CN105111303B - 一种固液结合制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种采用固液相结合的化学方法制备利拉鲁肽的方法，本发明能够简化利拉鲁肽的制备工艺，提高终产品的质量标准；本发明首次合成二肽单体Fmoc‑Lys(N‑ε‑(γ‑Glu(N‑Boc)‑OtBu)‑OH,并将其用于利拉鲁肽的制备，同时采用Fmoc‑Ala‑Ala‑OH参与制备利拉鲁肽，避免了24位或25位缺失Ala杂质肽的生成，降低了纯化难度，提高了收率；三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)水溶性较好，利于反相色谱纯化制备，同时还保护了N端的氨基在棕榈酸修饰过程中不发生副反应，极大的提高了终产品的收率；本发明的实施，解决了化学合成利拉鲁肽过程中终产品相关杂质肽超标、总收率低的难题，得到纯度大于99.5%，单杂小于0.1%的终产品，降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物制备方法领域，特别涉及一种固相和液相结合制备利拉鲁肽的方法。
背景技术
利拉鲁肽(Liraglutide)，商品名Victoza，由丹麦诺和诺德公司研发，于2010年1月25日在美国上市，2011年3月4日获SFDA批准，进入中国市场；用于成人2型糖尿病患者控制血糖，适用于单用二甲双胍或磺脲类药物最大可耐受剂量治疗后血糖仍控制不佳的患者，与二甲双胍或磺脲类药物联合应用。2014年12月23日，诺和诺德公司又推出用于治疗肥胖的Saxenda(商品名)，剂量为3mg/天。
利拉鲁肽是一种GLP-1类似物，与人GLP-1具有97%的序列同源性，人GLP-1可以结合并激活GLP-1受体。GLP-1受体为天然GLP-1的靶点，GLP-1是一种内源性肠促胰岛素激素，能够促进胰腺β细胞葡萄糖浓度依赖性地分泌胰岛素。与天然GLP-1不同的是，利拉鲁肽在人体中的药代动力学和药效动力学特点均适合每天一次的给药方案。皮下注射给药后，其作用时间延长的机理包括:使吸收减慢的自联作用；与白蛋白结合；对二肽基肽酶IV (DPP-IV)和中性内肽酶(NEP)具有更高的酶稳定性，从而具有较长的血浆半衰期。
利拉鲁肽化学表述为Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基))]-GLP-17-37，分子式为C172H265N43O51，相对分子质量为3751.2，CAS号为204656-20-2，序列信息如下：
目前，诺和诺德公司(US6458924和US6268343)主要通过基因重组技术，利 用酵母生产利拉鲁肽；但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34-GLP-17-37，还需要和N-α-十六酰基-Glu(OSu)-OtBu反应，利用化学方法在Lys26接上侧链；由于Arg34-GLP-17-37的侧链均未保护，存在多个活性位点，所以此过程会产生较多杂质，损失较大。
还有报道采用固相化学法制备利拉鲁肽，主要集中在侧链修饰的连接策略上：如专利CN102286092A采用Fmoc-Lys(Alloc)-OH参与接肽反应，Pd(PPh)3脱Alloc，然后连接侧链；CN103087181A采用Fmoc-Lys(Mtt)-OH或Fmoc-Lys(Mmt)-OH参与接肽反应，用1%TFA/5%TIS/DCM脱侧链保护基，连接侧链；CN103145828A采用Fmoc-Lys(ivDde)-OH参与接肽反应，水合肼脱侧链保护基，然后接侧链反应；CN103980358A采用先液相合成单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-十六酰基)-OtBu)-OH,然后参与接肽反应；CN103275209A采用先合成N端保护的利拉鲁肽主链，然后在液相条件下，用Nα-Pal-γ-Glu(OtBu)-OSu与之发生偶联反应，然后经酸TFA脱叔丁基，碱性条件下脱Fmoc或Dde(或ivDde)两步后处理，再经纯化得到利拉鲁肽。
本发明人用现有的合成方法，制备利拉鲁肽，发现纯度和收率均不高，不适于工业规模生产。鉴于以上问题，本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究，从而得到本发明的技术方案。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供一种利拉鲁肽的固相和液相相结合的制备方法。
本发明中利用合成的二肽单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-Boc)-OtBu)-OH 和Fmoc-Ala-Ala-OH参与制备利拉鲁肽，并采用三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)模式，极大的提高了终产品的收率；本发明降低合成难度和生产成本，提高了精肽的纯度和收率，有利于规模化工业生产。本发明一种固液结合制备利拉鲁肽方法的技书方案包括如下步骤：
(a) Boc-Glu(OSu)-OtBu和Fmoc-Lys-OH在碱性溶液下偶联生成二肽单体Fmoc-Lys (N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH；
(b)以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，采用Fmoc化学保护策略，按照利拉鲁肽肽序，依次与Fmoc保护氨基酸合成N端三氟乙酰化的全保护肽树脂，其中Fmoc保护氨基酸26位Lys采用的是单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH，24位和25位采用二肽单体Fmoc-Ala-Ala-OH；N端三氟乙酰化的全保护肽树脂结构如下：Tfa-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)- Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc) -OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg (Pbf)- Gly-树脂；
(c)用裂解试剂裂解肽树脂得到三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)，并经纯化，得到精肽：Tfa-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala- Ala -Lys(γ-Glu –OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg- Gly-OH；
(d)在碱性条件下，Pal- OSu与步骤(c)所得三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)精肽发生偶联反应，得到棕榈酸修饰的产物；
(e)经碱解、纯化、冻干得到利拉鲁肽。
其中以上步骤(a)中Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH的具体合成方法为：
将Fmoc-Lys-OH或其盐与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20%体积的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入1～1.2倍摩尔量（以Fmoc-Lys-OH的量计） Boc-Glu (OSu)-OtBu的有机溶剂B溶液； TLC监测反应终点，待反应结束减压蒸发去掉有机溶剂后，再加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH。
以上步骤中碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种;
有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
以上技术方案步骤(b)中N端三氟乙酰化的全保护肽树脂的具体制备方法为：以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，以2-5倍的投料比(以合成规模的物质量计），加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成至1位His后，用三氟乙酸酐封端，得到N端三氟乙酰化的全保护肽树脂Tfa-His(Trt)- Ala-Glu(OtBu)-Gly -Thr(tBu)-Phe- Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)- Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu -Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala- Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu) -Glu(OtBu)- Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly -Arg(Pbf)-Gly-树脂。其中26位Lys采用的Fmoc保护氨基酸为步骤(a)制得的Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu) -OH，24位和25位Ala采用Fmoc保护氨基酸为二肽单体Fmoc-Ala-Ala-OH；其他位点均采用常规的Fmoc保护氨基酸偶联。优选的，步骤(b)中所述的Wang树脂或CTC树脂的替代度为0.3-0.5mmol/g；所述缩合剂为DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/ HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；脱保护试剂为15～25%（体积含量）哌啶/DMF溶液 。
上述技术方案中步骤(c)中所述裂解试剂为加入体积比1-5%清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水和三异丙基硅烷中的一种或几种。
上述技术方案中步骤(d)的具体操作步骤为：
取步骤(c)所得精肽与碱A按照摩尔比1:4～6的比例溶解在水中，加入体积比5～20%的有机溶剂B助溶,待完全溶解后，搅拌下滴加入1～2.0倍摩尔量（以精肽的量计） Pal-OSu的有机溶剂B溶液；继续搅拌反应，TLC监测反应终点；反应达到终点后，加入1～2.0倍摩尔量的甘氨酸（以精肽的量计），终止反应。
其中步骤(d)中所述的碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种；所述有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或几种。
技术方案中步骤(e)中碱解的具体操作方法为：量取体积比10-12%的哌啶（以步骤(d)所得的溶液体积计），加入步骤(d)所得的溶液中，配制成浓度为1M的哌啶溶液，搅拌反应至三氟乙酰基碱解完全；然后经超滤装置脱盐，不断加入纯水稀释肽溶液，保持溶液体积不变；当溶液pH值降至12～10时，采用0.2-1.0%醋酸水溶液稀释肽溶液，至pH值降至5～6时，停止抽滤。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明首次合成二肽单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-Boc)-OtBu)-OH , 并将其用于利拉鲁肽的制备，其合成过程和纯化过程简单易行，便于中控检测，易于放大生产；同时采用Fmoc-Ala-Ala-OH参与制备利拉鲁肽，避免了24位或25位缺失Ala杂质肽的生成，降低了纯化难度，提高了收率； 三氟乙酰化的利拉鲁肽(未修饰)水溶性较好，利于反相色谱纯化制备，同时还保护了N端的氨基在棕榈酸修饰过程中不发生副反应，极大的提高了终产品的收率；本发明的实施，解决了化学合成利拉鲁肽过程中终产品相关杂质肽超标、总收率低的难题，终产品的纯度提高到99.5%以上，单杂控制在0.1%以下。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明进行详细说明，但不限定本专利；根据本发明改变原料的投料比、或是反应溶剂或及缩合剂等，均在本发明的保护范围内。
说明书和权利要求书中所使用的缩写含义如下：
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| CTC树脂 | 2-氯三苯甲基氯树脂 |
| Wang Resins | 王树脂 |
| tBu | 叔丁基 |
| Pbf | 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 |
| Trt | 三苯甲基 |
| Tfa | 三氟乙酰基 |
| Boc | 叔丁氧羰基 |
| EDPA | N-乙基二异丙基胺 |
| NMP | N-甲基-2-吡咯烷酮 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DMAP | 4-二甲氨基吡啶 |
| DIPEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
| HBTU | 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 |
| HATU | 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
| TBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸 |
| HOBT | 1-羟基苯并三唑 |
| HOAT | 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| Pal- OSu | 棕榈酸活性酯 |
实施例1：Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH的合成
准确称取Fmoc-Lys-OH 183.8g(0.5mol)和碳酸钠63.6(0.6mol)溶于1200mL水中，低温下(2-8℃)缓慢加入Boc-Glu(OSu)-OtBu的四氢呋喃溶液(200.3g，0.5mol)/1000ml，搅拌反应，TLC监测反应终点，反应完全后，旋蒸掉THF，冰水浴下加入10%柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，1000ml乙酸乙酯萃取3次,合并有机相，200ml饱和食盐水洗3次，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩至1000ml，静置析晶，得Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH 253.6g，收率73.5%。
实施例2：Fmoc-Gly-Wang Resins的合成
将载体Wang树脂400.0g(sub=0.47mmol/g)置于合成柱中，用2400mL DMF 洗涤两次，加入4000mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入Fmoc-Gly-OH/DIC/HOBT的混合DCM溶液[称取118.8g(400mmol) Fmoc-Gly-OH和64.8g(480mmol) HOBT置于甘氨酸活化瓶，加入2000mL体积比例为1∶1的DMF和DCM混合溶液搅拌溶解，低温(0℃)下加入76.4ml(480mmol)DIC,活化5分钟]，反应10min后加入4.8g(4mmol) DMAP；反应3h，抽掉反应液，用4000mL DMF洗涤两次，加入封端试剂2400mL(480ml乙酸酐和408ml吡啶溶解于1512mL DMF中)反应2h，抽滤掉反应液，分别用DMF、DCM、甲醇洗涤2次，真空干燥后得Fmoc-Gly-Wang Resins 436.6ｇ；取样测替代度为0.30mmol/g。
实施例3： Fmoc-Gly-CTC Resins的合成
称取CTC树脂50.0g(sub=0.40mmol/g)置于合成柱中，用240mL DMF 洗涤两次,加入240mL DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，加入溶有5.94g(20mmol) Fmoc-Gly-OH的DCM/DMF(3/1,体积比)溶液150ml，搅拌后加入DIPEA 6.6ml(40mmol)，鼓N2反应60min，抽掉反应液，加入DCM/CH3OH/DIPEA (体积比17：2：1) 混合溶液300ml封端3次，每次10min；然后用DMF、DCM、甲醇分别洗涤2次，真空干燥得Fmoc-Gly-CTC Resins 53.80g。测替代度为0.29mmol/g.
实施例4：肽树脂的制备
准确称取实施例2替代度为0.30mmol/g 的 Fmoc-Gly-Wang Resins 100g(合成规模30mmol)置于合成柱中，加入1000ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，800ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液1000ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH 53.7g(90mmol)、HOBT 13.4g(99mmol)和DIC 15.4ml(99mmol)的DMF溶液500ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用800ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu) -OH 、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu) -OH 、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-His(Trt)--OH、(Tfa)2O，得到N端三氟乙酰化的全保护利拉鲁肽(未修饰)肽树脂：Tfa-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)- Gly-Wang resins；经真空干燥，称重为：245.3g,树脂增重145.3g,增重率为99.2%。
实施例5：肽树脂裂解
将实施例4得到的240.0g N端三氟乙酰化的全保护利拉鲁肽(未修饰)肽树脂，加入到冷冻的2400ml裂解液(体积配比为TFA/TIS/H20=95/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，200mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至1600ml,倒入16L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得N端三氟乙酰化利拉鲁肽(未修饰)粗肽104.1g,粗肽收率94.9%，纯度76.8%。
实施例6：肽树脂的制备
准确称取实施例3替代度为0.29mmol/g Fmoc-Gly-CTC Resins 51.7g(合成规模15mmol)置于合成柱中，加入500ml DCM溶胀30min；抽滤掉DCM后，400ml DMF洗涤2次，加入20%哌啶/DMF溶液500ml脱保护2次，分别反应10min和10min；然后用400ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；加入26.9g(45mmol) Fmoc-Arg(Pbf)-OH、6.7g(49.5mmol)HOBT 和7.7ml(49.5mmol)DIC 的DMF溶液300ml，鼓N2搅拌反应2h，反应终点以Kaiser试剂检测结果为准，反应达终点后，抽掉反应液，用400ml DMF、DCM、DMF分别洗涤2次；随后再脱保护。如此反复循环操作，按照利拉鲁肽肽序，逐一和保护氨基酸偶联；依次连接的保护氨基酸为：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH 、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu) -OH 、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu) -OH 、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-His(Trt)-OH，(Tfa)2O，得到N端三氟乙酰化的全保护利拉鲁肽(未修饰)肽树脂：Tfa-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)- Gly-CTC resins；经真空干燥，称重为：116.9g,树脂增重65.2g,增重率为89.1%。
实施例7：肽树脂裂解
将实施例6得到的115.0g N端三氟乙酰化的全保护利拉鲁肽(未修饰)肽树脂，加入到冷冻的1150ml裂解液(体积配比为TFA/TIS/H20=95/2.5/2.5)中，室温下搅拌反应3h；裂解反应结束，过滤树脂，100mlTFA洗涤树脂2次，合并滤液和洗液，旋蒸浓缩至800ml,倒入8L冷冻甲叔醚中，析出白色沉淀；静置30min后，过滤，甲叔醚洗涤6次，真空干燥得N端三氟乙酰化利拉鲁肽(未修饰)粗肽47.6g,粗肽收率85.0%，纯度77.6%。
实施例8：N端三氟乙酰化利拉鲁肽(未修饰)的精制
称取实施例5所得粗肽100.0g溶于10%乙腈水溶液2500ml中，震荡溶解后，0.45um滤膜过滤后备用。
内径为100mm C18制备柱，流动相为0.1%TFA/水- 0.1%TFA/乙腈体系，上样量为6.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5%以上，单杂小于0.1%的精肽溶液，浓缩后冻干得精肽56.2g，纯化收率为56.2%，纯度99.6%，单杂均小于0.1%。
实施例9：N端三氟乙酰化利拉鲁肽(未修饰)的精制
称取实施例7所得粗肽45.0g溶于10%乙腈水溶液1200ml中，震荡溶解后，0.45um滤膜过滤后备用。
内径为100mm C18制备柱，流动相为0.1%TFA/水- 0.1%TFA/乙腈体系，上样量为6.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5%以上，单杂小于0.1%的精肽溶液，浓缩后冻干得精肽25.7g，纯化收率为57.1%，纯度99.6%，单杂均小于0.1%。
实施例10：利拉鲁肽的制备
将实施例8所得精肽56.0g(15mmol)加入2L三口反应瓶中，加入1000ml 10%乙腈水溶液搅拌溶解，冰水浴下，缓慢滴加10% Na2CO3水溶液，调节溶液pH至11，停止滴加；在冰水浴下滴加Pal-OSu的THF溶液7.1g(30mmol)/150ml,滴加完毕，撤冰浴，室温下反应3h;加入2.25g(30mmol)甘氨酸，继续反应30min，TLC监测反应终点；
向反应液中激烈搅拌下加入150ml哌啶，室温下继续搅拌,HPLC监测碱解终点；反应到终点后，停止搅拌，G3砂芯漏斗滤除不溶物，并用纯净水洗涤不溶物三次；合并洗液和滤液，用超滤装置除盐，不断加入纯水稀释肽溶液，保持溶液体积不变；当溶液pH值降至11时，采用0.5%醋酸水溶液稀释肽溶液，至pH值降至5时，停止抽滤。滤液经0.45um滤膜过滤，待用。
内径为100mm C8制备柱，流动相为20mM 醋酸铵水溶液- 乙腈体系，上样量为3.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5%以上，单杂小于0.1%的精肽溶液，脱盐后浓缩冻干得精肽39.3g，收率为70.2%，纯度99.6%，单杂均小于0.1%；制备总收率为37.5%。
实施例11：利拉鲁肽的制备
将实施例9所得精肽24.3g(6.5mmol)加入1L三口反应瓶中，加入500ml 10%乙腈水溶液搅拌溶解，冰水浴下，缓慢滴加10% EDPA/NMP溶液，调节溶液pH至11，停止滴加；在冰水浴下滴加Pal-OSu的THF溶液4.6g(13mmol)/80ml,滴加完毕，撤冰浴，室温下反应3h;加入0.98g(13mmol)甘氨酸，继续反应30min，TLC监测反应终点；
向反应液中激烈搅拌下加入61ml哌啶，室温下继续搅拌,HPLC监测碱解终点；反应到终点后，停止搅拌，G3砂芯漏斗滤除不溶物，并用纯净水洗涤不溶物三次；合并洗液和滤液，用超滤装置除盐，不断加入纯水稀释肽溶液，保持溶液体积不变；当溶液pH值降至11时，采用0.5%醋酸水溶液稀释肽溶液，至pH值降至5时，停止抽滤。滤液经0.45um滤膜过滤，待用。
内径为100mm C8制备柱，流动相为20mM 醋酸铵水溶液- 乙腈体系，上样量为3.0g/次，流速300ml/min，梯度洗脱；峰前和峰后循环进样，截取中控分析纯度为99.5%以上，单杂小于0.1%的精肽溶液，脱盐后浓缩冻干得精肽17.3g，收率为71.1%，纯度99.6%，单杂均小于0.1%；制备总收率为34.5%。
Claims (7)
1.一种固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)Boc-Glu(OSu)-OtBu和Fmoc-Lys-OH在碱性溶液下偶联生成二肽单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH；具体操作为：将Fmoc-Lys-OH或其盐与碱A按照摩尔比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％体积的有机溶剂B助溶，待完全溶解后，以Fmoc-Lys-OH的量计，搅拌下滴加入1～1.2倍摩尔量Boc-Glu(OSu)-OtBu的有机溶剂B溶液；继续搅拌反应，TLC监测反应终点，反应结束后，减压蒸掉有机溶剂，加入10％柠檬酸水溶液调溶液pH值至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH；
(b)以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，采用Fmoc化学保护策略，按照利拉鲁肽肽序，依次与Fmoc保护氨基酸合成N端三氟乙酰化的全保护肽树脂，其中Fmoc保护氨基酸26位Lys采用的是单体Fmoc-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-OH，24位和25位采用Fmoc-Ala-Ala-OH，其他位点均采用常规的Fmoc保护氨基酸偶联；N端三氟乙酰化的全保护肽树脂结构如下：
Tfa-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
(c)用裂解试剂裂解肽树脂得到三氟乙酰化的未修饰的利拉鲁肽，并经纯化，得到精肽：
Tfa-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-OH)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
(d)在碱性条件下，Pal-OSu与步骤(c)所得三氟乙酰化的未修饰的利拉鲁肽精肽发生偶联反应，得到棕榈酸修饰的产物；
(e)经碱解、纯化、冻干得到利拉鲁肽；
所述碱A为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、三乙胺、二乙胺、N-乙基二异丙基胺、N,N-二异丙基乙胺等中的一种；所述有机溶剂B为四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、乙腈中的一种或一种以上的混合液。
2.根据权利要求1所述的固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(b)中N端三氟乙酰化的全保护肽树脂的具体制备方法为：以Wang树脂或CTC树脂为固相载体，以合成规模的物质量计，以2-5倍的投料比加入相应的Fmoc保护氨基酸进行偶联反应，每一个偶联反应均是在缩合剂的存在下进行的固相接肽反应，反应完毕后用脱保护试剂脱除Fmoc，再与下一个Fmoc保护氨基酸进行偶联反应；重复操作直至合成至1位His后，用三氟乙酸酐封端，得到N端三氟乙酰化的全保护肽树脂Tfa-His(Trt)-Ala-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys(N-ε-(γ-Glu(N-α-Boc)-OtBu)-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂。
3.根据权利要求2所述的固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，Wang树脂或CTC树脂的替代度为0.3-0.5mmol/g。
4.根据权利要求2所述的固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，缩合剂为DIC/HOBT、DIC/HOAT、TBTU/HOBT/DIPEA、HBTU/HOBT/DIPEA、HATU/HOAT/DIPEA的一种；脱保护试剂为体积含量15～25％的哌啶/DMF溶液。
5.根据权利要求1所述固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(c)中所述裂解试剂为加入体积比1-5％清除剂的TFA溶液，所述清除剂为苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、巯基乙醇、苯酚、水、三异丙基硅烷中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(d)的具体操作步骤为：取步骤(c)所得精肽与碱A按照摩尔比1:4～6的比例溶解在水中，加入体积比5～20％的有机溶剂B助溶，待完全溶解后，以精肽的量计，搅拌下滴加入1～2.0倍摩尔量Pal-OSu的有机溶剂B溶液；继续搅拌反应，TLC监测反应终点；反应达到终点后，以精肽的量计，加入1～2.0倍摩尔量的甘氨酸，终止反应。
7.根据权利要求1所述的固液结合制备利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤(e)中碱解的具体操作步骤为：以步骤(d)所得的溶液体积计，量取体积比10-12％的哌啶，加入步骤(d)所得的溶液中配制成浓度为1M的哌啶溶液，搅拌反应至三氟乙酰基碱解完全；然后经超滤装置脱盐，不断加入纯水稀释肽溶液，保持溶液体积不变；当溶液pH值降至12～10时，采用0.2-1.0％醋酸水溶液稀释肽溶液，至pH值降至5～6时，停止抽滤。
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