CN105169459B - 一种多聚糖止血粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种多聚糖止血粉及其制备方法，其包括如下步骤：将高粘度高脱乙酰度壳聚糖与高古罗醛酸（G）海藻酸钠混合，之后加入氯化锌和氯化钙混合凝固浴进行搅拌交联，从而获得一种多聚糖止血粉。本发明还提供这种止血粉的组分及其含量。本发明使用高黏度高脱乙酰度壳聚糖、高G含量海藻酸盐作为止血粉的主要成分，获得的高黏度高脱乙酰度壳聚糖/海藻酸锌钙盐复合微球止血效果好。

Description

一种多聚糖止血粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种多聚糖止血粉及其制备方法。

背景技术

出血是创伤患者死亡原因之一，快速、有效地控制出血可明显减少其死亡率。单纯的外科手术不能完全控制出血，止血材料的使用可以大大减少出血量。目前，临床上应用较多的局部止血材料主要有粉末类(如沸石、胶原粉末和马铃薯淀粉)、多孔海绵类(明胶海绵、胶原海绵)、氧化再生纤维素和纤维蛋白胶(如速即纱)、止血纱布类等。

这些止血材料各自有一定的不足之处：明胶胶原材料来自牛皮，由于种属差异而易致变态反应，增加伤口的感染率，尤其是对污染的伤口，故应用受到限制；血纤维蛋白胶源自血液，可能会导致病毒感染；氧化再生纤维素结构松散，对出血点的粘附差，有引起再出血的可能，且止血时间较长，对出血迅猛者效果较差，不适合单独作为伤口止血材料故应用受到限制；多孔沸石和马铃薯淀粉在吸收血液中的水分后会放出大量的热，导致伤口局部坏死、炎症反应等。这些止血材料有些止血效果不确切，有些价格昂贵，有些使用不方便，都存在着一定的缺陷性。

壳聚糖具有无毒性、无刺激性、良好组织相容性、抗菌、消炎、止血、减少创面渗出和促进创伤组织再生、修复、愈合的作用，易于形成凝胶以及可自然降解的特性，可作为良好的止血材料。研究表明，在其他条件相同的情况下，①脱乙酰度相对较低的壳聚糖凝血效果越好，②粘度高的壳聚糖凝血效果好。所以现有技术中的壳聚糖止血材料，大多采用中粘度中低脱乙酰度壳聚糖或者高粘度中低脱乙酰度壳聚糖作为原料，鲜有采用高脱乙酰度壳聚糖作为壳聚糖止血材料的原料。

海藻酸盐作为生物相容性好的天然高分子材料，由其纤维制成的新型敷料，能在伤口表面原位形成凝胶，创造有利于伤口愈合的湿性密闭环境，从而促进伤口愈合。Davies等研究对比了海藻酸纱布和一般的手术纱布的止血效果，结果显示了海藻酸纱布优越的止血性能。Segal等对几种不同结构的海藻酸纱布的止血性能做了详细的研究，研究结果显示高古罗糖醛酸（G）含量的海藻酸纱布的凝血效应比其他结构的海藻酸纱布更好。

锌是生命必需的微量元素之一，它参与人体中多种酶的构成，具有极其广泛的生理作用。在医疗领域，严重烧伤会引起人体内锌的缺乏，并因此影响伤口的正常愈合，在医用辅料中加入锌离子后，通过创面补锌，可以起到促进伤口愈合的作用。Segal等的研究结果显示：含锌离子的海藻酸医用敷料与普通海藻酸医用敷料相比有更好的凝血作用及激活血小板的性能，使用在创面上时能提供有效的止血性能。

发明内容

由于壳聚糖脱乙酰度及粘度与其止血能力的特性，现有技术鲜有高粘度高脱乙酰度壳聚糖作为原料的止血材料，为解决上述问题，本发明提供一种多聚糖止血粉，由高粘度高脱乙酰度壳聚糖、高古罗糖醛酸海藻酸钠、混合交联剂以及液体石蜡和聚山梨酯-80制备而成。

本发明选用的高粘度高乙酰度壳聚糖，N-脱乙酰度为90～98%，粘度为1.0～2.0Pa·s。

本发明选用的高古罗糖醛酸海藻酸钠，其中的古罗糖醛酸（G）与甘露糖醛酸（M）比即G/M比为7～27:3。

本发明的选用的混合交联剂，包含氯化锌和氯化钙。

本发明提供的多聚糖止血粉各成分比例如下：

高粘度高脱乙酰度壳聚糖 1～3g；高古罗糖醛酸海藻酸钠 1～3g；混合交联剂80ml；液体石蜡 100～300ml；聚山梨酯-80 10～30ml。

本发明提供的多聚糖止血粉的制备方法包括以下步骤：

S1.原料溶液的制备：将高粘度高脱乙酰度壳聚糖溶于2%的稀醋酸中、将高古罗糖醛酸海藻酸钠溶于蒸馏水中，再将上述两种溶液混合制得混合溶液A，其中壳聚糖和海藻酸钠的质量比为1:1~3；

S2.油相溶液的制备：将液体石蜡和聚山梨酯-80按10~15:1的体积比混合获得油相溶液B；

S3.交联剂的制备：按0.75~1.5:1的质量比取用氯化锌和氯化钙，将其溶于适量的蒸馏水中，制得溶质质量浓度为2%的交联剂C；

S4.将步骤S1制得的混合溶液A加入步骤S2制得的油相溶液B中，搅拌5～10min或至均匀后，加入步骤S3制得的交联剂C充分搅拌30～45min，交联形成水凝胶微球D，静置沉淀，过滤；

S5.将步骤S4制得的水凝胶微球D用石油醚洗涤，稀碱浸泡、去除液体石蜡和聚山梨酯-80，再用乙醇进行梯度脱水，最后蒸馏水洗净，冷冻干燥后得到多聚糖止血粉。

本发明的有益效果如下：

①由于壳聚糖的凝血效果与其脱乙酰度和粘度有关，脱乙酰度相对较低的壳聚糖凝血效果越好这一技术常识，使得现有技术中壳聚糖止血材料享有使用高粘度高脱乙酰度壳聚糖作为原材料的情况，本发明提供的多聚糖止血粉，创造性地将高粘度高脱乙酰度壳聚糖作为主要成分之一，制备得到的多聚糖止血粉的止血效果比常规壳聚糖止血粉好。

②采用高古罗糖醛酸海藻酸钠作为主要成分之一，由于G/M比不同的海藻酸钠，其在止血效果上有所差别，本发明采用G/M比为7~27:3的高古罗糖醛酸海藻酸钠，达到更好止血的效果，此外由于高G含量的海藻酸钠在凝胶速率上相对较快，也起到加快止血产品在使用时的凝胶速率，加快止血效率。

③作为人体必需元素之一，锌除止血效果外，还能维持上皮细胞的正常生理功能，对成纤维细胞的增生、上皮形成、胶原合成均起到很重要的作用，本发明的技术方案中引入的锌元素，有助于伤口的愈合。

具体实施方式

下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例一

S1：将3g的G/M=7:3的高古罗糖醛酸海藻酸钠加入100ml的蒸馏水中配制成0.03g/ml的海藻酸钠溶液，将1g的 N-脱乙酰度为90%，粘度为1.0Pa·s的高粘度高脱乙酰度壳聚糖加入100ml 2%稀醋酸溶液中配制成0.01g/ml的壳聚糖溶液。将上述壳聚糖溶液加入海藻酸钠溶液中，均匀搅拌形成稳定的胶状溶液，即混合溶液A。

S2：300ml液体石蜡与30ml聚山梨酯-80混合得油相溶液B。

S3：氯化锌和氯化钙混合溶于适量蒸馏水中，制得溶质质量浓度为2%交联剂C,其中氯化锌与氯化钙的质量比为1.5:1。

S4：将步骤S1制得的混合溶液A加入步骤S2制得的油相溶液B中，搅拌5～10min或至均匀后，加入80ml步骤S3制得的交联剂C充分搅拌30～45min，交联形成水凝胶微球D，静置沉淀，过滤。

S5：将步骤S4制得的水凝胶微球D用150ml石油醚洗涤3次，之后用100ml 1%稀碱浸泡，再用30%、50%、70%及无水乙醇脱水4次，最后用蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥后得海藻酸锌钙盐/壳聚糖复合止血粉，即多聚糖止血粉。

实施例二

S1：将1g的G/M=7:3的高古罗糖醛酸海藻酸钠加入100ml的蒸馏水中配制成0.01g/ml的海藻酸钠溶液，将1g的 N-脱乙酰度为93%，粘度为1.0Pa·s的高粘度高脱乙酰度壳聚糖加入100ml 2%稀醋酸溶液中配制成0.01g/ml的壳聚糖溶液。将上述壳聚糖溶液加入海藻酸钠溶液中，均匀搅拌形成稳定的胶状溶液，即混合溶液A。

S2：200ml液体石蜡与20ml聚山梨酯-80混合得油相溶液B。

S3：氯化锌和氯化钙混合溶于适量蒸馏水中，制得溶质质量浓度为2%交联剂C,其中氯化锌与氯化钙的质量比为1:1。

S4：将步骤S1制得的混合溶液A加入步骤S2制得的油相溶液B中，搅拌5～10min或至均匀后，加入80ml步骤S3制得的交联剂C充分搅拌30～45min，交联形成水凝胶微球D，静置沉淀，过滤。

S5：将步骤S4制得的水凝胶微球D用150ml石油醚洗涤3次，之后用100ml 1%稀碱浸泡，再用30%、50%、70%及无水乙醇脱水4次，最后用蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥后得海藻酸锌钙盐/壳聚糖复合止血粉，即多聚糖止血粉。

实施例三

S1：将3g的G/M=27:3的高古罗糖醛酸海藻酸钠加入100ml的蒸馏水中配制成0.03g/ml的海藻酸钠溶液，将3g的 N-脱乙酰度为96%，粘度为2.0Pa·s的高粘度高脱乙酰度壳聚糖加入100ml 2%稀醋酸溶液中配制成0.01g/ml的壳聚糖溶液。将上述壳聚糖溶液加入海藻酸钠溶液中，均匀搅拌形成稳定的胶状溶液，即混合溶液A。

S2：300ml液体石蜡与20ml聚山梨酯-80混合得油相溶液B。

S3：氯化锌和氯化钙混合溶于适量蒸馏水中，制得溶质质量浓度为2%交联剂C,其中氯化锌与氯化钙的质量比为1:1。

S4：将步骤S1制得的混合溶液A加入步骤S2制得的油相溶液B中，搅拌5～10min或至均匀后，加入80ml步骤S3制得的交联剂C充分搅拌30～45min，交联形成水凝胶微球D，静置沉淀，过滤。

S5：将步骤S4制得的水凝胶微球D用150ml石油醚洗涤3次，之后用100ml 1%稀碱浸泡，再用30%、50%、70%及无水乙醇脱水4次，最后用蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥后得海藻酸锌钙盐/壳聚糖复合止血粉，即多聚糖止血粉。

实施例四

S1：将2.4g的G/M=17:3的高古罗糖醛酸海藻酸钠加入100ml的蒸馏水中配制成0.03g/ml的海藻酸钠溶液，将1.2g的 N-脱乙酰度为98%，粘度为2.0Pa·s的高粘度高脱乙酰度壳聚糖加入100ml 2%稀醋酸溶液中配制成0.01g/ml的壳聚糖溶液。将上述壳聚糖溶液加入海藻酸钠溶液中，均匀搅拌形成稳定的胶状溶液，即混合溶液A。

S2：300ml液体石蜡与20ml聚山梨酯-80混合得油相溶液B。

S3：氯化锌和氯化钙混合溶于适量蒸馏水中，制得溶质质量浓度为2%交联剂C,其中氯化锌与氯化钙的质量比为0.75:1。

S4：将步骤S1制得的混合溶液A加入步骤S2制得的油相溶液B中，搅拌5～10min或至均匀后，加入80ml步骤S3制得的交联剂C充分搅拌30～45min，交联形成水凝胶微球D，静置沉淀，过滤。

S5：将步骤S4制得的水凝胶微球D用150ml石油醚洗涤3次，之后用100ml 1%稀碱浸泡，再用30%、50%、70%及无水乙醇脱水4次，最后用蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥后得海藻酸锌钙盐/壳聚糖复合止血粉，即多聚糖止血粉。

为进一步说明本发明所制备的多聚糖止血粉具有更优异的止血活性，进行以下两个对比实验，具体操作如下：

1、自制多聚糖止血粉样品C与Cleox止血粉做小鼠断尾止血效果对比实验，具体操作如下：

①分别称取0.1g实施例制得的多聚糖止血粉样品和0.1g Cleox止血粉，分别置于展示瓶中，灭菌备用；

②取五只同批次的C57BL/6小鼠，称重，量尾长；

③用手术剪去小鼠尾长的三分之一后，立即将断尾伤口插入展示瓶中，同时计时。计算血流停止时的小鼠出血量。

2、将自制多聚糖止血粉与Cleox止血粉做体外凝血效果对比实验：

① SD大鼠称取重量，根据重量计算所需麻醉剂的量，腹腔注射10%水合氯醛；

② SD大鼠麻醉之后，打开胸腔，用注射器采集心脏血液，注入抗凝管中，备用；

③ 将称好的自制多聚糖止血粉和Cleox止血粉各4mg加入试管中，再向其中加入1.8ml抗凝全血溶液，最后向其中加入0.18ml的CaCl₂溶液，开始计时；

④ 观察血液变化，直至血液出现明显凝固状态，停止计时，记录下凝血时间，每个样品测三个平行样。

本发明样品与Cleox止血粉止血效果对比表

	实施例一	实施例二	实施例三	实施例四	Cleox止血粉
						止血时间（s）	87±9	88±12	86±15	89±10	101±10
出血量（mg）	10.4±0.6	10.4±1.1	10.2±1.6	10.5±1.0	11.2±2.1
						体外凝血时间（min）	9.45±0.35	9.40±0.40	9.30±0.25	9.50±0.28	10.42±0.35

由上述实验可知，本发明样品在止血效果上优于传统的壳聚糖止血粉。

上述实施例仅为本发明的较佳实施例，并非以此限制本发明的保护范围，故：凡对本发明做出的等效变换，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种多聚糖止血粉，其特征在于，由

①高粘度高脱乙酰度壳聚糖，所述的高粘度高脱乙酰度壳聚糖，其N-脱乙酰度为93或98%，粘度为1.0～2.0Pa·s；

②高古罗糖醛酸海藻酸钠，所述的高古罗糖醛酸海藻酸钠中古罗糖醛酸（G）与甘露糖醛酸（M）之比为7～27:3；

③混合交联剂，所述的混合交联剂包含氯化锌和氯化钙；以及

④液体石蜡和聚山梨酯-80制备而成；所述的止血粉组分如下：

高粘度高脱乙酰度壳聚糖 1～3g；

高古罗糖醛酸海藻酸钠 1～3g； 混合交联剂 80 ml；

液体石蜡 100～300ml； 聚山梨酯-80 10～30ml；

制备如上所述多聚糖止血粉的方法：

S1将高粘度高脱乙酰度壳聚糖溶于稀醋酸中制得壳聚糖溶液，将高古罗糖醛酸海藻酸钠溶于蒸馏水中制得海藻酸钠溶液，将上述两种溶液混合制得混合溶液A；

S2将液体石蜡与聚山梨酯-80混合获得油相溶液B；

S3将氯化锌和氯化钙混合溶于蒸馏水中，制得交联剂C；

S4将混合溶液A加入油相溶液B中，搅拌5～10min或至均匀后，加入交联剂C充分搅拌30～45min，交联形成水凝胶微球D，静置沉淀，过滤；

S5将制得的水凝胶微球D用石油醚洗涤、稀碱浸泡、乙醇梯度脱水、洗净、冷冻干燥制得多聚糖止血粉。

2.根据权利要求1所述多聚糖止血粉的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，高粘度高脱乙酰度壳聚糖和海藻酸钠的质量比为1:1~3，所述的稀醋酸溶液浓度为2%。

3.根据权利要求1所述多聚糖止血粉的制备方法，其特征在于，所述的步骤S2中，液体石蜡和聚山梨酯-80的体积比为10~15:1。

4.根据权利要求1所述多聚糖止血粉的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，氯化锌和氯化钙的质量比为0.75~1.5:1，所述的交联剂C溶液浓度为2%。