 |
| CN106591956A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-04-26 | 上海派森诺医学检验所有限公司 | 一种测序文库构建方法 |
| CN108315320A (zh) * | 2017-01-16 | 2018-07-24 | 李辉辉 | 一种rna高通量测序文库的制备方法 |
| CN108504651A (zh) * | 2017-02-27 | 2018-09-07 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 基于高通量测序的pcr产物大样本量混合建库的文库构建方法和试剂 |
| CN108728903A (zh) * | 2017-04-21 | 2018-11-02 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法 |
| CN108753921A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-11-06 | 广州微芯生物科技有限公司 | 一种构建基因组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒 |
| CN108866155A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-23 | 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 | 一种下一代测序文库的制备方法 |
| CN108949942A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-07 | 浙江大学 | 一种基于高通量测序的线粒体全基因组测序方法 |
| CN109477141A (zh) * | 2016-05-17 | 2019-03-15 | D名-It股份有限公司 | 样品鉴定方法 |
| CN110872615A (zh) * | 2018-08-31 | 2020-03-10 | 成都先导药物开发股份有限公司 | 一种用于对核苷酸双链进行测序的高通量二代测序方法 |
| CN113774121A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-10 | 武汉大学 | 一种基于RNA连接标签的低样本量m6A高通量测序方法 |
| WO2022199242A1 (zh) * | 2021-03-25 | 2022-09-29 | 南方医科大学 | 一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性dna甲基化建库和测序方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978206A (zh) * | 2012-11-27 | 2013-03-20 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 一种应用于混合建库的高通量测序接头及其建库方法 |
| CN104005090A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-27 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 低质量样本dna高通量测序文库的构建方法 |
| CN104032377A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-10 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用 |
| CN104232627A (zh) * | 2013-06-13 | 2014-12-24 | 深圳华大基因科技有限公司 | 2b-RAD混合建库技术 |
| CN104694635A (zh) * | 2015-02-12 | 2015-06-10 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种高通量简化基因组测序文库的构建方法 |
-
2015
- 2015-10-13 CN CN201510657439.6A patent/CN105200530A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978206A (zh) * | 2012-11-27 | 2013-03-20 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 一种应用于混合建库的高通量测序接头及其建库方法 |
| CN104232627A (zh) * | 2013-06-13 | 2014-12-24 | 深圳华大基因科技有限公司 | 2b-RAD混合建库技术 |
| CN104005090A (zh) * | 2014-05-28 | 2014-08-27 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 低质量样本dna高通量测序文库的构建方法 |
| CN104032377A (zh) * | 2014-06-30 | 2014-09-10 | 北京诺禾致源生物信息科技有限公司 | 单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用 |
| CN104694635A (zh) * | 2015-02-12 | 2015-06-10 | 北京百迈客生物科技有限公司 | 一种高通量简化基因组测序文库的构建方法 |
Cited By (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105985949A (zh) * | 2015-11-02 | 2016-10-05 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 一种rna高通量测序文库构建方法 |
| CN105926043A (zh) * | 2016-04-19 | 2016-09-07 | 苏州贝康医疗器械有限公司 | 一种提高孕妇血浆游离dna测序文库中胎儿游离dna占比的方法 |
| CN105861700A (zh) * | 2016-05-17 | 2016-08-17 | 湖州昂朴医学检验有限公司 | 一种针对神经肌肉病的高通量检测方法 |
| CN105861700B (zh) * | 2016-05-17 | 2019-07-30 | 上海昂朴生物科技有限公司 | 一种针对神经肌肉病的高通量检测方法 |
| CN109477141A (zh) * | 2016-05-17 | 2019-03-15 | D名-It股份有限公司 | 样品鉴定方法 |
| CN109477141B (zh) * | 2016-05-17 | 2022-07-12 | D名-It股份有限公司 | 样品鉴定方法 |
| CN106086189A (zh) * | 2016-06-22 | 2016-11-09 | 杭州和壹基因科技有限公司 | 一种提高数据均一性的rad建库方法 |
| CN105950612A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-09-21 | 北京全式金生物技术有限公司 | 一种高效的dna接头连接方法 |
| CN105950612B (zh) * | 2016-07-08 | 2019-06-21 | 北京全式金生物技术有限公司 | 一种高效的dna接头连接方法 |
| CN106591956A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-04-26 | 上海派森诺医学检验所有限公司 | 一种测序文库构建方法 |
| CN108315320A (zh) * | 2017-01-16 | 2018-07-24 | 李辉辉 | 一种rna高通量测序文库的制备方法 |
| CN108504651A (zh) * | 2017-02-27 | 2018-09-07 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 基于高通量测序的pcr产物大样本量混合建库的文库构建方法和试剂 |
| CN108728903A (zh) * | 2017-04-21 | 2018-11-02 | 深圳市乐土精准医疗科技有限公司 | 基于高通量测序用于地中海贫血大样本筛查的建库方法 |
| CN108753921A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-11-06 | 广州微芯生物科技有限公司 | 一种构建基因组测序文库的方法及相应的接头序列和试剂盒 |
| CN108866155A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-23 | 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 | 一种下一代测序文库的制备方法 |
| CN108949942A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-07 | 浙江大学 | 一种基于高通量测序的线粒体全基因组测序方法 |
| CN110872615A (zh) * | 2018-08-31 | 2020-03-10 | 成都先导药物开发股份有限公司 | 一种用于对核苷酸双链进行测序的高通量二代测序方法 |
| WO2022199242A1 (zh) * | 2021-03-25 | 2022-09-29 | 南方医科大学 | 一组条码接头以及中通量多重单细胞代表性dna甲基化建库和测序方法 |
| CN113774121A (zh) * | 2021-09-13 | 2021-12-10 | 武汉大学 | 一种基于RNA连接标签的低样本量m6A高通量测序方法 |
| CN113774121B (zh) * | 2021-09-13 | 2024-02-20 | 武汉大学 | 一种基于RNA连接标签的低样本量m6A高通量测序方法 |
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