CN105175499A

CN105175499A - 一种淋巴癌特异性的热休克蛋白复合物及其在淋巴瘤治疗中的应用

Info

Publication number: CN105175499A
Application number: CN201510647600.1A
Authority: CN
Inventors: 黄锡坚; 张小俊
Original assignee: SHENZHEN CURE & SURE BIOTECH Ltd
Current assignee: SHENZHEN CURE & SURE BIOTECH Ltd
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了一种淋巴癌相关的CD20、CD19及TCL1蛋白表达的长度为9个氨基酸的肽段，所述肽段的氨基酸序列见序列表中的序列1至序列11中的任意一个。本发明还提供了这些抗原肽与热休克蛋白gp96和HSP78的复合物及其制备方法，复合物包括gp96和HSP78与抗原多肽以非共价键结合的复合体，和二者以共价键连接形成的融合蛋白。这些复合物可以诱导针对淋巴癌的特异性的CTL，并且调节性T细胞的抑制剂可以增强这些复合物的CTL诱导能力。这种复合物可用于制备淋巴癌治疗和预防性疫苗。

Description

一种淋巴癌特异性的热休克蛋白复合物及其在淋巴瘤治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类能有效激活淋巴癌特异性T细胞的热休克蛋白复合物及其制备方法，以及其在治疗和预防淋巴癌中的应用。

技术背景

恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在我国也是造成城乡居民死亡的首要原因。淋巴瘤（lymphoma）又称恶性淋巴瘤，是起源于淋巴结和其他淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’sdisease,HD)和非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin’slymphoma,NHL)。根据最新的统计结果（2011年肿瘤登记数据），淋巴瘤发病率在我国常见恶性肿瘤中已排第8位。根据国内多中心性淋巴瘤病例分析结果（2012年）显示，B细胞淋巴瘤是我国人群最常见的淋巴瘤类型，约占总患者数的66%。

过去化疗是淋巴癌的主要治疗手段。经过一段时间的综合治疗，部分患者的病情可完全缓解，但是如果停药一段时间后，病情就可能复发。还有一部分患者，在开始治疗阶段就对该化疗方案不敏感，或者即便达到完全缓解(CR)后短时间内再次复发。迫切需要寻找一种高效、低毒、副作用小的方案来挽救患者生命，延长患者的生存期。

随着CD20单克隆抗体利妥昔单抗的问世，B细胞淋巴瘤的治疗进入了一个全新的时代，它几乎提高了所有B细胞淋巴瘤的治愈率。CD20白细胞分化抗原具有克隆特异性，仅表达于所有的前B细胞、成熟B细胞和超过95%的恶性B细胞表面，而不表达于造血干细胞、浆细胞和其他正常组织。利妥昔单抗通过和恶性B细胞表面的CD20结合诱导补体介导的细胞毒作用（CDC）和抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）杀伤肿瘤细胞，对于高度表达CD20的B细胞恶性淋巴瘤，利妥昔单抗的临床疗效已得到肯定。但其临床反应率仅为50%左右，完全缓解率只有10%。普遍认为的原因包括患者ADCC和CDC不健全，细胞凋亡机制受限，抗CD20抗体的滴度过低等。

目前普遍认为激活特异性T细胞是肿瘤成功治疗的关键。新近发展的CART技术通过抗原特异性抗体与T细胞受体（TCR）组成的嵌合分子激活特异性T细胞克隆，发挥T细胞杀伤功能治疗肿瘤。该技术可以通过靶向CD20和CD19用于B细胞肿瘤的治疗，已经取得了一定的效果。然而由于其中慢病毒的应用、外源基因工程细胞的引入带来新的癌变风险和非特异损伤风险，以及引入细胞的不可控风险，这些还需要进一步的研究。

因此针对淋巴癌特异性抗原活化患者自身的T细胞，在受控有序的状态下直接杀伤肿瘤细胞，是行之有效的淋巴癌治疗手段，能够有效的弥补上述方法的不足，是淋巴癌治疗的重点研究方向。

Gp96是热休克蛋白HSP90家族中的重要成员，主要定位于内质网腔(EndoplasmicReticulum)，在正常组织和肿瘤中均有广泛表达。正常情况下gp96在细胞中呈低水平表达，而热休克、葡萄糖缺乏、细菌和病毒感染等均可使其表达量上调。热休克蛋白HSP78是细胞质中HSP70家族中的成员，分子量约78kDa。gp96分子、HSP78均具有多肽结合的能力，作为分子伴侣能与细胞中各种短肽结合。目前已证实gp96和HSP78分子可以结合多种组织特异性抗原多肽,包括泡状口炎病毒抗原区肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。

在细胞外，gp96可作为呈递分子将结合的短肽呈递给I类MHC分子，激活特异性和记忆性T细胞，引发机体细胞免疫反应，其免疫原性由gp96所结合的短肽决定。此外，gp96还可以活化树突细胞（DC)促进MHCI类和MHCII类分子以及共刺激因子的表达，从而提高免疫反应。

因此，肿瘤自体gp96复合物因为携带有患者自身肿瘤的抗原肽，可以激活患者个体特异性T细胞反应杀伤肿瘤细胞，目前已成功应用于黑色素瘤、神经胶质瘤、肾癌等的临床治疗。在肿瘤自体gp96治疗淋巴癌的I期临床试验中（20人），有1人病理结果证实清除了皮肤结节重点淋巴癌细胞，8个患者实现疾病稳定。然而限于这种治疗方法对肿瘤组织大小的要求和疫苗制备的一次性，能够完成有效疗程的患者有限，自体gp96免疫治疗淋巴癌的效果比较有限。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是筛选能激活淋巴癌特异性T细胞的抗原。通过克服肿瘤细胞免疫编辑导致的低免疫原性，在健康个体及淋巴癌患者中诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(杀伤性T细胞，CTL)，利用CTL的强大抗淋巴癌作用治疗和预防肿瘤，对正常细胞及组织无破坏作用。

本发明的一个目的是提供一种与gp96和HSP78结合的淋巴癌抗原的复合物。所述的淋巴癌抗原可以分别是淋巴癌肿瘤抗原CD20蛋白上第38-46位的氨基酸序列，其序列可以是VGPTQSFFM，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原CD20蛋白上第119-127位的氨基酸序列，其序列可以是MNSLSLFAA，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原CD20蛋白上第175-183位的氨基酸序列，其序列可以是KNSPSTQYC，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原CD19蛋白上第72-80位的氨基酸序列，其序列可以是GIHMRPLAI，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原CD19蛋白上第89-97位的氨基酸序列，其序列可以是QQMGGFYLC，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原CD19蛋白上第509-517位的氨基酸序列，其序列可以是YAAPQLRSI，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原TCL1蛋白上第19-27位的氨基酸序列，其序列可以是WAWEKFVYL，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原TCL1蛋白上第49-57位的氨基酸序列，其序列可以是VLLRREDVV，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原TCL1蛋白上第66-74位的氨基酸序列，其序列可以是QIGPSLLPI，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原TCL1蛋白上第99-107位的氨基酸序列，其序列可以是KIDGVEDML，或其变异序列；淋巴癌肿瘤抗原TCL1蛋白上第102-110位的氨基酸序列，其序列可以是GVEDMLLEL，或其变异序列。

本发明的复合物既包括热休克蛋白以非共价键与多肽结合形成的复合物，又包括热休克蛋白以共价键与多肽结合形成的复合物。本发明提供了制备本发明中如上所述抗原多肽与热休克蛋白gp96和HSP78复合物的方法。

本发明所诉表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式在HLA-A2转基因小鼠中诱导形成特异性CTL。

本发明所诉表位肽可以在体外单独或以热休克蛋白复合物形式刺激HLA-A2阳性淋巴癌患者PBMC分泌IFN-γ，且这种作用在自体gp96免疫后显著增强。

本发明所诉表位肽可以单独或以热休克蛋白复合物形式提高HLA-A2阳性淋巴癌患者特异性T细胞反应。

本发明所述特异性CTL的诱导可以被Treg细胞抑制剂增强。

我们首次将淋巴癌相关抗原肽与体外表达的gp96蛋白组装，体外合成gp96-9肽复合物，将该gp96-9肽复合物免疫HLA-A2转基因小鼠，能刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞(CTL)，且应用调节性T细胞的抑制剂可以增强gp96-9肽复合物的免疫效果2倍以上。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型淋巴癌的治疗和预防性药物。

附图简要说明

图1.小鼠（BALB/c^HLA-A2+）的特异性CTL反应。以gp96-9肽复合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测特异性细胞裂解率。效应细胞CTL对特异性靶细胞的裂解百分率以4小时标准⁵¹Cr释放法测定，效应细胞与靶细胞之比分别是10、25、50和100，图中裂解率为10只小鼠平均值。

图2.gp96-肽段1免疫的小鼠脾脏淋巴细胞可抑制裸鼠皮下接种的淋巴癌细胞的生长。裸鼠腋下皮下接种人淋巴癌细胞Jeko-1，荷瘤20天后转输不同来源的小鼠脾脏淋巴细胞。抗原肽1组（n=20）接受经过gp96-抗原肽1复合物免疫的BALB/c^HLA-A2+小鼠的脾脏淋巴细胞；无关肽对照组（n=20）接受经过gp96-无关肽（HBcAg87-95）复合物免疫的Balb/c^HLA-A2+小鼠的脾脏淋巴细胞。

图3.小鼠（BALB/c^HLA-A2+）的特异性CTL反应。以CD20阳性或者CD20阴性的淋巴癌患者肿瘤组织来源gp96抗原复合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后检测9肽特异性T细胞的变化。以IFN-γ的ELISPOT方法检测小鼠脾脏淋巴细胞中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg_82-90为阴性对照。结果显示只有CD20阳性淋巴癌患者来源的gp96抗原复合物能激活9肽特异性T细胞，表明复合物中包含相关抗原。

图4.淋巴癌患者免疫自体肿瘤gp96复合物后9肽特异性T细胞的变化。以IFN-γ的ELISPOT方法检测患者外周血中9肽特异性T细胞。无关肽HBcAg_82-90为阴性对照。

具体实施方式：

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1.从淋巴癌组织中纯化gp96蛋白

将CD20⁺淋巴癌组织或者CD20^-淋巴癌组织匀浆后离心，用30%/70%饱和度(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀溶解后采用ConASepharose（GE公司）进行亲和层析，用8%的α-甲基葡萄糖苷洗脱结合的蛋白，糖苷洗脱液以Hitrap-Q(GE公司层析系统)进行阴离子层析，经过这三步纯化获得＞95%纯度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94单克隆抗体(SantaCruz公司)进行Western鉴定。其纯度用SDS-PAGE、银染和反相HPLC鉴定。

实施例2.从gp96蛋白释放非共价结合的多肽

将纯化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其终浓度达到0.2%（pH约2.0)，然后用超滤法(分子截留为30kDa,Millipore公司)分离多肽，将多肽混合物进行MALDI-TOF质谱(ABI4700)分析，多肽分子量大多在600-1200Da之间。

实施例3.反相HPLC分析多肽

多肽混合物冻干后溶于溶液A（0.065%TFA，2%乙腈），反相层析柱C18上样（SephasilpeptideC18；5um粒度；4.6X250mm，GE公司），从0至65%溶液B（0.05%TFA，100%乙腈)进行梯度洗脱，流速为1mL/min，用214nm波长检测。比较CD20⁺与CD20^-肿瘤组织HPLC图谱，发现一个CD20⁺组织共有而CD20^-组织中没有的肽峰。

实施例4.多肽微量测序与序列分析

收集该特异肽峰用MALDI-TOF质谱(ABI公司4700系统)鉴定其纯度，只发现分子量为1013Da的单一峰。对该肽微量测序(Procise491.蛋白测序仪，ABI公司)，其氨基酸序列为“VGPTQSFFM”，5份肿瘤组织得到的序列一致。在蛋白数据库中查询该序列(NCBI)，发现它位于CD20蛋白的38-46位。

实施例5.gp96蛋白与人工合成的多肽体外快速组装

人工合成9肽“VGPTQSFFM”(委托吉尔生化有限公司合成)，将gp96蛋白与多肽进行体外组装，体外结合反应体系：

2.7mmol/LKCl，1.47mmol/LKH₂PO₄，8.1mmol/LNa₂HPO₄，138mmo1/LNaCl，10%(V/V)甘油，3.0mmol/L9肽，0.421mmol/Lgp96蛋白，60℃反应10分钟，超滤法(截留分子量30kDa，Millipore公司)去除未结合的多肽。

实施例6表达淋巴癌抗原肽1和热休克蛋白gp96的融合蛋白

本实例提供了淋巴癌抗原肽1（VGPTQSFFM）与热休克蛋白gp96以共价键形成的融合蛋白的制备方法。我们人工合成互补的核酸序列（5′-GATCCGTGGGCCCCACGCAAAGCTTCTTCATGA-3′及5′-GATCTCATGAAGAAGCTTTGCGTGGGGCCCACG-3′），并通过复性获得双链DNA片段，核酸序列对应于该肽的氨基酸序列，同时还在序列的5′端引入限制性酶切位点BamHI粘性末端，3′端引入限制性酶切位点BglII的粘性末端，获得粘性片段1。我们通过PCR在gp96的基因两端分别引入限制性酶切位点BglII和XhoI，限制性酶切获得粘性片段2。通过酶切真核表达载体pSecTag2/HygroA获得BamHI、XhoI双切的粘性片段3。使用T4连接酶将3个DNA片段连接，从而将抗原肽-gp96表达框插入到表达载体pSecTag2/HygroA中。将基因工程载体pSecTag2/HygroB-Seq1-hgp96通过电穿孔的方式转染CHO细胞，以潮霉素B抗生素筛选阳性克隆，并通过ELISA检测培养上清中的gp96获得高产细胞株。

实施例7.免疫小鼠

选择出生8-10周的HLA-A2转基因的BALB/c小鼠(HLA-A2⁺)用于本实验。

免疫采用皮下免疫方式，部位为颈部，体积100uL，溶剂为PBS。同时在每次免疫前1天腹腔注射0.4mg的环磷酰胺。低剂量环磷酰胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg细胞从而能增强免疫效果。

gp96蛋白-9肽复合物的最适免疫剂量为0.1nmol。

免疫时间为0、1、3周进行三次的强化免疫，优于免疫一次或二次的效果。

免疫操作：将淋巴癌组织来源的gp96复合物及gp96-9肽复合物溶于PBS中，注射前充分混匀。免疫剂量：gp96-9肽复合物剂量为0.10nmol，肿瘤gp96的免疫剂量为25ug。采用颈背皮下注射，第一次免疫1周后进行第二次免疫，2周后加强免疫，3天后进行T细胞活性检测。

实施例8.细胞毒性(CTL)分析

试验共分为四组，分别为gp96-肽1+环磷酰胺、gp96-肽1、gp96-无关肽+环磷酰胺、gp96-无关肽。小鼠加强免疫3天后，从每只小鼠获得脾脏淋巴细胞，并以4小时标准⁵¹Cr释放实验(具体方法见Kuhrober,A,etal.1997.InternationalImmunology,9(8):1203-1212)测定细胞毒性活性。简而言之，以HLA-A2⁺/CD20⁺的B细胞淋巴癌细胞系Jeko-1为靶细胞，⁵¹Cr标记清洗后，每孔加入2×10⁴的靶细胞，加入不同数量的效应细胞，反应体系为100uL的完全培养基。37℃共培养4小时后收集上清测定特异裂解率。

从⁵¹Cr释放实验可以看出gp96-9肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在40%以上，通过注射环磷酰胺的预处理可以明显的提高gp96-9肽复合物的免疫效果，且这种细胞毒效应是表位肽特异性的（图1）。实验结果表明gp96-9肽复合物可开发成为一种新型抗淋巴癌的药物。

实施例9细胞转输体内抑瘤实验

以gp96-淋巴癌抗原肽1免疫HLA-A2转基因小鼠获得抗原肽1特异性的脾脏淋巴细胞。将1×10⁶Jeko-1（HLA-A2+/CD20+）细胞接种于Balb/c(nu/nu)腋窝皮下准备淋巴癌荷瘤小鼠，在接种后第20天时开始接受小鼠脾脏淋巴细胞转输。实验组荷瘤小鼠接受肽特异性淋巴细胞转输（◆）（n=20）；对照组小鼠转输免疫gp96-无关肽的小鼠淋巴细胞（■）（n=20），每周转输一次，共3周。检测肿瘤大小，如图所示转输gp96-淋巴癌抗原肽1复合物免疫小鼠的淋巴细胞可明显抑制人淋巴癌细胞的生长（图2）。

实施例10淋巴癌患者免疫自体gp96复合物治疗肿瘤

该研究中入组的淋巴癌患者需完成6-10个疗程的gp96免疫治疗。一周为一个疗程，每个疗程注射一次。试验组在术后8周内开始自体gp96免疫治疗。

操作流程

i患者入选：初发可根治性切除的淋巴癌患者。

ii肿瘤组织中gp96-肿瘤抗原复合物的纯化

按照孟颂东等发表的三步法（MengS,SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificationofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolationofgp96-boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.）对肿瘤组织中gp96蛋白进行提取纯化，通过ConA柱亲和层析结合HitrapQ柱离子交换方法纯化得到纯度95％以上gp96蛋白。

考马斯亮蓝显色法测定蛋白浓度，每份样本的蛋白提取量应能满足治疗的疗程需要。

微生物检测，应满足对蛋白疫苗制品的要求（参照生物制品规程）。

内毒素检测，应满足对蛋白疫苗制品的内毒素含量要求（鲎试剂法）。

iiigp96-肿瘤抗原复合物的使用

患者在手术后8周内接受第一次免疫治疗。每次免疫前1天，静脉注射环磷酰胺，然后三角肌部位皮下或腹部皮下注射自体gp96复合物。每周1次，共注射10次。

iv免疫学指标检查

以自体肿瘤裂解液、自体gp96复合物抗原以及淋巴癌抗原9肽、gp96-9肽复合物为刺激物检测自体肿瘤特异性T细胞活性。比较淋巴癌患者免疫前后特异性T细胞活性，发现自体gp96复合物免疫显著激活了患者特异性T细胞，预示了良好的预后。

v随访

注射完成后1年内，每3个月访视1次；之后每半年访视1次，直至患者死亡。

①2年内每3个月复查1次：

a)第3、9、15、21月复查内容：

血常规、肝肾功能、心电图；

肿瘤标志物（LDH、β2-M）；

腹部（肝脏、膜脏、腹膜后）B超；

胸片（正侧位）。

b)第6、12、18、24月复查内容：

血常规、肝肾功能、心电图；

肿瘤标志物（LDH、β2-M）；

胸、腹、盆腔增强CT。

②2年后每6个月复查1次，复查内容：

血常规、肝肾功能、心电图；

肿瘤标志物（LDH、β2-M）；

胸、腹、盆腔增强CT。

实施例11EISPOT法检测特异性T细胞

ELISPOT检测小鼠脾脏淋巴细胞或者淋巴癌患者PBMC中表位特异性CTL。按照ELISPOT试剂盒的说明书操作。

小鼠第3次免疫肿瘤gp963天后检测T细胞激活情况。先用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基封闭ELISPOT预包被板一小时，使用前倒掉封闭液,加入100uL含1×10⁵的小鼠脾脏淋巴细胞。实验组中加入10ug/mL的9肽、阳性对照加入4ug/mL的PHA进行刺激,阴性对照加入无关肽。在细胞培养箱内培养26-36小时后，检测特异性斑点的形成，并进行统计分析。我们选取CD20阴性及CD20阳性的淋巴癌患者来源的gp96复合物作为研究对象，结果发现只有CD20阳性患者来源的gp96可以激活9肽1特异性的T细胞（图3）。

对于人PBMC先用含10%胎牛血清的PRMI1640培养基封闭ELISPOT预包被板一小时，使用前倒掉封闭液,加入100uL含1×10⁵的人的PBMC（直接用新鲜的PBMC或者将PBMC体外扩增培养7天）。实验组中加入10g/mL的9肽、阳性对照加入4ug/mL的PHA进行刺激,阴性对照加入无关肽。在细胞培养箱内培养26-36小时后，检测特异性斑点的形成，并进行统计分析。我们选取HLA-A2阳性及CD20阳性的淋巴癌患者作为研究对象，通过ELISPOT方法检测患者新鲜血液中表位特异性CTL，特异性CTL的频率通过计数斑点数量来确定。在4例经自体gp96复合物免疫的HLA-A2阳性及CD20阳性的淋巴癌患者中均检测到高频率的VGPTQSFFM特异性CTL，且比免疫前有显著的提高，同时并没有检测到无关肽HBcAg82-90（阴性对照）特异性T细胞，说明ELISPOT结果是表位特异的（图4）。

实施例12其它gp96-多肽复合物的免疫活性测定

除上述抗原9肽之外，我们又选取其它10个淋巴癌抗原多肽与gp96体外组装并测定其免疫活性，这10个抗原多肽分别是1）CD20抗原多肽“MNSLSLFAA”，2）CD20抗原多肽“KNSPSTQYC”，3）CD19抗原多肽“GIHMRPLAI”，4）CD19抗原多肽“QQMGGFYLC”，5）CD19抗原多肽“YAAPQLRSI”，6）TCL1抗原多肽“WAWEKFVYL”，7）TCL1抗原多肽“VLLRREDVV”，8）TCL1抗原多肽“QIGPSLLPI”，9）TCL1抗原多肽“KIDGVEDML”，10）TCL1抗原多肽“GVEDMLLEL”。

分别人工合成这10种多肽，采用实施例5中所述的反应体系在体外使其与gp96结合，这10种多肽与gp96均有较高的亲和力。测定结合反应平衡常数K，上述10种肽与gp96结合反应中K值均在4.8以上。采用实施例7中所述的方法用上述10种淋巴癌抗原多肽与gp96形成的复合物，和上述10种淋巴癌抗原多肽与gp96的融合蛋白分别免疫小鼠，并采用实施例7中所述的方法分别对这20种复合物进行CTL分析，从⁵¹Cr释放实验可以看出这10种淋巴癌抗原多肽与gp96形成的复合物均可刺激HLA-A2转基因小鼠产生特异性细胞毒性T细胞。每只小鼠免疫剂量为0.1nmol(约10ug)时即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，通过对这10种多肽与gp96形成的复合物进行细胞毒性测定发现，靶细胞裂解率在40%-65%之间。调节性T细胞抑制剂的应用可以增强复合物的免疫效果。采用实施例9的方法表明这10种肽与gp96形成的复合物免疫在体内也可以抑制淋巴癌细胞的生长。

以上实验结果表明gp96与淋巴癌抗原多肽体外组装合成的复合物可开发成为一种新型淋巴癌治疗或预防药物。由于实验条件所限本发明专利不可能对每一种淋巴癌抗原多肽进行体外组装及免疫活性测定，但我们选取11种有代表性的肿瘤抗原肽作研究对象，在体外与gp96结合并进行免疫活性测定，大量实验表明gp96与这些抗原多肽形成的复合物均能刺激小鼠产生强烈的免疫反应，可开发成为一种新型治疗疫苗。因此，除上述11种抗原多肽之外，其它任何淋巴癌抗原多肽与gp96结合作为新型疫苗也应当在本发明的保护范围之内。

实施例13.HSP78-多肽免疫原性测定

将HSP78与11种多肽体外组装形成的复合物，反应体系同gp96(见实施例5)。将体外合成的复合物以及HSP78与11种多肽的融合蛋白（见实施例6）分别免疫小鼠。小鼠免疫方式、免疫剂量以及免疫程序与gp96实施方法相同(见实施例7)，细胞毒性(CTL)分析方法与gp96分析方法相同（见实施例8)。从⁵¹Cr释放实验可以看出HSP78-9肽复合物可刺激小鼠产生特异性细胞毒性T细胞，每只小鼠免疫0.1nmol(约10ug)即能诱发机体产生强烈的细胞免疫反应，细胞毒性测定靶细胞的裂解率在40%以上。实验表明HSP78-9肽复合物可开发成为一种新型淋巴癌治疗和预防的药物。

序列表

<110>深圳市康尔诺生物技术有限公司

<120>一种淋巴癌特异性的热休克蛋白复合物及其在淋巴瘤治疗中的应用

<130>一种淋巴癌特异性的热休克蛋白复合物及其在淋巴瘤治疗中的应用

<160>11

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽1

<400>1

ValGlyProThrGlnSerPhePheMet

15

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽2

<400>2

MetAsnSerLeuSerLeuPheAlaAla

15

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽3

<400>3

LysAsnSerProSerThrGlnTyrCys

15

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽4

<400>4

GlyIleHisMetArgProLeuAlaIle

15

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽5

<400>5

GlnGlnMetGlyGlyPheTyrLeuCys

15

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽6

<400>6

TyrAlaAlaProGlnLeuArgSerIle

15

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽7

<400>7

TrpAlaTrpGluLysPheValTyrLeu

15

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽8

<400>8

ValLeuLeuArgArgGluAspValVal

15

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽9

<400>9

GlnIleGlyProSerLeuLeuProIle

15

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽10

<400>10

LysIleAspGlyValGluAspMetLeu

15

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>表位肽11

<400>11

GlyValGluAspMetLeuLeuGluLeu

15

Claims

1.一种与热休克蛋白结合的表位肽VGPTQSFFM，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。

2.一种与热休克蛋白结合的表位肽MNSLSLFAA，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。

3.一种与热休克蛋白结合的表位肽KNSPSTQYC，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.3所示。

4.一种与热休克蛋白结合的表位肽GIHMRPLAI，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.4所示。

5.一种与热休克蛋白结合的表位肽QQMGGFYLC，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.5所示。

6.一种与热休克蛋白结合的表位肽YAAPQLRSI，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.6所示。

7.一种与热休克蛋白结合的表位肽WAWEKFVYL，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.7所示。

8.一种与热休克蛋白结合的表位肽VLLRREDVV，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.8所示。

9.一种与热休克蛋白结合的表位肽QIGPSLLPI，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.9所示。

10.一种与热休克蛋白结合的表位肽KIDGVEDML，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.10所示。

11.一种与热休克蛋白结合的表位肽GVEDMLLEL，其特征在于：其氨基酸序列如序列表中SEQIDNO.11所示。

12.如权利要求1-11任一项所述的表位肽与gp96或HSP78通过共价键或非共价键连接形成的复合物。

13.如权利要求1-11任一项所述的表位肽在体外单独或与热休克蛋白形成如权利要求12所述的复合物在单独或共同免疫人体诱导生成杀伤性T细胞中的用途。

14.如权利要求13所述免疫诱导杀伤性T细胞在治疗和预防淋巴癌中的用途。