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CN105163721A - 脂质纳米颗粒组合物以及制备和使用其的方法 - Google Patents

脂质纳米颗粒组合物以及制备和使用其的方法 Download PDF

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CN105163721A CN201380033174.1A CN201380033174A CN105163721A CN 105163721 A CN105163721 A CN 105163721A CN 201380033174 A CN201380033174 A CN 201380033174A CN 105163721 A CN105163721 A CN 105163721A
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Abstract

公开了脂质纳米颗粒制剂，制备和使用其的方法。

Description

脂质纳米颗粒组合物以及制备和使用其的方法
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本申请要求2012年5月23日提交的美国临时申请61/650,729和2013年3月14日提交的美国临时申请61/784,892(将所述临时申请的公开内容通过引用整体并入本文)的优先权。
关于联邦政府资助的研究的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号R01CA135243、DK088076和CA152969下由政府资助进行的。政府具有本发明的某些权利。
序列表
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技术领域
本公开内容涉及可用于递送治疗性组合物包括但不限于核酸(NA)的脂质纳米颗粒(LN)。
发明背景
脂质体是由一个或多个脂双层组成的小囊泡，其能够运载亲水性分子(在含水核心内)或疏水性分子(在其脂双层中)。如本文中所用，“脂质纳米颗粒”(LN)为描述亚微米范围内的基于脂质的颗粒的一般术语。LN可具有脂质体的结构特征和/或具有可选择的非双层类型的结构。利用LN通过全身性途径进行的药物递送需要克服几个生理屏障。网状内皮系统(RES)负责从循环清除LN。一旦逸出脉管系统并到达靶细胞，LN通常通过胞吞作用被吸收，并且必须在酸性内涵体条件中的降解之前将药物释放至细胞质中。
特别地，这样的核酸(NA)(包括siRNA和其它治疗性寡核苷酸)的递送是限制它们用于临床转换(clinicaltranslation)的潜力的主要技术挑战。
高效递送媒介物的开发是寡核苷酸(ON)治疗剂的临床转换的关键。期望LN制剂应当能够(1)保护药物免受酶促降解；(2)横穿毛细血管内皮；(3)特异性到达靶细胞类型而不引起过度免疫活化或脱靶细胞毒性；(4)促进胞吞作用和内涵体释放；和(5)形成具有胶体稳定性和长贮存期的稳定制剂。
发明概述
本文中提供了可以以高效率封装治疗性寡核苷酸并且达到有效递送的物理和生物学标准的脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含具有叔胺和季胺头基的阳离子脂质的组合。在某些实施方案中，除了脂质以外，脂质纳米颗粒还包含小肽例如短杆菌肽。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含RNA酶或DNA酶降解试剂例如蛋白酶K。还提供了这些实施方案的组合。季胺和叔胺-阳离子脂质的组合(QTsome)、短杆菌肽(A、B、C或D)(SPLN-G)和/或蛋白酶K(PrKsome)的掺入增加了脂质纳米颗粒制剂的转染率。
在第一广泛方面，本文中提供了包含叔胺和季胺-阳离子脂质的组合的脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，叔胺-阳离子脂质选自DODAP、DODMA、DC-CHOL、N,N-二甲基十六烷基胺或其组合。在某些实施方案中，季胺-阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DDAB或其组合。在某些实施方案中，叔胺-阳离子脂质的浓度低于总脂质含量的50.0摩尔百分率。在某些实施方案中，季胺-阳离子脂质的浓度低于总脂质含量的20.0摩尔百分率。在特定实施方案中，脂质纳米颗粒以选自45:0、5:40、15:30、22.5:22.5、30:15或40:5的摩尔比包含脂质DODMA和DOTMA。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒以选自90:10、70:30、50:50、30:70或10:90的摩尔比包含脂质DMHDA和DOTAP。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。在某些实施方案中，封装的分子包括选自质粒DNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的核酸。在某些实施方案中，治疗剂或核苷酸的封装率为20％或更高。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含阳离子聚合物。在具体的实施方案中，阳离子聚合物选自：精胺、哌嗪、三精胺、四精胺、寡精胺、thermine、精脒、二精脒、三精脒、寡精脒、腐胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、分枝或直链类型的聚乙烯亚胺和聚烯丙胺。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含融合肽。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒具有小于300nm的直径。
在另一个广泛的方面，本文中提供了具有小于300nm的直径并且包含肽的脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，肽选自短杆菌肽A、B、C、D或S；JTS-1；蛋白酶K(PrK)；trichorovin-Xlla；狂犬病病毒糖蛋白；白细胞介素-1β；HIV-Tat；单纯疱疹病毒VP22蛋白；及其组合。在某些实施方案中，肽包括抗生素。在特定实施方案中，抗生素选自短杆菌肽A、B、C、D或S。在特定实施方案中，肽基本上由脂质化(lipidated)JTS-1融合肽组成。在特定实施方案中，脂质化(lapidated)JTS-1融合肽以总制剂的约0至约30摩尔百分率存在。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含蛋白酶K。蛋白酶K可以以总制剂的约0至约30摩尔百分率存在。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。在某些实施方案中，封装的分子包括选自质粒DNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的核酸。
在另一个广泛的方面本文中提供了包含DNA酶或RNA酶降解试剂的脂质纳米颗粒。在某些实施方案中，DNA酶或RNA酶降解试剂基本上由蛋白酶K组成。在某些实施方案中，纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。在具体实施方案中，封装的分子包括选自pDNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的寡核苷酸。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒具有小于300nm的直径。
在另一个广泛的方面，本文中提供了具有小于300nm的直径并且包含如下物质的两种或更多种的组合的脂质纳米颗粒：叔胺和季胺-阳离子头基的混合物；抗生素；和DNA酶或RNA酶降解试剂。在某些实施方案中，DNA酶或RNA酶降解试剂基本上由蛋白酶K组成。在某些实施方案中，抗生素包括短杆菌肽A、B、C、D或S。
本文中描述的脂质纳米颗粒制剂的任何制剂可包含聚乙二醇-脂质缀合物。在某些实施方案中，聚乙二醇-脂质缀合物选自聚山梨酯80、TPGS、mPEG-DSPE、PEG-DMG。在某些实施方案中，聚乙二醇-脂质以低于约10.0摩尔百分率的浓度存在。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含N,N-二甲基十六烷基胺。在具体实施方案中，N,N-二甲基十六烷基胺以低于制剂的约60.0摩尔百分率的浓度存在。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含能够结合靶细胞或靶分子的配体。在某些实施方案中，配体为抗体或抗体片段。在具体实施方案中，配体选自cRGD、含半乳糖部分、转铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白或表皮生长因子。
在另一个广泛的方面本文中提供了包含本文中描述的脂质纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在某些实施方案中，口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤施用药物组合物。在某些实施方案中，将药物组合物制备为口服施用片剂、无菌溶液、无菌悬浮液、冻干粉剂或栓剂。
在另一个广泛的方面，本文中提供了诊断或治疗癌症或传染病的方法。方法包括给有此需要的患者施用有效量的本文中描述的药物组合物。
附图概述
图1：SK-HEP-1细胞中萤光素酶表达的下调。用通过LN递送的萤光素酶特异性siRNA处理表达萤光素酶的细胞，所述LN包含数种不同的叔胺(DODMA,DMA)和季胺(DOTMA,TMA)的组合(QTsome)。将Lipofectamine2000(Lipo2000)用作阳性对照。萤光素酶活性表达为相对于未处理的细胞的百分数。
图2：QTsome中的G3139对KB细胞中的Bcl-2表达的下调。评价了包含不同量的DMHDA的QTsome。将Lipo2000用作阳性对照。通过RT-PCR测定相对于肌动蛋白的Bcl-2mRNA表达，其中未处理的KB细胞用作mRNA表达的基线。
图3：以15:1的N:P凝聚了c-myb的SPLN-G的ζ电位。
图4：在0％和20％的血清条件下用SPLN-G处理的SK-HEP-1细胞的活力。细胞活力表达为相对于未处理的SK-HEP-1细胞的平均活力的百分数。
图5：使用SPLN-G递送的萤光素酶-siRNA对SK-HEP-1细胞中的萤光素酶表达的下调。将Lipofectamine2000(Lipo2000)用作阳性对照。萤光素酶活性表达为相对于未处理的细胞的百分数。
图6：使用加载有G3139(针对Bcl-2的ASO)的SPLN-G对MCF-7细胞中的Bcl-2表达的下调。将Lipo2000用作阳性对照。通过RT-PCR测定相对于肌动蛋白的Bcl-2mRNA表达，其中未处理的MCF-7细胞用作mRNA表达的基线。
图7：使用加载有G3139(针对Bcl-2的ASO)的SPLN-G对KB细胞中Bcl-2表达的下调。将Lipo2000用作阳性对照。通过RT-PCR测定相对于肌动蛋白的Bcl-2mRNA表达，其中未处理的KB细胞用作mRNA表达的基线。
图8：乳糖化对SPLN-G尺寸和ζ电位的影响。这些通过无唾液酸糖蛋白受体(ASGR)靶向肝和肝癌细胞。
图9：通过萤光素酶测定在表达萤光素酶的SK-HEP-1细胞中评价无唾液酸糖蛋白受体(ASGR)靶向和SPLN-G中的短杆菌肽。萤光素酶活性表达为相对于未处理的细胞的百分数。
图10：通过共聚焦显微镜观察的SPLN-G的细胞转运。DAPI(蓝色)用于对细胞的细胞核染色。siRNA-Cy3(红色)用于跟踪siRNA的内化。叠加显示高百分数的siRNA被递送至胞质溶胶。
图11：通过流式细胞术观察的封装Cy3-siRNA的非靶向SPLN-G和乳糖化SPLN-G(Lac-SPLN-G)的细胞吸收。
图12：Lac-SPLN-G-anti-miR-155对SK-HEP-1细胞中的miR-155的下调。无序对照(scrambledcontrol)miRNA(SC)用作阴性对照。通过RT-PCR测定相对于RNU6B的miR-155表达，其中未处理的SK-HEP-1细胞用作mRNA表达的基线。
图13：不同的脂质-对-siRNA(w/w)比率的Lac-SPLN-G-siRNA复合物的凝胶迁移率变动分析。
图14：使用具有LOR-1284(靶向核糖核苷酸还原酶RNRR2亚单位的siRNA)(购自Dharmacon)的PrKsome对KB细胞中的RNRR2表达的下调。通过qRT-PCR测定相对于肌动蛋白的RNRR2mRNA表达，其中未处理的KB细胞用作mRNA表达的基线。
图15A-B：不同血清条件下PrKsome对RNRR2表达水平的下调。图15A显示无血清；图15B显示5％FBS。图15C显示10％FBS。通过实时RT-PCR测定相对于肌动蛋白的RNRR2mRNA表达，其中未处理的KB细胞用作mRNA表达的基线。
图16：具有和不具有PrK的脂质纳米颗粒的细胞活力比较研究。细胞活力表达为相对于未处理的KB细胞的平均活力的百分数。
图17：LOR-1284siRNA在血浆中的稳定性研究。在72小时的时期内在小鼠血浆中温育PrKsome制剂，通过凝胶电泳显现剩余的siRNA的相对量。
图18：包含1:0.3的siRNA:PrK(w/w)的PrKsome的温度依赖性ζ电位。
图19：通过10％FBS培养基中的PrKsome递送的LOR-1284siRNA对RNRR2下调的温度依赖性效率。通过实时RT-PCR测定相对于肌动蛋白的RNRR2mRNA表达，其中未处理的KB细胞用作mRNA表达的基线。
图20：QTsome的作用机制。
图21：SPLN-G的描述。
图22：蛋白酶K包衣保护寡核苷酸免受存在于血清中的DNA酶和RNA酶降解。
图23：具有JTS-1融合肽的SPLN-J和具有蛋白酶K包衣的LN的简图。
图24：加载有anti-miR-221的SPLN-G20在MDA-MB-468乳腺癌细胞中对p27/kip1mRNA的上调。这显示SPLN-G20是用于递送anti-miR的有效媒介物。P27/Kip1是miR-221的靶。该上调表明miR-221功能的抑制。
图25：BT-549细胞的p27/Kip1中的SPLN-G20转染。
图26：BT-549细胞的ERα中的SPLN-G20转染。
图27：Lac-DOPE(蓝色)、DOPE(红色)和乳糖醛酸(绿色)的FTIR光谱。
图28A-B：Lac-GLN的表征：图28A显示具有不同程度的乳糖化的GLN的粒度和ζ电位。每一个值代表5个测量的平均值±SD。图28B显示通过TEM显示的anti-miR-155-Lac-GLN的形态学。比例尺代表100nm。
图29A-29B：Lac-GLN的表征：图29A)Lac-GLB的胶体稳定性。将Lac-GLN-anti-miR-155于4℃或25℃贮存，随时间过去测量粒度。结果为3个单独实验的平均值。误差棒代表标准差。图29B)anti-miR-155-Lac-GLN的血清稳定性。将单独的anti-miR-155或anti-miR-155-Lac-GLN与50％FBS在37℃混合0hr、4hr和12hr。随后利用凝胶电泳分析样品。
图30：包含anti-miR-155的GLN和Lac-GLN的物理化学性质。值为平均值±SD(n＝5)。
图31：包含Cy3-anti-miR-155的Lac-GLN和其它对照制剂在HepG2细胞中的细胞吸收，如通过共聚焦显微镜测定的。
图32A-C：用GLN、Lac-GLN或利用20mM乳糖和1％BSA预温育的Lac-GLN处理HepG2细胞。在FACSCalibur流式细胞仪上测量荧光信号。图32A显示利用GLN或Lac-GLN处理HepG2细胞。图32B和图32C分别显示利用20mM乳糖和1％BSA的预温育对Lac-GLN的影响。结果示于直方图中，X和Y轴分别表示荧光强度和细胞计数。
图33A-33C：Lac-GLN和其它制剂的体外递送。图33A)包含Luci-siRNA的Lac-GLN和其它对照制剂的体外递送。用包含100nM的浓度的luci-siRNA的Lac-GLN转染SK-HEP-1细胞，进行4hr，转染后48hr评价萤光素酶基因表达。结果为4个重复的平均值。误差棒代表标准差。图33B)来自MTS分析的Lac-GLN的细胞毒性。结果代表平均值±SD。图33C)包含anti-miR-155的Lac-GLN和对照制剂的体外递送。用包含100nM的浓度的anti-miR-155的Lac-GLN转染HepG2细胞，转染后48hr评价miR-155表达。结果为3个重复的平均值。误差棒代表标准差。
图34A-B：不同浓度的anti-miR-155处理对miR-155和靶基因表达的体外评价。图34A显示不同浓度的anti-miR-155处理对miR-155表达的评价。用包含100nM或200nManti-miR-155的Lipofectamine2000和Lac-GLN转染HepG2细胞，进行4hr，转染后48hr评价miR-155表达。值代表平均值±SD(n＝3)。图34B显示miR-155靶向基因表达的评价。在用阳性对照或包含100nM和200nManti-miR-155的Lac-GLN转染HepG2细胞后48hr，评价C/EBPβ和FOXP3基因表达。结果为3个重复的平均值。误差棒代表标准差。
图35A-35B：包含Cy5-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN的组织分布。在包含Cy5-anti-miR-155的GLN或Lac-GLN的静脉内施用后4hr，从C57BL/6小鼠收集心脏、肺、脾、肾和肝。通过IVIS成像系统测量Cy5荧光信号。
图36A和36B：包含Cy3-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN在肝和其它器官中的共聚焦显微镜检查。图36A显示在包含Cy3-anti-miR-155的GLN或Lac-GLN的静脉内施用后4hr，从C57Bl/6小鼠收集肝、肺和脾。在OlympusFV1000Filter共聚焦显微镜上显现Cye3荧光信号。在图36A中，红色和黄色箭头分别表示Cy4-anti-miR-155被肝细胞和枯否细胞吸收。
图37A-C：anti-miR-155处理对miR-155和靶基因表达的体内评价。用包含1.5mg/kganti-miR-155的Lac-GLN和对照制剂处理C57BL/6小鼠。静脉内施用后4hr，收集肝组织，提取RNA。每一个值代表3个测量的平均值±SD。图37A显示通过实时RT-PCR分析miR-155的表达。图37B和37C显示通过实时RT-PCR分析mir-155下游靶C/EBPβ和FOXP3的表达。每一个值代表3个测量的平均值±SD。
发明详述
在本文中在脂质纳米颗粒的背景下描述了不同实施方案。本领域技术人员将理解，下列实施方案的详细描述仅仅是举例说明性的，并且无意以任何方式限定。其它实施方案本身将很容易地被具有本公开内容的益处的这样的技术人员理解。本文中提及的“实施方案”、“方面”或“实施例”表示所描述的本发明的实施方案可包括特定性质、结构或特征，但并非每个实施方案必需包括特定性质、结构或特征。此外，短语“在一个实施方案中”的重复使用不一定是指相同的实施方案，尽管其可指相同实施方案。
并非所有本文中描述的实施方式或方法的常规特性都得到显示和说明。当然，应理解在任何这样的实际实施方式的开发中，将作出许多实施方式特异性决定以实现开发明的特殊目的，例如与应用和商业相关的限制的相容性，以及这些特殊目的将随实施方式和开发者的不同而变化。此外，应理解这样的研制工作可能是复杂且耗时的，但虽然如此对于具有本公开内容的益处的本领域技术人员来说仍然是常规工作。
一般说明
基于核酸(NA)的疗法可被开发来促进或抑制基因表达。由于基因的突变和miRNA特征谱的变化被认为是癌症和其它疾病的基础病因，因而基于NA的试剂可直接作用于基础病因，从而使治疗潜能最大化。基于NA的疗法的非限定性实例包括：质粒DNA(pDNA)、小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、microRNA(miR)、模拟物(mimetic)、anti-miR/antagomiR/miR抑制剂和反义寡核苷酸(ASO)。在本文中描述的纳米颗粒组合物开发之前，由于将NA转运至它们的细胞内靶具有特别的挑战性以及由于NA相对不稳定并易于受血清和细胞核酸酶降解，因此基于NA的疗法的临床转换在它们的实现中面临几个障碍。此外，NA的高负电荷使得其不可能转运穿过细胞膜，从而进一步限制效用。
本文中描述的LN为常规治疗性化合物和基于NA的疗法的递送提供了有用平台。使用LN配制的药物在体内提供了期望的药代动力学(PK)性质，例如，因高渗透和滞留(EPR)效应而引起的增加的血液循环时间和增加的在实体瘤部位的积累。此外，在某些实施方案中，LN可以用聚乙二醇包被表面以减少血清蛋白对LN的调理作用和导致的RES介导的吸收，和/或用细胞特异性配体包被来提供靶向药物递送。
对于全身性递送，期望LN的ζ电位不是过度正的或负的。具有高正电荷的LN倾向于与非靶细胞、组织和循环血浆蛋白非特异性相互作用，并且可引起细胞毒性。或者，具有高负电荷的LN不能有效地包含NA(其本身带负电荷)，并且可触发快速的RES介导的清除，从而降低治疗效果。具有中性至中度电荷的LN最适合用于体内药物和基因递送。
本文中提供了具有增强的转染活性的脂质纳米颗粒(LN)。脂质纳米颗粒可将疏水性分子分配在脂膜内或将水溶性颗粒或分子封装在含水核心中。在某些实施方案中，LN制剂包含脂质的混合物，通常包括带电荷的脂质和中性脂质，和任选地还包括PEG化脂质和/或胆固醇。本公开内容的LN制剂可包含季胺和叔胺的组合、肽例如短杆菌肽(A、B、C、D或S)或RNA酶或DNA酶降解试剂例如蛋白酶K。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒通过将具有季胺头基的阳离子脂质与具有叔胺头基的阳离子脂质组合来产生。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒是小肽脂质纳米颗粒(SPLN)，并包含肽例如短杆菌肽或JTS1。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包被有蛋白酶K，这在血清存在的情况下增强转染。为了便于参照，包含短杆菌肽的SPLN在本文中称为SPLN-G，包含JTS-1肽的SPLN在本文中称为SPLN-J，包含蛋白酶K的脂质纳米颗粒在本文中称为PrKsome。还提供了这些不同实施方案的组合。LN具有小于300nm，或在特定实施方案中约50与约200nm之间的直径。这些LN显示增强的转染和降低的细胞毒性，特别在见于全身性施用过程中的高血清条件下。LN适用于广泛的目前的治疗剂和系统、血清稳定性和靶向递送，具有高转染率。
如本文中所用，术语“脂质纳米颗粒”是指由一种或多种脂质组分形成的任何小囊泡。本文中描述的LN制剂可包含阳离子脂质。阳离子脂质为在任何生理pH下具有净正电荷的脂质。正电荷用于与带负电荷的治疗剂例如ASO通过静电相互作用缔合。
适当的阳离子脂质包括但不限于3β-[N-(N’,N’-二甲氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-Chol)；1,2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷(DODAP)；二甲基双十八烷基溴化铵盐(DDAB)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-氯化乙基磷酸胆碱盐(DL-EPC)；N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N-N-N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N-N-N-二甲基氯化铵(DODMA)；N,N-双十八烷-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)；N-(1-(2,3-二油氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)；1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)；双十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)；缀合于阳离子修饰基团的中性脂质；及其组合。此外，可使用许多可获得的制剂中的阳离子脂质，例如(来自GIBCO/BRL)，(来自GIBCO/MRL)，siPORT(来自AppliedBiosystems)，(来自Promega)和(来自Bio-RadLaboratories,Inc.)。本领域技术人员将承认，更多的阳离子脂质适合用于包含在LN制剂中。本公开内容的阳离子脂质可以以制剂中脂质的约0至约80.0摩尔百分率的浓度存在，或以制剂的约5.0至约50.0摩尔百分率的浓度存在。
在某些实施方案中，目前公开的LN制剂还包含阴离子脂质。阴离子脂质是在生理pH下具有净负电荷的脂质。这些阴离子脂质，当与阳离子脂质组合时，可用于减少LN的总表面电荷，并引入LN双层结构的pH依赖性破裂，从而通过在酸性pH诱导非层状相来促进核苷酸释放，或诱导与细胞膜的融合。
适当的阴离子脂质的实例包括但不限于：脂肪酸例如油酸、亚油酸和亚麻酸；胆甾醇半琥珀酸酯；1,2-二-O-十四烷基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(二醚PG)；1,2-二肉豆蔻基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-rac-甘油)(钠盐)；1,2-二肉豆蔻基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)；1-十六酰,2-(9Z,12Z)-十八碳二烯酰-sn-甘油-3-磷酸盐；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-rac-(1-甘油)](DOPG)；二油酰基磷脂酸(DOPA)；和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；缀合于中性脂质的阴离子修饰基团；及其组合。本公开内容的阴离子脂质以制剂的高至约60.0摩尔百分率，或制剂的约5.0至约25.0百分率的浓度存在。
在某些实施方案中，带电荷的LN对于转染是有利的，但脱靶效应例如细胞毒性和RES-介导的吸收可发生。亲水性分子例如聚乙二醇(PEG)可缀合于脂质锚并包含在本文中描述的LN中以阻碍LN聚集或与膜相互作用。可将亲水性聚合物共价地键合于脂质组分或使用交联剂将其缀合于官能团例如胺。
亲水性聚合物的适当缀合物包括但不限于聚乙烯醇(PVA)；聚山梨酯80；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸氨基乙醇-N-PEG2000(DSPE-PEG2000)；D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸盐(TPGS)；二肉豆蔻酰基磷脂酰基乙醇胺-PEG2000(DMPE-PEG2000)；和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DPPE-PEG2000)。亲水性聚合物可以以制剂的约0至约15.0摩尔百分率，或制剂的约5.0至约10.0摩尔百分率的浓度存在。使用的PEG的分子量为约100至约10,000Da，或约100至约2,000Da。
本文中描述的LN还可包含中性和/或两亲性脂质作为辅助脂质。这些脂质用于稳定制剂，减少体内清除，或增强转染率。可在糖例如但不限于葡萄糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、纤维二糖、棉子糖、麦芽三糖、葡聚糖或其组合的溶液中配制LN以促进溶解稳定性(lyostability)和/或低温稳定性。
中性脂质在生理pH具有0净电荷。可将几种中性脂质之一或其组合包含在本文中公开的任何LN制剂中。
适当的中性脂质包括但不限于：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、脑苷脂、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、二酰甘油、糖基化二酰甘油、异戊烯醇(prenol)、溶酶体PLA2底物、N-酰基甘氨酸及其组合。
其它适当的脂质包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺；甾醇类例如胆固醇、脱氢胆固醇、谷固醇、霉菌固醇、薯蓣皂苷配基、羊毛甾烯醇、豆固醇、7-烯胆烷醇和去氢表雄酮；和鞘脂类例如鞘氨醇、神经酰胺类、鞘磷脂、神经节苷脂类、糖苷神经鞘脂类、鞘磷脂、植物鞘氨醇；及其组合。
本文中描述的LN制剂还可包含致融性脂质或致融性包衣以促进膜融合。适当的致融性脂质的实例包括但不限于单油酸甘油酯、油酸、棕榈油酸、磷脂酸、磷酸肌醇4,5-二磷酸(PIP2)及其组合。
本文中描述的LN制剂还可包含阳离子脂质。这样的脂质的头基在性质上可以是伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在某些实施方案中，LN包含叔胺与季胺的混合物。
适当的叔胺基脂质包括但不限于：DODAP；DODMA；N,N-二甲基十六烷基胺(DMHDA)和DC-CHOL。适当的季胺基脂质包括但不限于：DOTAP、DOTMA和DDAB。多种氨基脂质，特别地叔和季阳离子脂质的组合对于治疗剂的LN递送是有益的。阳离子脂质可以以组合的高达约60摩尔百分率的浓度存在。
此处描述的LN制剂还可包含阳离子聚合物或阳离子聚合物的缀合物。阳离子聚合物或其缀合物可单独使用或与脂质纳米载体组合使用。
适当的阳离子聚合物包括但不限于：聚乙烯亚胺(PEI)；五乙烯六胺(PEHA)；精胺；精脒；聚(L-赖氨酸)；聚(酰胺基胺)(PAMAM)树状聚合物；聚丙烯亚胺树状聚合物；聚(2-二甲氨基乙基)-甲基丙烯酸酯(pDMAEMA)；壳聚糖；三(2-氨乙基)胺及其甲基化衍生物；及其组合。链长度和分枝是多聚体递送系统的实现的重要考虑因素。高分子量聚合物例如PEI(MW25,000)可用作转染剂，但受困于细胞毒性。低分子量PEI(MW600)不引发细胞毒性，但因其不能促进与核酸的稳定凝聚而受限制。
还可将阴离子聚合物掺入本文中公开的LN制剂。适当的阴离子聚合物包括但不限于：聚(丙基丙烯酸)(PPAA)；聚(谷氨酸)(PGA)；藻酸盐；葡聚糖；黄原胶；衍生聚合物；及其组合。
在某些实施方案中，LN制剂包括聚合物的缀合物。可将缀合物与靶向试剂、亲脂性部分、肽、蛋白质或增加总体治疗功效的其它分子交联。
适当的交联剂包括但不限于：N-琥伯酰亚胺3-[2-吡啶基二硫代]-丙酸盐(SPDP)；3,3’-二硫双丙酰亚氨酸二甲酯(DTBP)；二环己基碳二亚胺(DCC)；二异丙基碳二亚胺(DIC)；1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)；N-羟基硫代琥珀酰亚胺(磺基-NHS)；N’-N’-羰二咪唑(CDI)；N-乙基-5-苯基异恶唑-3’磺酸盐(伍德沃德氏试剂K)；及其组合。
LN制剂还可包含肽和/或蛋白质。肽和蛋白质，特别地来源于细菌和病毒或用作抗生素剂的肽和/或蛋白质，可帮助膜渗透。可将肽或蛋白质与脂质直接混合、共价连接或用交联剂缀合于脂质部分。
适当的肽和蛋白质包括但不限于：短杆菌肽A、B、C、D和S；HA2；JTS-1；蛋白酶K(PrK)；trichorovin-Xlla(TV-Xlla)；狂犬病病毒糖蛋白(RVG)；白细胞介素-1β；HIV-Tat；单纯疱疹病毒(HSV)VP22蛋白；及其组合。在某些实施方案中，以约0至约40摩尔百分率使用JTS-1和/或短杆菌肽。在某些实施方案中，通过与寡核苷酸直接混合或至十六烷基异硫氰酸酯缀合将约0至约30摩尔百分率的浓度的PrK用于PrK的LN表面包被。
靶向试剂至LN的添加提供了相较于被动靶向法增加的效率。靶向包括特异性靶向部分例如但不限于针对细胞表面受体的配体或抗体、肽、脂蛋白、糖蛋白、激素、维生素、抗体、抗体片段、前药以及这些部分的缀合物或组合的掺入。
在某些实施方案中，靶向效率的最大化包括利用适当的靶向部分对LN进行表面包被而非封装靶向试剂。该方法最优化与细胞表面受体的相互作用。
应理解可在合成过程中将靶向试剂直接掺入LN，或在随后步骤中添加。靶向部分上的官能团以及治疗性应用的具体要求(例如，可降解的连接)决定至LN中的掺入的适当方法。不具有亲脂性区域的靶向部分不能直接插入LN的脂双层，并且需要在插入之前至脂质的预先缀合，或必须与LN形成静电复合物。
同样地，在某些情况下，靶向配体不能直接连接于亲脂性锚。在这些情况下，可将交联剂形式的分子桥用于促进相互作用。在某些实施方案中，如果锚定的靶向部分的空间限制阻止与期望的生理靶的充分相互作用，则使用交联剂是有利的。此外，如果靶向部分仅在一定方向上具有功能(例如，单克隆抗体)，则通过交联剂至脂质锚的连接是有益的。可将生物缀合的常规方法用于将靶向剂连接于LN。可将可还原的或可水解的连接用于阻止制剂在体内积累和随后的细胞毒性。
LN制备的各种方法适合于合成本公开内容的LN。例如，可使用乙醇稀释、冷冻-解冻、薄膜水合、超声处理、挤压、高压均化、去垢剂透析、微流化、切向流渗滤、无菌过滤和/或冷冻干燥。此外，数种方法可用于减小LN的尺寸。例如，可在适合用于脂质均化的任何装置例如AvestinEmulsiflex装置上进行均化。可使用具有适当的孔径(0.05至0.2μm)的聚碳酸酯膜在LipexBiomembrane挤压机上进行挤压。可进行多个粒度减小循环来使样品内的尺寸变化最小化。随后可将所得的LN通过尺寸排阻柱例如SepharoseCL4B或通过切向流渗滤加工以纯化LN。
本文中描述的LN的任何实施方案还可在制备过程中包括乙醇。在LN制剂中掺入约30-50％的乙醇使脂双层去稳定，并促进带电荷部分之间例如阳离子脂质与阴离子ASO和siRNA之间的静电相互作用。在施用之前稀释于高浓度乙醇溶液中制备的LN。或者，可通过透析或渗滤除去乙醇，这也除去未被封装的NA。
在某些实施方案中，期望对LN进行灭菌。这可在进行或未进行粗滤的情况下通过将LN通过0.2或0.22μm无菌过滤器来实现。
可通过许多方法进行LN的物理表征。可将动态光散射(DLS)或原子力显微镜检查(AFM)用于测定平均直径及其标准差。在某些实施方案中，特别期望LN具有约200nm的直径。通过ζ电位差计进行的ζ电位测量在测定颗粒的相对稳定性中是有用的。可利用于去离子水或适当的缓冲液中稀释的样品进行动态光散射分析和ζ电位分析。低温透射电子显微镜(Cryo-TEM)和扫描电子显微镜(SEM)可用于测定LN的详细的形态学。
本文中描述的LN在冷冻下可稳定数月。可使用标准方法冷冻干燥在合成与施用之间需要长期保存的LN。可在冷冻之前将冷冻保护剂例如10％蔗糖添加至LN悬浮液以维持制剂的完整性。为了长期稳定性，推荐冷冻干燥经加载的LN制剂。
季胺和叔胺-阳离子脂质(QTSOME)
虽然LN的物理特性增强有孔肿瘤血管中的高渗透和滞留(EPR)，但内涵体逃逸仍然是常规LN制剂的挑战。为此目的，已开发了包含用于核酸的复合的带正电荷的基于季胺或叔胺的阳离子脂质的脂质纳米颗粒。基于季胺的阳离子脂质具有永久性正电荷并且能够与核酸形成稳定的静电复合物。然而，叔胺-阳离子脂质是条件性电离的，并且它们的正电荷在很大程度上受pH调节。本文中提供了包含季胺和叔胺-阳离子脂质的组合的LN(QTsomes)，其提供了治疗剂可籍以在内涵体内从LN释放的机制。QTsome是条件性电离的，并在内涵体的酸性条件下促进脂双层破裂和寡核苷酸内涵体释放。季胺基-阳离子脂质是永久性带电荷的，从而确保脂质与寡核苷酸之间的强相互作用，从而确保稳定性。叔胺和季胺阳离子脂质的组合提供了最适的pH反应特征谱，而这对于单独的每一类脂质是不可能的。QTsome在转染细胞方面比常规阳离子脂质体更具活性。
QTsome显示出比标准阳离子脂质制剂更高的转染活性。细调季胺与叔胺-阳离子脂质之间的平衡允许精确地控制核酸至胞质溶胶中的释放。在具体实施方案中，特定释放参数的使用提供了可籍以使基于核酸的治疗剂的活性最大化的技术。例如，应指出，叔胺-阳离子脂质当单独使用时，具有pH依赖性电离特征谱。由于单一脂质种类可能不提供LN电荷特征的期望水平的控制，因此可使用叔胺和季胺-阳离子脂质的组合，从而导致这样的组合在siRNA递送上的显著提高的活性。
图1描述了叔胺和季胺阳离子脂质的组合的相对萤光素酶表达。在5:40的季胺-阳离子脂质对叔胺-阳离子脂质的比率上，对于表达萤光素酶的HCC细胞的萤光素酶siRNA转染，显示了超过85％的下调。图20描述了QTsome的作用机制。在pH7.4下，季胺-阳离子脂质(QA-CL)维持“+”电荷以提供稳定性。在pH5.5下，QA-CL和叔胺-阳离子脂质(TA-CL)带电荷，这促进内涵体膜相互作用/破裂。
小肽脂质纳米颗粒(SPLN)
本文中还提供了包含小肽脂质纳米颗粒(SPLN)的LN。在某些实施方案中，SPLN包含抗生素短杆菌肽。本文中描述了短杆菌肽的某些变体(A、B、C、D)，所述变体先前未被当作转染剂来进行研究。尽管这些短杆菌肽亚型与短杆菌肽S共有保守的肽序列，但短杆菌肽A、B、C和D形成β螺旋结构，而短杆菌肽形成环状结构。因此，短杆菌肽A-D与短杆菌肽S不同。短杆菌肽二聚化并形成离子载体，促进膜融合，这促进了内涵体和LN的脂双层的去稳定化。因此，包含短杆菌肽的SPLN在基于核酸的疗法中是理想的。短杆菌肽A、B、C、D或S至LN的掺入显著增加了ASO和siRNA的细胞转染率。
在某些实施方案中，利用短杆菌肽的SPLN被命名为SPLN-G，随后是对应于制剂中短杆菌肽的摩尔百分率的数字。图21描述了SPLN-G。
将短杆菌肽A、B、C、D或S组合至脂质纳米颗粒制剂中增加了ASO和siRNA制剂在血清存在情况下的转染率。短杆菌肽促进内涵体膜双层对ODN的透化。相反地，转染剂例如LipofectamineTM2000在血清存在的情况下显示显著减小的转化活性。具有萤光素酶siRNA的SPLN-G在血清存在的情况下在HCC细胞中显示低细胞毒性和比转染剂Lipofectamine2000(LF)更高的转染活性，如图5中显示的。在血清存在的情况下未显示转染活性的减小的脂质纳米颗粒制剂是有利的，因为血清条件最好地模拟了实际患者中的条件，从而有利于更好的至临床研究的转换。
本文中还提供了掺入脂质化JTS-1融合肽的SPLN。这些SPLN-J颗粒显示了高转染活性，并且具有高膜融合活性，该膜融合活性通过JTS-1从卷曲至螺旋的pH依赖性构象变化而触发。
蛋白酶K(PRK)(PRKSOME)
核苷酸在施用后于血清中的降解是基于核苷酸的疗法，甚至牵涉脂质或聚合物载体的疗法所持续关注的问题。通常地，进行对核苷酸的改变(例如主链和碱基对修饰)以更好地保护核苷酸免受降解。然而，这些修饰可导致药物的减弱的活性或脱靶活性。为了克服该问题，本文中提供了包含DNA酶或RNA酶降解试剂的脂质纳米颗粒制剂。在具体实施方案中，DNA酶或RNA酶降解试剂为蛋白酶K(PrK)。蛋白酶K包衣保护寡核苷酸免受存在于血清中的DNA酶和RNA酶降解。这由图23来描述。蛋白酶K能够比不具有蛋白酶K的脂质纳米颗粒更好地保护siRNA。蛋白酶K的包含在血清存在的情况下增加转染率而在KB细胞中无显著的细胞毒性。PrKsome具有高度通用性，并适用于天然的和化学修饰的寡核苷酸。
可将蛋白酶K包衣掺入此处描述的LN的任何实施方案。以非限定性实例的方式，图24描述了具有蛋白酶K包衣的SPLN-J。
应用
取决于应用，本文中公开的脂质纳米颗粒可被设计来有利于特性例如增强的与核酸的相互作用、增强的血清稳定性、减少的RES-介导的吸收、靶向递送或内涵体中的pH敏感性释放。由于LN制剂的不同性质，本文中提供的几种方法的任一种可用于实现特定治疗目标。阳离子脂质、阴离子脂质、PEG-脂质、中性脂质、致融性脂质、氨基脂、阳离子聚合物、阴离子聚合物、聚合物缀合物、肽、靶向部分及其组合可用于实现特定目标。
本文中描述的脂质纳米颗粒可用作用于治疗性递送寡核苷酸(ON)治疗剂例如siRNA、shRNA、miRNA、anti-miR和反义ODN的平台。这些治疗剂可用于处理众多疾病例如不同类型的癌症、白血病、病毒感染和其它疾病。例如，靶向部分例如环状-RGD、叶酸、转铁蛋白或抗体通过使得能够进行靶向药物递送来极大地增强了活性。许多肿瘤在它们的细胞表面上过表达受体。适当的靶向部分的非限定性实例包括转铁蛋白(Tf)、叶酸、低密度脂蛋白(LDL)和表皮生长因子。此外，肿瘤血管内皮标志物例如α-v-β-3整联蛋白和前列腺特异性膜抗原(PSMA)作为靶向LN的靶是有价值的。在某些实施方案中，具有在直径上测量为约300nm或更小的颗粒、具有低于50mV的ζ电位以及大于20.0％的封装率的LN制剂用于NA递送。
本文中描述的LN制剂的实施方案的单独的或彼此组合的实现与当前的脂质纳米颗粒设计的范例协同作用。
可将许多治疗剂与本文中描述的LN结合使用。这样的治疗剂的非限定性实例包括抗肿瘤药、抗感染剂、局部麻醉剂、抗过敏剂、抗贫血药、血管生成抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道拮抗剂、抗高血压药、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗风湿药、驱虫药、抗寄生虫药、皮质类固醇、激素、激素拮抗药、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗糖尿病药、抗癫痫药、抗出血药、抗高渗药、抗青光眼药、免疫调节细胞因子、镇静药、趋化因子、维生素、毒素、麻醉品、成像剂及其组合。
基于核酸的治疗剂高度适用于本公开内容的LN制剂。这样的基于核酸的治疗剂的实例包括但不限于：pDNA、siRNA、miRNA、anti-miRNA、ASO及其组合。为了保护免受血清核酸酶降解和稳定治疗剂，可对取代核酸和/或磷酸二酯接头进行修饰。这样的修饰包括但不限于：主链修饰(例如，硫代磷酸酯连接)；2’修饰(例如，2’-O-甲基取代的碱基)；两性离子修饰(6’-氨基己基修饰的ODN)；亲脂性部分(例如，脂肪酸、胆固醇或胆固醇衍生物)的添加；及其组合。修饰的序列与本文中公开的LN制剂协同作用。例如，3’-胆固醇至ODN的添加通过在系统中添加亲脂性相互作用给LN复合物提供稳定性(否则所述LN复合物仅仅通过静电相互作用保持在一起)。此外，该亲脂性添加通过将ODN定位至细胞膜的外叶层(outerleaflet)来促进细胞渗透。应用肽例如短杆菌肽或JTS-1因其致融性性质而进一步促进制剂的细胞渗透。或者，酶例如蛋白酶K的添加可进一步帮助ODN抵抗降解。
取决于治疗性应用，本文中描述的LN可通过下列方法来施用：口服、胃肠外、静脉内、肌内、皮下、腹膜内、经皮肤、瘤内、动脉内、全身性或对流增强的(convection-enhanced)递送。在特定实施方案中，静脉内、肌内、皮下或瘤内递送LN。使用不同的或相似的LN的随后给药可使用可选择的施用途径来进行。
本公开内容的药物组合物包含溶解或分散在药学上可接受的载体中的有效量的本文中公开的脂质纳米颗粒制剂和/或另外的试剂。短语“药物的”或“药学上可接受的”是指当给动物例如人施用时不产生有害、过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，包含至少一种化合物或另外的活性成分的药物组合物的制备对于本领域技术人员来说是已知的，如由Remington’sPharmaceuticalSciences,2003(通过引用并入本文)举例说明的。此外，对于动物(例如人)施用，应理解LN制剂应当满足FDA生物标准办公室要求的无菌、致热原性、一般安全性和纯度标准。
取决于以固体、液体还是气雾剂形式施用以及对于这样的施用途径如注射是否需要是无菌的，本文中公开的组合物可包含不同类型的载体。本文中公开的组合物可通过静脉内、皮内、经皮肤、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌内、皮下、经粘膜、子宫内、口服、局部、局域、通过吸入(例如，喷雾吸入)，通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接浸浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、于乳剂中、于脂质组合物(例如，脂质体)中或通过其它方法或上述方法的任意组合来施用，这对于本领域技术人员来说是已知的(参见，例如，Remington'sPharmaceuticalSciences,2003，通过引用并入本文)。
给动物或人患者施用的本文中公开的组合物的实际剂量可由物理和生理学因素例如体重或表面积、病况的严重度、待治疗的疾病的类型、先前或同时进行的治疗干预、患者的特发症和施用途径来确定。取决于施用剂量和途径，优选剂量和/或有效量的施用的次数可根据受试者的反应而变化。在任何情况下，负责施用的医生将确定组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的适当剂量。
在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其它实施方案中，活性化合物可包含例如单位重量的约2％至约75％，或约25％至约60％，以及可在其中导出的任意范围。天然地，可以以这样的方式制备每一种治疗上有用的组合物中的活性化合物的量，以便在任何给定的化合物的单位剂量中将获得适当的剂量。制备这样的药物制剂的本领域技术人员将考虑因素例如溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产物贮存期以及其它药理学考虑因素，这样，多种剂量和治疗方案可以是期望的。
在其它非限定性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重至约1000mg/kg/体重或更多，以及可在其间导出的任意范围。在可从本文中所列数目导出的范围的非限定性实例中，可基于上述数目施用约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约500毫克/kg/体重等范围的剂量。
在某些实施方案中，本文中的组合物和/或另外的试剂被配制来通过消化道途径施用。消化道途径包括所有可能的其中组合物与消化道直接接触的施用途径。具体地，本文中公开的药物组合物可口服、含服、经直肠或舌下施用。这样，这些组合物可用惰性稀释剂或用可同化的食用载体来配制。
在其它实施方案中，本文中描述的组合物可通过胃肠外途径来施用。如本文中所用，术语“胃肠外”包括绕开消化道的途径。具体地，本文中公开的药物组合物可以例如但不限于通过静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内途径施用(将美国专利6,753,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158、5,641,515和5,399,363各自明确地通过引用整体并入本文)。
可在适当地与表面活性剂例如羟丙基纤维素混合的水中制备在本文中公开的作为游离碱或药学上可接受的盐的组合物的溶液。还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备分散体。在常规贮存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂来防止微生物的生长。适合用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于无菌注射液或分散体的临时制备的无菌粉剂(美国专利5,466,468，明确地通过引用整体并入本文)。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须具有达到易注射能力存在的程度的流动性。其在制造和贮存条件下必须是稳定的，并且必需防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(即，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其适当的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。微生物的作用的预防可通过各种抗菌和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现。在许多情况下，优选包含等渗试剂例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝或明胶来实现。
对于水溶液中的胃肠外施用，例如，必要时应当适当地缓冲溶液，以及首先利用充足的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。关于这一点，根据本公开内容，可使用的无菌含水介质对于本领域技术人员来说是已知的。例如，可将一个剂量溶解于1ml等渗NaCl溶液中，添加至1000ml皮下输液液体或在建议的输注部位注射，(参见例如，“Remington'sPharmaceuticalSciences”第15版,第1035-1038页和1570-1580页)。取决于待治疗的受试者的病况，剂量将必要地发生一定的变化。负责施用的人，在任何情况下，将确定用于个体受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应当满足FDA生物标准办公室要求的无菌、致热原性以及一般安全性和纯度标准。
通过将组合物以需要的量与多种上文中列举的其它成分(需要时)掺入适当的溶剂，随后进行过滤器灭菌来制备无菌注射液。通常地，通过将各种无菌组合物掺入无菌媒介物来制备分散体，所述媒介物包含基本分散介质和来自上文中列举的成分的所需的其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，一些制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其产生活性成分和来自其先前经无菌过滤的溶液的任何其它的期望成分的粉剂。在利用或不利用稳定剂的情况下，将粉末组合物与液体载体例如水或盐溶液组合。
在其它实施方案中，组合物可被配制来用于通过各种各样的途径施用例如局部(即，经皮肤)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或通过吸入施用。
用于局部施用的药物组合物可包括被配制来用于含药敷用的组合物，例如软膏剂、糊剂、乳膏或粉剂。软膏剂包括所有用于局部施用的油脂性、吸附、乳化和水溶性基于的组合物，而乳膏和洗剂是仅包括乳化基质的那些组合物。局部施用的药剂可包含渗透促进剂来促进活性成分通过皮肤的吸附。适当的渗透促进剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮和月桂氮酮。用于局部施用的组合物的可能基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷膏和矿脂以及任何其它适当的吸附、乳化或水溶性软膏基质。必要时，局部制剂还可包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂来保存组合物和提供均质混合物。组合物的经皮肤施用还可包括“贴剂”的使用。例如贴剂可在一段固定的时期内以预定的速率和连续方式提供一种或多种组合物。
在某些实施方案中，组合物可通过滴眼剂、鼻内喷雾、吸入和/或其它气雾剂递送媒介物来递送。用于将组合物通过鼻气雾喷雾器直接递送至肺的方法已描述于美国专利5,756,353和5,804,212(将其各自明确地通过引用并入本文)中。同样地，使用鼻内微粒树脂(Takenaga等人,1998)和溶血磷脂酰基甘油化合物(美国专利5,725,871,明确地通过引用整体并入本文)进行的药物递送在制药领域中也是公知的，并且可用于递送本文中描述的组合物。同样地，以聚四氟乙烯支持基质的形式进行的经粘膜药物递送描述于美国专利5,780,045(明确地通过引用整体并入本文)中，并且可用于递送本文中描述的组合物。
还预期本文中公开的组合物可通过气雾剂来递送。术语气雾剂是指分散在液化或加压的气体喷射剂中的细碎的固体或液体颗粒的胶体系统。用于吸入的典型气雾剂由液体喷射剂或液体喷射剂与适当的溶剂的混合物中的活性成分的悬浮液组成。适当的喷射剂包括烃类和烃醚。适当的容器根据喷射剂的压力需要而变化。气雾剂的施用根据受试者的年龄、体重以及症状的严重度和反应而变化。
实施例
在本文中的实施例中定义本发明的某些实施方案。应当理解这些实施例，虽然显示本发明的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。根据上文中的论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可对本发明进行各种变化和修改以使其适合于各种用途和条件。
实施例1
通过将脂质溶解于100％乙醇中来产生脂质原液。所有脂质获自AvantiPolarLipids(USA)或SigmaAldrich(USA)并且在不进行进一步纯化的情况下使用。将脂质(卵磷脂酰胆碱:胆固醇:TPGS,15:35:5)与不同浓度的叔胺(DODMA)和季胺(DOTMA)(45:0,5:40,15:30,22.5:22.5,30:15,40:5,45:0；DODMA:DOTMA)于1.0mL小瓶中组合。添加额外的乙醇以达到180μL的体积。随后将其与420μL10mM柠檬酸缓冲液组合以达到30％乙醇的终浓度。以15:1的胺对磷酸盐的比率(N:P)组合制剂与SILENCER萤火虫萤光素酶(GL2+GL3)siRNA(Invitrogen)。让制剂温育15分钟，随后用无血清DMEM(GIBCO)稀释至300μL的总体积。Lipofectamine2000(Invitrogen)用作阳性对照，以相同的N:P将其与相同量的siRNA组合，并稀释至相同的总体积。
转染前24h，将在37℃、5％CO2气氛下于DMEM培养基中生长的表达萤光素酶的SK-HEP-1(肝细胞癌)细胞以2x104个细胞/孔的密度涂板在96孔板中。将细胞生长至大致80％的汇合，除去含血清培养基。用70μL转染培养基转染细胞，处理4h。以一式4份进行实验。在完成处理后，用1XPBS洗涤细胞，恢复含血清DMEM。完成处理后48h，按照制造商的说明书，利用萤光素酶测定试剂盒(Promega)，分析细胞的萤光素酶表达。结果示于图1中。包含5％DOTMA和40％DODMA的制剂显示最有效的转染活性，显示了萤光素酶表达的超过85％的敲低。
实施例2
通过将脂质溶解于100％乙醇中来产生脂质原液。所有脂质获自AvantiPolarLipids(USA)或SigmaAldrich(USA)并且在不进行进一步纯化的情况下使用。将脂质(卵磷脂酰胆碱:胆固醇:TPGS,15:35:5)与不同浓度的叔胺(DMHDA)和季胺(DOTMA)(90:10,70:30,50:50,30:70,10:90；DMHDA:DOTMA)于1.0mL小瓶中组合。添加额外的乙醇以达到180μL的体积。随后将其与420μL10mM柠檬酸缓冲液组合以达到30％乙醇的终浓度。以15:1的胺对磷酸盐的比率(N:P)组合制剂与G3139(Genasense)ODN。让制剂温育15分钟，随后用无血清RPMI1640(Mediatech)稀释至300μL的总体积。Lipofectamine2000(Invitrogen)用作阳性对照，以相同的N:P将其与相同量的ODN组合，并稀释至相同的总体积。
转染前24h，将在37℃、5％CO2气氛下于RPMI1640培养基中生长的KB(HeLa的亚系)细胞以2x104个细胞/孔的密度涂板在96孔板中。将细胞生长至大致80％的汇合，除去含血清培养基。用70μL转染培养基转染细胞，处理4h。以一式4份进行实验。在完成处理后，用1XPBS洗涤细胞，恢复含血清RPMI1640。完成处理后48h，分析细胞的Bcl-2下调。将实时聚合酶链式反应(RT-PCR)用于评价Bcl-2相对于肌动蛋白的下调。如图2中显示的，利用含DMHDA/DOTAP(90/10摩尔比)的制剂的转染导致相较于未转染细胞Bcl-2表达的大于75％的下调。LipofectamineTM、单独的DMHDA和单独的DOTAP用作对照。以备选比例存在的DMHDA/DOTAP的制剂显示较低比率的转染率。
实施例3
分析不同SPLN-G制剂的转染率：SPLN-G50(40:5:50:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、GRAM、TPGS)、SPLN-G35(40:5:35:15:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE、TPGS)、SPLN-G30(40:5:30:20:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE、TPGS)、SPLN-G20(40:5:20:30:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE、TPGS)、SPLN-G10(40:5:10:40:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE、TPGS)和SPLN-G0(40:5:50:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、DOPE、TPGS)。所有脂质购自AvantiPolarLipids(USA)或SigmaAldrich(USA)，并且可无需进一步纯化的情况下使用。将脂质和肽溶解于乙醇中，以适当的比例组合以形成LN。添加额外的乙醇和柠檬酸缓冲液以获得30％的终乙醇含量。将2.0mg/mL的LN溶液与siRNA或ODN以15:1的N:P比组合，使其在室温下反应15min，随后进一步稀释。制剂的粒度在100与300nm之间的范围内变化。对于含短杆菌肽的制剂，利用去离子水稀释的并与c-mybODN组合的制剂的ζ电位测量(图3)显示了在5与15mV之间的范围内变化的ζ电位。这与显示高于35mV的ζ电位的阳性对照Lipofectamine2000形成鲜明对比。
将在37℃、5％CO2气氛下于补充有10％FBS和1％链霉素/青霉素的DMEM培养基(GIBCO)中培养的SK-HEP-1细胞生长至汇合，随后以2x104个细胞/孔的密度涂板在96孔板中。将萤火虫萤光素酶(GL2+GL3)siRNA与制剂以N:P15:1组合。使制剂与脂质制剂在室温下组合15min，随后用DMEM进行稀释。在无血清和20％血清的条件下测试转染率。除去培养基，用每孔70μL转染培养基替代所述培养基。处理细胞4h，随后用1XPBS洗涤3次。处理后48h小时，通过MTS测定和萤光素酶测定试剂盒分别分析细胞活力(图4)和萤光素酶表达(图5)。包含35％或更少的短杆菌肽的制剂在高血清转染条件下显示比Lipofectamine2000更低的细胞毒性和更高的转染率。
在MCF-7(ER阳性乳腺癌)细胞中研究ODNG3139对Bcl-2的下调。在20％血清存在的情况下进行转染，将RT-PCR用于评价Bcl-2相对于肌动蛋白的下调(图6)。SLN-G20相对于Lipofectamine2000显示显著的Bcl-2的下调。以重复方式(n＝3)在KB细胞中重复该研究，如图7中显示的。
实施例4
通过使用EDC/NHS交联乳糖醛酸与DOPE(1:5:10:5,DOPE:LA:EDC:NHS)来形成乳糖化DOPE(L-DOPE)。将脂质和肽(45:5:5:10:28:2:10摩尔比的DODAP:DOTAP:L-DOPE:DMG-PEG:短杆菌肽)在1XPBS中组合。用L-DOPE(用DOPE取代)和/或短杆菌肽完成其它对照制剂。配制的LN的粒度(图8)落在50至150nm之间。制剂在30天的时期中显示胶体稳定性。LN的ζ电位(图8)在-10与10mV之间的范围内变化。ODN加载效率的研究显示超过75％的凝聚。
将萤光素酶测定法用于测定LLN在表达萤光素酶的SK-HEP-1细胞中的靶向效率。将在37℃、5％CO2气氛下于补充有10％FBS和1％链霉素/青霉素的DMEM培养基(GIBCO)中培养的SK-HEP-1细胞生长至汇合，随后以2x104个细胞/孔的密度涂板在96孔板中。将萤火虫萤光素酶(GL2+GL3)siRNA与制剂以N:P10:1组合。使制剂与脂质制剂在室温下组合10min，随后用DMEM进行稀释。在无血清、10％和20％血清的条件下测试转染率。除去培养基，用每孔70μL的转染培养基(siRNA100nM)替代所述培养基。处理细胞4h，随后用1XPBS洗涤3次。处理后48h小时，通过萤光素酶测定试剂盒分析萤光素酶表达(图9)。包含短杆菌肽以及ASGR的制剂显示比任一种单独的LN修饰更高的转染率。
利用荧光显微镜检查(图10)和流式细胞术(图11)分析LLN的吸收。将DAPI核用于肝细胞癌(HCC)细胞，添加cy3-标记的寡核苷酸以显示细胞吸收。如通过荧光图像显示的，ASGR靶向是siRNA和ODN至细胞的胞质溶胶的有效递送所必需的。流式细胞术数据显示靶向LLN与非靶向LLN之间约3.3倍的差异，进一步支持靶向递送的有利方面。利用RT-PCR评估LN-antagomir制剂对miR-155的下调(图12)。实现了miR-155相对于RNU6B的约60％的下调。使用100nManti-miR-155。
实施例5
将脂质(60:35:5的摩尔比的DDAB、CHOL、Tween80)溶解于100％乙醇中。将100μL的该溶液稀释于900μL1XPBS中。将不同w/w比率的LN与LOR-1284(购自Dharmacon的siRNA)(0.1μg)组合以进行凝胶迁移率变动分析(图13)。阻滞在1:8(siRNA:LN)上发生。将LN与0.1μMsiRNA组合以进行下调研究。使用肌动蛋白(作为对照)以及1:20和1:30(siRNA:LN)的w/w比率通过RT-PCR评估LN-siRNALOR-1281制剂对RNRR2的下调。在转染之前24h，将在37℃、5％CO2气氛下于RPMI1640培养基中生长的KB细胞以3.0x105个细胞/孔的密度涂板涂板在6孔板中。使细胞生长至大致80％的汇合，除去含血清培养基。用1000μL转染培养基转染细胞，处理4h。在含10％血清的RPMI1640培养基存在的情况下进行转染。以一式三份进行实验。在处理完成后，用1XPBS洗涤细胞，恢复含血清RPMI1640。在处理完成后48h，利用RT-PCR，以肌动蛋白作为管家基因来分析细胞的RNRR2表达水平。结果示于图14中。对于1:30siRNA:LN制剂，发生显著的下调。
将先前步骤的LN(1:30,siRNA:LN)与不同量的用LOR-1284预混合的PrK组合，在室温进行15min。转染前24h，将在37℃、5％CO2气氛下于RPMI1640培养基中生长的KB(口腔癌)细胞以3.0x105个细胞/孔的密度涂板在6孔板中。将细胞生长至大致80％的汇合，除去含血清培养基。用1000μL转染培养基转染细胞，处理4h。在含0％、5％和10％血清的RPMI1640培养基存在的情况下进行转染。以一式3份进行实验。在完成处理后，用1XPBS洗涤细胞，恢复含血清RPMI1640。完成处理后48h，利用RT-PCR分析细胞的RNRR2表达水平，肌动蛋白用作管家基因。结果示于图15中。对于含血清培养基，0.3:1:LN-PrK:siRNALOR-1281的制剂相较于无PrK的制剂显示显著的下调。还在相同转染参数下，利用含10％血清的培养基进行细胞活力研究。LN和PrK-LN在处理的水平上都未显示显著的细胞毒性(图16)。PrK-siRNA复合物在血清中的保护作用通过在新鲜小鼠血浆中温育LN-siRNA和PrK-LN-siRNA复合物来进行研究(图17)。在制剂中包含PrK在3天的时期中相较于无保护制剂显示显著的保护活性。
其它研究调查了PrK-LN的温度效应。将PrK、LOR-1284和LN以0.3:1:30的重量比通过涡旋组合，将其维持在4℃、18℃、37℃和55℃的温度。测量形成的复合物的ζ电位(图18)。在18℃和37℃混合的复合物具有比在4℃和55℃混合的复合物高得多的ζ电位。测试在不同温度形成的复合物的体外活性。转染前24h，将在37℃、5％CO2气氛下于RPMI1640培养基中生长的KB细胞以3x105个细胞/孔的密度涂板在96孔板中。将细胞生长至大致80％的汇合，除去含血清培养基。用1000μL转染培养基转染细胞，处理4h。转染在含10％血清的RPMI1640培养基存在的情况下进行。以一式两份进行实验。在处理完成后，用1XPBS洗涤细胞，恢复含血清RPMI1640。完成处理后48h，利用肌动蛋白作为管家基因，通过RT-PCR分析细胞的RNPR2表达水平。结果示于图19中。在较高温度(37℃和55℃)复合的制剂相对于在较低温度形成的制剂显示转染率的少量增加。
实施例6
研究了用于anti-miR至MDA-MB-468细胞内的递送的SPLN-G20。如上所述制备SPLN-G20。在转染前24h，将MDA-MB-468(三阴性乳腺癌细胞)以2x104个细胞/cm2的密度于补充有1％青霉素/链霉素和10％FBS的DMEM/F12培养基中涂板在6孔板中。将SPLN-G20与anti-miR-221组合以测定其上调miR-221的下游靶p27/Kip1(肿瘤抑制因子)的能力。anti-miR-221的序列如下：5’-gsasaacccagcagacaaugusasgscsu-Chol-3’[SEQIDNO.1]。该序列包含2’-O-甲基-修饰的寡核苷酸(小写字母)和硫代磷酸酯连接(s下标)以促进反义寡核苷酸的核酸酶稳定性。此外，疏水性部分(胆固醇(Chol))至3’末端的添加用于更好地促进与脂质纳米颗粒制剂的缔合。在20％血清存在的情况下，使用具有50、100和250nManti-miR-221的SPLN-G20转染MDA-MB-468细胞。使处理进行4h，随后除去转染培养基，用新鲜培养基(补充有10％FBS)替代所述培养基。让细胞增殖额外的44h，随后开始RT-PCR。利用TRIzolReagent(LifeTechnologies)从细胞提取RNA，按照制造商的说明书，利用III第一链合成系统(LifeTechnologies)产生cDNA。随后使用SYBRgreen(LifeTechnologies)和针对p27/kip1的引物(AlphaDNA)(正向：5’CGTGCGAGTGTCTAACGG-3’[SEQIDNO.2],反向：5’-CGGATCAGTCTTTGGGTC-3’[SEQIDNO.3])进行RT-PCR。
将β-肌动蛋白(正向：5’-CGTCTTCCCCTCCATCG-3’[SEQIDNO.4],反向：5’-CTCGTTAATGTCACGCAC-3’)[SEQIDNO.5]用作对照。如图24中显示的，mRNA通过SPLN-G/anti-miR-221的处理以剂量依赖性方式被上调数倍。
实施例7
如先前所述制备包含40:5:20:30:5的摩尔比的DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE、TPGS的SPLN-G20第1版(SPLN-G20v1)。还用DODAP和SoyPC(SPC)分别替代DMHDA和DOPE来产生了SPLN-G20的第2版(SPLN-G20v2)。DODAP也是叔胺，并且在转染上比DMHDA得到更好地表征。在该实施方案中，选择用SPC替代辅助脂质是因为基于DOPE的制剂通常因与血清蛋白的相互作用而显示减小的体内活性。将终组成设置在40:5:20:30:5(DODAP:DOTAP:GRAM:SPC:TPGS)的摩尔比。所有脂质和肽购自AvantiPolarLipids(USA)或Sigma-Aldrich(USA)，并且在无需进一步纯化的情况下使用。将脂质和肽溶解于乙醇中，以适当的比例组合。添加额外的乙醇和pH4.0的柠檬酸缓冲液以达到30％的终乙醇含量。此时，将2.0mg/mL的脂质纳米颗粒溶液与anti-miR以15:1的N:P组合，浸浴超声处理5min，并使其在室温15分钟以形成静电复合物，随后进一步稀释。制剂的粒度在100与200nm之间的范围内变动。
将Anti-miR-221与SPLN-G20v1和SPLN-G20v2以15:1的N:P组合。就miR-221的下游离靶p27/kip1(牵涉细胞凋亡调控的基因)和雌激素受体α(ERα,负责雌激素受体的表达，从而负责对基于激素的疗法的致敏的基因)的上调测试BT-549(三阴性乳腺癌细胞系)。转染前24h，将细胞以2×104个细胞/cm2的密度于补充有5％FBS和1％青霉素/链霉素(LifeTechnologies)的DMEM/F12细胞培养基中涂板在6孔板中。转染时，用含20％血清的培养基替代培养基。将20％血清用于模拟体内的高血清条件。用适当的对照或基于加载了250nManti-miR-221的SPLN-G的制剂在37℃转染细胞，进行4h。处理期结束时，用1XPBS洗涤细胞2次。让细胞增殖44h，随后开始RT-PCR。利用TRIzol试剂(LifeTechnologies)从细胞提取RNA，按照制造商的说明书，利用III第一链合成系统(LifeTechnologies)产生cDNA。随后使用SYBRgreen(LifeTechnologies)以及针对p27/kip1和雌激素受体α的引物进行RT-PCR。β-肌动蛋白用作参照基因。如图25中显示的，游离的anti-miR-221显示最小的活性，然而SPLN-G20v1和SPLN-G20v2分别显示p27/Kip1的～1.75和～2.5倍上调。对于ERα表达，观察到相似的结果，如图26中显示的。SPLN-G20v1上调ERα近3倍，而SPLN-G20v2上调ERα超过5倍。这些数据显示SPLN-G20v2是体内anti-miR递送的特别有用的纳米载体。
实施例8
合成包含乳糖醛酸(LA)、具有半乳糖部分和连接于磷脂的亲脂性无唾液酸糖蛋白受体(ASGR)靶向配体，将其掺入LN以用于anti-miR-155的肝特异性递送。还将短杆菌肽A掺入LN以促进anti-miR的内涵体释放。该制剂在本文中称为基于乳糖化短杆菌肽的LN(Lac-GLN)。在HepG2细胞和在小鼠中评价肝细胞靶向。研究了物理化学性质、细胞吸收、体外和体内递送效率。
1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷(DODAP)和L-α-二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)购自AvantiPolarLipids(Alabaster,AL)；1,2-二肉豆蔻-sn-甘油和甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)购自NOFAmericaCorporation(Elysian,MN)；1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自ThermoScientific(Rockford,IL)。单甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG-DSPE)获自GenzymePharmaceuticals(Cambridge,MA)。胆固醇、乳糖醛酸、短杆菌肽A和所有其它试剂购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)而无需进一步纯化。萤火虫萤光素酶(GL2+GL3)siRNA(Luci-siRNA)(AM4629)、阴性无序对照(AM17010)和Lipofectamine2000购自Invitrogen(GrandIsland,NY)。
Anti-miR-155(序列：5’-A*C*CCCUAUCACGAUUAGCAUU*A*A-3’(SEQIDNO.6),包含硫代磷酸酯连接(*)和2’-O-甲基)、Cy3标记的anti-miR-155(Cy3-anti-miR-155)和Cy5.5标记的anti-miR-155(Cy5.5-anti-miR-155)由AlphaDNA(Montreal,Canada)合成。用于miR-155(002623)和RNU6B(001093)的实时RT-PCR测定的Taqman试剂盒购自AppliedBiosystems(Carlsbad,CA)。
乳糖醛酸由EDC活化，并转化成其NHS酯，随后将其与DOPE反应以产生n-乳糖基(lactobionyl)-DOPE(Lac-DOPE)。在Nexus470FTIR分光光度计(ThermoScientific,Rockford,IL)上通过傅里叶变换红外(FTIR)光谱表征产物。通过乙醇注射法制备Lac-GLN。将包含50:10:28:2:10摩尔比的DODAP,Lac-DOPE,DOPE,DMG-PEG和短杆菌肽A的脂质混合物溶解于乙醇中，随后快速注射入无RNA酶和DNA酶的HEPES缓冲液(20mM,pH7.4)。利用浸浴超声仪将所得的脂质纳米颗粒超声处理2min，随后使用截留分子量(MWCO)10,000的DaltonFloat-A-Lyzer(SpectrumLaboratoriesInc.,RancoDominguz,CA)在室温针对无RNA酶和DNA酶的水透析4hr以除乙醇。
通过将等体积的溶解于无RNA酶和DNA酶的HEPES缓冲液中的anti-miR-155添加至Lac-GLN，随后短暂涡旋10sec，和在室温温育10min来制备包含anti-miR-155的Lac-GLN。将脂质:anti-miR的重量比固定在10:1，anti-miR-155的浓度为1mg/kg。使用0.22μm过滤器(FisherScientific,Pittsburgh,PA)对所得的纳米颗粒进行灭菌。通过相同方法制备对照制剂。
以体积加权分配模式在Model370NICOMPSubmicronParticleSizer(NICOMP,SantaBarbara,CA)上利用动态光散射测定包含anti-miR-155的Lac-GLN的粒度。将颗粒分散在细胞培养基中。利用FEITecnaiG2BioTWIN透射电子显微镜(FEICompany,OR,USA)检查Lac-GLN的形态学。如上所述制备样品，在多孔碳网上利用醋酸双氧铀对一滴样品进行负染色1min以进行分析。使用Gatan791MultiScanCCS照相机记录图像，利用DigitalMicrograph3.1软件包处理图像。
使用ZetaPALSζ电位分析仪(BrookhavenInstrumentsCorp.,Holtsville,NY)在20mMHEPES缓冲液中检查包含anti-miR-155的Lac-GLN的表面电荷。按照制造商的说明书，利用Quant-iTTMRiboGreenRNA试剂盒(Invitrogen,GrandIsland,NY)测定Lac-GLN的封装率，使用发光光谱仪(KS54B,PerkinElmer,UK)以480nm的激发和520nm的发射测定荧光强度(FI)。计算封装率。
通过在4℃或25℃的贮存过程中，在30天的时期中监控粒度的变化来测定包含anti-miR-155的Lac-GLN的胶体稳定性。血清稳定性测试用于研究Lac-GLN保护anti-miR免受血清核酸酶降解的能力。将Anti-miR-155-lac-GLN和游离的anti-miR-155暴露于50％胎牛血清(FBS)并在37℃温育不同的时间段。随后将每一种样品的等分加载至包含溴化乙锭的1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中。
将人HCC细胞系SK-Hep-1和HepG2细胞培养在37℃和5％CO2下培养于补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中。
对于Luci-siRNA转染，将2x104个细胞/孔的稳定表达萤光素酶的SK-Hep-1细胞于800μl培养基中接种在48孔板中，使其在5％CO2气氛下于37℃生长过夜。第二天，用含有0％、10％和20％FBS的培养基替代培养基，用包含100nMLuci-siRNA的Lac-GLN和各种对照制剂转染细胞，进行4hr。转染后，用包含10％FBS的新鲜培养基替代培养基，转染后48hr，用PBS洗涤细胞，按照制造商的说明书，使用萤光素酶测定试剂盒(Promega,Madison,WI)测定细胞裂解物中的萤光素酶活性。简而言之，使用BCAAssay试剂盒(Pierce,Rockford,IL)测定每一个孔的蛋白质的总量，通过针对蛋白质的总量进行标准化来测定萤光素酶活性。随后将萤光素酶下调计算为相较于未处理的阴性对照的相对值。
对于anti-miR-155转染，利用2ml培养基将HepG2细胞以2x105个细胞/孔涂板在6孔板中，在5％CO2气氛下于37℃温育过夜。随后用新鲜培养基替代培养基，使用Lipofectamine2000、Lac-GLN和对照制剂，利用100nManti-miR-155转染细胞，在4hr温育后，用新鲜培养基替代培养基。将细胞在37℃温育另外48hr，随后通过实时RT-PCR分析测定miR-155及其靶基因的表达水平。作为阳性对照，按照制造商的方案，使用Lipofectamine2000，利用Luc-siRNA和anti-miR-155转染细胞。未处理的细胞和空Lac-GLN用作阴性对照。
通过MTS测定(Promega,Madison,WI)评价Lac-GLN的细胞毒性。将HepG2细胞以1x104个细胞/孔的密度接种于96孔板中。在过夜温育后，用空Lac-GLN、单独的阴性对照RNA、单独的anti-miR-155、包含阴性对照RNA的Lac-GLN和包含anti-miR-155的Lac-GLN以100nM的RNA浓度处理细胞24hr。随后将MTS试剂(20μL)添加至每一个孔，将细胞温育另外2hr。使用MultiskanAscent自动板读数器测量每一个孔在490nm的光密度(OD)。将未处理的细胞用作对照，并定义为100％活力。细胞活力计算为未处理细胞的百分数。
通过将荧光Cy3-anti-miR-155转染入HepG2细胞来进行Lac-GLN的细胞吸收的分析，利用共聚焦显微镜和流式细胞术进行评价。对于共聚焦显微镜，将2x105个细胞/孔的HepG2细胞接种在6孔板(该6孔板在每一个孔的底部包含无菌盖玻片(FisherScientific,12-545-82,Pittsburgh,PA))中，让其生长过夜。随后用包含100nMCy3-anti-miR-155的GLN、Lac-GLN和具有20mM乳糖和1％BSA的Lac-GLN在37℃处理细胞1hr，随后进行利用PBS的洗涤步骤5次。用4％多聚甲醛固定细胞15min，用Hoechst33342(Invitrogen,GrandIsland,NY)和Alexa-488鬼笔环肽(Invitrogen,GrandIsland,NY)在室温各自染色10min。随后将具有细胞的盖玻片与板脱离，用常规载玻片盖上。在OlympusFV1000Filter共聚焦显微镜(OlympusOpticalCo.,Tokyo,Japan)上进行共聚焦分析。
为了进行流式细胞术分析，用包含100nMCy3-anti-miR-155的GLN、Lac-GLN、具有20mM乳糖和1％BSA的GLN和具有20mM乳糖和1％BSA的Lac-GLN在37℃处理2x105的HepG2细胞1hr。使用0.25％胰蛋白酶悬浮细胞，用PBS洗涤5次，用4％多聚甲醛进行固定。在BectonDickinsonFACScalibur流式细胞仪(FranklinLakes,NewJersey)上测量荧光强度，对于每一个样品收集总共10,000个事件。
利用TriZol试剂(Invitrogen,GrandIsland,NY)从转染的细胞或组织提取物分离总RNA，按照标准方案进行纯化。使用TaqManMicroRNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)合成miR-155cDNA，使用TaqManMicroRNA试剂盒(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)扩增和定量cDNA。使用第一链cDNA合成试剂盒(Invitrogen,GrandIsland,NY)合成C/EBPβ和FOXP3的cDNA，使用SYBRGreen法(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)扩增和定量所得的cDNA。
利用PrimerExpress程序(AppliedBiosystems)设计引物：
C/EBPβ：
正向：5'-AGAAGACCGTGGACAAGCACAG-3'[SEQIDNO.7],
反向：5'-TTGAACAAGTTCCGCAGGGTGC-3'[SEQIDNO.8]；
FOXP3
正向：5'-AATGGCACTGACCAAGGCTTC-3'[SEQIDNO.9],
反向：5'-TGTGGAGGAACTCTGGGAATGTG-3'[SEQIDNO.10]；和
GAPDH:
正向：5'-CCCCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTT-3[SEQIDNO.11],
反向：5'-GGCCATGAGGTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'[SEQIDNO.12])。
将miR-155水平针对RUN6B的水平进行标准化，而将C/EBPβ和FOXP3的水平针对GAPDH的水平进行标准化。使用2-ΔCT法计算它们的表达。
将包含荧光Cy3-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN用于共聚焦显微镜分析。以200μl的总注射体积给雄性C57BL/6小鼠静脉内施用包含Cy3-anti-miR-155(50μg)的GLN和Lac-GLN。4hr后，处死小鼠，收集组织。将收集的组织于4％多聚甲醛中固定6hr，在4℃于30％蔗糖中浸渍过夜。随后将组织转移至块规夹持器，用O.C.T.冷冻培养基(FisherScientific,Pittsburgh,PA)包埋，于液氮中进行冷冻。将组织样品进行处理以进行组织切片，用Hoechst33342(Invitrogen,GrandIsland,NY)和Alexa-488鬼笔环肽(Invitrogen,GrandIsland,NY)在室温各自染色10min。使用OlympusFV1000Filter共聚焦显微镜(OlympusOpticalCo.,Tokyo,Japan)捕捉荧光图像。
将包含荧光Cy5-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN用于通过IVIS成像测量不同组织的体内吸收。将与上述相同的处理用于本实验。收集整个组织，将其在4％多聚甲醛中固定6hr，在4℃于30％蔗糖中浸渍12hr。使用XenogenIVIS-200Optical体内成像系统(CaliperLifeSciences,Hopkinton,MA)测量整个组织的Cy5荧光信号。
以1.5mg/kg的剂量通过静脉内注射给雄性C57BL/6小鼠施用包含阴性对照RNA或anti-miR-155的Lac-GLN和其它对照。施用后48hr，麻醉小鼠，收集肝组织，立即将其在液氮中冷冻。如先前部分中所描述的，进行RNA提取和RT-PCR。
将结果报告为平均值±标准差，对于每一个实验进行最少一式三份重复。通过学生氏t检验(对于两个组)或ANOVA(对于多个组)分析组间比较。当p值<0.05时，结果被认为是统计上显著的。利用MicrosoftExcel2003软件进行所有统计分析。
将FTIR用于确认缀合物的形成。图27为Lac-DOPE、DOPE和乳糖醛酸的FTIR光谱。lac-DOPE的吸收峰在1660cm-1和1540cm-1是蓝色的，表明酰胺键形成。
评价了具有不同摩尔百分率的Lac-DOPE的GLN的粒度和ζ电位，该特征示于图39A-B和41A-B中。制剂中10％的Lac-DOPE是最适组合物，具有72.66nm的平均直径和3.49mV的ζ电位。该组合物被选择作为用于下列实验的递送载体，称为Lac-GLN。通过TEM进一步检查Lac-GLN的尺寸和形态学。图30B中的图像显示直径小于100mm的Lac-GLN的球状形状和均一的大小分布，这与通过DLS获得的数据一致。
根据颗粒凝聚寡核苷酸的能力计算封装率。如图30中显示的，Lac-GLN的封装率>85％。通过随时间过去监控粒度的变化来测定胶体稳定性。如图29C中显示的，Lac-GLN的平均直径在4℃于30天的时期中保持不变，但在25℃贮存下观察到平均直径的显著增加。
通过血清稳定性测试评价Lac-GLN保护anti-miR的能力。在该测试中，将游离anti-miR和anti-miR-155-Lac-GLN与FBS混合，在37℃培养不同的时期。如图31B中显示的，Lac-GLN能够保护anti-miR-155免受核酸酶降解达12hr，然而游离anti-miR-155在4hr的血清温育内被完全消化。该结果证明了Lac-GLN的良好血清稳定性。
首先通过比较GLN与Lac-GLN在HCC细胞特异性吸收中的表现来检查递送效率。用包含Cy3-anti-miR-155的非靶向GLN和ASGR靶向Lac-GLN处理在表面上具有高ASGR表达的HepG2细胞。将利用20mM乳糖和1％BSA的预温育用于分别阻断ASGR介导的吸收和非特异性吸收。通过共聚焦显微镜评价细胞。如图29中显示的，利用Lac-GLN处理的细胞显示比利用非靶向GLN处理的细胞显著更强的荧光信号。该吸收增强在利用阻断剂预处理的细胞中减弱，这证明Lac-GLN的细胞吸收为ASGR特异性的。该结果表明Lac-GLN的成功的ASGR靶向。
通过流式细胞术进一步定量GLN和Lac-GLN的细胞吸收。如图30A中显示的，在HepG2细胞中，Lac-GLN的吸收约为非靶向GLN的吸收的3.58倍。荧光信号在利用20mM乳糖和1％BSA的GLN预处理的细胞中未显著减弱，表明HCC细胞对GLN的非特异性吸收(图30C)。然而，Lac-GLN的吸收在利用阻断剂预温育的细胞中减少3.51倍，而在阻断剂不存在的情况下，GLN与Lac-GLN处理的细胞之间的吸收是可比较的(图30B)。该结果进一步确认了ASGR-靶向递送提高了HCC细胞的细胞吸收。
通过分析靶向萤光素酶基因的siRNA的沉默能力，将稳定地表达萤火虫萤光素酶mRNA的HCCSK-Hep1细胞用于测定不同媒介物的转染率和几个因素(包括靶向配体、短杆菌肽A和血清)对转染率的影响。图32A显示了在不含FBS的培养基中，相较于LN处理组(96.35％)中的萤光素酶表达，Lac-LN处理组(78.95％)中的萤光素酶表达显著更少，这确认了ASGR靶向策略的有利方面。然而，包含20％FBS的培养基影响该转化率仅6％。利用商购Lipofectamine2000的处理引起7.84％的萤光素酶表达的减少，接近LN处理组，并且该转染被高浓度血清强烈抑制。此外，分析了作为竞争剂的短杆菌肽A的增加的浓度的效应。令人惊讶地，在Lac-GLN处理组中，5％和10％的短杆菌肽A在转染过程中不受FBS的存在的影响。该发现与先前报导的研究相反，在所述研究中转染活性对血清的存在敏感。在HepG2细胞中获得类似的结果(数据未显示)。因此，该Lac-GLN制剂是有利的，因为血清是临床情况中体内递送的主要障碍。
为了评估该媒介物在其它体外和体内递送中的应用，首先研究其对HCC细胞的细胞毒性。利用等量的空Lac-GLN、单独的阴性对照RNA、单独的anti-miR-155、阴性对照RNA-Lac-GLN和anti-miR-155-Lac-GLN处理HepG2细胞。如图33B中显示的，在处理细胞与未处理细胞之间未观察到细胞活力的显著变化。该结果显示了Lac-GLN在HepG2细胞中的低细胞毒性。
随后，在HepG2细胞中评价包含anti-miR-155的Lac-GLN对miR-155及其下游靶的表达的作用。用包含anti-miR-155的Lac-GLN和其它对照制剂处理细胞4hr，利用实时RT-PCR，在转染后48hr测量miR-155及其靶向基因的表达。图33C显示了不同处理组相对于未处理组的miR-155表达水平。利用Lipofectamine2000处理的阳性对照具有92.4％的未处理组的miR-155表达。此外，LN、GLN、Lac-LN和Lac-GLN处理组显示与Lipofectamine2000处理组的水平相似的miR-155表达水平，并且这些组间的差异很小。基于阳性对照与Lac-GLN处理组之间的miR-155表达的小的差异，将2倍的anti-miR-155浓度用于检查miR-155的下调是否是anti-miR-155浓度依赖性的。如图34A中显示的，当anti-miR-155的浓度从100nm加倍至200nM时，Lipofectamine2000处理组的miR-155表达从92.4％变化至89.5％。两个处理之间的该差异在统计上仍然是不显著的。在Lac-GLN处理组中，观察到相似的倾向，其中miR-155的表达在100nM和200nManti-miR-155处理中分别为87.2％和82.9％。这些数据表明miR-155表达不依赖于anti-miR-155浓度，并且anti-miR-155递送不导致miR-155降解。
为了进一步检查递送效率，评价了miR-155靶向基因C/EBPβ和FOXP3的表达。结果概述于图34B中。与miR-155的稳定表达相反(图32A)，在Lac-GLN100nManti-miR-155处理组中，C/EBPβ和FOXP3表达分别存在16.1和4.1倍的增加。在利用Lipofectamine2000转染的细胞中仅观察到C/EBPβ和FOXP3表达的分别1.4、1.9倍的增加。此外，使anti-miR-155浓度加倍导致C/EBPβ和FOXP3表达的增加的上调，从而明确地证明miR-155靶向基因表达依赖于anti-miR-155浓度。因此，anti-miR-155的递送最可能导致miR-155的功能性抑制而非其降解。总而言之，这些结果显示Lac-GLN在anti-miR递送中优于商购可得的试剂。
为了评估Lac-GLN的体内递送效率和组织特异性，在以1.5mg/kg的剂量给其静脉内施用包含Cy5-anti-miR-155的GLN和Lac-GLN的C57BL/6小鼠中进行组织分布研究。4hr后，收集器官，比较荧光信号。如图35中显示的，当用非靶向GLN注射小鼠时，肺、脾和肝是显示荧光信号的主要器官。相反地，当用Lac-GLN处理小鼠时，最大荧光信号积累在肝中，脾和肾中具有极微弱的信号，在肺中未检测到信号。这些结果显示通过Lac-GLN进行的Cy5-anti-miR-155的递送是肝特异性的，并且Lac-GLN能够使脱靶吸收降至最低，从而提高了总的递送效率。
对肝和其它器官进行共聚焦显微镜检查以进一步评价GLN与Lac-GLN之间的递送效率。除了肝细胞以外，肝还包含大量被称为居留巨噬细胞(residentialmacrophage)的枯否细胞。如在图36A中显示的，当用Lac-GLN处理小鼠时，肝中的肝细胞比枯否细胞吸收更大部分的荧光信号，然而在非靶向GLN-Cy5-anti-miR-155处理的肝中，吸收主要通过枯否细胞进行。
还检查了肺和脾中的荧光信号的分布以评价Lac-GLN递送。如图36B中显示的，Lac-GLN处理的小鼠的肺和脾中积累的荧光信号少于GLN处理的小鼠中的荧光信号，从而表明Lac-GLN对于至肝的递送的高度特异性。
随后，研究了Lac-GLN-anti-miR-155在C57BL/6小鼠肝中的递送效率。为此目的，通过尾静脉给小鼠注射单次剂量的于Lipofectamine2000、GLN、Lac-LN或Lac-GLN中配制的1.5mg/kg的anti-miR-155。空Lac-GLN、包含阴性对照RNA的Lac-GLN或游离的anti-miR-155的注射用作阴性对照。施用后48hr，处死小鼠，收集肝。通过实时RT-PCR评价miR-155及其靶C/EBPβ的表达。图37A举例说明miR-155的表达。如所指出的，miR-155水平在阴性对照组中未被改变。当使用Lipofecamine2000和Lac-GLN递送anti-miR-155时，相较于未转染对照，分别观察到13％和20％的miR-155表达的微小减少。此外，GLN、Lac-LN和Lac-GLN之间的差异不显著。相反地，通过C/EBPβ表达反映的递送效率在这些组间变化相当大，如通过在GLN、Lac-LN和Lac-GLN处理组中C/EBPβ表达相较于未处理组的分别的2.8、3.7和6.9倍的增加所显示的(图37B)。在阴性对照组中未观察到显著的变化，Lipofectamine2000处理组仅显示1.4倍的C/EBPβ的上调。此外，另一个miR-155靶基因FOXP3的表达在GLN、Lac-LN和Lac-GLN处理组中分别增加1.1、1.2和2.1倍(图37C)。这些数据证明Lac-GLN提高递送效率，并且与体外实验的结果一致(图34)。
实施例9
合成cRGD-PEG-DSPE缀合物。通过产生硫醚键的-SH和-马来酰亚胺反应缀合cRGDfC与PEG-DSPE-马来酰亚胺。反应过程中使用的cRGDfC与PEG-PSPE-马来酰亚胺的摩尔比为1.5:1。将cRGDfC和PEG-DSPE-马来酰亚胺各自溶解在含有5mMEDTA的PBS缓冲液(pH＝7.0)中。将cRGDfC与PEG-DSPE溶液组合，在搅拌的条件下于室温反应6h。在PD-10柱上通过凝胶过滤纯化产物，以从产物除去未反应/过量的cRGDfC。对于按比例放大的反应，可用GPC、使用MWCO2000膜的透析或切向流渗滤来替代凝胶过滤。可将产物冷冻或冷冻干燥以赋予长期稳定性。利用HPLC和利用LC-MS确认产物纯度。可按说明书建立最小cRGDfC缀合水平(例如，80％)和游离肽含量(例如，<1％)。可利用BCA蛋白测定法来测定产物的cRGDfC含量。
在上述实施例中定义了本文中公开的制剂和方法的某些实施方案。应当理解，这些实施例，虽然显示了本发明的特定实施方案，但仅以举例说明的方式给出。根据上述论述和这些实施例，本领域技术人员可确定本公开内容的基本特征，并且在不背离其精神和范围的情况下，可进行各种变化和修饰以使本文中描述的组合物和方法适合于各种用途和条件。可进行各种变化，以及可用等同物替代其组分而不背离本公开内容的基本范围。此外，可进行许多修饰以使特定情形或材料适合于本公开内容的教导而不背离其基本范围。

Claims (89)

1.一种脂质纳米颗粒，其包含基于叔胺的阳离子脂质和基于季胺的阳离子脂质的组合。
2.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中叔胺-阳离子脂质选自DODAP、DODMA、DC-CHOL、N,N-二甲基十六烷基胺或其组合。
3.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中季胺-阳离子脂质选自DOTAP、DOTMA、DDAB或其组合。
4.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中叔胺-阳离子脂质的浓度低于总脂质含量的60.0摩尔百分率。
5.权利要求的1脂质纳米颗粒，其中季胺-阳离子脂质的浓度低于总脂质含量的20.0摩尔百分率。
6.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。
7.权利要求6的脂质纳米颗粒，其中被封装的分子包含选自质粒DNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的核酸。
8.权利要求1的脂质纳米颗粒，其还包含阳离子聚合物。
9.权利要求8的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子聚合物选自：精胺、哌嗪、三精胺、四精胺、寡精胺、thermine、精脒、二精脒、三精脒、寡精脒、腐胺、聚赖氨酸、聚精氨酸、分枝或直链类型的聚乙烯亚胺和聚烯丙胺。
10.权利要求1的脂质纳米颗粒，其还包含融合肽。
11.权利要求6的脂质纳米颗粒，其中所述治疗剂或核苷酸的封装率为20％或更高。
12.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有低于300nm的直径。
13.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒以选自45:0、5:40、15:30、22.5:22.5、30:15或40:5的摩尔比包含脂质DODMA和DOTMA。
14.权利要求1的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒以选自90:10、70:30、50:50、30:70或10:90的摩尔比包含脂质DMHDA和DOTAP。
15.一种具有小于300nm的直径并且包含肽的脂质纳米颗粒。
16.权利要求15的脂质纳米颗粒，其中所述肽选自短杆菌肽A、B、C、D或S；JTS-1；蛋白酶K(PrK)；trichorovin-Xlla；狂犬病病毒糖蛋白；白细胞介素-1β；HIV-Tat；单纯疱疹病毒VP22蛋白；及其组合。
17.权利要求15的脂质纳米颗粒，其中所述肽包括抗生素。
18.权利要求17的脂质纳米颗粒，其中所述抗生素选自短杆菌肽A、B、C、D或S。
19.权利要求15的脂质纳米颗粒，其中所述肽基本上由脂质化JTS-1融合肽组成。
20.权利要求19的脂质纳米颗粒，其中所述脂质化JTS-1融合肽以总制剂的约0至约30的摩尔百分率存在。
21.权利要求15的脂质纳米颗粒，其还包含蛋白酶K。
22.权利要求15的脂质纳米颗粒，其中蛋白酶K以总制剂的约0至约30的摩尔百分率存在。
23.权利要求15的脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。
24.权利要求23的脂质纳米颗粒，其中被封装的分子包含选自质粒DNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的核酸。
25.一种包含DNA酶或RNA酶降解试剂的脂质纳米颗粒。
26.权利要求25的脂质纳米颗粒，其中所述DNA酶或RNA酶降解试剂基本上由蛋白酶K组成。
27.权利要求25的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒封装选自核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药、营养补充剂、生物标志物或其组合的分子。
28.权利要求27的脂质纳米颗粒，其中被封装的分子包含选自pDNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA或其组合的寡核酸。
29.权利要求25的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有低于300nm的直径。
30.一种脂质纳米颗粒，其具有小于300nm的直径并且包含如下物质的两种或更多种的组合：
叔胺和季胺-阳离子头基的混合物；
抗生素；或
DNA酶或RNA酶降解试剂。
31.权利要求30的脂质纳米颗粒，其中所述RNA酶或RNA酶降解试剂基本上由蛋白酶K组成。
32.权利要求30的脂质纳米颗粒，其中所述抗生素包含短杆菌肽A、B、C、D或S。
33.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其还包含聚乙二醇-脂质缀合物。
34.权利要求33的脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇-脂质缀合物选自聚山梨酯80、TPGS、mPEG-DSPE、PEG-DMG。
35.权利要求33的脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇-脂质以小于约10.0摩尔百分率的浓度存在。
36.权利要求33的脂质纳米颗粒，其还包含N,N-二甲基十六烷基胺。
37.权利要求36的脂质纳米颗粒，其中所述N,N-二甲基十六烷基胺以小于制剂的约60.0摩尔百分率的浓度存在。
38.权利要求36的脂质纳米颗粒，其还包含能够结合靶细胞或靶分子的配体。
39.权利要求38的脂质纳米颗粒，其中所述配体为抗体或抗体片段。
40.权利要求39的脂质纳米颗粒，其中所述配体选自cRGD、含半乳糖的部分、转铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白或表皮生长因子。
41.一种包含权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
42.权利要求41的药物组合物，其中通过口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤途径施用所述药物组合物。
43.权利要求41的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为口服施用的片剂。
44.权利要求41的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为无菌溶液。
45.权利要求41的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为无菌悬浮液。
46.权利要求41的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为冻干粉剂。
47.权利要求41的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为栓剂。
48.一种诊断或治疗癌症或传染病的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用有效量的权利要求41的药物组合物。
49.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒封装至少一种选自核酸、化疗剂及其组合的分子。
50.权利要求49的脂质纳米颗粒，其中被封装的分子包含选自质粒DNA、反义寡核苷酸、miR、anti-miR、shRNA、siRNA及其组合的核酸。
51.权利要求49的脂质纳米颗粒，其中被封装的分子包含选自如下物质的治疗剂：抗肿瘤药、抗感染剂、局部麻醉剂、抗过敏剂、抗贫血药、血管生成抑制剂、β-肾上腺素能阻断剂、钙通道拮抗剂、抗高血压药、抗抑郁剂、抗惊厥药、抗细菌药、抗真菌药、抗病毒药、抗风湿药、驱虫药、抗寄生虫药、皮质类固醇、激素、激素拮抗药、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗糖尿病药、抗癫痫药、抗出血药、抗高渗药、抗青光眼药、免疫调节细胞因子、镇静药、趋化因子、维生素、毒素、麻醉品、成像剂及其组合。
52.权利要求49的脂质纳米颗粒，其中被封装的分子包括核酸治疗剂。
53.权利要求52的脂质纳米颗粒，其中所述核酸治疗剂选自pDNA、siRNA、miRNA、anti-miRNA、ASO及其组合。
54.权利要求52的脂质纳米颗粒，其中所述核酸治疗剂通过对取代NA碱基单位进行修饰和/或通过修饰核糖2’位置或替代磷酸二酯接头来进行稳定。
55.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有低于约300nm的直径。
56.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有低于约200nm的直径。
57.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其中所述聚合物通过直接连接或通过接头结合于脂质的外表面。
58.权利要求16的脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒具有至少约40％的分子的封装率。
59.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其还包含缀合有聚乙二醇的脂质。
60.权利要求59的脂质纳米颗粒，其中所述缀合有聚乙二醇的脂质包含聚山梨酯80、TPGS和mPEG-DSPE的一种或多种。
61.权利要求27的脂质纳米颗粒，其中所述缀合有聚乙二醇的脂质以小于约15.0摩尔百分率的浓度存在。
62.权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒，其还包含能够结合于靶细胞或靶分子的配体。
63.权利要求62的脂质纳米颗粒，其中所述配体为抗体或抗体片段。
64.权利要求62的脂质纳米颗粒，其中所述配体选自cRGD、含半乳糖的部分、转铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白或表皮生长因子。
65.一种包含权利要求1、15或25的脂质纳米颗粒和药学可接受的赋形剂的药物组合物。
66.权利要求65的药物组合物，其中通过口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤途径施用所述药物组合物。
67.权利要求65的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为口服施用片剂、吸入剂或栓剂。
68.权利要求65的药物组合物，其中将所述药物组合物制备为无菌溶液、无菌悬浮液或冻干粉剂。
69.一种包含anti-miR-221和SPLN-G20的脂质纳米颗粒，其中SPLN-G20以40:5:20:30:5的摩尔比包含DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE和TPGS。
70.权利要求69的脂质纳米颗粒，其中所述anti-miR-221具有序列：5’-gsasaacccagcagacaaugusasgscsu-Chol-3’，SEQIDNO.1。
71.权利要求70的脂质纳米颗粒，其中所述序列包含2’-O-甲基-修饰的寡核苷酸(小写字母)和硫代磷酸酯连接(s下标)以增强寡核苷酸的核酸酶稳定性。
72.一种包含与脂质纳米颗粒组合的anti-miR-221的组合物。
73.权利要求72的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含SPLN-G20v1和SPLN-G20v2，其中所述SPLN-G20第1版(SPLN-G20v1)以40:5:20:30:5的摩尔比包含DMHDA、DOTAP、GRAM、DOPE和TPGS，并且其中所述SPLN-G20(SPLN-G20v2)以40:5:20:30:5的摩尔比包含DODAP、DOTAP、GRAM、SoyPC(SPC)和TPGS。
74.权利要求73的组合物，其中所述脂质纳米颗粒以15:1的N:P包含SPLN-G20v1和SPLN-G20v2。
75.一种治疗患有或怀疑患有乳腺癌的受试者的方法，包括施用有效量的权利要求69、70、71、72、73或74的脂质纳米颗粒。
76.一种在患有乳腺癌的受试者中提供抗致癌作用的方法，其中miR-221表达水平在病例受试者的癌细胞中相对于对照受试者更高，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求69、70、71、72、73或74的组合物。
77.权利要求76的方法，其中所述脂质纳米颗粒下调miR-221表达。
78.权利要求76的方法，其中所述乳腺癌包括三阴性乳腺癌。
79.权利要求78的方法，其中所述受试者为人。
80.一种包含与脂质纳米颗粒组合的anti-miR-155的组合物。
81.权利要求80的组合物，其中所述脂质纳米颗粒包括Lac-GLN，其中所述Lac-GLN包括包含乳糖醛酸(LA)、具有半乳糖部分并连接于磷脂的亲脂性无唾液酸糖蛋白受体(ASGR)靶向配体。
82.权利要求80或81的组合物，其还包含掺入脂质纳米颗粒的短杆菌肽A。
83.权利要求82的组合物，其以50:10:28:2:10的摩尔比包含DODAP、Lac-DOPE、DOPE、DMG-PEG和短杆菌肽A。
84.权利要求80的组合物，其中所述anti-miR-155具有序列：5’-A*C*CCCUAUCACGAUUAGCAUU*A*A-3’，SEQIDNO.6。
85.权利要求84的组合物，其中所述序列包含硫代磷酸酯连接(*)和2’-O-甲基。
86.一种治疗患有或怀疑患有肝癌的受试者的方法，包括施用有效量的权利要求80、81、82、83、84或85的脂质纳米颗粒。
87.一种在患有肝癌的受试者中提供抗致癌作用的方法，其中miR-155表达水平在病例受试者的癌细胞中相对于对照受试者更高，所述方法包括给所述受试者施用有效量的权利要求80、81、82、83、84或85的脂质纳米颗粒。
88.权利要求87的方法，其中所述脂质纳米颗粒下调C/EBPβ和FOXP3基因。
89.权利要求86、87或88的方法，其中所述受试者为人。
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