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CN105164149A - 具有饱腹感激素释放活性的新型多肽 - Google Patents

具有饱腹感激素释放活性的新型多肽 Download PDF

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CN105164149A
CN105164149A CN201480016483.2A CN201480016483A CN105164149A CN 105164149 A CN105164149 A CN 105164149A CN 201480016483 A CN201480016483 A CN 201480016483A CN 105164149 A CN105164149 A CN 105164149A
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CN
China
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glp
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amino acids
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CN201480016483.2A
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B.M.图克
E.S.克鲁
N.J.麦格劳
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Central Soya Co Inc
Original Assignee
Central Soya Co Inc
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Abstract

本发明涉及具有饱腹感激素释放活性(例如胆囊收缩素(CCK)和/或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)释放活性)的新型多肽。

Description

具有饱腹感激素释放活性的新型多肽
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2013年1月28日提交的美国临时申请61/757,556的权益，该临时申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明整体涉及新型多肽及它们的应用。具体地，本发明的新型多肽具有例如饱腹感激素释放活性(胆囊收缩素(CCK)和/或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)释放活性)。
背景技术
在美国和全世界，超重和肥胖者以及与体重增加相关联的疾病的数量和比例正在上升。虽然这并非由单个潜在因素诱发，一种致病因素可能是许多人的久坐不动的生活方式以及同时增加的高热量食物消费，其中包括“快餐”。大多数“快餐”趋于为高脂肪和/或高糖的。
对抗流行性体重增加的一个可行目标可以是诱发CCK。CCK是一种由肠胃细胞响应于营养物质而释放至循环中的肽激素，具体地为一餐摄入的蛋白或脂质。在中枢和外周神经系统中CCK充当神经递质和神经调节物质。CCK从响应于餐后进入胃肠内腔的营养物质(例如，蛋白和脂肪)的十二指肠和空肠的I内分泌细胞中释放出来。一旦释放出来，CCK启动了许多协调的反应以促进消化并调节食物摄入量，包括介导胆汁从胆囊排空，调节消化酶从胰腺的释放，通过调节幽门括约肌控制胃排空，以及通过迷走神经传入神经元将神经信号传入中枢神经系统。据信神经元CCK介导中枢神经系统内的多个事件，包括调控多巴胺神经传递和致焦虑效应，以及影响认知能力和伤害感受(J.N.Crawley和R.L.Corwin，1994，Peptides，15：731-755；N.S.Baber，C.T.Dourish，和D.R.Hill，Pain(1989)，39(3)，307-28；以及P.DeTullio，J.Delarge和B.Pirotte，ExpertOpiniononInvestigationalDrugs(2000)，9(1)，129-146)。CCK已经显示通过两种受体亚型：CCK-A(CCK-1)和CCK-B(CCK-2)亚型来介导它的各种不同的激素和神经调节物质的功能(G.N.Woodruff和J.Hughes，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(1991)，31：469-501)。CCK-1和CCK-2受体亚型属于七跨膜G蛋白偶联受体超家族。许多研究表明CCK通过CCK-1受体介导了饱腹感效应，其据信通过迷走神经传入将中继餐后饱腹信号传入中枢神经系统从而引起饱腹的“感觉”(G.P.Smith等人，Science213(1981)，第1036-1037页；以及J.N.Crawley等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，257(1991)，第1076-1080页)。
已经显示CCK施加了一些产生饱腹感的直接作用，包括抑制胃排空，抑制胃酸分泌，以及刺激胆囊收缩。无论是通过这些直接影响胃排空及肠消化或通过中枢神经系统途径，CCK引起饱腹感，这通常会导致更少的热量消耗。
对抗流行性体重增加的另一个可行目标可以是诱发GLP-1。GLP-1已被描述为具有大阵列效应的肠促胰岛素激素。在1984年发现了GLP-1，并且发现它是一种重要的肠促胰岛素(Nauck，M.A.；Kleine，N.；Orskov，C.；Hoist，J.J.；Willms，B.；Creutzfeldt，W.，Diabetologia1993，36，741-744)。GLP-1由响应于葡萄糖和脂肪酸的远侧回肠中的L细胞释放，然而，已知肽类直接诱导和/或调节GLP-1的释放(HiraT等人，(2009)，AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol297：G663-G671)。GLP-1在餐后被释放至循环并强效刺激葡萄糖依赖性的β-胰腺细胞释放胰岛素。许多附加的效应也已归因于GLP-1，包括刺激胰岛素生物合成、恢复胰岛的葡萄糖敏感性以及刺激葡萄糖转运蛋白GLUT-2和葡糖激酶表达的增加。GLP-1还具有许多效应：调节β-细胞群、刺激现有的β-细胞的复制和生长、抑制细胞凋亡以及来自导管前体细胞的新β-细胞的再生，这导致肝葡萄糖输出减少。GLP-1的有益的胰外作用也有报道诸如直接作用于降低肝脂含量和改善心功能(Abu-HamdahR.JClinEndocrinolMetab.2009Jun；94(6)：1843-52.Epub2009Mar31)。在肠道中，GLP-1是强效的蠕动和胃排空的抑制剂，并已显示出抑制胃酸分泌。胃排空的抑制导致随时间推移食物摄取减少以及体重减轻(Flint，A.；Raben，A.；Astrup，A.；Hoist，J.J.，JClinInv1998，101，515-520；Zander，M.；Madsbad，S.；Madsen，J.L.；Hoist，J.J.，Lancet2002，359，824-830)。GLP-1也已示出对食物摄入有中枢影响，其通过控制食欲的下丘脑中心的GLP-1受体的作用控制食欲(Maturitas.BarberTM等人，2010年11月；67(3)：197-202.doi：10.1016/j.maturitas.2010.06.018.Epub，2010年7月23日)。
鉴于体重增加流行以及缺乏有效对抗方法，人们需要有营养的、容易获得的补充剂、成分、和/或食物产品，它们可以食用并促进体重减轻或控制体重。为此，本发明提出具有饱腹感激素释放活性的新型多肽(例如CCK和/或GLP-1释放活性)。
发明内容
本发明的一个方面涵盖鉴定具有诱发例如STC-1细胞的CCK释放能力的新型多肽、以及编码该多肽的多核苷酸。在另一方面，本发明涵盖鉴定具有诱发例如STC-1细胞的GLP-1释放能力的新型多肽、以及编码该多肽的多核苷酸。在另一方面，本发明涵盖鉴定具有诱发例如STC-1细胞的CCK和GLP-1释放能力的新型多肽、以及编码该多肽的多核苷酸。
在其它方面，本发明涵盖包含本发明的多肽的产品(例如包含可食用材料和本文所述多肽的食物产品或包含本文所述多肽的补充剂)。
在其它方面，本发明涵盖诱发细胞如STC-1细胞释放CCK的方法，这是使所述细胞接触本发明多肽的结果。在其它方面，本发明涵盖诱发细胞如STC-1细胞释放GLP-1的方法，这是使所述细胞接触本发明多肽的结果。在其它方面，本发明涵盖诱发细胞如STC-1细胞释放CCK和GLP-1的方法，这是使所述细胞接触本发明多肽的结果。在具体方面，该细胞是STC-1细胞。
在其它方面，本发明涵盖诱发饱腹感的方法。在诱发饱腹感方法的其它方面，提供本发明的多肽并诱发细胞释放CCK。在诱发饱腹感方法的其它方面，提供本发明的多肽并诱发细胞释放GLP-1。在诱发饱腹感方法的其它方面，提供本发明的多肽并诱发细胞释放CCK和GLP-1。
附图说明
图1.CCK释放剂量响应曲线，用于SEQIDNO：1。SEQIDNO：1用固相方法合成，并且用于刺激STC-1细胞如所述释放CCK。数据拟合逻辑函数。根据回归数据，估计EC50将为43μM。
图2.GLP-1释放剂量响应曲线，用于SEQIDNO：1。SEQIDNO：1用固相方法合成，并且用于刺激STC-1细胞如所述释放GLP-1。数据拟合逻辑函数。根据回归数据，估计ECS0将为186μM。
图3.截短肽的CCK释放活性。全长SEQIDNO：1的N-末端和C-末端截短肽用固相方法合成，并且用于刺激STC-1细胞如所述释放CCK。数据表示三个独立实验的结果，并且表达为由全长肽刺激的CCK释放活性的百分比。
图4.截短肽的GLP-1释放活性。全长SEQIDNO：1的N-末端和C-末端截短肽用固相方法合成，并且用于刺激STC-1细胞如所述释放GLP-1。数据表达为由全长肽刺激的GLP-1释放活性的百分比。
具体实施方式
CCK和GLP-1促进饱腹感和缓慢的胃排空，从而赋予受试者饱的感觉。目前已发现包含氨基酸序列SEQIDNO：1及其变体的新型多肽具有诱发细胞如STC-1细胞释放CCK和GLP-1的能力。本发明的新型多肽以及它们的变体如本文所示进行了较充分的描述。
食物摄取对食欲和进一步的食物摄取施加一个瞬时抑制效应。在食物的所有特性中，总能量含量和宏量营养素组合物(例如脂肪、碳水化合物、或蛋白)看起来是此类饱腹感相关的主观感受的主要决定因素。大量证据表明三种宏量营养素在抑制饥饿和能量摄取的程度上存在差异。蛋白已经显示出比脂肪更致饱，脂肪继而比碳水化合物更致饱。来源于亲本食物蛋白的一些特定多肽结构具有生物活性的发现已经刺激了对可能导致饱腹感诱发产品(例如食物产品)开发的肽的研究，该产品目标在于控制食物摄取并由此影响体重。
I.新型多肽和编码其的多核苷酸。
本发明的一个特定方面涉及分离的多肽，其具有与SEQIDNO：1至少50％，至少55％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％相同的序列同一性。在另一个特定方面，本发明的多肽具有与SEQIDNO：1至少50％，至少55％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或100％相同的序列同一性，该多肽也具有诱发例如STC-1细胞释放CCK和/或GLP-1的能力。
在其它方面，本发明的多肽包含SEQIDNO：1或其变体的氨基酸序列、基本上由该序列组成、或由该序列组成，并且具有诱发例如STC-1细胞释放CCK和/或GLP-1的能力。就包含本发明多肽的多肽而言，这些多肽可由无限的氨基酸组成，或者可由有限的氨基酸组成，有限的氨基酸具有的上限为约1,000个氨基酸，约975个氨基酸，约950个氨基酸，约925个氨基酸，约900个氨基酸，约875个氨基酸，约850个氨基酸，约825个氨基酸，约800个氨基酸，约775个氨基酸，约750个氨基酸，约725个氨基酸，约700个氨基酸，约675个氨基酸，约650个氨基酸，约625个氨基酸，约600个氨基酸，约590个氨基酸，约580个氨基酸，约570个氨基酸，约560个氨基酸，约550个氨基酸，约540个氨基酸，约530个氨基酸，约520个氨基酸，约510个氨基酸，约500个氨基酸，约490个氨基酸，约480个氨基酸，约470个氨基酸，约460个氨基酸，约450个氨基酸，约440个氨基酸，约430个氨基酸，约420个氨基酸，约410个氨基酸，约400个氨基酸，约390个氨基酸，约380个氨基酸，约370个氨基酸，约360个氨基酸，约350个氨基酸，约340个氨基酸，约330个氨基酸，约320个氨基酸，约310个氨基酸，约300个氨基酸，约290个氨基酸，约280个氨基酸，约270个氨基酸，约260个氨基酸，约250个氨基酸，约240个氨基酸，约230个氨基酸，约220个氨基酸，约210个氨基酸，约200个氨基酸，约190个氨基酸，约180个氨基酸，约170个氨基酸，约160个氨基酸，约150个氨基酸，约140个氨基酸，约130个氨基酸，约120个氨基酸，约110个氨基酸，约100个氨基酸，约90个氨基酸，约80个氨基酸，约70个氨基酸，约60个氨基酸，约50个氨基酸，约40个氨基酸，约30个氨基酸，约20个氨基酸，或约15个氨基酸。
对于本发明的多肽，在其涉及变体时，这些变体无限制地包括SEQIDNO：1的插入、取代、断裂、缺失、C-末端截短、和N-末端截短。在某些方面，氨基酸改变，即，插入、取代、断裂、缺失等，性质上改变较小，不显著影响蛋白的折叠和/或活性(例如保守取代；小的缺失，通常一至约10个氨基酸；小的氨基末端或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；小的连接肽；或通过改变净电荷或另一项功能以有利于纯化的小的延伸，诸如多组氨酸标签、抗原表位、或结合域)。
在其它实施例中，变体具有如下性质：多肽的物理化学性质发生改变，但是诱发例如STC-1细胞释放CCK和/或GLP-1的活性未发生变化。例如，变体可具有改善的溶解度、提高的底物特异性、或增强的生物活性。
对于本发明的变体，使用本文所述的测定法测试多肽以确定它们是否具有必需的活性。例如就N-末端或C-末端截短而言，测试这些多肽的CCK和/或GLP-1活性。变体和利用变体的测试的示例在本文包含的实例中提供。
在本发明提出取代的多肽变体的某些方面，通过用另一个天然存在的或非天然存在的氨基酸取代例如SEQIDNO：1中的一个氨基酸来使残基发生突变。天然存在的氨基酸包括，例如，丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(O)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。
在本发明的特定方面，取代是保守取代。在其它特定方面，取代是非保守取代。保守和非保守氨基酸取代是本领域的普通技术人员已知的。一般来讲，保守氨基酸取代用另一个类似化学结构、电荷等的氨基酸来置换一个氨基酸，并且对多肽功能无显著影响。然而，非保守氨基酸取代用非类似化学结构、电荷等的另一个氨基酸来置换一个氨基酸。
为了进一步说明，保守取代为例如在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酸和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的基团内的取代。例如，碱性氨基酸可用另一个碱性氨基酸取代，酸性氨基酸可用另一个酸性氨基酸取代，极性氨基酸可用另一个极性氨基酸取代等。氨基酸取代一般不改变比活性，这是本领域已知的并且在例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，In，TheProteins，AcademicPress，NewYork中有所描述。非保守取代可认为是性质上不保守的取代。
在本发明提出的由断裂、缺失、截短等产生的多肽变体的某些方面，氨基酸残基从SEQIDNO：1中去除。此类断裂、缺失、截短等基本上不对所得多肽的活性造成负面影响。在特定方面，从SEQIDNO：1的C-末端、N-末端、或C-末端与N-末端进行截短是本发明的一部分。在其它特定方面，这些截短的多肽可去除多达五个、四个、三个、两个、或一个N-末端氨基酸，并且基本上不对活性造成负面影响(即，CCK、GLP-1、或CCK与GLP-1诱发活性)。在其它特定方面，这些截短的多肽可去除多达五个、四个、三个、两个、或一个C-末端氨基酸，并且基本上不对活性造成负面影响(即，CCK、GLP-1、或CCK与GLP-1诱发活性)。本文所述的这些截短令人惊讶及意外地展示了活性提高。提供了本发明的示例性截短多肽，例如SEQIDNO：2-6和8-10，并且在实例3和4中进一步详述。在特定方面，SEQIDNO：1的截短多肽大小为约500道尔顿，约600道尔顿，约700道尔顿，约800道尔顿，约900道尔顿，约1kDa，约1.1kDa，约1.2kDa，约1.3kDa，约1.4kDa，或约1.5kDa。
本发明也涉及如本文所述编码本发明多肽的分离多核苷酸。本领域的普通技术人员已知的并且认识到的是一定范围内的不同多核苷酸编码给定的氨基酸序列，这是遗传密码的简并性导致的结果。本发明的多核苷酸的一个示例是SEQIDNO：14。如上所述，对于遗传密码的简并性，本发明的多核苷酸包括等同多核苷酸，即，密码子简并序列，它们的序列不同，但是编码相同的多肽。这些多核苷酸序列可由本领域的普通技术人员确定。
通过了解本文所述的本发明多肽，设计多个部分或全长多核苷酸序列诸如编码本发明的多肽范围的cDNA和/或基因克隆是可能的。例如，可使用简并PCR获取本发明的多核苷酸，该PCR使用设计用于编码本文所述多肽的目标序列的引物。这些引物通常包含多个简并位置。本领域已知的标准技术可用于测定本发明的多核苷酸序列的范围。
多肽制备方法不限制本发明的范围。可使用在本发明时期已知的任何多肽制备方法，同样可使用后来出现的方法。
例如，本发明的肽可通过用包含感兴趣的多肽的编码序列的表达载体转染宿主细胞进行制备。表达载体或重组质粒通过如下方法制备：将与能够控制复制和表达的常规调控控制序列操作性相连的本发明多肽的编码序列置于宿主细胞内和/或从宿主细胞中分泌。调控序列包括启动子序列如CMV启动子和信号序列，其可来源于其它已知蛋白。所选择的宿主细胞通过常规技术用载体转染以产生转染过的宿主细胞。随后通过常规技术培养转染过的细胞以制备本发明的工程化多肽。
在本发明多肽的方法与构造中使用的用于克隆和亚克隆步骤的合适载体可由本领域的技术人员选择。例如，可使用克隆载体的常规pUC系列。一种载体，pUCl9，是可商购获得的。另外，能够容易地复制和操纵的任何载体具有丰富的克隆位点和可选择的基因(例如抗生素抗性)，并且可用于克隆。因此，克隆载体的选择不是本发明的限制因素。
表达载体也可通过适于异源DNA序列的扩增表达的基因进行表征，例如哺乳动物的二氢叶酸还原酶基因(DHFR)。其它载体序列包括多聚腺苷酸信号序列，诸如来自牛生长激素(BGH)的序列和β珠蛋白启动子序列(betaglopro)。本文可用的表达载体可通过本领域的技术人员熟知的技术来合成。
此类载体的组分例如复制子、选择基因、增强子、启动子、信号序列等，可获取自商业或天然来源，或者可通过已知技术合成，用于引导选择宿主内的重组DNA产物的表达和/或分泌。本领域已知的多种类型的其它合适表达载体用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母、和真菌表达，它们也可选择用于该目的。
本发明也涵盖用重组质粒转染的细胞系，该细胞系包含本发明多肽的编码序列。用于这些克隆载体的克隆和其它操纵的宿主细胞也是常规的。然而，来自大肠杆菌的各种菌株的细胞可用于复制克隆载体以及本发明多肽构造中的其它步骤。用于表达的合适宿主细胞或细胞系包括哺乳动物细胞诸如NS0、Sp2/0、CHO(例如DG44)、COS、HEK、成纤维细胞(例如3T3)、和骨髓瘤细胞。可使用人类细胞，因此使得分子能够用人糖基化模式进行修饰。另选地，可使用其它真核细胞系。合适的宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选及多肽制备与纯化的方法的选择是本领域已知的。
细菌细胞可证明用作适合本发明多肽表达的宿主细胞(参见例如Pluckthun，A.，Immunol.Rev.，130：151-188(1992))。然而，由于在细菌细胞中表达的多肽趋于未折叠的或不正确折叠的形式或非糖基化形式，在细菌细胞中产生的任何重组多肽将必须筛选其活性保持情况。如果细菌细胞表达的分子具有正确折叠的形式，该细菌细胞将为期望的宿主，或者在其它方面，该分子可在细菌宿主中表达，并且随后进行再折叠。例如，用于表达的大肠杆菌的各种菌株在生物技术领域中是熟知的宿主细胞。枯草芽孢杆菌、链霉菌属、其它杆菌等各种菌株也可用于该方法。
在期望的情况下，本领域技术人员已知的酵母细胞菌株、以及昆虫细胞如果蝇属和鳞翅目昆虫细胞及病毒表达系统也可用作宿主细胞。参见例如Miller等人，GeneticEngineering，8：277-298，PlenumPress(1986)及其中引用的参考文献。
可构建载体的一般方法、制备本发明宿主细胞所需的转染方法、和从此类宿主细胞制备本发明多肽所需的培养方法全部可以是常规技术。通常，本发明的培养方法是无血清培养方法，通常在无血清悬浮液中培养细胞。同样地，一旦产生，本发明的多肽可根据本领域的标准方法从细胞培养内容物中纯化，包括硫酸铵沉淀法、亲和柱法、柱层析法、凝胶电泳法等。此类技术在本领域技术范围内并且不限制本发明。然而，本发明多肽的另一种表达方法可利用转基因动物中的表达，诸如描述于美国专利4,873,316中的方法。这涉及利用动物酪蛋白启动子的表达系统，该启动子当转基因掺入哺乳动物中时，允许雌性动物在其乳汁中产生期望的重组蛋白。
一旦通过期望方法表达，随后使用如本文所述合适的测定法检查产生的多肽的活性。
本发明的多肽也可纯化制备，以及通过有机合成(诸如固相合成)大量制备。用于多肽合成的技术是熟知的。例如，R.B.Merrifield(1963).J.Am.Chem.Soc.85(14)：2149-2154，Merrifield(1990)Int.J.Peptide.ProteinRes35：161-214，AthertonE.等人(1979)BioorgChem.8351，US2009/0292108和2009/0221792、以及其中描述多肽合成的参考文献。此外，多肽可使用自动合成仪进行合成。当然，多肽可容易地购自多肽供应商。下文中描述了一种示例性方法。100mgTentagel-S-RAM(Rapp-Polymere)以0.24mmol/g的载量被转入可商购获得的多肽合成设备(PSMM(Shimadzu))，其中多肽序列根据碳二亚胺/HOBt方法被逐步构建。FMOC-氨基酸衍生物通过加入5倍克分子数相等的过量二异丙基碳二亚胺(DIC)、二异丙基乙胺(DIPEA)和羟基苯并三唑(HOBt)，然后转入反应容器，与树脂载体混合30分钟而被预激活。洗涤步骤通过，例如，添加DMF并彻底混合1分钟进行。裂解步骤通过，例如，在DMF中添加哌啶并彻底混合4分钟进行。单个反应的移除和洗涤溶液通过迫使溶液通过反应容器的底部玻璃料实现。使用了氨基酸衍生物FMOC-Ala、FMOC-Arg(Pbf)、FMOC-Asp、FMOC-Gly、FMOC-His(Trt)、FMOC-Ile、FMOC-Leu、FMOC-Lys(BOC)、FMOC-Pro、FMOC-Ser(tBu)和FMOC-Tyr(tBu)(Orpegen)。当合成完成时，干燥树脂。随后通过在室温用三氟乙酸/TIS/EDT/水(体积比95∶2∶2∶1)处理2小时裂解多肽酰胺。通过过滤、浓缩所述溶液和通过加入冰冷的乙醚沉淀，获得固体形式的粗产物。在0.1％TFA中以5-60％梯度乙腈在40分钟内以12ml/min的流速通过RP-HPLC纯化多肽，并使用UV检测器器在215nm评估洗脱液。通过分析型RP-HPLC和质谱测定单个部分的纯度。
本发明的多肽也可从蛋白水解产物组合物中分级得到。制备并分级蛋白水解产物组合物的方法是本领域已知的(参见例如美国预授权公布20110257087)。例如，多肽可从大豆蛋白水解产物组合物中分级得到。在其它方面，多肽可从蛋白水解产物组合物中分级得到，该蛋白水解产物组合物来源于大麦、芥花籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物、蛋类、或它们的组合。在其它方面，多肽可从不同的蛋白水解产物的组合中分级得到。例如，多肽可来源于大豆蛋白水解产物组合物与玉米蛋白水解产物的组合。作为另外一种选择，大豆蛋白水解产物组合物可与芥花籽蛋白水解产物组合物和小麦蛋白质水解产物组合物组合使用。在其它方面，多肽可从蛋白水解产物组合物中分级得到，该蛋白水解产物组合物来源于大豆和至少一种其它蛋白来源的组合，其它蛋白来源选自大麦、芥花籽、羽扇豆、玉米、燕麦、豌豆、马铃薯、大米、小麦、动物、乳品和蛋类。
II.诱发CCK和/或GLP-1的方法以及诱发饱腹感的方法
在某些方面，本发明提供诱发细胞释放CCK和/或GLP-1的方法，该方法包括接触所述细胞与有效量的本文所述多肽。提供的多肽可为任何可接受的形式(例如食物产品中的一部分成分、补充剂等)。测定CCK和GLP-1的释放是本领域已知的。例如，合适的样品(例如细胞培养基、血清等)可在经受本发明多肽处理之前和之后进行测量，从而测定是否有CCK和/或GLP-1的增加。这些测量使用例如可商购获得的免疫测定法来完成。
在其它某些方面，本发明提供诱发饱腹感的方法，该方法包括提供有效量的本文所述多肽。提供的多肽可为任何可接受的形式(例如食物产品中的一部分成分、补充剂等)。测定是否诱发了饱腹感的是本领域已知的。例如，生物标记(例如CCK和GLP-1)可用作测量饱腹感的方法，如能够进行较主观的测量，包括视觉类似物标度，其常常由线条(具有不同的长度)与每个线条末端相连的极端描述语组成(例如“我从没有比现在更饥饿过”-“我一点都不饿”)。
III.包含本发明多肽的产物。
本发明的某些方面涵盖包含可食用材料和本文所述多肽的食物产品。取决于所需食物产品，与可食用材料组合的特定多肽的选择能够并且将会不同。
取决于所需食物产品，合适可食用材料的选择将会不同。所述可食用材料可为植物来源的材料(例如，蔬菜汁、谷类食物等)、动物来源的材料(例如，乳品产品、蛋类产品等)、或生物材料(例如，蛋白、碳水化合物、脂质等)，其分离自植物来源的材料或动物来源的材料等。
本发明的某些食物产品可包括例如热或冷的谷类食品、巴、烘焙食品、饮料、酸奶、甜点、小吃、意大利面食和肉类(包括家禽和海产品)。
在本发明的一个方面，食物产品是液体或干混饮料。液体或干混饮料的非限制性示例包括果汁、水果饮料、果味饮料、蔬菜饮料、营养饮料、能量饮料、运动饮料、豆浆饮料、大豆风味饮料、米乳饮料、风味乳饮料、酸奶饮料、婴儿代乳品、荼饮料、咖啡饮料、膳食替代饮料、蛋白混合饮料、补充饮料、体重控制饮料、它们的组合以及干混饮料。
包含液体或干混饮料的可食用材料可能并且将会不同。适用的可食用材料的非限制性示例包括果汁、蔬菜汁、脱脂乳、减脂乳、2％乳、全脂乳、奶油、淡奶、酸奶、酪乳、巧克力、可可粉、咖啡、荼等。
饮料产品还可包括天然和人造的甜味剂(例如，葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖糊精、三氯蔗糖、天冬甜素、糖精、甜叶菊、玉米糖浆、蜂蜜、枫糖浆等)、风味剂(例如，巧克力、可可、巧克力风味剂、香草精、香草风味剂、水果风味剂等)、乳化或增稠剂(例如，卵磷脂、角叉菜胶、纤维素胶、纤维素凝胶、淀粉、阿拉伯树胶、黄原胶凝胶等)、稳定剂、脂质材料(例如，芥花籽油、向日葵油、高油酸向日葵油、脂肪粉等)、防腐剂和抗氧化剂(例如，山梨酸钾、山梨酸、BHA、BHT、TBHQ、迷迭香提取物、维生素A、维生素C和维生素E及它们的衍生物、以及各种植物提取物诸如那些包含具有抗氧化性质的类胡萝卜素、生育酚或类黄酮等)、着色剂、维生素、矿物质、以及它们的组合。
在本发明的某些方面，食物产品是一种食物巴(压成块的加工食品)，诸如格兰诺拉巴、谷类食物巴、营养巴、代餐巴、或能量巴。
在本发明的某些其它方面，食物产品是基于谷类的产品。基于谷类的食物产品的非限制性示例包括早餐谷类、早餐巴、意大利面食、面包、焙烤产品(即，粉饼、馅饼、卷状食品、饼干、薄脆饼干)和小吃产品(例如炸土豆条、椒盐脆饼干等)。基于谷类的食品的可食用材料可以例如来源于小麦(例如变白面粉、全麦面粉、麦芽精、麦麸等)、玉米(例如玉米面、玉米粗粉、玉米淀粉等)、燕麦(例如膨化燕麦、燕麦片、燕麦粉等)、稻米(例如膨化稻米、米粉、稻米淀粉)等。
在本发明的另一方面，食物产品是“固体”乳品基产品。合适的“固体”乳品基食品产品的非限制性示例包括硬质干酪产品、软质干酪产品、冰淇淋产品、酸奶产品、冷冻酸奶产品、搅打乳品样产品、果汁冻等。
在本发明的其它方面，食物产品是肉类产品或仿肉产品。肉类食物产品的示例包括例如加工肉制品、碎肉制品和全肉制品。肉类材料可以是动物肉或海产品肉。仿肉产品可以是组织化植物蛋白或组织化乳品蛋白，它们的质地模仿动物或海产品的肉。在肉类食品产品中仿肉产品可以是部分或全部肉类材料。
在本发明的另一方面，包含本文所述多肽的产品是补充剂。
IV.定义。
除非另有说明，否则技术术语根据常规用法使用。常见科技术语的定义可见于例如McGraw-HillDictionaryofScientific&TechnicalTerms，由McGraw-HillHealthcareManagementGroup出版；BenjaminLewin，GenesVIII，OxfordUniversityPress出版；Kendrew等人(编辑)，TheEncyclopediaofMolecularBiology，BlackwellPublishers出版；和RobertA.Meyers(编辑)，MolecularBiologyandBiotechnology：aComprehensiveDeskReference，Wiley，John&Sons，Inc出版；以及其它类似的技术参考文献中。
如本文所用，“一个”可意指一个或多个。如本文所用，与单词“包含”连用时，单词“一个”可意指一个或多于一个。如本文所用，“另一个”可意指至少第二个或更多个。此外，除非上下文另外需求，单数术语将包括复数且复数术语将包括单数。
如本文所用，“约”是指数值，包括例如整数，分数和百分数，不论是否明确说明。一般来讲，术语“约”是指一个数值范围(例如，引用值的+/-5-10％)，本领域的普通技术人员将考虑其等同于引用值(例如，具有相同的功能或结果)。在一些情况下，术语“约”可包括四舍五入到最接近的显著数字的数值。
如本文所用，“包含”和其所有形式和时态(包括例如包含(comprise，comprised))与“包括”、“含有”或“其特征在于”为同义词，是包容性或开放式语言，并且不排除任何额外的未列举的元素、步骤或成分。如本文所用，“组成”和其所有形式和时态(包括例如组成(consist，consisted))是封闭式的语言，并且排除任何未列举的元素、步骤或成分。如本文所用，“基本上由...组成”及其所有形式和时态将本发明的范围限于指定的元件、步骤、或成分以及不会实质上影响受本发明权利要求保护的基本和新型特性的那些。申请人注意到，某些实施例中引用了过渡性短语包括(comprising)。不论在任何地方申请人引用了这个过渡性短语，所述过渡性短语由...组成(consistingof)或基本上由...组成(consistingessentiallyof)也被申请人考虑到并为本发明的一部分。
如本文所用，“有效量”是指一定量的本发明多肽当接触细胞(例如STC-1细胞)时，能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放、或它们的组合。例如，有效量表示为在实例中使用的SEQIDNO：1及其变体的量和浓度，本领域的普通技术人员能够基于环境(例如，与高度复杂的活体多细胞生物体相比较的分离细胞)对其进行调节。
如本文所用，“食物产品”是指包含蛋白、碳水化合物、和/或脂肪的产品，并且旨在用于消耗及用作食物或食品来源(例如生长、修复、和生命过程以及用于提供能量)。例如，食物产品无限制地包括热或冷的谷类食物、巴(例如格兰诺拉巴、谷类食物巴、营养巴、代餐巴、或能量巴)、烘焙食物、饮料(例如液体和干混饮料)、酸奶、甜点、小吃、面食、包括家禽和海产品的肉类(例如加工肉制品、碎肉制品和全肉制品)、谷类食物产品(例如早餐谷类食物、早餐巴、意大利面食、面包、烘焙产品(例如粉饼、馅饼、卷状食品、饼干、薄脆饼干)、和小吃产品(例如炸土豆片、脆饼干等))、以及乳品基产品(例如硬质干酪、软质干酪、冰淇淋、酸奶、冷冻酸奶、搅打乳品样产品、果汁牛奶冻等)。
如本文所用，“分离的”或“纯化的”是指从至少一种与其天然相关联的组分移出的多肽或多核苷酸。例如，多肽当用SDS-PAGE测定时可为至少1％的纯度，例如至少5％的纯度，至少10％的纯度，至少20％的纯度，至少40％的纯度，至少60％的纯度，至少80％的纯度，至少90％的纯度，或至少95％的纯度，并且多核苷酸当用琼脂糖电泳测定时可为至少1％的纯度，例如至少5％的纯度，至少10％的纯度，至少20％的纯度，至少40％的纯度，至少60％的纯度，至少80％的纯度，至少90％的纯度，或至少95％的纯度。
如本文所用，“补充剂”是指与提供大量卡路里相反，旨在通过提供特定营养物质或其它分子补充膳食的组合物。例如，补充剂可为固体、半固体、或液体形式(例如压片的或胶囊包封的)，提供本发明的多肽。除了本发明的多肽之外，补充剂可包含任何一种或多种以下物质：维生素、矿物质、植物成分、氨基酸、必需脂肪酸、以及传统上或除此以外可以被看作或用于补充剂的其它物质。
如本文所用，“变体”是指与序列SEQIDNO：1不同，但是依然包含部分SEQIDNO：1的序列。涉及本发明多肽的变体也能够诱发例如STC-1细胞释放CCK和/或GLP-1。本发明的变体无限制地包括SEQIDNO：1的插入、取代、断裂、缺失、C-末端截短、和N-末端截短。
V.实例。
实例1.CCK活性。
SEQIDNO：1进行化学合成。为了测定CCK释放活性，将SEQIDNO：1溶解在10mg/ml的Dulbecco磷酸盐缓冲液(D-PBS)中。随后用d-PBS将这一溶液稀释至介于0.002和4mg/ml之间，然后加入1∶1比率的D-PBS和Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM-高葡萄糖)的STC-1细胞培养基(通道25至28)中，并且与细胞一起在37℃(99°F)和5％CO2含量条件下温育4小时。该溶液包含SEQIDNO：1，将其加入浓度范围介于0.001和2mg/ml之间的细胞以生成剂量响应曲线。
在温育后，STC-1细胞释放到培养基中的CCK浓度使用可商购获得的CCK检测试剂盒进行测定，该试剂盒购自PhoenixPharmaceuticals，Burlingame，CA(目录号EK-069-04)。根据制造商的说明，使用标准曲线进行测定，其覆盖的浓度范围为0.4到1000pg/孔。在450nm波长处，测量吸光度。
图1示出CCK释放的剂量响应曲线，用于SEQIDNO：1。获取自SEQIDNO：1的每个测试浓度的CCK量对肽的浓度对数绘制曲线。随后使用OriginLab制图软件拟合数据与逻辑函数来产生剂量响应曲线。从拟合数据外推EC50，并且发现其为43μM。
实例2.GLP-1活性。
SEQIDNO：1进行化学合成。为了测定GLP-1释放活性，将SEQIDNO：1溶解在10mg/ml的Dulbecco磷酸盐缓冲液(D-PBS)中。用D-PBS将这一溶液稀释至介于0.002和4mg/ml之间，然后加入1：1比率的D-PBS和Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium(DMEM-高葡萄糖)的STC-1细胞培养基(通道25至28)中，并且与细胞一起在37℃(99°F)和5％CO2含量条件下温育2小时。该溶液包含SEQIDNO：1，将其加入浓度范围介于0.001和2mg/ml之间的细胞以生成剂量响应曲线。
在温育后，STC-1细胞释放到培养基中的GLP-1浓度使用可商购获得的GLP-1检测试剂盒进行测定，该试剂盒购自PhoenixPharmaceuticals，Burlingame，CA(目录号EK-028-11)。根据制造商的说明，使用标准曲线进行测定，其覆盖的浓度范围为0.4到1000pg/孔。在450nm波长处，测量吸光度。
图2示出GLP-1剂量响应曲线，用于SEQIDNO：1。获取自SEQIDNO：1的每个测试浓度的GLP-1量对肽的浓度对数绘制曲线。随后使用OriginLab制图软件拟合数据与逻辑函数来产生剂量响应曲线。从拟合数据外推EC50，并且发现其为186μM。
实例3.展示CCK活性的序列变体。
SEQIDNO：1的C-和N-末端截短变体被化学合成并测定其CCK释放活性。使用实例1所述方法测定每个变体在2mg/ml浓度下的CCK活性。这些测定的结果示于图3中。肽的变体描述于表1中。
表1：
SEQ ID Nos 氨基酸序列
1 NH2-TSLDFPALSWLRL-COOH
2 NH2-SLDFPALSWLRL-COOH
3 NH2-LDFPALSWLRL-COOH
4 NH2-DFPALSWLRL-COOH
5 NH2-FPALSWLRL-COOH
6 NH2-PALSWLRL-COOH
7 NH2-ALSWLRL-COOH
8 NH2-TSLDFPALSWLR-COOH
9 NH2-TSLDFPALSWL-C00H
10 NH2-TSLDFPALSW-COOH
11 NH2-TSLDFPALS-COOH
12 NH2-TSLDFPAL-COOH
在各种情况下，肽变体展示了不同的CCK释放活性。前五个N-末端氨基酸的连续截短物展示了显著大于全长肽的活性，前三个C-末端氨基酸的连续截短物与其相同(参见图3)。
实例4.展示GLP-1活性的序列变体。
SEQIDNO：1的C-和N-末端截短变体被化学合成并测定其GLP-1释放活性。使用实例2所述方法测定每个变体在2mg/ml浓度下的GLP-1活性。这些测定的结果示于图4中。肽的变体描述于表1中。
在各种情况下，肽变体展示了不同的GLP-1释放活性。前五个N-末端氨基酸的连续截短物展示了显著大于全长肽的活性，前三个C-末端氨基酸的连续截短物与其相同(参见图4)。
参考
本文提及的和/或引用的全部专利和出版物均以引用方式并入本文，其引用程度如同每一单独的公布被特定和个别地以引用方式全文并入。

Claims (17)

1.一种分离的多肽，所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO：1或其变体。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约50％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的胆囊收缩素(CCK)释放、胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)释放，或它们的组合。
3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约75％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约90％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
5.根据权利要求2所述的多肽，其中所述变体是N-末端截短变体、C-末端截短变体、或它们的组合。
6.一种产品，所述产品包含
(a)可食用材料；和
(b)分离的多肽，其包含氨基酸序列SEQIDNO：1或其变体。
7.根据权利要求6所述的产品，其中所述产品是食物产品。
8.根据权利要求6所述的产品，其中所述产品是补充剂。
9.根据权利要求6所述的产品，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约50％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
10.根据权利要求9所述的产品，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约75％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
11.根据权利要求10所述的产品，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约90％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
12.根据权利要求6所述的多肽，其中所述变体是N-末端截短变体、C-末端截短变体、或它们的组合。
13.一种诱发细胞的CCK释放、GLP-1释放、或它们的组合的方法，所述方法包括使所述细胞接触包含氨基酸序列SEQIDNO：1或其变体的多肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约50％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约75％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述变体与SEQIDNO：1至少约90％相同，并且当有效量的所述多肽接触STC-1细胞时能够诱发所述细胞的CCK释放、GLP-1释放，或它们的组合。
17.根据权利要求13所述的多肽，其中所述变体是N-末端截短变体、C-末端截短变体、或它们的组合。
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