CN105102616A

CN105102616A - 具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽

Info

Publication number: CN105102616A
Application number: CN201380061327.3A
Authority: CN
Inventors: Y.李; J.麦塞瓦恩; S.C.罗斯曼
Original assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Current assignee: Butamax Advanced Biofuels LLC
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2013-09-26
Publication date: 2015-11-25
Also published as: JP6407869B2; WO2014052670A1; US20170044578A1; AU2013323427A1; EP2900811B1; US20140093930A1; EP2900811A1; BR112015006691A2; EP3444339A1; US10174345B2; CA2886157A1; US9512408B2; JP2015530115A

Abstract

本发明提供了具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽。本发明也公开了包含采用此类多肽的异丁醇生物合成途径的重组宿主细胞。本发明还公开了采用宿主细胞生产异丁醇的方法，所述宿主细胞包含具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽。

Description

具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽

相关申请的交叉引用

本申请涉及并要求提交于2012年9月26日的美国临时申请序列号61/705977的权益，其全文以引用方式并入本文。

以电子方式递交的序列表的引用

与本申请一同提交的以电子方式递交的ASCII文本文件(文件名：20130926_CL5862WOPCT_SeqList.txt，大小：1,236,821字节，以及创建日期：2013年9月26日)中列出的序列内容全文以引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及具有适合在异丁醇生产途径中发挥作用的酮醇酸还原异构酶活性的多肽。

背景技术

酮醇酸还原异构酶(KARI)参与缬氨酸和异亮氨酸的生物性生产。KARI酶还已被显示对于利用工程化的微生物生产异丁醇的途径是有用的(美国专利7,851,188和7,993,889)。此类微生物能够被用于从植物来源的底物生产异丁醇。

虽然用于异丁醇的化学合成的方法是已知的(羰基合成、一氧化碳的催化氢化(Ullmann′sEncyclopediaofIndustrialChemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlagGmbHandCo.，Weinheim，Germany，第5卷，第716-719页)和甲醇与正丙醇的格尔伯特缩合(Carlini等人，J.Molec.Catal.A.Chem.220：215-220，2004))，但这些工艺利用来源于石油化学品的起始材料，通常是昂贵的。此外，异丁醇的化学合成不具有环境优势(诸如使温室气体排放最小化)的潜能。用植物来源的原材料生产异丁醇将代表本领域的进步。

能够利用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的KARI酶能够在通常使用的微生物细胞中利用通过现有的糖酵解途径和其它代谢途径产生的NADH，并可导致改善的异丁醇生产。美国专利8,129,162和美国申请公布2010/0197519A1以及美国申请13/428585，其提交于2012年3月23日(公布为美国申请公布20130071898A1)，各自以引用方式并入本文，描述了生成具有不同利用辅因子(NADH)能力的KARI酶。然而，本领域仍然存在对具有适用于诸如异丁醇生物合成途径的生产途径的KARI活性的替代性多肽的需求。

发明内容

本文提供了提高重组宿主细胞的异丁醇产量的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞(例如，包含异丁醇生物合成途径和具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽或其片段)。在实施例中，所述方法包括异源多肽或其片段，所述异源多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的非赖氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的非苏氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的非甲硫氨酸的氨基酸残基。在其它实施例中，使用了本发明的另一个具有KARI活性的异源多肽或其片段。在其它实施例中，使用了本发明的多核苷酸或其片段，其编码本发明的具有KARI活性的多肽或其片段。在实施例中，所述方法还包括在其中产生异丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与碳底物接触。在所述方法的实施例中，所述重组宿主细胞产生的异丁醇比包含异丁醇生物合成途径但不包含所述异源多肽或其片段的重组宿主细胞产生的异丁醇多。

本文提供了提高重组宿主细胞的NADH利用率的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞(例如，包含异丁醇生物合成途径和具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽或其片段)。在实施例中，所述方法包括异源多肽或其片段，所述异源多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的非赖氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的非苏氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的非甲硫氨酸的氨基酸残基。在其它实施例中，使用了本发明的另一个具有KARI活性的异源多肽或其片段。在其它实施例中，使用了本发明的多核苷酸或其片段，其编码本发明的具有KARI活性的多肽或其片段。在实施例中，所述方法包括在其中产生异丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与碳底物接触。在所述方法的实施例中，所述重组宿主细胞的NADH利用率比包含异丁醇生物合成途径但不包含所述异源多肽或其片段的重组宿主细胞的NADH利用率高。在所述方法的实施例中，NADH利用率的提高是NADH/NADPH比率的提高。

本文提供了提高重组宿主细胞的生长速率的方法，所述方法包括(a)提供本发明的重组宿主细胞(例如，包含异丁醇生物合成途径和具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽或其片段)。在实施例中，所述方法包含异源多肽或其片段，所述异源多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的非赖氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的非苏氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的非甲硫氨酸的氨基酸残基。在其它实施例中，使用了本发明的另一个具有KARI活性的异源多肽或其片段。在其它实施例中，使用了本发明的多核苷酸或其片段，其编码本发明的具有KARI活性的多肽或其片段。在实施例中，所述方法包括在其中产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触。在所述方法的实施例中，所述重组宿主细胞的生长速率比包含异丁醇生物合成途径但不包含所述异源多肽或其片段的重组宿主细胞的生长速率大。

在本发明的所述方法的实施例中，所述重组多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的为酪氨酸或丙氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的为缬氨酸、丙氨酸或亮氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的为亮氨酸的氨基酸残基。在本发明的所述方法的实施例中，所述重组宿主细胞是酵母宿主细胞。在本发明的所述方法的实施例中，所述酵母来自下列属：酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、或毕赤酵母属(Pichia)。在本发明的所述方法的实施例中，所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在本发明的所述方法的实施例中，所述异源多肽或片段由与SEQIDNO：761、752、759或760具有至少约85％、至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性的序列编码。在本发明的所述方法的实施例中，所述异源多肽或片段包含与SEQIDNO：237、227、233或234具有至少约85％、至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性的序列。

本文提供了重组宿主细胞，其包含异丁醇生物合成途径和：a)具有酮醇酸还原异构酶活性的异源多肽，所述异源多肽与下列之一具有至少约85％、至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性：K9JM2(SEQIDNO：193)、K9JM3(SEQIDNO：194)、K9JM4(SEQIDNO：195)、K9JM5(SEQIDNO：196)、K9JM6(SEQIDNO：197)、K9JM7(SEQIDNO：198)、K9JM8(SEQIDNO：199)、K9JM9(SEQIDNO：200)、K9JM10(SEQIDNO：201)、K9JM11(SEQIDNO：202)、K9JM12(SEQIDNO：203)、K9JM13(SEQIDNO：204)、K9JM14(SEQIDNO：205)、K9JM15(SEQIDNO：206)、K9JM16(SEQIDNO：207)、K9JM17(SEQIDNO：208)、K9JM18(SEQIDNO：209)、K9JM19(SEQIDNO：210)、K9JM20(SEQIDNO：211)、K9JM21(SEQIDNO：212)、K9JM22(SEQIDNO：213)、K9JM23(SEQIDNO：214)、K9JM24(SEQIDNO：215)、K9JM25(SEQIDNO：216)、K9JM26(SEQIDNO：217)、K9JM27(SEQIDNO：218)、K9JM28(SEQIDNO：219)、K9JM29(SEQIDNO：220)、K9JM30(SEQIDNO：221)、K9JM31(SEQIDNO：222)、JM32(SEQIDNO：223)、JM33(SEQIDNO：224)、JM34(SEQIDNO：225)、JM35(SEQIDNO：226)、JM36(SEQIDNO：227)、JM37(SEQIDNO：228)、JM38(SEQIDNO：229)、JM39(SEQIDNO：230)、JM40(SEQIDNO：231)、JM42(SEQIDNO：232)、JM43(SEQIDNO：233)、JM44(SEQIDNO：234)，K9_DAVID_SH(SEQIDNO：236)、K9ALL3(SEQIDNO：237)，K9_URSALA(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)、JM41(SEQIDNO：240)、K9ALL148(SEQIDNO：241)、K9JM148(SEQIDNO：242)、K9ALL156(SEQIDNO：243)、K9JM156(SEQIDNO：244)、K9ALL191(SEQIDNO：245)、K9JM191(SEQIDNO：246)、K9ALL254(SEQIDNO：247)、K9ALL278(SEQIDNO：248)、K9ALL37(SEQIDNO：249)、K9JM37S(SEQIDNO：250)、K9ALL66(SEQIDNO：66)、K9JM66(SEQIDNO：252)、K9ALL8Q(SEQIDNO：253)、K9JM8Q(SEQIDNO：254)、K9ALL45(SEQIDNO：255)、K9_LUCY(SEQIDNO：300)、K9_ILYA(SEQIDNO：301)、K9ALL258(SEQIDNO：302)、K9YW25-T191S(SEQIDNO：303)、PLH689：：ALL3(SEQIDNO：304)、F53L(SEQIDNO：307)、F53I(SEQIDNO：308)、F53M(SEQIDNO：309)、F53V(SEQIDNO：310)、F53P(SEQIDNO：311)、F53S(SEQIDNO：312)、F53A(SEQIDNO：313)、F53E(SEQIDNO：314)、F53Q(SEQIDNO：315)、T11-1(SEQIDNO：316)、T11-2(SEQIDNO：317)、T11-3(SEQIDNO：318)、T11-4(SEQIDNO：319)、T11-5(SEQIDNO：320)、T11-6(SEQIDNO：321)、T11-7(SEQIDNO：322)、T11-10(SEQIDNO：323)、T11-12(SEQIDNO：324)、T11-13(SEQIDNO：325)、T11-14(SEQIDNO：326)、T11-15(SEQIDNO：327)、T11-16(SEQIDNO：328)、T11-18(SEQIDNO：329)、T11-19(SEQIDNO：330)、T11-21(SEQIDNO：331)、T11-22(SEQIDNO：332)、T11-25(SEQIDNO：333)、T11-27(SEQIDNO：334)、T11-28(SEQIDNO：335)、T11-29(SEQIDNO：336)、T11-30(SEQIDNO：337)、T11-32(SEQIDNO：338)、T11-33(SEQIDNO：339)、T11-35(SEQIDNO：340)、T11-36(SEQIDNO：341)、T11-37(SEQIDNO：342)、T11-38(SEQIDNO：343)、T11-39(SEQIDNO：344)、T11-42(SEQIDNO：345)、T11-43(SEQIDNO：346)、T11-44(SEQIDNO：347)、T11-45(SEQIDNO：348)、T11-46(SEQIDNO：349)、T11-47(SEQIDNO：350)、T11-49(SEQIDNO：351)、T11-50(SEQIDNO：352)、T11-52(SEQIDNO：353)、T11-54(SEQIDNO：354)、T11-55(SEQIDNO：355)、T11-56(SEQIDNO：356)、T11-57(SEQIDNO：357)、T11-58(SEQIDNO：358)、T11-59(SEQIDNO：359)、T11-60(SEQIDNO：360)、T11-61(SEQIDNO：361)、T11-62(SEQIDNO：362)、T11-64(SEQIDNO：363)、T11-66(SEQIDNO：364)、T11-67(SEQIDNO：365)、T11-69(SEQIDNO：366)、T11-70(SEQIDNO：367)、T11-72(SEQIDNO：368)、T11-74(SEQIDNO：369)、T11-75(SEQIDNO：370)、T11-76(SEQIDNO：371)、T11-79(SEQIDNO：372)、T11-80(SEQIDNO：373)、T11-81(SEQIDNO：374)、T11-83(SEQIDNO：375)、T11-84(SEQIDNO：376)、T11-85(SEQIDNO：377)、T11-86(SEQIDNO：378)、T11-87(SEQIDNO：379)、T11-88(SEQIDNO：380)、T11-91(SEQIDNO：381)、T11-94(SEQIDNO：382)、T11-95(SEQIDNO：383)、T11-96(SEQIDNO：384)、T11-97(SEQIDNO：385)、T11-99(SEQIDNO：386)、T11-103(SEQIDNO：387)、T11-104(SEQIDNO：388)、T11-109(SEQIDNO：389)、T11-110(SEQIDNO：390)、T11-111(SEQIDNO：391)、T11-114(SEQIDNO：392)、T11-116(SEQIDNO：393)、T11-117(SEQIDNO：394)、T11-119(SEQIDNO：395)、T11-121(SEQIDNO：396)、T11-122(SEQIDNO：397)、T11-124(SEQIDNO：398)、T11-125(SEQIDNO：399)、T11-128(SEQIDNO：400)、T11-130(SEQIDNO：401)、T11-131(SEQIDNO：402)、T11-134(SEQIDNO：403)、E147V(SEQIDNO：552)、G164D(SEQIDNO：404)、G304V(SEQIDNO：405)、N258S(SEQIDNO：406)、T71S(SEQIDNO：407)、V184I(SEQIDNO：408)、A279D(SEQIDNO：409)、D98V(SEQIDNO：410)、M169F(SEQIDNO：411)、M169K(SEQIDNO：412)、M169L(SEQIDNO：413)、E100Q_M312K(SEQIDNO：414)、ECB11(SEQIDNO：534)、EC2A2(SEQIDNO：535)、EC2B12(SEQIDNO：536)、EGC10(SEQIDNO：537)、EGD9(SEQIDNO：538)、EGG8(SEQIDNO：539)、EHG1(SEQIDNO：540)、EHG2(SEQIDNO：541)、EHH6(SEQIDNO：520)、EHH9(SEQIDNO：521)、EHH10(SEQIDNO：522)、EHH12(SEQIDNO：523)、EKC5(SEQIDNO：546)、EKG4(SEQIDNO：547)、EJF5(SEQIDNO：548)、EJB8(SEQIDNO：549)、EJA1(SEQIDNO：550)、EJB10(SEQIDNO：551)、K9_Lucy_SH(SEQIDNO：553)、或K9JM1(SEQIDNO：192)、或其活性片段；或b)编码a)的异源多肽的异源多核苷酸。

本文还提供了重组宿主细胞，其包含异丁醇生物合成途径和：a)具有酮醇酸还原异构酶活性的异源多肽，所述异源多肽与下列具有至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性：K9JM2(SEQIDNO：193)、K9JM3(SEQIDNO：194)、K9JM4(SEQIDNO：195)、K9JM5(SEQIDNO：196)、K9JM6(SEQIDNO：197)、K9JM7(SEQIDNO：198)、K9JM8(SEQIDNO：199)、K9JM9(SEQIDNO：200)、K9JM10(SEQIDNO：201)、K9JM11(SEQIDNO：202)、K9JM12(SEQIDNO：203)、K9JM13(SEQIDNO：204)、K9JM14(SEQIDNO：205)、K9JM15(SEQIDNO：206)、K9JM16(SEQIDNO：207)、K9JM17(SEQIDNO：208)、K9JM18(SEQIDNO：209)、K9JM19(SEQIDNO：210)、K9JM20(SEQIDNO：211)、K9JM21(SEQIDNO：212)、K9JM22(SEQIDNO：213)、K9JM23(SEQIDNO：214)、K9JM24(SEQIDNO：215)、K9JM25(SEQIDNO：216)、K9JM26(SEQIDNO：217)、K9JM27(SEQIDNO：218)、K9JM28(SEQIDNO：219)、K9JM29(SEQIDNO：220)、K9JM30(SEQIDNO：221)、K9JM31(SEQIDNO：222)、JM32(SEQIDNO：223)、JM33(SEQIDNO：224)、JM34(SEQIDNO：225)、JM35(SEQIDNO：226)、JM36(SEQIDNO：227)、JM37(SEQIDNO：228)、JM38(SEQIDNO：229)、JM39(SEQIDNO：230)、JM40(SEQIDNO：231)、JM42(SEQIDNO：232)、JM43(SEQIDNO：233)、JM44(SEQIDNO：234)、K9_DAVID_SH(SEQIDNO：236)、K9ALL3(SEQIDNO：237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)、JM41(SEQIDNO：240)、K9ALL148(SEQIDNO：241)、K9JM148(SEQIDNO：242)、K9ALL156(SEQIDNO：243)、K9JM156(SEQIDNO：244)、K9ALL191(SEQIDNO：245)、K9JM191(SEQIDNO：246)、K9ALL254(SEQIDNO：247)、K9ALL278(SEQIDNO：248)、K9ALL37(SEQIDNO：249)、K9JM37S(SEQIDNO：250)、K9ALL66(SEQIDNO：66)、K9JM66(SEQIDNO：252)、K9ALL8Q(SEQIDNO：253)、K9JM8Q(SEQIDNO：254)、K9ALL45(SEQIDNO：255)、K9_LUCY(SEQIDNO：300)、K9_ILYA(SEQIDNO：301)、K9ALL258(SEQIDNO：302)、K9YW25-T191S(SEQIDNO：303)、PLH689：：ALL3(SEQIDNO：304)、F53L(SEQIDNO：307)、F53I(SEQIDNO：308)、F53M(SEQIDNO：309)、F53V(SEQIDNO：310)、F53P(SEQIDNO：311)、F53S(SEQIDNO：312)、F53A(SEQIDNO：313)、F53E(SEQIDNO：314)、F53Q(SEQIDNO：315)、T11-1(SEQIDNO：316)、T11-2(SEQIDNO：317)、T11-3(SEQIDNO：318)、T11-4(SEQIDNO：319)、T11-5(SEQIDNO：320)、T11-6(SEQIDNO：321)、T11-7(SEQIDNO：322)、T11-10(SEQIDNO：323)、T11-12(SEQIDNO：324)、T11-13(SEQIDNO：325)、T11-14(SEQIDNO：326)、T11-15(SEQIDNO：327)、T11-16(SEQIDNO：328)、T11-18(SEQIDNO：329)、T11-19(SEQIDNO：330)、T11-21(SEQIDNO：331)、T11-22(SEQIDNO：332)、T11-25(SEQIDNO：333)、T11-27(SEQIDNO：334)、T11-28(SEQIDNO：335)、T11-29(SEQIDNO：336)、T11-30(SEQIDNO：337)、T11-32(SEQIDNO：338)、T11-33(SEQIDNO：339)、T11-35(SEQIDNO：340)、T11-36(SEQIDNO：341)、T11-37(SEQIDNO：342)、T11-38(SEQIDNO：343)、T11-39(SEQIDNO：344)、T11-42(SEQIDNO：345)、T11-43(SEQIDNO：346)、T11-44(SEQIDNO：347)、T11-45(SEQIDNO：348)、T11-46(SEQIDNO：349)、T11-47(SEQIDNO：350)、T11-49(SEQIDNO：351)、T11-50(SEQIDNO：352)、T11-52(SEQIDNO：353)、T11-54(SEQIDNO：354)、T11-55(SEQIDNO：355)、T11-56(SEQIDNO：356)、T11-57(SEQIDNO：357)、T11-58(SEQIDNO：358)、T11-59(SEQIDNO：359)、T11-60(SEQIDNO：360)、T11-61(SEQIDNO：361)、T11-62(SEQIDNO：362)、T11-64(SEQIDNO：363)、T11-66(SEQIDNO：364)、T11-67(SEQIDNO：365)、T11-69(SEQIDNO：366)、T11-70(SEQIDNO：367)、T11-72(SEQIDNO：368)、T11-74(SEQIDNO：369)、T11-75(SEQIDNO：370)、T11-76(SEQIDNO：371)、T11-79(SEQIDNO：372)、T11-80(SEQIDNO：373)、T11-81(SEQIDNO：374)、T11-83(SEQIDNO：375)、T11-84(SEQIDNO：376)、T11-85(SEQIDNO：377)、T11-86(SEQIDNO：378)、T11-87(SEQIDNO：379)、T11-88(SEQIDNO：380)、T11-91(SEQIDNO：381)、T11-94(SEQIDNO：382)、T11-95(SEQIDNO：383)、T11-96(SEQIDNO：384)、T11-97(SEQIDNO：385)、T11-99(SEQIDNO：386)、T11-103(SEQIDNO：387)、T11-104(SEQIDNO：388)、T11-109(SEQIDNO：389)、T11-110(SEQIDNO：390)、T11-111(SEQIDNO：391)、T11-114(SEQIDNO：392)、T11-116(SEQIDNO：393)、T11-117(SEQIDNO：394)、T11-119(SEQIDNO：395)、T11-121(SEQIDNO：396)、T11-122(SEQIDNO：397)、T11-124(SEQIDNO：398)、T11-125(SEQIDNO：399)、T11-128(SEQIDNO：400)、T11-130(SEQIDNO：401)、T11-131(SEQIDNO：402)、T11-134(SEQIDNO：403)、E147V(SEQIDNO：552)、G164D(SEQIDNO：404)、G304V(SEQIDNO：405)、N258S(SEQIDNO：406)、T71S(SEQIDNO：407)、V184I(SEQIDNO：408)、A279D(SEQIDNO：409)、D98V(SEQIDNO：410)、M169F(SEQIDNO：411)、M169K(SEQIDNO：412)、M169L(SEQIDNO：413)、E100Q_M312K(SEQIDNO：414)、ECB11(SEQIDNO：534)、EC2A2(SEQIDNO：535)、EC2B12(SEQIDNO：536)、EGC10(SEQIDNO：537)、EGD9(SEQIDNO：538)、EGG8(SEQIDNO：539)、EHG1(SEQIDNO：540)、EHG2(SEQIDNO：541)、EHH6(SEQIDNO：520)、EHH9(SEQIDNO：521)、EHH10(SEQIDNO：522)、EHH12(SEQIDNO：523)、EKC5(SEQIDNO：546)、EKG4(SEQIDNO：547)、EJF5(SEQIDNO：548)、EJB8(SEQIDNO：549)、EJA1(SEQIDNO：550)、EJB10(SEQIDNO：551)、K9_Lucy_SH(SEQIDNO：553)、或K9JM1(SEQIDNO：192)、或其活性片段；或b)编码a)的多肽的异源多核苷酸；其中所述具有酮醇酸还原异构酶活性的异源多肽对于NADH具有小于约50的K_M。

在实施例中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在实施例中，所述酵母选自酵母细胞，所述酵母细胞是下列属的成员：酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、或毕赤酵母属。在实施例中，所述宿主细胞是酿酒酵母。

在实施例中，所述宿主细胞包含异丁醇生产途径。在实施例中，所述异丁醇生产途径包括下列底物至产物的转化：丙酮酸至乙酰乳酸；乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；2-酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异丁醇；其中多于一种、多于两种、多于三种、多于四种或所有底物至产物的转化是由与所述宿主细胞异源的酶催化的。在实施例中，所述异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化是由利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶催化的。在实施例中，宿主细胞具有降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性。在实施例中，所述宿主细胞具有降低或消除的醛脱氢酶活性。在实施例中，所述宿主细胞是酵母且具有降低或消除的丙酮酸脱羧酶活性。在实施例中，所述底物至产物的转化是由基本上位于细胞溶胶中的酶催化的。

在实施例中，与表Z中给出的序型HMM进行比较时，本文提供的多肽具有＜10^-3的E值。

本文提供了用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：a)提供本文所提供的重组宿主细胞；以及b)在其中产生异丁醇的条件下，使a)的宿主细胞与碳底物接触。在实施例中，所述接触的至少一部分发生在厌氧条件下。在实施例中，异丁醇对甘油的摩尔比大于1。

本文还提供了用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：a)提供产生异丁醇的重组宿主细胞；以及b)在其中产生异丁醇的条件下，使a)的宿主细胞与碳底物接触；其中所述接触的至少一部分发生在厌氧条件下；并且其中所产生的异丁醇对甘油的比率大于1。

本丈提供了包含异丁醇和本文所公开的重组宿主细胞的组合物。

本丈提供了多肽，其与下列包括至少约90％同一性、或至少约95％同一性、或至少约99％同一性：K9JM2(SEQIDNO：193)、K9JM3(SEQIDNO：194)、K9JM4(SEQIDNO：195)、K9JM5(SEQIDNO：196)、K9JM6(SEQIDNO：197)、K9JM7(SEQIDNO：198)、K9JM8(SEQIDNO：199)、K9JM9(SEQIDNO：200)、K9JM10(SEQIDNO：201)、K9JM11(SEQIDNO：202)、K9JM12(SEQIDNO：203)、K9JM13(SEQIDNO：204)、K9JM14(SEQIDNO：205)、K9JM15(SEQIDNO：206)、K9JM16(SEQIDNO：207)、K9JM17(SEQIDNO：208)、K9JM18(SEQIDNO：209)、K9JM19(SEQIDNO：210)、K9JM20(SEQIDNO：211)、K9JM21(SEQIDNO：212)、K9JM22(SEQIDNO：213)、K9JM23(SEQIDNO：214)、K9JM24(SEQIDNO：215)、K9JM25(SEQIDNO：216)、K9JM26(SEQIDNO：217)、K9JM27(SEQIDNO：218)、K9JM28(SEQIDNO：219)、K9JM29(SEQIDNO：220)、K9JM30(SEQIDNO：221)、K9JM31(SEQIDNO：222)、JM32(SEQIDNO：223)、JM33(SEQIDNO：224)、JM34(SEQIDNO：225)、JM35(SEQIDNO：226)、JM36(SEQIDNO：227)、JM37(SEQIDNO：228)、JM38(SEQIDNO：229)、JM39(SEQIDNO：230)、JM40(SEQIDNO：231)、JM42(SEQIDNO：232)、JM43(SEQIDNO：233)、JM44(SEQIDNO：234)、K9_DAVID_SH(SEQIDNO：236)、K9ALL3(SEQIDNO：237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)、JM41(SEQIDNO：240)、K9ALL148(SEQIDNO：241)、K9JM148(SEQIDNO：242)、K9ALL156(SEQIDNO：243)、K9JM156(SEQIDNO：244)、K9ALL191(SEQIDNO：245)、K9JM191(SEQIDNO：246)、K9ALL254(SEQIDNO：247)、K9ALL278(SEQIDNO：248)、K9ALL37(SEQIDNO：249)、K9JM37S(SEQIDNO：250)、K9ALL66(SEQIDNO：66)、K9JM66(SEQIDNO：252)、K9ALL8Q(SEQIDNO：253)、K9JM8Q(SEQIDNO：254)、K9ALL45(SEQIDNO：255)、K9_LUCY(SEQIDNO：300)、K9_ILYA(SEQIDNO：301)、K9ALL258(SEQIDNO：302)、K9YW25-T191S(SEQIDNO：303)、PLH689：：ALL3(SEQIDNO：304)、F53L(SEQIDNO：307)、F53I(SEQIDNO：308)、F53M(SEQIDNO：309)、F53V(SEQIDNO：310)、F53P(SEQIDNO：311)、F53S(SEQIDNO：312)、F53A(SEQIDNO：313)、F53E(SEQIDNO：314)、F53Q(SEQIDNO：315)、T11-1(SEQIDNO：316)、T11-2(SEQIDNO：317)、T11-3(SEQIDNO：318)、T11-4(SEQIDNO：319)、T11-5(SEQIDNO：320)、T11-6(SEQIDNO：321)、T11-7(SEQIDNO：322)、T11-10(SEQIDNO：323)、T11-12(SEQIDNO：324)、T11-13(SEQIDNO：325)、T11-14(SEQIDNO：326)、T11-15(SEQIDNO：327)、T11-16(SEQIDNO：328)、T11-18(SEQIDNO：329)、T11-19(SEQIDNO：330)、T11-21(SEQIDNO：331)、T11-22(SEQIDNO：332)、T11-25(SEQIDNO：333)、T11-27(SEQIDNO：334)、T11-28(SEQIDNO：335)、T11-29(SEQIDNO：336)、T11-30(SEQIDNO：337)、T11-32(SEQIDNO：338)、T11-33(SEQIDNO：339)、T11-35(SEQIDNO：340)、T11-36(SEQIDNO：341)、T11-37(SEQIDNO：342)、T11-38(SEQIDNO：343)、T11-39(SEQIDNO：344)、T11-42(SEQIDNO：345)、T11-43(SEQIDNO：346)、T11-44(SEQIDNO：347)、T11-45(SEQIDNO：348)、T11-46(SEQIDNO：349)、T11-47(SEQIDNO：350)、T11-49(SEQIDNO：351)、T11-50(SEQIDNO：352)、T11-52(SEQIDNO：353)、T11-54(SEQIDNO：354)、T11-55(SEQIDNO：355)、T11-56(SEQIDNO：356)、T11-57(SEQIDNO：357)、T11-58(SEQIDNO：358)、T11-59(SEQIDNO：359)、T11-60(SEQIDNO：360)、T11-61(SEQIDNO：361)、T11-62(SEQIDNO：362)、T11-64(SEQIDNO：363)、T11-66(SEQIDNO：364)、T11-67(SEQIDNO：365)、T11-69(SEQIDNO：366)、T11-70(SEQIDNO：367)、T11-72(SEQIDNO：368)、T11-74(SEQIDNO：369)、T11-75(SEQIDNO：370)、T11-76(SEQIDNO：371)、T11-79(SEQIDNO：372)、T11-80(SEQIDNO：373)、T11-81(SEQIDNO：374)、T11-83(SEQIDNO：375)、T11-84(SEQIDNO：376)、T11-85(SEQIDNO：377)、T11-86(SEQIDNO：378)、T11-87(SEQIDNO：379)、T11-88(SEQIDNO：380)、T11-91(SEQIDNO：381)、T11-94(SEQIDNO：382)、T11-95(SEQIDNO：383)、T11-96(SEQIDNO：384)、T11-97(SEQIDNO：385)、T11-99(SEQIDNO：386)、T11-103(SEQIDNO：387)、T11-104(SEQIDNO：388)、T11-109(SEQIDNO：389)、T11-110(SEQIDNO：390)、T11-111(SEQIDNO：391)、T11-114(SEQIDNO：392)、T11-116(SEQIDNO：393)、T11-117(SEQIDNO：394)、T11-119(SEQIDNO：395)、T11-121(SEQIDNO：396)、T11-122(SEQIDNO：397)、T11-124(SEQIDNO：398)、T11-125(SEQIDNO：399)、T11-128(SEQIDNO：400)、T11-130(SEQIDNO：401)、T11-131(SEQIDNO：402)、T11-134(SEQIDNO：403)、E147V(SEQIDNO：552)、G164D(SEQIDNO：404)、G304V(SEQIDNO：405)、N258S(SEQIDNO：406)、T71S(SEQIDNO：407)、V184I(SEQIDNO：408)、A279D(SEQIDNO：409)、D98V(SEQIDNO：410)、M169F(SEQIDNO：411)、M169K(SEQIDNO：412)、M169L(SEQIDNO：413)、E100Q_M312K(SEQIDNO：414)、ECB11(SEQIDNO：534)、EC2A2(SEQIDNO：535)、EC2B12(SEQIDNO：536)、EGC10(SEQIDNO：537)、EGD9(SEQIDNO：538)、EGG8(SEQIDNO：539)、EHG1(SEQIDNO：540)、EHG2(SEQIDNO：541)、EHH6(SEQIDNO：520)、EHH9(SEQIDNO：521)、EHH10(SEQIDNO：522)、EHH12(SEQIDNO：523)、EKC5(SEQIDNO：546)、EKG4(SEQIDNO：547)、EJF5(SEQIDNO：548)、EJB8(SEQIDNO：549)、EJA1(SEQIDNO：550)、EJB10(SEQIDNO：551)、K9_Lucy_SH(SEQIDNO：553)、或K9JM1(SEQIDNO：192)、或其活性片段，其中所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。本文还提供了编码此类多肽的多核苷酸。因此，本文提供了包含此类多肽的重组宿主细胞和包含此类多核苷酸的重组宿主细胞。在实施例中，重组宿主细胞还包含异丁醇生物合成途径。在实施例中，在生产异丁醇的方法中采用了此类重组宿主细胞。

本文提供了将乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸的方法，所述方法包括：a)提供本文所公开的多肽；以及b)在其中产生2，3-二羟基异戊酸的条件下，使a)的多肽与乙酰乳酸接触。

本文还提供了用于将乙酰乳酸转化成二羟基异戊酸的方法，所述方法包括提供所述多肽。本文还提供了用于将乙酰乳酸转化成二羟基异戊酸的方法，所述方法包括提供包含所提供的多肽的微生物宿主细胞；以及使所述多肽与乙酰乳酸接触，其中产生二羟基异戊酸。本文还提供了生产选自异丁醇、泛酸盐、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、3，3-苹果酸二甲酯、和2-甲基-1-丁醇的产物的方法，所述方法包括：提供本文提供的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含产物生物合成途径；以及在其中产生产物的条件下，使所述微生物宿主细胞与碳底物接触。在实施例中，所述接触的至少一部分发生在厌氧条件下。

本文提供了多核苷酸，其编码本发明的一种或多种KARI多肽或其片段。在实施例中，所述多核苷酸包含与SEQIDNO：692-806的任何之一具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％同一性的核酸序列或本文所述的任何其它序列。在实施例中，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。在实施例中，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个终止区。在实施例中，本文提供了包含本发明的一个或多个多核苷酸的重组载体。在实施例中，本文提供了包含本发明的一个或多个多核苷酸的重组宿主细胞。在实施例中，本文提供了包含本发明的一个或多个载体的重组宿主细胞。在实施例中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在实施例中，所述酵母来自下列属：酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、或毕赤酵母属。在实施例中，所述酵母是酿酒酵母。

附图说明和序列描述

通过下面的详细描述、附图和随附的序列描述可以更全面地理解本发明，这些详细描述、附图和随附的序列描述形成了本申请的一部分。

图1示出了四种不同的异丁醇生物合成途径。标记为“a”、“b”、“c”、“d”、“e”、“f”、“g”、“h”、“i”、“j”和“k”的步骤表示下文所述的底物至产物的转化。

图2示出了由指明的变体(参见实例5)产生的异丁醇(mM)的箱线图。

图3A-3B示出了从承载KARI变体的菌株发酵而成的甘油(图3A)和异丁醇(图3B)的摩尔产量。

如美国申请公布20100197519和20090163376中所述，表Z是在表A中列出的经实验验证的KARI酶的序型HMM的表。

表A：经实验验证的KARI酶。

代表了比对中多个柱的序型HMM中的11个位置(其对应于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)Pf-5KARI的11个辅因子交换位置)被鉴定为位置24、33、47、50、52、53、61、80、115、116和170。表Z与本文一同以电子方式递交并以引用方式并入本文。

与本文一同以电子方式提交的序列表中提供的序列以引用方式并入本文。与标准相符合，在本文的序列表和序列表格中给出的某些引物可用N表示核苷酸a或g或c或t；K用于表示g或t；M用于表示a或c。

具体实施方式

除非另行定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本申请(包括其定义)为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。

应当理解，参考本文所公开的多肽时“来源于”涵盖了基于所指示的生物中存在的KARI的氨基酸序列合成的序列以及直接从所述生物的遗传物质克隆的那些。

如本文所用，“工程化的多肽”是指合成的，即以某些方式不同于天然存在的多肽的多肽。

为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而能够包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外，除非另外相反指明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排它性的或。例如，下列中任一者均满足条件A或B：A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。

如本文所用，术语“由…组成”、或变型如“由…构成”或“包括”，如本说明书和权利要求通篇所使用的，表示任何所列举的整数或整数的组的涵盖，但是没有附加的整数或整数的组可被添加至所指定的方法、结构、或组合物。

如本文所用，术语“基本上由…组成”、或变型如“基本上由…构成”或“基本上包括”，如本说明书和权利要求通篇所使用的，表示任何所列举的整数或整数的组的涵盖，以及不从实质上改变所指定的方法、结构、或组合物的基本的或新的性能的任何所列举的整数或整数的组的任选的涵盖。参见M.P.E.P.§2111.03。

此外，涉及元素或组分实例(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词”一个”或”一种”旨在为非限制性的。因此，应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单个实施例，而是涵盖如申请所述的所有可能的实施例。

如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异等。术语“约”还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施例中，术语“约”指在报告数值的10％范围内，优选在报告数值的5％范围内。

如本文所用，术语“发明”或“本发明”旨在大体施用于当前的或稍后修订和补充的、或在说明书中的权利要求中所述的发明的所有实施例。

术语“异丁醇生物合成途径”是指生产异丁醇的酶途径。某些异丁醇生物合成途径在图1中示出并如本文所述。有时“异丁醇生物合成途径”与“异丁醇生产途径”同义地被使用。

包含“工程化的醇生产途径”(诸如工程化的丁醇或异丁醇生产途径)的重组宿主细胞是指包含经修饰的途径的宿主细胞，该途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不生产的醇，或提高产量或更有效地生产。

如本文所用，术语“有效异丁醇产量”是指每克细胞产生的异丁醇总克数。

本文所用术语“有效滴度”是指每升发酵培养基通过发酵生产的丁醇的总量。丁醇的总量包括：(i)发酵培养基中的丁醇量；(ii)由有机提取剂回收的丁醇量；以及(iii)如果利用汽提，由气相回收的丁醇量。

如本文所用，术语“有效速率”是指每升发酵培养基通过发酵每小时产生的丁醇的总量。

如本文所用，术语“有效收率”是指生物催化剂消耗每单位可发酵碳底物产生的丁醇的量。

术语“NAPDH消耗测定法”是指用于确定KARI酶的比活性的酶测定法，包括从酶反应测量KARI辅因子、NAPDH的消失。

“KARI”是酮醇酸还原异构酶的缩写。

当指KARI酶的各种氨基酸残基相对于NADPH的腺苷2′-磷酸酯的位置时，术语“紧邻”是指所述酶的结构的三维模型中位于与该酶结合的NADPH的腺苷2′-磷酸酯的磷原子约内的氨基酸。

术语“酮醇酸还原异构酶”(缩写为KARI)和“乙酰羟酸异构还原酶”将可互换使用，并指能够催化(S)-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的反应、被归类为EC编号EC1.1.1.86(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego)的酶。如本文所用，术语“I类酮醇酸还原异构酶”是指通常具有330至340个氨基酸残基之间的短型，不同于被称为II型的通常具有约490个残基的长型。

术语“酮醇酸还原异构酶活性”和“KARI活性”是指催化(S)-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的底物至产物的转化的能力。

术语“乙酰乳酸合酶”(“ALS”)是指催化丙酮酸至乙酰乳酸和CO₂的转化的酶。乙酰乳酸具有两种立体异构体((R)和(S))；该酶偏好由生物系统产生的(S)-异构体。已知乙酰乳酸合酶的例子为EC编号2.2.1.6(EnzymeNomenclature1992，AcademicPress，SanDiego)。这些酶可得自多种来源，包括但不限于：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(GenBankNo：CAB15618，Z99122，分别是NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(GenBankNo：AAA25079，M73842)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(GenBankNo：AAA25161，L16975)。

术语“乙酰羟酸脱水酶”或“二羟酸脱水酶”(“DHAD”)是指催化2，3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸的酶。乙酰羟酸脱水酶的例子已知为EC编号EC4.2.1.9。这些酶可得自多种微生物，包括但不限于大肠杆菌(E.coli)(GenBankNo：YP_026248，NC_000913)、酿酒酵母(S.cerevisiae)(GenBankNo：NP_012550，NC_001142)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)(GenBankNo：CAF29874，BX957219)、和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBankNo：CAB14105，Z99115)。合适的DHAD序列是本领域已知的和/或本文提供的。

术语“支链α-酮酸脱羧酶”(本文也称为酮异戊酸脱羧酶或“kivD”)是指催化α-酮异戊酸转化成异丁醛和CO₂的酶。已知支链α-酮酸脱羧酶的例子为EC编号4.1.1.72，并且得自许多来源，包括但不限于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)(GenBankNo：AAS49166，AY548760；CAG34226，AJ746364)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(GenBankNo：NP-461346，NC-003197)、和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)(GenBankNo：NP-149189，NC-001988)。

术语“支链醇脱氢酶”(本文也称为“醇脱氢酶”或“ADH”)是指催化异丁醛转化成异丁醇的酶。支链醇脱氢酶的例子已知为EC编号1.1.1.265，但是也可被归类为其它醇脱氢酶(具体地讲，EC1.1.1.1或1.1.1.2)。这些酶可利用NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和/或NADPH作为电子供体，并可得自多种来源，包括但不限于酿酒酵母(S.cerevisiae)(GenBankNo：NP-010656，NC-001136；NP-014051，NC-001145)、大肠杆菌(E.coli)(GenBankNo：NP-417484)、和丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicum)(GenBankNo：NP-349892，NC_003030)。

术语“支链酮酸脱氢酶”是指催化α-酮异戊酸转化成异丁酰-CoA(异丁酰-辅酶A)的酶。此类酶可使用NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为电子受体。支链酮酸脱氢酶的例子已知为EC编号1.2.4.4。这些支链酮酸脱氢酶包含四个亚基，并且来自所有亚基的序列可得自多种微生物，包括但不限于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(GenBankNo：CAB14336，Z99116；CAB14335，Z99116；CAB14334，Z99116；和CAB14337，Z99116)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)GenBankNo：AAA65614，M57613；AAA65615，M57613；AAA65617，M57613；和AAA65618，M57613)。

术语“碳底物”或“可发酵的碳底物”是指能够由本发明的宿主生物代谢的碳源，和尤其选自：单糖、低聚糖、多糖、和单碳底物或它们的混合物的碳源。

如本文所用，术语“比活性”是指给定量的蛋白质中的活性单位。因此，所述比活性不是直接测量的，但是通过将1)酶样品中以单位/mL表示的活性除以2)该样品中蛋白质的浓度而算出的，因此比活性表示为单位/mg。纯的、完全活性的酶样品的比活性是这种酶的特征。蛋白质混合物样品的比活性是蛋白质在该样品(其由感兴趣的活性酶构成)中的相对分数的量度。

术语“k_cat”和“K_M”是本领域技术人员已知的并且被描述于EnzymeStructureandMechanism，第2版(Ferst；W.H.FreemanPress，NY，1985；98-120页)。K_M，米氏常数，是达到最大速度一半时的底物浓度。术语“k_cat”，通常被称为“转换数”，是指每活性位点每单位时间底物分子转化成产物的最大数量，或每单位时间所述酶转换的次数。k_cat＝V_max/[E]，其中[E]是酶浓度(Ferst，同上)。如本文所用，术语“总转换”和“总转换数”是指由KARI酶和底物的反应形成的产物量。

术语“催化效率”是指酶的k_cat/K_M。催化效率用于定量酶对于底物的特异性。

术语“分离的核酸分子”、“分离的核酸片段”和“遗传构建体”将可互换地使用，并将指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：

氨基酸	三字母缩写	单字母缩写
			丙氨酸	Ala	A
精氨酸	Arg	R
			天冬酰胺	Asn	N
天冬氨酸	Asp	D
			半胱氨酸	Cys	C
谷氨酰胺	Gln	Q
			谷氨酸	Glu	E
甘氨酸	Gly	G
			组氨酸	His	H
异亮氨酸	Ile	I
			亮氨酸	Leu	L
赖氨酸	Lys	K
			甲硫氨酸	Met	M
苯丙氨酸	Phe	F
			脯氨酸	Pro	P
丝氨酸	Ser	S
			苏氨酸	Thr	T
色氨酸	Trp	W
			酪氨酸	Tyr	Y
缬氨酸	Val	V

术语“基因”指能够被表达为特定蛋白质的核酸片段，其任选包括编码序列前的调控序列(5′非编码序列)和编码序列后的调控序列(3′非编码序列)。“天然基因”指与其自身的调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”指为非天然基因的任何基因，包含天然状态下不一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源基因”指在微生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主微生物中的基因，它通过基因转移导入宿主微生物内。外来基因可以包括插入到非天然微生物内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，术语“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

术语“内源的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中处于其天然位置的天然多核苷酸或基因，或对于天然多肽，从基因组中的该位置被转录和翻译。

术语“异源的”当用于指多核苷酸、基因、或多肽时是指通常不存在于宿主生物中的多核苷酸、基因、或多肽。“异源的”也包括天然编码区、或它们的一部分，即以不同于对应的天然基因的形式重新导入源生物体，例如，不在所述生物体基因组中的天然位置上。所述异源多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式导入宿主生物体。异源基因可包括具有被重新导入天然宿主的非天然调控区的天然编码区。“转基因”是已通过转化方法被导入基因组内的基因。

术语“重组基因表达元件”是指表达一种或多种特异性蛋白质的核酸片段，包括在针对所述蛋白质的编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′终止序列)的调控序列。嵌合基因是重组基因表达元件。操纵子的编码区可以与可操作地连接的启动子和终止区一起来自重组基因表达元件。

“调控序列”是指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，其可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操作子、抑制子、转录终止信号、翻译前导序列、内含子、聚腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整个来源于天然基因、或可由来源于天然存在的不同启动子的不同元件组成、或甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员知道，不同的启动子可指导基因在不同的组织或细胞类型中、在不同的发育阶段、或响应于不同的环境或生理条件的表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时候表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。在另一方面，“诱导型启动子”导致基因在该启动子被诱导或被启动子特异性的信号或分子开启时被表达。还认识到，由于大多情况下调控序列的确切界限尚未完全限定，不同长度的DNA片段可具有相同的启动子活性。例如，应当理解“FBA1启动子”能用于指来源于FBA1基因的启动子区的片段。

如本文所用，术语“终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。这包括聚腺苷酸化识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列。聚腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片段向mRNA前体的3’端的添加。所述3’区能够影响相关联的编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。已经认识到，由于大多数情况下调控序列的确切界限尚未完全界定，不同长度的DNA片段可具有相同的终止子活性。例如，应当理解，“CYC1终止子”能够被用于指来源于CYC1基因的终止子区的片段。

术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。

如本文所用，术语“表达”指源于本发明的核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，术语“转化”是指将核酸片段转移至宿主微生物的基因组内，导致基因稳定遗传。包含转化的核酸片段的宿主微生物被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”微生物。

术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带不是细胞的中央代谢的部分的基因、并且通常处于环状双链DNA片段形式的染色体外元件。此类元件可以是线性或环状的、单链或双链DNA或RNA的、来源于任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，在其中许多核苷酸序列已被接合或组合为能够将针对所选择的基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′非翻译序列一起导入细胞中的独特构造。“转化盒”是指包含外来基因，并且在该外来基因之外还具有有利于特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外来基因，并且在该外来基因之外还具有允许或增强该基因在外来宿主中的表达的元件的特定载体。

术语“位点饱和度文库”是指包含在特定氨基酸位置包含同时用20种可能的氨基酸随机替换的文库。

术语“易错PCR”是指通过施加不完美的或“草率的”PCR反应条件添加随机拷贝错误，其在特定核苷酸序列中生成随机化的突变文库。

如本文所用，术语“密码子简并性”指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。技术人员非常了解特定宿主细胞在使用核苷酸密码子来确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，期望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

如它是指用于转化各种宿主的基因或核酸分子的编码区，术语“密码子优化的”是指在基因或核酸分子的编码区中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一个、或多于一个、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一个或多个密码子。

包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差，允许编码该基因的序列中的变型。由于每一密码子由三个核苷酸组成，而组成DNA的核苷酸限于四种特异性碱基，因此存在64种可能的核苷酸组合，其中有61种编码氨基酸(其余三种密码子编码结束翻译的信号)。本文将显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”重制为表1A。因此，许多氨基酸被分配了多于一种的密码子。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽泛范围内变化而不会改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

表1A：标准遗传密码

对于使用特定密码子来编码特定氨基酸向延伸中的肽链中的插入，许多生物表现出偏好。密码子偏好、或密码子偏好性、生物体间密码子使用的差异是遗传密码子的简并性造成的，在许多生物体中有很详细的记录。密码子偏好性常与信使RNA(mRNA)的翻译效率有关，这继而据信取决于特别是被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。选定的tRNA在细胞中的优势一般而言反映了在肽的合成中最频繁使用的密码子。因此，能够基于密码子优化对基因进行加工，以使基因在给定生物中的表达最优化。

考虑到对于多种多样的动物、植物和微生物物种存在大量的基因序列，计算密码子使用的相对频率是可能的。密码子使用表是易得的，例如在http：//www.kazusa.or.jp/codon/(2008年3月20日访问)提供的密码子使用数据库，并且这些表可以在许多方面进行调整。参见Nakamura，Y.等人，Nucl.AcidsRes.28：292(2000)。从GenBankRelease128.0[2002年2月15日]计算的酵母的密码子使用表被重制为下文的表1B。该表使用mRNA命名，因此，该表使用存在于RNA中的尿嘧啶(U)，而不是存在于DNA中的胸腺嘧啶(T)。表1B经过了调整，因此计算了每个氨基酸的频率，而非全部64个密码子。

表1B：酿酒酵母的密码子使用表

通过利用该表或类似的表，本领域的普通技术人员能够将这些频率应用于任何给定的多肽序列，并产生密码子优化的编码所述多肽的编码区的核酸片段，但其使用针对给定的物种优化的密码子。

以优化的频率随机分配密码子来编码给定的多肽序列，能够通过计算每种氨基酸的密码子频率，然后随机地为多肽序列分配密码子而人工地实现。另外，多种算法和计算机软件程序是本领域的普通技术人员易得的。例如，Lasergene包中的“EditSeq”功能(购自DNAstar，Inc.，Madison，WI)，VectorNTI套件的backtranslation功能(购自InforMax，Inc.，Bethesda，MD)，和GCG-Wisconsin包中的“backtranslate”功能(购自Accelrys，Inc.，SanDiego，CA)。此外，对密码子优化的编码区序列来说，各种资源是可公开获取的例如，http：//www.entelechon.com/bioinformatics/backtranslation.php？lang＝eng提供的“backtranslation”功能(2008年4月15日访问过)，和http：//bioinfo.pbi.nrc.ca：8090/EMBOSS/index.html提供的“backtranseq”功能(2002年7月9日访问过)。构建基本的算法来基于给定的频率分配密码子也能够由本领域的普通技术人员用基本的数学函数实现。

密码子优化的编码区也可通过本领域的技术人员已知的多个方法进行设计，包括软件包诸如“syntheticgenedesigner”(http：//phenotype.biosci.umbc.edu/codon/sgd/index.php)。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数的“多肽”以及复数的“多肽”，并指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。术语“多肽”是指任何两个或更多个氨基酸的一条或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”、或其它任何用于指由两个或更多个氨基酸组成的一条链或多条链的术语，都包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可用于替换或与这些术语中任一项互换使用。多肽可来源于天然生物源或由重组技术产生，但不一定是由指定的核酸序列翻译的。它可由任何方式生成，包括通过化学合成。

以“分离的”多肽或片段形式的变体和其衍生物意为不在其天然环境下的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽能够从它天然的(native或natural)环境中去除。据认为在宿主细胞中表达的重组多肽和蛋白质进行分离用于本发明目的，即为天然的或重组的多肽，其已通过任何合适的技术分离、分馏、或部分或基本上纯化。

如本文所用，术语“变体”和“突变体”是同义的，是指通过利用例如重组DNA技术(诸如诱变)产生的一个或多个氨基酸插入、缺失、突变、和替换，而不同于具体地列出的多肽的多肽。通过将特定多肽的序列与同源的多肽(例如酵母或细菌的)的序列进行比较，并使高度同源区(保守区)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化，或通过用共有序列代替氨基酸，可发现用以确定哪些氨基酸残基可以被替代、添加、或缺失而不会破坏所关注的活性的指导。

另选地，编码这些相同或相似的多肽的重组多核苷酸变体可以被合成，或通过利用遗传密码中的“冗余”进行选择。可将各种密码子替换诸如产生各种限制性位点的沉默改变导入，以将克隆优化到质粒或病毒载体中以供表达。多核苷酸序列的多种突变可体现在所述多肽或添加到所述多肽的其它肽的域中以改变多肽中任意部分的性质。例如，突变能用于降低或消除目标蛋白质的表达，并且包括但不限于整个基因或基因的一部分的缺失、基因中DNA片段的插入(在启动子区或编码区)，使得所述蛋白质不表达或以低水平表达；在编码区导入突变即增加终止密码子或框移，使得功能蛋白质不表达；以及在编码区导入一个或多个突变以改变氨基酸，使得表达不具备功能的或较少酶活性的蛋白质。

氨基酸“替换”可以是一个氨基酸替换为另一个具有相似结构和/或化学性质的氨基酸的结果，即，保守的氨基酸替换，或可以是一个氨基酸替换为另一个具有不同结构和/或化学性质的氨基酸的结果，即，非保守的氨基酸替换。“保守”氨基酸替换可基于所涉及的残基在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两亲性性质上的相似性进行。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；并且带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。另选地，“非保守的”氨基酸替换可以通过选择任何这些氨基酸在极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性、或两亲性性质方面的差异实现。“插入”或“缺失”可在重组蛋白质结构上或功能上耐受的变型范围之内。通过系统地利用重组DNA技术产生多肽分子中的氨基酸的插入、缺失、或替换，并检测所得重组变体的活性，可以以实验方法确定所允许的变型。

氨基酸或核苷酸序列的“基本部分”是指这样的部分，该部分包括的多肽的氨基酸序列或基因的核苷酸序列足以推定地鉴定所述多肽或基因，所述鉴定或可以由本领域技术人员通过人工评价序列来完成，或可以利用诸如BLAST(Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993))的算法通过计算机自动化的序列比对和鉴定进行。一般来讲，为了推定地鉴定多肽或核酸序列是否与已知的蛋白质或基因同源，需要有十个或更多的连续氨基酸或三十个或更多的核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个邻接核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性的基因鉴定(如DNA杂交)和基因分离(如细菌菌落或噬斑的原位杂交)的方法中。此外，12-15个碱基的短寡核苷酸可在PCR中用作扩增引物，以便获得包含该引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“基本部分”包含的序列足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。本说明书教导了编码特定蛋白质的完整氨基酸和核苷酸序列。具有如本文报道序列的益处，技术人员现在可使用全部公布序列或它们的主要部分用于本领域技术人员已知的目的。因此，本发明包括如所附的序列表中报道的完整序列，以及如上文所定义的这些序列的基本部分。

术语“互补”用于描述核苷酸碱基之间能够彼此杂交的关系。例如，就DNA而言，腺嘌呤是与胸腺嘧啶互补的而胞嘧啶是与乌嘌呤互补的，而就RNA而言，腺嘌呤是与尿嘧啶互补的，而胞嘧啶是与乌嘌呤互补的。

术语“百分比同一性”如本领域已知是指通过比较多个序列测定的、两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。本领域中“同一性”也意为多肽或多核苷酸序列之间的序列关联度，视情况而定，如由此类序列字符串的匹配来测定。“同一性”和“相似性”可容易地通过已知方法计算出来，所述的方法包括但不限于下列文献中所描述的那些：1.)ComputationalMolecularBiology(Lesk，A.M.编辑)OxfordUniversity：NY(1988)；2.)Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3.)ComputerAnalysisof SequenceData，PartI(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)Humania：NJ(1994)；4.)SequenceAnalysisinMolecularBiology(vonHeinje，G.编辑)Academic(1987)；以及5.)SequenceAnalysisPrimer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。

设计确定同一性的优选方法来给出待测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中被编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可以用LASERGENE生物信息学计算软件包(LASERGENEbioinformaticscomputingsuite(DNASTARInc.，Madison，WI))中的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对方法”进行，该方法涵盖若干个不同的算法，包括对应于称为ClustalV的比对方法的“ClustalV比对方法”(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.，8：189-191(1992))中，并且可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlign^TM程序中找到的比对方法。对于多重比对，默认值对应于GAPPENALTY＝10以及GAPLENGTHPENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、GAPPENALTY＝3、WINDOW＝5以及DIAGONALSSAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、GAPPENALTY＝5、WINDOW＝4以及DIAGONALSSAVED＝4。在使用ClustalV程序进行序列比对后，通过查看同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。另外所述“ClustalW比对方法”是可用的并对应于标记为ClustalW的比对方法(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.8：189-191(1992))和可以在LASERGENE生物信息学计算软件包(DNASTARInc.)中的MegAlign^TMv6.1程序中找到的比对方法。用于多重比对的默认参数(GAPPENALTY＝10、GAPLENGTHPENALTY＝0.2、DelayDivergenSeqs(％)＝30、DNATransitionWeight＝0.5、ProteinWeightMatrix＝Gonnet系列、DNAWeightMatrix＝IUB)。在使用ClustalW程序进行序列比对后，通过查看在同一程序中的“序列距离”表有可能获得“百分比同一性”。

本领域的技术人员非常清楚，多种程度的序列同一性可用于鉴定多肽，例如从其它物种，其中此类多肽具有相同或相似的功能或活性，或可用于描述对应的多核苷酸。有用的同一性百分比例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％、或55％至100％的任何正数百分比在描述本发明时可以是有用的，如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。适合的多核苷酸片段不仅具有上述同源性，而且通常包含具有至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、或至少250个核苷酸的多核苷酸。此外，具有上述同源性的适合的多核苷酸片段编码具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件包括但不限于：1.)GCG程序套件(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，WI)；2.)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3.)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4.)Sequencher(GeneCodesCorporation，AnnArbor，MI)；以及5.)结合Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenomeRes.，[Proc.Int.Symp.](1994)，MeetingDate1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor，Plenum：NewYork，NY)。应当理解，在本申请的上下文中使用序列分析软件进行分析时，除非另外指明，否则分析结果将基于所参考程序的“默认值”。如本文所用，“默认值”是指在首次初始化软件时软件最初加载的任何值或参数的设定。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)(下文称“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience出版(1987)。附加的方法参见MethodsinEnzymology，第194卷，GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology(PartA，2004，ChristineGuthrie和GeraldR.Fink(编辑)，ElsevierAcademicPress，SanDiego，CA)。其它的分子工具和技术是本领域已知的，包括通过重叠延伸聚合酶链反应(PCR)的接合(Yu等人(2004)FungalGenet.Biol.41：973-981)，对于酿酒酵母URA3基因座突变的阳性选择(Boeke，J.D.等人(1984)Mol.Gen.Genet.197，345-346；MARomanos等人，NucleicAcidsRes.1991年1月11日；19(1)：187)，cre-lox位点特异性重组系统以及突变型lox位点和FLP底物突变(Sauer，B.(1987)MolCellBiol7：2087-2096；Senecoff等人(1988)JournalofMolecularBiology，第201卷，第2期，第405-421页；Albert等人(1995)ThePlantJournal.第7卷，第4期，649-659页)，“无缝”基因缺失(Akada，等人(2006)Yeast；23(5)：399-405)，以及空位修复方法(Ma等人.，Genetics58：201-216；1981)。

本文提供的所述重组宿主细胞和方法满足了提升微生物生产异丁醇的需求，其中KARI酶起到至关重要的作用。在图1中示出的异丁醇生物合成途径中，KARI酶催化了乙酰乳酸至二羟基异戊酸(DHIV)的底物至产物的转化。

异丁醇的生产通常利用了宿主微生物中存在的糖酵解途径。在糖酵解期间从葡萄糖产生两分子的丙酮酸的过程中，通过3-磷酸甘油醛脱氢酶反应从NAD+净产生两分子的NADH。在另外的从两分子丙酮酸产生一分子异丁醇的过程中，通过KARI反应净消耗一分子NAD(P)H，通过异丁醇脱氢酶反应净消耗一分子NAD(P)H。在酵母中NADH与NADPH的互变通常是缓慢而低效率的；因此，待消耗的NADPH是通过代谢(例如，通过戊糖磷酸途径)、在该过程中消耗底物而生成的。同时，细胞努力保持体内平衡的NAD+/NADH比率，导致在异丁醇制备中生成的多余NADH被无用的其它代谢中间体的还原过程消耗；例如，通过从丙酮酸生成乳酸盐。因此，在产生的NADH和通过异丁醇途径消耗的NADH之间的不平衡可导致以两种方式降低从葡萄糖制备异丁醇的摩尔收率：1)非必需的代谢操作以产生NADPH，以及2)无用的代谢中间体的还原过程以维持NAD+/NADH的内平衡。

有利于生物合成途径的具有KARI活性的多肽

本文所公开了来自Anaerostipescaccae的KARI酶的多个变体。此类变体对于针对特定生产条件、优化利用KARI的生物合成途径(诸如异丁醇生物合成途径)的效率提供了另选的替代方案。在实例中展示了采用来源于Anaerostipescaccae的K9KARI酶的多个变体生产异丁醇。因此，利用本发明公开，本领域技术人员将能制备适用于一系列生产条件的、包含本发明所公开的KARI酶或其活性片段的重组宿主细胞。如此，本文提供的变体在包含KARI活性催化的底物至产物转化的其它生物合成途径中也可以是可用的。

在实施例中，本文提供的具有KARI活性的多肽在对应于SEQIDNO：93的S56和S58处包含氨基酸替换。在实施例中，本文提供的具有KARI活性的多肽在对应于SEQIDNO：93的Y53处包含氨基酸替换。在一些实施例中，对应于S56的位置处的氨基酸是A。在一些实施例中，对应于S58的位置处的氨基酸是D或E。在一些实施例中，对应于Y53的位置处的氨基酸是F、I、L、V、P、M、S、Q、E、P、或A。在一些实施例中，对应于S56的位置处的氨基酸是V或D。在一些实施例中，对应于S58的位置处的氨基酸是D或Q。

在实施例中，本文提供的多肽在对应于SEQIDNO：93的位置90或93或两者的那些位置包含氨基酸替换。在实施例中，在位置90处的氨基酸是M、L、Y或A。在实施例中，在位置93处的氨基酸是I、A、V、L或T。在实施例中，两个位置均被替换。在表3中示出了所述替换的多个例子组合。在实施例中，此类多肽具有KARI活性。

在其它实施例中，本文提供的多肽对应于SEQIDNO：93的位置90或93或94或其组合的那些位置包含氨基酸替换。在实施例中，在位置90处的所述氨基酸是K、M、或Y。在实施例中，在位置93处的所述氨基酸是A、I、T或V。在实施例中，在位置94处的所述氨基酸是I、L、M、或F。在实施例中，这些位置的组合或全部被替换掉。在表5和6中示出了所述替换的例子组合。在实施例中，此类多肽具有KARI活性。

在其它实施例中，本文提供的多肽在对应于SEQIDNO：239的A73、L167、T191、S32、V220、L243、C46、E200、E68、D14、I234、A311、F189、K42、V158、G45、P124、K42、D196、L284、P101、M132、K270、K77、P125、K136、A162、D242、F115、Q213、Y262、F292、K238、I256、C156、M94、F53、C209、S330、Q91、A210、A157、N107、K294、V56、I25、H235、I84、F189、Y254、V56、G114、E194、L211、D225、A166、L171、T218、G248、K96、V123、F53、M108、E186、D302、E58、G223、T93、G114、G151、D302、K42、K282、I283、G120、T191、Y254、V123、K126、K281、A174、V142、D168、E261、A92、M169、E274、A176、A214、I99、A210、T191、T187、L219、T187、L219、T191、G304、A105、C209、P101、A279、G120、A303、K314、I272、R181、E145、A214、T93、D127、N40、G207、E326、D295、E147、G149、V298、T273、T131、I122、D264、H118、R190、L315、D242、M312、S285、I234、L85、H140或M237的至少一个位置处包含至少一个氨基酸替换。在实施例中，本文提供的多肽包含在这些位置的至少2个、这些位置的至少3个或这些位置的至少4个的替换。表11中提供了此类替换的例子组合，以及适于在此类位置处替换的氨基酸例子。

在实施例中，多肽包含下列替换的至少一个、至少两个或至少3个：T191N、T191S、E58D、E274K、T187S、K42N、A105T、A73T、A92D、A279T、A176T、G120S、M169K、R181K或A214V。

在实施例中，多肽在对应于SEQIDNO：93的位置53的位置处包含替换，其选自L、I、M、V、P、S、A、E或Q。在实施例中，在位置53处的氨基酸是F。

在实施例中，本文提供的多肽包含下列替换或其组合中的一个：Y53F、S56A、K57E、S58E、N87P、K90A/Y、T93L、M94L、E148Q、H37N、G45C、G66A、E148G、E148Q、V156A、T191S、Y254F或K278M。在实施例中，本文提供的多肽在对应于SEQIDNO：93的位置53、56、57、58、87和90的每个位置处包含替换。在实施例中，在所述位置处的氨基酸是53F、56A、57E、58E、87P、90A/Y。在实施例中，此类多肽还包含在对应于93或94或两者的位置处的替换。在实施例中，在这些位置处的氨基酸是93L或94L。此类替换组合的例子可包括但不限于下列：

53，56，57，58，87，90，93，94
	53，56，57，58，87，90，93，94，148
53，56，57，58，87，90，93，94，37
	53，56，57，58，87，90，93，94，45
53，56，57，58，87，90，93，94，66
	53，56，57，58，87，90，93，94，148
53，56，57，58，87，90，93，94，156
	53，56，57，58，87，90，93，94，191
53，56，57，58，87，90，93，94，254
	53，56，57，58，87，90，93，94，278
53，56，57，58，87，90，94，37
	53，56，57，58，87，90，94，66
53，56，57，58，87，90，94，148
	53，56，57，58，87，90，94，156
53，56，57，58，87，90，94，191
	53，56，57，58，87，90，93
53，56，57，58，87，90，93，191
	53，56，57，58，87，90，93，94，258
53，56，57，58，87，90，94，148

此类替换组合的例子可包括但不限于：

Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，E148Q
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，H37N
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，G45C
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，G66A
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，E148G
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，V156A
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，T191S
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，Y254F
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，K278M
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90Y，M94L，H37N
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90Y，M94L，G66A
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90Y，M94L，E148Q
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90Y，M94L，V156A
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90Y，M94L，T191S
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，T191S
	Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90A，T93L，M94L，N258S
Y53F，S56A，K57E，S58E，N87P，K90Y，M94L，E148Q

在实施例中，多肽在对应于位置158、67、162、312、169或其组合的位置处包含氨基酸替换。在实施例中，在位置158处的氨基酸是T、K或W。在实施例中，在位置67处的氨基酸是L、M或Q。在实施例中，在位置162处的氨基酸是Q、P、H、R、C、N。在实施例中，在位置169处的氨基酸是Q、C、T、E或M。在实施例中，在位置312处的氨基酸是C或L。

在实施例中，多肽在对应于位置53、56、57、58、87或其组合的位置处包含氨基酸替换。在实施例中，多肽还包含在位置87、147、164、304、258、71、184、79、98、169、100、312或其组合处的替换。此类替换组合的例子可包括但不限于下列：

53，56，57，58，87
	53，56，57，58，87，147
53，56，57，58，87，164
	53，56，57，58，87，304
53，56，57，58，87，258
	53，56，57，58，87，71
53，56，57，58，87，184
	53，56，57，58，87，79

53，56，57，58，87，98
	53，56，57，58，87，169
53，56，57，58，87，169
	53，56，57，58，87，169
53，56，57，58，87，100，312

此类替换组合的例子可包括但不限于下列：

Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P
	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，E147V
Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，G164D
	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，G304V
Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，N258S
	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，T71S
Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，V184I
	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，A79D
Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，D98V
	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，M169F
Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，M169K
	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，M169L
Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，E100Q，M312K

在实施例中，具有SEQIDNO：239的KARI变体还包含替换，其选自：A73T；L167M和T191S；S32Y和V220I；L243S；C46S和E200E；E68G；D14N，I234N和A311V；F189L；K42M和V158D；G45D；P124S；K42N，D196V和L284C；P101S，M132V和K270N；K77M；P125S；K136E，A162T和D242V；F115I，Q213H和Y262N；F292I；K238M；I256T和C156V；M94L；F53L，C209S和S330Y；Q91R和A210D；A157S；N107S；F53I和K294M；V56A；I25N和H235Y；I84N和F189Y；Y254H、V56A；G114C，E194D，L211S和D225E；A166T，L171S，T218I和G248C；K96E和V123A；K96E和V123A；F53I和M108L；E186D；F53I；D302E；E58D；G223D；T93A，G114D和G151S；D302E；K42N，K282N和I283F；G120S；T191N和Y254H；V123A和K126M；K281M；A174D；V142F，D168E和E261E；A92D；M169K；E274K；A176T；A214V；I99V和A210T；T191S；T187S；L219W；G304C；A105T；C209R；P101S；A279T；G120S，A303T和K314M；I272N；R181K；E145V和A214T；T93I；D127E；N40D和T191S；G207S和E326K；D295E；E147D；G149C和V298A；T273S；T131A；I122F；D264V；H118Y和R190G；L315M；D264V；D242N；M312I；S285Y；I234M；L85M，H140Y和M237L；以及其组合。

在实施例中，具有SEQIDNO：239的KARI变体还包含替换，其选自：F53L；F53I；F53M；F53V；F53P；F53S；F53A；F53E；F53Q；Y53F，S56V，K57E，S58E和N87P；Y53L，S56V，K57E，S58E和N87P；Y53I，S56V，K57E，S58E和N87P；以及其组合。

在实施例中，具有SEQIDNO：239的KARI变体还包含替换，其选自：Y53L，S56V，K57E，S58E和N87P；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和E147V；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和G164D；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和G304V；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和N258S；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和T71S；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和V184I；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和A79D；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和D98V；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和M169F；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和M169K；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P和M169L；Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P，E100Q和M312K；以及其组合。

在实施例中，具有SEQIDNO：239的KARI变体还包含替换，其选自ECB11、EC2A2、EC2B12、K9SB2_SH、EGC10、EGG8、EGD9、EHG1、EHG2、EHH12、EHH10、EHH6、EHH9、EKC5、EKG4、EJF5、EJA1、EJB8、EJB10；以及其组合的那些。

在实施例中，本文提供的多肽包含的氨基酸序列与下列的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％同一性：K9JM2、K9JM3、K9JM4、K9JM5、K9JM6、K9JM7、K9JM8、K9JM9、K9JM10、K9JM11、K9JM12、K9JM13、K9JM14、K9JM15、K9JM16、K9JM17、K9JM18、K9JM19、K9JM20、K9JM21、K9JM22、K9JM23、K9JM24、K9JM25、K9JM26、K9JM27、K9JM28、K9JM29、K9JM30、K9JM31、JM32、JM33、JM34、JM35、JM36、JM37、JM38、JM39、JM40、JM42、JM43、JM44、K9SB2、K9_DAVID_SH、K9ALL3、K9_URSALA(K9SB2+A56V)、JM41、K9ALL148、K9JM148、K9ALL156、K9JM156、K9ALL191、K9JM191、K9ALL254、K9ALL278、K9ALL37、K9JM37S、K9ALL66、K9JM66、K9ALL8Q、K9JM8Q、K9ALL45、K9_LUCY、K9_ILYA、K9ALL258、K9YW25-T191S、PLH689：：ALL3、F53L、F53I、F53M、F53V、F53P、F53S、F53A、F53E、F53Q、T11-1、T11-2、T11-3、T11-4、T11-5、T11-6、T11-7、T11-10、T11-12、T11-13、T11-14、T11-15、T11-16、T11-18、T11-19、T11-21、T11-22、T11-25、T11-27、T11-28、T11-29、T11-30、T11-32、T11-33、T11-35、T11-36、T11-37、T11-38、T11-39、T11-42、T11-43、T11-44、T11-45、T11-46、T11-47、T11-49、T11-50、T11-52、T11-54、T11-55、T11-56、T11-57、T11-58、T11-59、T11-60、T11-61、T11-62、T11-64、T11-66、T11-67、T11-69、T11-70、T11-72、T11-74、T11-75、T11-76、T11-79、T11-80、T11-81、T11-83、T11-84、T11-85、T11-86、T11-87、T11-88、T11-91、T11-94、T11-95、T11-96、T11-97、T11-99、T11-103、T11-104、T11-109、T11-110、T11-111、T11-114、T11-116、T11-117、T11-119、T11-121、T11-122、T11-124、T11-125、T11-128、T11-130、T11-131、T11-134、E147V、G164D、G304V、N258S、T71S、V184I、A279D、D98V、M169F、M169K、M169L、E100Q_M312K、ECB11、EC2A2、EC2B12、EGC10、EGD9、EGG8、EHG1、EHG2、EHH6、EHH9、EHH10、EHH12、EKC5、EKG4、EJF5、EJB8、EJA1、EJB10、K9_Lucy_SH、或K9JM1、或其活性片段。因此，在实施例中，本文提供的多肽包含的氨基酸序列与下列的序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％同一性：K9JM36(SEQIDNO：227)、K9JM43(SEQIDNO：233)、K9JM44(SEQIDNO：234)、或K9ALL3(SEQIDNO：237)、或其活性片段。在实施例中，多肽包含K9JM36(SEQIDNO：227)、K9JM43(SEQIDNO：233)、K9JM44(SEQIDNO：234)、或K9ALL3(SEQIDNO：237)、或其活性片段的序列。

在实施例中，在诸如来源于Anaerostipescaccae的KARI酶中的多处替换降低了对于NADH的K_M。

在实施例中，所述多肽包含少于10、15或20处替换。在实施例中，基于实验验证的KARI以及在表Z中给出的具有小于＜10^-3的E值，所述多肽匹配序型HMM。可使用hmmsearch(购自JaneliaFarmResearchCampus，Ashburn，VA的HMMER软件包)将序列与表Z中给出的序型HMM进行比较。

本文还提供了编码本文提供的多肽的多核苷酸。在实施例中，本文提供的多肽包含的氨基酸序列与SEQIDNO：692-806的任何之一具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％同一性。本文还提供了包含此类多肽或多核苷酸的重组宿主细胞和包括此类重组宿主细胞的方法。

分子技术

本文使用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且描述于下列文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1989)(下文称“Maniatis”)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，ExperimentswithGeneFusions，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY(1984)；以及Ausubel，F.M.等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology，由GreenePublishingAssoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。

另外的具有KARI活性的多肽的鉴定

利用本公开，本领域技术人员将能够容易地鉴定另外合适的具有KARI活性的多肽。使用本文所公开的和本领域可获得的序列，在技术人员所熟知的文献和生物信息学数据库中能够鉴定其它多核苷酸、基因和/或多肽的序列。例如，通过用本文提供的多核苷酸或多肽序列对可公开获得的数据库的BLAST检索，能够鉴定此类序列。在此类方法中，同一性能够基于ClustalW比对方法，采用GAPPENALTY＝10，GAPLENGTHPENALTY＝0.1和Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数。

另外，本文所公开的多核苷酸或多肽序列能够用于鉴定其它天然的KARI同源物。例如，每个本文所公开的编码KARI的核酸片段能够用于分离编码同源蛋白质的基因。使用序列依赖性规程分离同源基因是本领域熟知的。序列依赖性规程的例子包括但不限于：(1)核酸杂交方法；(2)DNA和RNA扩增方法，这可通过核酸扩增技术的多种用法来举例说明[如聚合酶链反应(PCR)，Mullis等人，美国专利4,683,202；连接酶链反应(LCR)，Tabor等人，Proc.Acad.Sci.USA82：1074(1985)；或链置换扩增反应(SDA)，Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和(3)文库构建和互补筛选方法。

应当理解利用本公开，本领域的普通技术人员能够生成本文提供的多肽的活性片段，例如，通过基于在N-末端的序列比对截短本文提供的多肽并确认KARI活性。在实施例中，本文提供的AnaerostipescaccaeKARI及其变体相对于野生型序列(SEQIDNO：93)是在N末端截短的。

变体的生成

本文所述的变体可通过本领域中已知的任何方法生成。本领域中已知的用于定点诱变的方法包括，例如，(Agilent，SantaClara，CA)和(Affymetrix/USB，SantaClara，CA)。本领域中已知的用于随机点诱变的方法包括，例如，易错PCR(例如，Bloom等人，BMCBiol.2007，5：29，doi：10.1186/1741-7007-5-29.)或(Agilent，SantaClara，CA)、暴露于化学诱变剂(例如，甲磺酸乙酯)或紫外线、在PCR中使用经修饰的核苷酸(例如，Wong等人，NucleicAcidsRes.2004，32：3，e26.)、和使用特殊的致突菌株。本领域中已知的用于DNA重组或“改组”的方法包括，例如，随机片段化和重装配(例如，Stemmer1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：22，10747-10751.)、异源双链修复(例如，Volkov等人，NucleicAcidsRes.199927：18，e18.)、交错延伸(例如，Zhao等人，Nat.Biotechnol.1998，16：3，258-261.)、非配对引物改组(例如，Milano等人，美国专利7,879,582)、定点重组(例如，Hiraga等人，J.Mol.Biol.2003，330：2，287-296.)、以及合成改组(例如，Ness等人，Nat.Biotechnol.2002，20，1251-1255.)。用于蛋白质变体文库构建的其它方法包括，例如，环状变换(circularpermutation)(例如，Guntas等人，PLoSOne.2012，7(4)：e35998)、和DNA化学合成。

利用本公开，本领域的技术人员能够容易地制备和使用本文提供的变体以及具有与它们小于100％的同一性(如上文所述)的变体。可使用本文描述和展示的方法获得另外的具有KARI活性的多肽。例如，如本文所述可采用具有KARI活性的多肽构建位点饱和基因文库。用于构建此类基因文库的试剂盒可商购获得(例如，购自USBCorporation，Cleveland，OH，#78480)。也可使用可商购获得的试剂盒(例如QuickChangeIIXL定点诱变试剂盒，目录号200524，Stratagene，LaJolla，CA)进行定点诱变。用于诱变靶向位点的引物设计是本领域熟知的，并且鉴定所述靶向位点的多重序列比对同样是熟知的。

辅因子特异性

为了测定辅因子特异性，可针对在乙酰乳酸饱和状态下的每种辅因子计算V_max/K_M比率；在两种辅因子的摩尔浓度相同和乙酰乳酸饱和状态的条件下，对于NADH具有更高比率的那些变体与NADH的反应速率将比与NADPH的高。可使用本领域已知的和/或本文提供的方法测定对于NADH和NADPH的V_max和K_M值。例如，为了测定对于NADH和NADPH的V_max和K_M值，可在各种NADH和NADPH浓度下测定部分纯化的蛋白质。

KARI结构

本领域提供了在具有KARI活性的多肽的鉴定和修饰中有用的结构信息，诸如在本文所述参考文献中的以及在本文表Z中提供的序型HMM中的和在美国申请公布20100197519和20090163376所描述的。

据报道，NADPH的磷酸p2’氧原子与菠菜KARI的Arg162、Ser165和Ser167的侧链形成氢键(BiouV.，等人，TheEMBOJournal，16：3405-3415，1997)。在将其结构与菠菜KARI的进行比较后，Ahn等人(J.Mol.Biol.，328：505-515，2003)的研究已经鉴定出针对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(PAO-KARI)的三个NADPH磷酸结合位点(Arg47、Ser50和Thr52)。基于与PF5KARI具有92％氨基酸序列同源性的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1-KARI的晶体结构，建立了结合NADPH、乙酰乳酸和镁离子的PF5-KARI的结构(PDBID1NP3，AhnH.J.等人，J.Mol.Biol.，328：505-515，2003)。PAO1-KARI结构是同十二聚体，并且每个十二聚体由具有大量二聚体界面的六个同二聚体组成。KARI的活性位点位于上述二聚体界面内。生物学组件是通过六个同二聚体定位在四面体的边缘上，产生具有23点群对称性的高度对称的十二聚体而形成的。

利用DeepView/SwissPDB查看器(Guex，N.和Peitsch，M.C.，Electrophoresis，18：2714-2723，1997)，基于PAO1-KARI的单体A和单体B的坐标以及PF5-KARI的序列，建立了PF5-KARI二聚体的模型。然后将该模型在Silicon图形系统上输入程序O(Jones，T.A.等人，ActaCrystallogr.A47：110-119，1991)用于进一步修饰。

PAO1-KARI的结构在其活性位点内不具有NADPH、底物或抑制剂或镁。因此，在乙酰乳酸结合位点内具有镁离子、NADPH和抑制剂(N-羟基-N-异丙基草酰胺盐)的菠菜KARI结构(PDBIDlyve，BiouV.等人，TheEMBOJournal，16：3405-3415，1997.)被用于在活性位点内对这些分子建模。植物KARI与PF5-或PAO1KARI均具有非常小的序列同源性(＜20％氨基酸序列同一性)，然而在这两种KARI酶的活性位点区内的结构是非常相似的。为了重叠这两种KARI结构的活性位点，程序O中的命令LSQ_ext、LSQ_improve、LSQ_mol被用于排列菠菜KARI的单体A至PF5KARI模型的单体A的活性位点。提取了结合在菠菜KARI的活性位点内的NADPH、两个镁离子和抑制剂的坐标，并整合进PF5KARI的分子A。通过应用由程序计算的从单体A至单体B的转化运算符，针对PF5KARI的单体B生成了这些分子的一组坐标。

由于在PAO1KARI晶体结构的活性位点中没有NADPH，NADPH结合位点中的磷酸结合环区(PAO1KARI中的残基44-45，菠菜KARI中的残基157-170)的结构在这两者之间是非常不同的。为了对NADPH的形式建模，PF5-KARI磷酸结合环(44-55)的模型被1yve(157-170)的所替换。利用程序O中的mutate_replace命令，将这两者之间侧链的任何差异转化成PF5-KARI序列中的那些，并手动地调整了替换的侧链的构象。利用程序CNX(ACCELRYSSanDiegoCA，Burnger，A.T.和Warren，G.L.，ActaCrystallogr.，D54：905-921，1998)对整个NADPH/Mg/抑制剂结合的二聚体PF5-KARI模型进行了一轮能量最小化，然后用底物乙酰乳酸(AL)在模型中替换了抑制剂。

KARI活性

本文所述的多肽包括具有KARI活性的那些。使用本领域中描述的方法(例如，在美国专利8,129,162中，该文献以引用方式并入本文)，通过测定乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸的酶促转化，能够确认KARI活性。例如，在上述转化之后可以使用酶标仪(诸如来自MolecularDevice，Sunnyvale，Calif的)在340nm测量辅因子NADPH或NADH从反应中的消失。

KARI活性还可以通过在包含编码催化图1的步骤a、c、d、和e中给出的底物至产物转化的多肽的多核苷酸的宿主细胞中表达给定的KARI，并测量异丁醇的生产而被确认，如本文所描述和展示的(参见实例)。另选地，KARI活性可通过测量在KARI催化的底物至产物的转化的下游的生物合成途径中的中间产物的产生而被确认。同样，使用类似的策略并确认在KARI催化的底物至产物的转化的下游的生物合成途径产物或中间产物的产生，包含其它生物合成途径的底物至产物的转化的宿主细胞也能够用于确认KARI活性。

一旦生成了变体，可以很容易使用本领域已知的和/或本文所公开的方法评估带有NADH或NADPH的KARI活性。例如，可通过在340nm处测量来自反应的NADPH或NADH的消失或通过测定米氏常数(通过使用HPLC/MS测量2，3-二羟基异戊酸的形成))来测定KARI活性。

异丁醇产量的确认

异丁醇在培养基中的存在和/或浓度能够通过本领域中已知的多种方法(参见，例如，美国专利7,851,188，以引用方式并入)被测定。例如，特异性的高效液相色谱(HPLC)方法，其利用ShodexSH-1011柱和ShodexSHG保护柱(二者均可购自WatersCorporation(Milford，Mass.))，配有折射率(RI)检测。用0.01MH₂SO₄作为流动相，以0.5mL/min流速和50℃的柱温实现色谱分离。在所使用的条件下异丁醇的保留时间为46.6分钟。

另选地，气相色谱(GC)方法是可用的。例如，特异性的GC方法，其利用HP-INNOWax柱(30m×0.53mm内径，1μm膜厚度，AgilentTechnologies(Wilmington，DE))，配有火焰离子化检测器(FID)。载气为氦气，流速为4.5mL/分钟，在150℃用恒定顶压测量；注射分流比在200℃为1∶25；炉温为45℃保持1分钟，以10℃/分钟从45℃升温至220℃，并在220℃保持5分钟；并且FID检测在240℃、26mL/分钟的氦气补气条件下使用。异丁醇的保留时间为4.5分钟。

DHMB的减少

DHMB在包含异丁醇生物合成途径的宿主细胞中的产生表明并不是所述途径中的全部底物均被转化成所期望的产物。因此，收率降低了。此外，DHMB能够对产物的生产具有抑制性效应。例如，DHMB能够降低生物合成途径中的酶的活性或在发酵期间对酵母生长和/或生产能力具有其它抑制效应。因此，本文所述的方法提供了在发酵期间减少DHMB的方法。所述方法包括减少DHMB的产生的方法和从发酵组合物中除去DHMB的方法两者。

减少DHMB的产生

在本文所述的一些实施例中，重组宿主细胞能够包含降低或消除的使乙酰乳酸转化成DHMB的能力。宿主细胞使乙酰乳酸转化成DHMB的能力能够被降低或消除，例如，通过对编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的多核苷酸或基因的修饰或破坏，或对具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的修饰或破坏。在其它实施例中，所述重组宿主细胞能够在编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸或基因中或在具有乙酰乳酸还原酶活性的内源多肽中包含缺失、突变、和/或替换。此类修饰、破坏、缺失、突变、和/或替换能够导致乙酰乳酸还原酶活性被降低、基本上被消除、或被消除。在本发明的一些实施例中，所述生物合成途径的产物以与相同的产物在不包含降低或消除的使乙酰乳酸转化成DHM的能力的重组宿主细胞中的生产相比更高的收率或量被生产。在一些实施例中，乙酰乳酸至DHMB的转化在重组宿主细胞中是降低的、基本上被消除的、或被消除的。在一些实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽选自：YMR226C、YER081W、YIL074C、YBR006W、YPL275W、YOL059W、YIR036C、YPL061W、YPL088W、YCR105W、YOR375C、和YDR541C。

因此，所述产物可以为包含异丁醇的组合物，所述组合物基本上不含DHMB或不含DHMB。在一些实施例中，包含丁醇的组合物包含不超过约5mM、约4mM、约3mM、约2mM、约1mM、约0.5mM、约0.4mM、约0.3mM的DHMB、或约0.2mM的DHMB。

在本文所公开的具有对乙酰乳酸还原酶活性的所述修饰的重组宿主细胞中，涉及乙酰乳酸至不是DHMB的底物的转化的生物合成途径的任何产物能够以更高的效果被生产。此类产物包括但不限于丁醇，例如异丁醇、2-丁醇、和BDO，以及支链氨基酸。

在一些实施例中，所述宿主细胞在编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的至少一种内源多核苷酸中，包含至少一个缺失、突变、和/或替换。在一些实施例中，所述宿主细胞在编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的至少两种内源多核苷酸中的每一种中，包含至少一个缺失、突变、和/或替换。

在一些实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽能够催化乙酰乳酸至DHM的转化。在一些实施例中，具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽能够催化乙酰乳酸至2S，3S-DHMB(快DHMB)和/或2S，3R-DHMB(慢DHMB)的还原。

DHMB的去除

在其它实施例中，DHM的减少能够通过从发酵中去除DHMB实现。如此，本文还描述了具有降低的DHMB浓度的发酵。DHM的去除能够导致，例如，更高纯度的产物、或需要更少的加工来达到所期望的纯度的产物。因此，本文还提供了包含具有提高的纯度的生物合成途径的产物(诸如乙醇或丁醇)的组合物。

DHMB能够在发酵过程中或发酵过程之后被去除，并且能够通过本领域中已知的任何方法被去除。DHMB能够通过，例如被提取至有机相或反应性提取而被去除。

在一些实施例中，发酵液包含小于约0.5mM的DHMB。在一些实施例中，发酵液在约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约25小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时、或约50小时的发酵之后包含小于约1.0mM的DHMB。在一些实施例中，发酵液在约20小时、约25小时、约30小时、约35小时、约40小时、约45小时、或约50小时的发酵之后包含小于约5.0mM的DHMB。

生物合成途径

虽然本文所示的KARI变体适用于异丁醇的生产(参见实例)，据设想本文所公开的KARI可用于利用了由KARI活性催化的底物至产物的转化(诸如乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸或2-乙酰-2-羟基丁酸酯至2，3-二羟基-3-甲基戊酸酯)的任何生物合成途径中。此类途径包括但不限于用于生产泛酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或3，3-苹果酸二甲酯的途径。

在一个实施例中，包括由KARI催化的底物至产物转化的途径是包括下列底物至产物的转化的泛酸生物合成途径：

-丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸，其可被例如酮醇酸还原异构酶(KARI)催化；

-2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸，其可被例如二羟酸脱水酶(DHAD)催化；

-α-酮异戊酸至2-脱氢泛酸，其可被例如3-甲基-2-氧丁酸羟甲基转移酶(panB；其可被归类为EC2.1.2.11)催化；

-2-脱氢泛酸至(R)-泛酸，其可被例如2-脱氢泛酸2-还原酶(panE；其可被归类为EC1.1.1.169)催化

-(R)-泛酸至(R)-泛酸酯，其可被例如泛酸-β-丙氨酸连接酶(panC；其可被归类为EC6.3.2.1)催化。

在另一个实施例中，包括由KARI催化的底物至产物转化的途径是包括下列底物至产物的转化的缬氨酸生物合成途径：

-丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-α-酮异戊酸至缬氨酸，其可被例如支链氨基转移酶(ilvE(BAT)；其可被归类为EC2.6.1.42)催化。

在另一个实施例中，包括由KARI催化的底物至产物转化的途径是包括下列底物至产物的转化的异亮氨酸生物合成途径：

-丙酮酸和α-酮丁酸至2-乙酰-2-羟基丁酸酯，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-2-乙酰-2-羟基丁酸酯至2，3-二羟基-3-甲基戊酸酯，其可被例如KARI催化；

-2，3-二羟基-3-甲基戊酸酯至3-甲基-2-氧代-戊酸酯，其可被例如DHAD催化；

-3-甲基-2-氧代-戊酸酯至异亮氨酸，其可被例如支链氨基转移酶(ilvE(BAT)；其可被归类为EC2.6.1.42)催化。

在另一个实施例中，包括由KARI催化的底物至产物转化的途径是包括下列底物至产物的转化的亮氨酸生物合成途径：

-丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-α-酮异戊酸至2-异丙基苹果酸，其可被例如2-异丙基苹果酸合酶(leuA，其可被归类为EC2.3.3.13)催化；

-2-异丙基苹果酸至2-马来酸异丙酯，其可被例如3-异丙基苹果酸脱水酶(leu1；其可被归类为EC4.2.1.33)催化；

-2-马来酸异丙酯至3-异丙基苹果酸，其可被例如3-异丙基苹果酸脱水酶(leu1；其可被归类为EC4.2.1.33)催化；

-3-异丙基苹果酸至2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯，其可被例如3-异丙基苹果酸脱氢酶(leuB；其可被归类为EC1.1.1.85)催化；

-2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯至4-甲基-2-氧代戊酸酯(自发反应)；以及

-4-甲基-2-氧代戊酸酯至亮氨酸，其可被例如支链氨基转移酶(ilvE(BAT)；其可被归类为EC2.6.1.42)催化。

在另一个实施例中，包括由KARI催化的底物至产物转化的途径是包括下列底物至产物的转化的3，3-苹果酸二甲酯生物合成途径：

丙酮酸至乙酰乳酸，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-α-酮异戊酸至(R)-3，3苹果酸二甲酯，其可被例如苹果酸二甲酯脱氢酶(DMMD；其可被归类为1.1.1.84)催化。

异丁醇生物合成途径

某些合适的异丁醇生物合成途径在美国专利申请公布US20070092957中公开，该专利以引用方式并入本文。在图1中提供了所公开的异丁醇生物合成途径的图表。如以引用方式并入本文的美国专利申请公布US20070092957A1所述，在异丁醇生物合成途径例子中的步骤包括下列转化：

-丙酮酸至乙酰乳酸(参见图1，其中途径步骤a)，其可被例如乙酰乳酸合酶催化；

-乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(参见图1，其中途径步骤b)，其可被例如KARI催化；

-2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸(参见图1，其中途径步骤c)，其可被例如乙酰羟酸脱水酶，也称为二羟酸脱水酶(DHAD)催化；

-2-酮异戊酸至异丁醛(参见图1，其中途径步骤d)，其可被例如支链2-酮酸脱羧酶，也称为酮酸脱羧酶(“kivD”)催化；以及

-异丁醛至异丁醇(参见图1，其中途径步骤e)，其可被例如支链醇脱氢酶催化。

在另一个例子异丁醇生物合成途径中的步骤包括下列转化：

i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)

ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)

iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(途径步骤c)

iv)α-酮异戊酸至异丁酰-CoA(途径步骤f)

v)异丁酰-CoA至异丁醛(途径步骤g)，以及

vi)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)。

在另一个例子异丁醇生物合成途径中的步骤包括下列转化：

i)丙酮酸至乙酰乳酸(途径步骤a)

ii)乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸(途径步骤b)

iii)2，3-二羟基异戊酸至α-酮异戊酸(途径步骤c)

iv)α-酮异戊酸至缬氨酸(途径步骤h)

v)缬氨酸至异丁胺(途径步骤i)

vi)异丁胺至异丁醛(途径步骤j)，以及

vii)异丁醛至异丁醇(途径步骤e)。

可供选择的途径步骤f、g、h、i、j、和k的底物至产物转化描述于美国专利申请公布US2007/0092957A1，其以引用方式并入本文。可用于上述底物至产物转化以及那些附加的异丁醇途径的基因和多肽描述于美国专利申请公布20070092957和PCT公布WO2011/019894，上述文献均以引用方式并入本文。美国申请公布2011/019894、20070092957、20100081154描述了二羟酸脱水酶，包括来自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和变异链球菌(Streptococcusmutans)的那些。本文还提供了二羟酸脱水酶“L2V4”(氨基酸SEQIDNO：822)。酮异戊酸脱羧酶包括来源于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)(SEQIDNO：542)和格氏李斯特菌(Listeriagrayi)(SEQIDNO：543)。以引用方式并入的美国专利申请公布2009/0269823和美国申请公布20110269199描述了醇脱氢酶。醇脱氢酶包括来自木糖氧化无色杆菌(Achromobacterxylosoxidans)的SadB。另外的醇脱氢酶包括马肝ADH和印度拜叶林克菌(Beijerinkiaindica)ADH、以及利用NADH作为辅因子的那些。在一个实施例中，丁醇生物合成途径包括a)酮醇酸还原异构酶，其对于NADH具有小于约300μM、小于约100μM、小于约50μM、小于约20μM或小于约10μM的K_M；b)醇脱氢酶，其利用NADH作为辅因子；或c)a)和b)两者。

另外在以引用方式并入本文的美国专利申请公布US20070092957A1中描述了使用公开的生物合成途径构建细菌与酵母的嵌合基因和基因工程以生产异丁醇。

修饰

丙酮酸脱羧酶基因的功能性缺失已被用于提高用于生物合成产物途径中的丙酮酸的可用性。例如，美国申请公布US2007/0031950A1公开了带有一种或多种丙酮酸脱羧酶基因的破坏并且表达D-乳酸脱氢酶基因的酵母菌株，其被用于生产D-乳酸。美国申请公布US2005/0059136A1公开了没有丙酮酸脱羧酶活性的葡萄糖耐受性双碳源独立(GCSI)酵母菌株，其可具有外源乳酸脱氢酶基因。Nevoigt和Stahl(Yeast12：1331-1337(1996))描述了减少的丙酮酸脱羧酶和提高的NAD-依赖的甘油3-磷酸脱氢酶在酿酒酵母中对甘油收率的影响。美国申请公布20090305363公开了通过工程化酵母以表达细胞溶胶定位的乙酰乳酸合酶和基本上除去丙酮酸脱羧酶活性，提高丙酮酸至乙酰乳酸的转化。

可用于本文提供的细胞中的另外的修饰的例子包括降低甘油-3-磷酸脱氢酶的活性和/或破坏编码具有丙酮酸脱羧酶活性的多肽的至少一个基因或破坏编码控制丙酮酸脱羧酶基因表达的调控元件的至少一个基因的修饰，如美国专利申请公布20090305363(以引用方式并入本文)所述，对宿主细胞的修饰通过Entner-Doudoroff途径提供增加的碳通量或还原当量平衡，如美国专利申请公布20100120105(以引用方式并入本文)所述。其它修饰包括编码催化利用丙酮酸的生物合成途径中的步骤的多肽的至少一种多核苷酸的整合。其它修饰包括编码具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽的内源多核苷酸中的至少一个缺失、突变和/或替换，如提交于2012年3月23日的美国申请13/428585中所述，其以引用方式并入本文。在实施例中，所述具有乙酰乳酸还原酶活性的多肽为酿酒酵母(Saccharomycescerevisae)的YMR226C或其同源物。附加的修饰包括编码具有醛脱氢酶和/或醛氧化酶活性的多肽的内源多核苷酸中的缺失、突变、和/或替换，提交于2012年3月23日的美国申请13/428585，其以引用方式并入本文。在实施例中，所述具有醛脱氢酶活性的多肽为来自酿酒酵母的ALD6或其同源物。在其中该酵母生产的宿主细胞是pdc-的具有降低葡萄糖抑制的效应的基因修饰，其描述于美国申请公布US20110124060。

WIPO公布WO/2001/103300公开了重组宿主细胞，其包含(a)至少一种编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的异源多核苷酸；和(b)(i)在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源基因中的至少一个缺失、突变、和/或替换；和/或(ii)编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源多核苷酸。在实施例中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽是由AFT1、AFT2、FRA2、GRX3或CCC1编码的。在实施例中，影响Fe-S簇生物合成的多肽是组成型突变体AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、或AFT1C293F。

另外，宿主细胞可包含编码具有磷酸转酮酶活性的多肽的异源多核苷酸和/或编码具有磷酸转乙酰酶活性的多肽的异源多核苷酸。

用于异丁醇生产的微生物宿主

用于异丁醇生产的微生物宿主可选自细菌、蓝细菌、丝状真菌和酵母。用于生产异丁醇的微生物宿主将是异丁醇耐受性的，使得收率不受丁醇毒性的限制。在高滴度异丁醇水平下具有代谢活性的微生物是本领域所未知的。尽管已从产溶剂梭菌(solventogenicClostridia)中分离了丁醇耐受性突变体，但有关其它潜在可用的细菌菌株的丁醇耐受性方面的信息几乎没有。关于细菌中醇耐受性的比较的大部分研究表明，丁醇的毒性大于乙醇(deCavalho等人，Microsc.Res.Tech.，64：215-22，2004)和(Kabelitz等人，FEMSMicrobiol.Lett.，220：223-227，2003，Tomas等人，J.Bacteriol.，186：2006-2018，2004)报导称在丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)中发酵期间的1-丁醇收率可受1-丁醇毒性限制。1-丁醇对丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的主要影响是破坏膜功能(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.，50：1238-1243，1985)。

选择用于生产异丁醇的微生物宿主应该是异丁醇耐受性的，并应能将碳水化合物转化成异丁醇。选择合适微生物宿主的标准包括如下：对异丁醇的固有耐受性、对葡萄糖的高利用率、用于基因操纵的遗传工具的可用性、以及生成稳定的染色体改变的能力。

具有异丁醇耐受性的合适宿主菌株可通过基于菌株的固有耐受性进行的筛选而被鉴定。微生物对异丁醇的固有耐受性可以通过测定在基本培养基中生长时造成生长率50％抑制的异丁醇浓度(IC50)来测量。IC50值可以利用本领域已知的方法来测定。例如，可让所关注的微生物在多种量的异丁醇存在下生长，并且通过测量在600纳米处的光密度来监测生长速率。倍增时间可以从生长曲线的对数部分计算并用作生长率的量度。产生50％生长抑制的异丁醇的浓度可以从生长抑制百分比对异丁醇浓度的图表来确定。优选地，所述宿主菌株对于异丁醇的IC50将高于约0.5％。

用于异丁醇生产的微生物宿主还应以高速率利用葡萄糖。大多数微生物能够代谢碳水化合物。然而，某些环境微生物不能高效代谢碳水化合物，因此它们将不是合适的宿主。

从基因方面修饰宿主的能力对任何重组微生物的产生来说十分关键。基因转移技术的模式可以是电穿孔、接合、转导或天然转化。可利用广泛的宿主接合型质粒和药物抗性标记。基于可在宿主中起作用的抗生素抗性标记的性质，针对该宿主微生物来定制克隆载体。

还必须操纵微生物宿主以通过缺失多种基因而使竞争碳流的途径失活。这就需要转座子或染色体整合载体的可用性以引导失活。另外，生产宿主应能经受化学诱变以使得能得到改善异丁醇固有耐受性的突变体。

基于上述标准，用于生产异丁醇的合适的微生物宿主包括但不限于下列属的成员：梭菌属(Clostridium)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、弧菌属(Vibrio)、乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、和酵母属(Saccharomyces)。合适的宿主包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)、红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcusgallinarium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。在一些实施例中，所述宿主细胞是酿酒酵母。酿酒酵母酵母为本领域所已知并可购自多种来源，包括但不限于美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)、CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心、LeSaffre、GertStrandAB、FermSolutions、NorthAmericanBioproducts、Martrex和Lallemand。酿酒酵母包括但不限于BY4741、CEN.PK113-7D、Ethanol酵母、FermPro^TM酵母、XR酵母、GertStrandPrestigeBatchTurboalcohol酵母、GertStrandPotDistillers酵母、GertStrandDistillersTurbo酵母、FerMax^TMGreen酵母、FerMax^TMGold酵母、酵母、BG-1、PE-2、CAT-1、CBS7959、CBS7960和CBS7961。

生产宿主的构建

可以使用本领域熟知的技术来构建含有必需基因的重组微生物，所述必需基因将编码用于将可发酵碳底物转化成异丁醇的酶途径。如上所述，在本发明中，编码本发明的异丁醇生物合成途径中的一个的酶的基因能够从多种来源分离，所述酶例如乙酰乳酸合酶、乙酰羟酸还原异构酶、乙酰羟酸脱水酶、支链α-酮酸脱羧酶、和支链醇脱氢酶。

从细菌基因组中获得所需基因的方法是分子生物学领域中常用并且为人所熟知的。例如，如果基因的序列已知，则可以通过限制性内切酶消化来产生合适的基因组文库并且可以用与所需基因序列互补的探针来筛选。一旦分离了序列之后，即可以用标准的引物引导的扩增方法诸如聚合酶链反应(美国专利4,683,202)来扩增DNA，以获得适于使用合适载体转化的量的DNA。用于优化密码子以在异源宿主细胞内表达的工具很容易得到。一些密码子优化工具可基于宿主微生物的GC含量获得。

一旦鉴定并分离了相关途径的基因之后，即可将它们通过本领域中已知的方法转化到合适的表达宿主内。用于转化多种宿主细胞的载体或盒是常见的，并且可从以下公司商购获得：如(Madison，WI)、InvitrogenCorp.(Carlsbad，CA)、Stratagene(LaJolla，CA)和NewEnglandBiolabs，Inc.(Beverly，MA)。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区和控制转录终止的DNA片段3′区。两种控制区均可来源于与所转化的宿主细胞同源的基因，尽管应当理解，此类控制区还能够来源于对被选择作为生产宿主的具体物种而言非天然的基因。

可用于驱动相关途径编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有许多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上，任何能够驱动这些遗传因子(包括在实例中使用的那些)的启动子均适用于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(可用于在酵母属中表达)；AOX1(可用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、ara、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac、和trc(用于在大肠杆菌、产碱杆菌属、和假单胞菌属中表达)以及amy、apr、npr启动子和用于在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、和浸麻类芽孢杆菌中表达的多种噬菌体启动子。就酵母重组宿主细胞而言，多种启动子能够被用于构建基因的表达盒，包括但不限于下列适用于酵母中的组成型启动子：FBA1、TDH3(GPD)、ADH1、GPM1和ILV5；和下列适用于酵母中的诱导型启动子：GAL1、GAL10、OLE1、和CUP1。其它酵母启动子包括杂合启动子UAS(PGK1)-FBA1p、UAS(PGK1)-ENO2p、UAS(FBA1)-PDC1p)、UAS(PGK1)-PDC1p、和UAS(PGK)-OLE1p，它们描述于2012年3月23日提交的美国申请13/428585，所述专利以引用方式并入本文。

终止控制区也可以来源于对优选宿主天然的多种基因。任选地，终止位点可以是非必需，然而，如果包括是最优选的。

某些载体能够在广泛的宿主细菌中复制并可通过接合进行转移。可利用完全并注解的序列pRK404和三个相关载体-pRK437、pRK442和pRK442(H)。这些衍生物已被证明是在革兰氏阴性菌中进行遗传操纵的有用工具(Scott等人，Plasmid，50：74-79，2003)。广宿主范围的IncP4质粒RSF1010的若干质粒衍生物也可获得，其具有在一系列革兰氏阴性菌中发挥功能的启动子。质粒pAYC36和pAYC37具有连同多个克隆位点一起的活性启动子，使得在革兰氏阴性菌中的异源基因能够表达。

染色体基因置换工具也可广泛获得。例如，广宿主范围的复制子pWV101的热敏性变体已被修饰，以构建可用于在一系列革兰氏阳性菌内实现基因置换的质粒pVE6002(Maguin等人，J.Bacteriol.，174：5633-5638，1992)。此外，体外转座体可得自商业来源(诸如)，用以在各种基因组中产生随机突变。

异丁醇生物合成途径在多种微生物宿主中的表达更详细地描述于下文中。

异丁醇生物合成途径在大肠杆菌(E.coli)中的表达

可用于转化大肠杆菌(E.coli)的载体或盒是常见的并且可以从上文所列公司商购获得。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多种来源分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进大肠杆菌(E.coli)NM522中。

异丁醇生物合成途径在红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)中的表达

一系列大肠杆菌(E.coli)-红球菌(Rhodococcus)穿梭载体可用于在红平红球菌(R.erythropolis)中表达，所述穿梭载体包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，62：61-68，2003)。另外，一系列启动子可用于异源基因在红平红球菌(R.erythropolis)中表达(Nakashima等人，Appl.Environ.Microbiol.，70：5557-5568，2004和Tao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，68：346-354，2005)。红平红球菌(R.erythropolis)染色体基因中的靶向基因破坏可以利用Tao等人(同上)和Brans等人(Appl.Environ.Microbiol.，66：2029-2036，2000)描述的方法创建。

首先可以将如上文所述的产生异丁醇所需的异源基因克隆至pDA71或pRhBR71内，并转化进大肠杆菌(E.coli)中。然后，可以通过电穿孔将载体转化进红平红球菌(R.erythropolis)中，如Kostichka等人(同上)所述。所述重组体可在含有葡萄糖的合成培养基中生长，并随后可利用本领域已知的方法来产生异丁醇。

异丁醇生物合成途径在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的表达

枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中基因表达及突变产生的方法也是本领域所熟知的。例如，异丁醇生物合成途径的基因可从多种来源被分离、克隆到经修饰的pUC19载体中并转化进枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BE1010中。另外，可将异丁醇生物合成途径的五个基因分离成两个操纵子用于表达。可将该途径的三个基因(bubB、ilvD和kivD)整合进枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BE1010的染色体中(Payne等人，J.Bacteriol.，173，2278-2282，1991)。可将剩余的两个基因(ilvC和bdhB)克隆到表达载体中并转化进携带整合的异丁醇基因的芽孢杆菌菌株中。

异丁醇生物合成途径在地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)中的表达

在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中复制的大多数质粒和穿梭载体可用于通过原生质体转化或电穿孔来转化地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)。异丁醇的生产所需的基因能够被克隆进质粒pBE20或pBE60衍生物中(Nagarajan等人，Gene，114：121-126，1992)。转化地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的方法是本领域已知的(Fleming等人，Appl.Environ.Microbiol.，61：3775-3780，1995)。所构建的用于在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中表达的质粒可以被转化进地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)中以制备可生产异丁醇的重组微生物宿主。

异丁醇生物合成途径在浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)中的表达

可按照上面关于在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中表达的描述来构建质粒，并通过原生质体转化法将该质粒用于转化浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillusmacerans)，以制备可生产异丁醇的重组微生物宿主。

异丁醇生物合成途径在真养产碱杆菌(罗尔斯通菌(Ralstonia) (Alcaligeneseutrophus)中的表达

用于在真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)中进行基因表达和产生突变的方法是本领域内已知的(Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.，60：3585-3591，1994)。可以将用于异丁醇生物合成途径的基因克隆进上述任何广宿主范围载体中的任何一个中，并通过电穿孔以生成生产异丁醇的重组体。产碱杆菌属(Alcaligenes)中的聚羟基丁酸酯途径已被详细描述，多种修饰真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)基因组的遗传技术是已知的，并且这些工具可以应用于工程化异丁醇生物合成途径。

异丁醇生物合成途径在恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中的表达

用于在恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)中进行基因表达方法是本领域内已知的(参见例如Ben-Bassat等人，美国专利6,586,229，该文献以引用方式并入本文)。可将丁醇途径基因插入至pPCU18中，将该连接好的DNA电转化进电感受态的恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)DOT-T1C5aAR1细胞以制备生产异丁醇的重组子。

异丁醇生物合成途径在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达

用于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中基因表达的方法是本领域已知的(例如，MethodsinEnzymology，第194卷，GuidetoYeastGenetics andMolecularandCellBiology，PartA，2004，ChristineGuthrie和GeraldR.Fink编辑，ElsevierAcademicPress，SanDiego，CA)。酵母中的基因表达通常需要在受关注的基因前的启动子和转录终止子。多种酵母启动子，包括本文的实例中所使用的那些，能够被用于构建用于编码异丁醇生物合成途径的基因的表达盒，包括但不限于组成型启动子FBA、GPD、ADH1、和GPM，以及诱导型启动子GAL1、GAL10、和CUP1。合适的转录终止子包括但不限于FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、GAL1t、CYC1、和ADH1。例如，合适的启动子、转录终止子、和异丁醇生物合成途径的基因能够被克隆进大肠杆菌(E.coli)-酵母穿梭载体，并转化进酵母细胞，如美国申请公布20100129886中所述。这些载体允许菌株在大肠杆菌和酵母菌株中繁殖。通常，载体包含选择性标记和在所期望的宿主中允许自主复制或染色体整合的序列。在酵母中通常使用的质粒是穿梭载体pRS423、pRS424、pRS425和pRS426(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，它们包含大肠杆菌(E.coli)复制起点(例如，pMB1)、酵母2μ复制起点，以及用于营养选择的标记。用于这四种载体的选择性标记是HIS3(载体pRS423)、TRP1(载体pRS424)、LEU2(载体pRS425)和URA3(载体pRS426)。具有编码所关注的多肽的基因的表达载体的构建，能够通过标准分子克隆技术在大肠杆菌(E.coli)中或通过缺口修复重组方法在酵母中进行。

缺口修复克隆方法利用了酵母中高效的同源重组。通常，酵母载体DNA被消化(例如，在其多克隆位点)，以在其序列中产生“缺口”。生成了多个所关注的插入DNA，所述插入DNA在5和3端包含≥21bp的序列，这些序列彼此依次重叠，并且与载体DNA的5’和3’末端重叠。例如，为了构建用于“基因X”的酵母表达载体，选择了酵母启动子和酵母终止子用于表达盒。从酵母基因组DNA扩增了上述启动子和终止子，从基因X的来源生物PCR扩增了基因X或从包含基因X序列的克隆载体获得了基因X。在线性化载体的5’端和启动子序列之间、启动子和基因X之间、基因X和终止子序列之间、以及终止子和线性化载体的3’端之间，有至少21bp的重叠序列。然后，带“缺口”的载体和插入DNA被共转化入酵母菌株，并在包含适当化合物混合物的培养基上铺板，所述混合物允许质粒上营养选择标记的互补作用。正确的插入组合的存在能够使用从经选择的细胞制备的质粒DNA通过PCR作图确认。然后可将从酵母分离的质粒DNA(通常浓度较低)转化到大肠杆菌菌株中，例如TOP10，然后通过小量抽提和限制性作图以进一步验证所述质粒构建体。最后，能够通过序列分析验证构建体。

与缺口修复技术一样，向酵母基因组中的整合同样利用了酵母中的同源重组系统。通常，利用高保真度DNA聚合酶和引物，包含编码区加上控制元件(启动子和终止子)和营养缺陷型标记的盒被PCR扩增，其中所述引物与所述盒杂交，并且包含与期望插入发生的基因组区的5’和3’区同源的40-70个碱基对的序列。然后，PCR产物被转入酵母，并在包含适当化合物混合物的培养基上铺板，所述混合物允许对整合的营养缺陷型标记的选择。例如，为整合“基因X”到染色体位置“Y”中，所述启动子-编码区X-终止子构建体是由质粒DNA构建体聚合酶链反应扩增的，并通过SOE聚合酶链反应或一般的限制性消化和克隆接合到营养缺陷型标记(如URA3)。使用包含与酵母染色体上位置“Y”的5′和3′区同源的40-70bp的引物序列，PCR扩增了包含启动子-编码区X-终止子-URA3区的完整的盒。PCR产物被转入酵母，并在缺少尿嘧啶的生长培养基上进行选择。通过菌落PCR或通过对染色体DNA的直接测序能够验证转化子。

异丁醇生物合成途径在植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)中的表达

乳杆菌属(Lactobacillus)属于乳杆菌科(Lactobacillales)，并且用于转化枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和链球菌属(Streptococcus)的许多质粒及载体可用于转化乳杆菌属(Lactobacillus)。合适载体的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene183：175-182，1996)；和(O’Sullivan等人，Gene，137：227-231，1993)；pMBB1和pHW800，pMBB1的衍生物(Wyckoff等人，Appl.Environ.Microbiol.，62：1481-1486，1996)；pMG1，接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.，184：5800-5804，2002)；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：4581-4584，1997)；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.，67：1262-1267，2001)；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.，38：1899-1903，1994)。若干来源于植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的质粒也已被报道(vanKranenburgR.等人，Appl.Environ.Microbiol.，71：1223-1230，2005)。

异丁醇生物合成途径在多种肠球菌属(Enterococcus)菌种(屎肠球菌 (E.faecium)、鹑鸡肠球菌(E.gallinarium)、和粪肠球菌(E. faecalis))中的表达

肠球菌属(Enterococcus)属于乳杆菌科(Lactobacillales)，上述用于转化乳酸杆菌(Lactobacilli)、杆菌(Bacilli)和链球菌(Streptococci)菌种的多种质粒和载体可用于肠球菌属(Enterococcus)菌种。合适载体的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene，183：175-182，1996)；和(O’Sullivan等人，Gene，137：227-231，1993)；pMBB1和pHW800，pMBB1的衍生物(Wyckoff等人，Appl.Environ.Microbiol.，62：1481-1486，1996)；pMG1，接合质粒(Tanimoto等人，J.Bacteriol.，184：5800-5804，2002)；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.，63：4581-4584，1997)；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.，67：1262-1267，2001)；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.AgentsChemother.，38：，1899-1903，1994)。还可以使用采用来自乳球菌属(Lactococcus)的nisA基因的用于粪肠球菌(E.faecalis)的表达载体(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.，64：2763-2769，1998)。另外，可以使用用于在屎肠球菌(E.faecium)染色体中进行基因置换的载体(Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.，72：334-345，2006)。

发酵培养基

本发明中的发酵培养基必须含有合适的碳底物。合适的底物可包括但不限于：单糖，诸如葡萄糖和果糖；低聚糖，诸如乳糖或蔗糖；多糖，诸如淀粉、纤维素或它们的混合物；以及来自可再生原料的未纯化混合物，诸如干酪乳清渗透物、玉米浆、糖用甜菜糖蜜及大麦麦芽。此外，碳底物还可以是其向关键生物化学中间体的转化已被证明的一碳底物如二氧化碳、或甲醇。除一和二碳底物之外，甲基营养微生物还已知利用多种其它包含碳的化合物诸如甲胺、葡糖胺和多种氨基酸用于代谢活动。例如，甲基营养酵母已知可利用来自甲胺的碳来形成海藻糖或甘油(Bellion等人，Microb.GrowthC1Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32.(编辑)：Murrell，J.Collin；Kelly，DonP.Publisher：Intercept，Andover，UK)。相似地，假丝酵母属的多种菌种将会代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.，153：485-489，1990)。因此，预期本发明中所利用的碳源可涵盖各种含碳底物并将仅受限于微生物的选择。

尽管预期以上提及的所有碳底物及它们的混合物均适用于本发明，优选的碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖。

除了合适的碳源外，发酵培养基还必须含有本领域的技术人员已知的适于培养物生长并促进生产异丁醇所必需的酶途径的矿物质、盐、辅因子、缓冲液及其它组分。

培养条件

通常，细胞在约25℃至约40℃范围的温度在适当的培养基中生长。在本发明中合适的生长培养基是普通的市售制备的培养基，例如LuriaBertani(LB)肉汤、沙氏葡糖(SD)肉汤(SabouraudDextrose(SD)broth)或酵母培养基(YM)肉汤。其它限定或合成生长培养基也可被使用，并且适合特定微生物的生长的培养基将是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。已知可以直接或间接调节分解代谢物阻遏的试剂，如环腺苷2′，3′-单磷酸(cAMP)，也可以掺入发酵培养基中。

适于发酵的pH范围是介于pH5.0至pH9.0之间，其中pH6.0至pH8.0优选作为起始条件。

发酵可在有氧或厌氧条件下进行，其中厌氧或微氧条件是优选的。

工业分批和连续发酵

本方法采用分批发酵方法。经典的分批发酵是封闭系统，在其中培养基的组成在发酵开始时被设定，并且在发酵过程中不受人工改变。因此，在发酵开始时，用期望的一种或多种微生物对培养基进行接种，在不向系统添加任何物质的情况下进行发酵。然而，通常来说，“分批”发酵是指碳源的添加是分批的，但经常试图控制诸如pH和氧浓度之类的因素。在分批系统中，系统的代谢产物和生物质组成持续改变直至发酵结束时。在分批培养物内，细胞缓慢通过静态延滞期到达高速生长对数期，并最后达到稳定期，此时生长速率减缓或终止。如果不加以处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，对数期中的细胞负责产生大部分终产物或中间产物。

标准的分批系统的变型是补料-分批系统。补料-分批发酵方法也适用于本发明，并且包括典型的分批系统，不同之处在于底物随着发酵过程递增地被添加。在分解代谢物阻遏往往抑制细胞的代谢作用以及其中期望培养基中具有有限量的底物时，补料分批系统是可用的。补料分批系统中的实际底物浓度难于测量并因而可根据一些可测量因素例如pH、溶解氧以及废气如CO₂的分压进行评估。分批发酵和补料-分批发酵在本领域内是常用的且众所周知，并且例子可见于如下文献：ThomasD.Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA或Deshpande，Mukund(Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227，1992)，它们以引用方式并入本文。

尽管本发明是以分批模式进行，但预期该方法将可适用于连续发酵方法。连续发酵是一种开放系统，其中将设定好的发酵培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续发酵一般而言使培养物维持在恒定的高密度，其中细胞主要处于对数期生长。

连续发酵允许调节一种因素或任意数目的因素，这些因素影响细胞生长或终产物浓度。例如，一种方法将维持限制性营养物质诸如碳源或氮水平处于固定速率并允许所有其它参数适度。在其它系统中，影响生长的多个因素可连续改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统力求维持稳态的生长条件，并因而在发酵过程中由于培养基被取出而导致的细胞损失必须与细胞的生长率保持平衡。调节用于连续发酵的营养物质和生长因子的方法以及使产物形成的速率最大化的技术是工业微生物学领域为人们所熟知的，Brock详述了多种方法(同上)。

预期可采用分批发酵、补料分批发酵或连续发酵工艺来实施本发明，并且任何已知的发酵模式均将适用。此外，预期细胞可作为全细胞催化剂被固定在基质上，并经受发酵条件以生产异丁醇。

从发酵培养基分离异丁醇的方法

对于ABE发酵使用本领域已知方法，生物生产的异丁醇可从发酵培养基中分离出来(参见例如，Durre，Appl.Microbiol.Biotechnol.49：639-648(1998)，Groot等人，Process.Biochem.27：61-75(1992)，以及其中的参考文献)。例如，可通过离心、过滤、滗析等从发酵培养基移除固体。然后，可使用诸如蒸馏、共沸蒸馏、液-液提取、吸附、汽提、膜蒸发、或全蒸发的方法从发酵培养基分离异丁醇。

由于异丁醇与水形成低沸点的共沸混合物，蒸馏能够被用于分离混合物至其共沸组合物。蒸馏可结合其它分离方法被使用，以获得共沸物附近的分离。可结合蒸馏被用于分离和纯化丁醇的方法包括但不限于滗析、液-液提取、吸附、和基于膜的技术。另外，使用夹带剂的共沸蒸馏可以分离丁醇(参见例如，Doherty和Malone，ConceptualDesignofDistillationSystems，McGrawHill，NewYork，2001)。

丁醇-水混合物形成非均相共沸物，使得蒸馏可结合滗析被用于分离和纯化异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵培养基被蒸馏至接近共沸组合物。然后，浓缩共沸混合物，通过滗析从发酵培养基分离异丁醇。滗出的水相可作为回流返回至第一蒸馏塔。富含异丁醇的滗出有机相可通过在第二蒸馏塔中蒸馏被进一步纯化。

异丁醇还能够利用液-液提取结合蒸馏被从发酵培养基分离。在该方法中，利用使用适当溶剂的液-液提取从发酵液提取异丁醇。然后，包含异丁醇的有机相被蒸馏，以从溶剂分离丁醇。

蒸馏结合吸附也能够被用于从发酵培养基分离异丁醇。在该方法中，包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组合物，然后通过使用吸附剂诸如分子筛(Aden等人，LignocellulosicBiomasstoEthanolProcessDesignandEconomicsUtilizingCo-CurrentDiluteAcidPrehydrolysisandEnzymaticHydrolysisforCornStover，报告NREL/TP-510-32438，NationalRenewableEnergyLaboratory，2002年6月)除去残留的水分。

此外，蒸馏结合全蒸发可被用于从发酵培养基分离和纯化异丁醇。在该方法中，将包含异丁醇的发酵液蒸馏至接近共沸组合物，然后通过亲水性膜利用全蒸发来除去剩余的水(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。

原位产物移除(ISPR)(也称为提取发酵)可用于从生产其的发酵容器中移除丁醇(或其它发酵性醇)，从而使微生物以高收率生产丁醇。本领域已经描述过的一种用于移除发酵性醇的ISPR方法是液-液提取。概括地讲，就丁醇发酵而言，例如，使包括微生物的发酵培养基在丁醇浓度达到毒性水平之前的时间与有机提取剂接触。所述有机提取剂和所述发酵培养基形成两相混合物。所述丁醇分配至有机提取剂相，降低了在包含微生物的水相中的浓度，从而限制了微生物在抑制性的丁醇中的暴露。

可进行液-液提取例如按照美国专利申请公布2009/0305370中所述的方法进行，其公开内容全文以并入本文。美国专利申请公布2009/0305370描述了生产丁醇和采用液-液提取从发酵液中回收丁醇的方法，所述方法包括以下步骤：使发酵液与水不混溶的提取剂接触，以形成包含水相和有机相的两相混合物。通常，提取剂能够是有机提取剂，其选自饱和的、单不饱和的、多不饱和的(以及它们的混合物)C₁₂-C₂₂脂肪醇、C₁₂-C₂₂脂肪酸、C₁₂-C₂₂脂肪酸的酯、C₁₂-C₂₂脂肪醛、以及它们的混合物。用于ISPR的提取剂能够是非醇提取剂。ISPR提取剂能够是外源的有机提取剂如油醇、二十二醇、鲸蜡醇、月桂醇、肉豆蔻醇、硬脂醇、1-十一烷醇、油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、肉豆蔻酸甲酯、油酸甲酯、十一烷醛、月桂醛、20-甲基十一烷醛、以及它们的混合物。

在一些实施例中，通过使发酵培养基中的醇与有机酸(例如，脂肪酸)和能够使所述醇与所述有机酸酯化的催化剂接触能够形成醇。在此类实施例中，所述有机酸能够作为所述醇酯被分配至其中的ISPR提取剂。有机酸能够被补充至发酵容器和/或来源于被提供至发酵容器的补充碳的生物质。原料中存在的脂质能够被催化水解为有机酸，并且相同的催化剂(例如，酶)能够使有机酸与醇酯化。催化剂能够在发酵之前被提供至原料，或能够在原料的提供之前或与其同时地被提供至发酵容器。当催化剂被提供至发酵容器时，通过脂质向有机酸的水解和有机酸与发酵容器中存在的丁醇基本上同时的酯化作用，能够获得醇酯。并非来源于原料的有机酸和/或天然油也能够被进料至发酵容器，而天然油被水解为有机酸。任何不与所述醇酯化的有机酸能够作为ISPR提取剂的部分。包含醇酯的提取剂能够被从发酵培养基分离，并且能够从提取剂回收醇。提取剂能够被再循环至发酵容器。如此，就丁醇生产的情况而言，例如，丁醇至酯的转化降低了发酵培养基中的游离丁醇浓度，保护了微生物免受提高的丁醇浓度的毒性影响。此外，未分级的谷物能够被用作原料而没有分离其中的脂质，因为脂质能够被催化水解为有机酸，从而降低了脂质在ISPR提取剂中积累的速率。

原位产物移除能够在分批模式或连续模式中进行。在连续模式的原位产物移除中，产物被连续地从反应器中移出。在分批模式的原位产物移除中，一定体积的有机提取剂被添加至发酵容器，并且提取剂在过程中不被移出。对于原位产物移除，有机提取剂能够在发酵开始时与发酵培养基接触，形成两相的发酵培养基。另选地，有机提取剂能够在微生物已达到所期望的生长的量(这能够通过测量培养物的光密度确定)之后与发酵培养基接触。另外，有机提取剂能够在发酵培养基中的产物醇水平达到预先选定的水平时与发酵培养基接触。就根据本发明的一些实施例的丁醇生产的情况而言，有机酸提取剂能够在丁醇浓度达到毒性水平之前的时间与发酵培养基接触，使得丁醇与有机酸酯化以产生丁醇酯，并从而降低发酵容器中的丁醇浓度。然后，包含酯的有机相能够在达到所期望的丁醇酯有效滴度之后被从发酵容器移出(并从组成水相的发酵液分离)。在一些实施例中，包含酯的有机相在发酵容器中可用的可发酵糖的发酵基本上完成之后被从水相分离。

异丁醇的生产

如本文所描述和展示，申请人已经发现适合在异丁醇生产途径中使用的KARI酶变体。

在实施例中，采用此类变体的异丁醇生产可提供减小的甘油积累。在实施例中，对于上述具有KARI活性的多肽的变体(其对于NADH的K_M比未被替换的多肽的低)，异丁醇对甘油的摩尔比提高了。在实施例中，异丁醇与甘油的摩尔比大于1。在实施例中，异丁醇与甘油的摩尔比大于2。在实施例中，所述摩尔比大于3。在实施例中，所述摩尔比大于4、大于5、大于6、大于7、大于8、大于9、大于10、大于12或大于14。在实施例中，所述摩尔比在约1至5、约1至10、约2至8、约5至10、约5至15、约10至15或约12至15的范围内。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。从上述讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本发明的基本特性，并且在不脱离其实质和范围的情况下，能够对本发明进行各种变化和修改以适应不同的用途和条件。

一般方法：

适于细菌培养物维持和生长的材料和方法也是本领域所熟知的。适用于如下实例中的技术可在如下文献列出的内容中找到：ManualofMethods forGeneralBacteriology，PhillippGerhardt，R.G.E.Murray，RalphN.Costilow，EugeneW.Nester，WillisA.Wood，NoelR.Krieg和G.BriggsPhillips编辑，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，DC.(1994)或ThomasD.Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrial Microbiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1989)中。用于细菌细胞生长和维持的所有试剂、限制性酶和材料可购自AldrichChemicals(Milwaukee，WI)、BDDiagnosticSystems(Sparks，MD)、LifeTechnologies(Rockville，MD)、或SigmaChemicalCompany(St.Louis，MO)，除非另外指明。

所用缩写的意义如下：表示埃，“min”表示分钟，“h”表示小时，“μl”表示微升，“ng/μl”表示纳克每微升，“pmol/μl”表示皮摩尔每微升，“ml”表示毫升，“L”表示升，“g/L”表示克每升，“ng”表示纳克，“sec”表示秒，“ml/min”表示毫升每分钟，“w/v”表示重量每体积，“v/v”表示体积每体积，“nm”表示纳米，“mm”表示毫米，“cm”表示厘米，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“mg”表示毫克，“g”表示重力常数，“rpm”表示每分钟转数，“HPLC”表示高效液相色谱法，“MS”表示质谱，“HPLC/MS”高效液相色谱法/质谱，“EDTA”表示乙二胺四乙酸，“dNTP”表示三磷酸脱氧核苷酸，“℃”表示摄氏度，并且“V”表示电压。

在实例中给出的替换位置的编号是基于全长AnaerostipescaccaeKARI序列(SEQIDNO：93)。

实例中所用的菌株PNY2068和PNY2115的构建：

酿酒酵母菌株PNY0827被用作宿主细胞，用于进一步针对PNY2068和PNY2115基因操作。PNY0827是指来源于酿酒酵母的一种菌株，其根据2011年9月22日的布达佩斯条约被保藏于ATCC，美国典型培养物保藏中心，PatentDepository10801UniversityBoulevard，Manassas，VA20110-2209，并且具有专利保藏命名PTA-12105。

URA3的缺失和产孢成单倍体

为了删除内源URA3编码区，从pLA54(SEQIDNO：1)PCR扩增缺失盒，其包含侧接loxP位点的P_TEF1-kanMX4-TEF1t盒以允许体内同源重组和后续移除KANMX4标记。使用PusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物BK505(SEQIDNO：2)和BK506(SEQIDNO：3)进行PCR。每种引物的URA3部分来源于URA3ATG上游的5′区180bp和编码区下游的3′区78bp，使得kanMX4盒整合导致URA3编码区的置换。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化到PNY0827中(MethodsinYeastGenetics，2005，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第201-202页)并且在30℃补充了2％葡萄糖和100μg/mL遗传霉素的YEP培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选的转化子以验证所述整合盒的存在，所用引物为LA468(SEQIDNO：4)和LA492(SEQIDNO：5)。获得了杂合二倍体：NYLA98，其具有基因型MATa/aURA3/ura3：：loxP-kanMX4-loxP。为了获得单倍体，NYLA98使用标准方法产孢(CodónAC，Gasent-RamírezJM，BenítezT.FactorswhichaffectthefrequencyofsporulationandtetradformationinSaccharomycescerevisiaebaker′syeast.ApplEnvironMicrobiol.1995PMID：7574601)。四分体用微操作器解剖并在补充了2％葡萄糖的丰富YPE培养基上生长。包含四个活孢子的四分体被接种至不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，并且通过多重菌落PCR验证配对类型，使用引物AK109-1(SEQIDNO：6)、AK109-2(SEQIDNO：7)、以及AK109-3(SEQIDNO：8)。所得经鉴定的单倍体菌株称为NYLA103(其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP，和NYLA106，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP)。

His3的缺失

为删除内源HIS3编码区，使用了无缝的缺失盒。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs，Ipswich，MA)和用CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增用于无缝HIS3缺失的PCR盒的四个片段，用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen；Valencia，CA)制备。HIS3片段A的扩增使用引物oBP452(SEQIDNO：9)和引物oBP453(SEQIDNO：10)，其包含与HIS3片段B的5′端同源的5′尾。HIS3片段B的扩增使用引物oBP454(SEQIDNO：11)，其包含与HIS3片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP455(SEQIDNO：12)，其包含与HIS3片段U的5′端同源的5′尾。HIS3片段U的扩增使用引物oBP456(SEQIDNO：13)，其包含与HIS3片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP457(SEQIDNO：14)，其包含与HIS3片段C的5′端同源的5′尾。HIS3片段C的扩增使用引物oBP458(SEQIDNO：15)，其包含与HIS3片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP459(SEQIDNO：16)。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。HIS3片段AB通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段A和HIS3片段B并用引物oBP452(SEQIDNO：9)和oBP455(SEQIDNO：12)进行扩增。HIS3片段UC通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段U和HIS3片段C并用引物oBP456(SEQIDNO：13)和oBP459(SEQIDNO：16)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，然后用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。HIS3ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合HIS3片段AB和HIS3片段UC并用引物oBP452(SEQIDNO：9)和oBP459(SEQIDNO：16)进行扩增。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。NYLA106的感受态细胞用HIS3ABUCPCR盒转化，并在30℃涂布至不含尿嘧啶补充了2％葡萄糖的合成完全培养基。通过在30℃利用复制平板培养法在不含组氨酸且补充了2％葡萄糖的合成的完全培养基上对转化子进行了筛选，以验证正确的整合。抽提基因组DNA以通过PCR验证整合，对于5′端所用引物为oBP460(SEQIDNO：17)和LA135(SEQIDNO：18)，对于3′端所用引物为oBP461(SEQIDNO：19)和LA92(SEQIDNO：20)。通过按照标准规程在30℃涂布于补充2％葡萄糖和5-FOA的合成完全培养基上，对URA3标记进行回收利用。通过将来自所述5-FOA平板的菌落接种到SD-URA培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株称为PNY2003，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δ。

PDC1的缺失

为删除内源PDC1编码区，从pLA59(SEQIDNO：21)PCR扩增缺失盒，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物LA678(SEQIDNO：22)和LA679(SEQIDNO：23)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于PDC1起始密码子的上游5′区50bp和终止密码子的下游3′区50bp，使得URA3盒的整合导致PDC1编码区被置换，但保留了所述编码区的最初50bp和最后50bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2003，并且在30℃不含尿嘧啶且补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选了转化子以验证正确的整合，所用引物为LA337(SEQID：24)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：18)，其为URA3内部引物。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA692(SEQIDNO：25)和LA693(SEQIDNO：26)，其位于PDC1编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落涂布在不含尿嘧啶并补充了2％葡萄糖的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株称为PNY2008，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66。

PDC5的缺失

为删除内源PDC5编码区，从pLA59(SEQIDNO：21)PCR扩增缺失盒，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物LA722(SEQIDNO：28)和LA733(SEQIDNO：29)进行PCR。每种引物的PDC5部分来源于PDC5起始密码子上游的5′区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒整合导致整个PDC5编码区的置换。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2008，并且在30℃不含尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选转化子以验证正确的整合，所用引物为LA453(SEQID：30)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：18)，其为URA3内部引物。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA694(SEQIDNO：31)和LA695(SEQIDNO：32)，其位于PDC5编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富YEP培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株称为PNY2009，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66。

FRA2的缺失

FRA2缺失被设计为从编码序列3′端删除250个核苷酸，保留FRA2编码序列的最初113个核苷酸不动。一个阅读框终止密码子出现在所述缺失的下游7个核苷酸的位置。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs，Ipswich，MA)和用CEN.PK113-7D基因组DNA作为模板，扩增用于无缝FRA2缺失的PCR盒的四个片段，用GentraPuregeneYeast/Bactkit(Qiagen；Valencia，CA)制备。FRA2片段A的扩增使用引物oBP594(SEQIDNO：33)和引物oBP595(SEQIDNO：34)，其包含与FRA2片段B的5′端同源的5′尾。FRA2片段B的扩增使用引物oBP596(SEQIDNO：35)，其包含与FRA2片段A的3′端同源的5′尾，和引物oBP597(SEQIDNO：36)，其包含与FRA2片段U的5′端同源的5′尾。FRA2片段U的扩增使用引物oBP598(SEQIDNO：37)，其包含与FRA2片段B的3′端同源的5′尾，和引物oBP599(SEQIDNO：38)，其包含与FRA2片段C的5′端同源的5′尾。FRA2片段C的扩增使用引物oBP600(SEQIDNO：39)，其包含与FRA2片段U的3′端同源的5′尾，和引物oBP601(SEQIDNO：40)。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。FRA2片段AB通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段A和FRA2片段B并用引物oBP594(SEQIDNO：33)和oBP597(SEQIDNO：36)进行扩增。FRA2片段UC通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段U和FRA2片段C并用引物oBP598(SEQIDNO：37)和oBP601(SEQIDNO：40)进行扩增。所得PCR产物在琼脂糖凝胶上纯化，然后用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化。所述FRA2ABUC盒通过重叠PCR生成，通过混合FRA2片段AB和FRA2片段UC并用引物oBP594(SEQIDNO：33)和oBP601(SEQIDNO：40)进行扩增。用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。

为删除内源FRA2编码区，使用标准技术将上述获得的无缝缺失盒转化进PNY2009并涂布在不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。制备基因组DNA以通过PCR验证整合，引物oBP602(SEQIDNO：41)和LA135(SEQIDNO：18)用于5′端，引物oBP602(SEQIDNO：41)和oBP603(SEQIDNO：42)用于扩增整个基因座。通过按照标准规程在30℃接种于补充了1％乙醇和5-FOA(5-氟乳清酸)的合成完全培养基上，对URA3标记进行了回收。通过将来自5-FOA平板的菌落接种到不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2037具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-1oxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ。

天然2μ质粒的加入

使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)从pLA59(SEQIDNO：29)PCR-扩增了loxP71-URA3-loxP66标记，并且连同LA811×817(SEQIDNO：43，44)和LA812x818(SEQIDNO：45，46)2-μ质粒片段(扩增自来自CEN.PK113-7D的天然2-μ质粒；CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)真菌生物多样性中心)在30℃、SE-URA平板上转化菌株PNY2037。所得的菌株PNY20372μ：：loxP71-URA3-loxP66用pLA34(pRS423：：cre)(也称为pLA34)(SEQIDNO：27)转化并且在30℃、SE-HIS-URA平板上进行选择。将转化子接种在YP-1％半乳糖平板上并使其在30℃下生长48小时以诱导Cre重组酶表达。然后将单个菌落接种至SE-URA、SE-HIS和YPE平板以确认URA3标记移除。所得经鉴定的菌株PNY2050具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxP，his3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μ。

从PNY2050构建PNY2068

从PNY2050如下述构建PNY2068[MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：P_FBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-P_FBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P_ILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66pdc1Δ：：P_PDC1-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66]。

GPD2的缺失

为删除内源GPD2编码区，从pLA59(SEQIDNO：21)PCR扩增缺失盒，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。使用PhusionHighFidelityPCRMasterMix(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)和引物LA512(SEQIDNO：47)和LA513(SEQIDNO：48)进行PCR。每种引物的GPD2部分来源于GPD2起始密码子上游的5′区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒整合导致整个GPD2编码区的置换。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2050，并且在30℃不含尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为LA516(SEQIDNO：49)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：18)，其位于URA3内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA514(SEQIDNO：50)和LA515(SEQIDNO：51)，其位于GPD2编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2056具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δ。

YMR226的缺失和AlsS的整合

为了删除内源YMR226C编码区，从pLA71(SEQIDNO：52)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的乙酰乳酸合酶基因，所述基因带有FBA1启动子和CYC1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自KapaBiosystems(Woburn，MA)的KAPAHiFi和引物(SEQIDNO：LA82953)和LA834(SEQIDNO：54)进行PCR。每种引物的YMR226C部分来源于所述编码序列的最初60bp和位于终止密码子上游409bp处的65bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2056，并且在30℃不含尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为N1257(SEQIDNO：55)，其位于5′编码区的外部，和LA740(SEQIDNO：61)，其位于FBA1启动子内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为N1257(SEQIDNO：55)和LA830(SEQIDNO：56)，其位于YMR226C编码区内部，和引物LA830(SEQIDNO：56)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQIDNO：20)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2061具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：P_FBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66。

ALD6的缺失和KivD的整合

为了删除内源ALD6编码区，从pLA78(SEQIDNO：57)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种格氏李斯特菌(Listeriagrayi)的kivD基因，所述基因带有杂合的FBA1启动子和TDH3终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自KapaBiosystems(Woburn，MA)的KAPAHiFi和引物LA850(SEQIDNO：58)和LA851(SEQIDNO：59)进行PCR。每种引物的ALD6部分来源于所述编码序列的最初65bp和所述编码区的最后63bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2061，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为N1262(SEQIDNO：60)，其位于5′编码区的外部，和LA740(SEQIDNO：61)，其位于FBA1启动子内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为N1263(SEQIDNO：62)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQIDNO：20)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株PNY2065具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：P_FBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-P_FBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71。

ADH1的缺失和ADH的整合

ADH1是酿酒酵母中存在的内源醇脱氢酶。如下所述，用来自印度拜叶林克氏菌(Beijerinckiiindica)的醇脱氢酶(ADH)置换内源ADH1。

为了删除内源ADH1编码区，从pLA65(SEQIDNO：63)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckiiindica)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自KapaBiosystems(Woburn，MA)的KAPAHiFi和引物LA855(SEQIDNO：64)和LA856(SEQIDNO：65)进行PCR。每种引物的ADH1部分来源于ADH1起始密码子上游的5′区50bp和所述编码区的最后50bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2065，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为LA414(SEQIDNO：66)，其位于5′编码区的外部，和LA749(SEQIDNO：67)，其位于ILV5启动子内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA413(SEQIDNO：68)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQIDNO：20)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得的经过鉴定的菌株PNY2066具有基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：P_FBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-P_FBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P_ILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66。

将ADH整合至pdc1Δ基因座

为在pdc1Δ区整合另外的ADH拷贝，从pLA65(SEQIDNO：63)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckiiindica)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用来自KapaBiosystems(Woburn，MA)的KAPAHiFi和引物LA860(SEQIDNO：69)和LA679(SEQIDNO：23)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于PDC1起始密码子的上游5′区60bp和位于终止密码子上游103bp处的50bp。使用了内源的PDC1启动子。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2066，并且在30℃不含尿嘧啶且补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR筛选了转化子以验证正确的整合，所用引物为LA337(SEQID：24)，其位于5′编码区的外部，和N1093(SEQIDNO：70)，其位于BiADH基因内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA681(SEQIDNO：71)，其位于3′编码区的外部，和LA92(SEQIDNO：20)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为PNY2068，其具有如下基因型：MATaura3Δ：：loxP-kanMX4-loxPhis3Δpdc1Δ：：loxP71/66pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μgpd2Δymr226cΔ：：P_FBA1-alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66ald6Δ：：(UAS)PGK1-P_FBA1-kivD_Lg-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P_ILV5-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66pdc1Δ：：P_PDC1-ADH_Bi(y)-ADH1t-loxP71/66。

从PNY2050构建PNY2115

从PNY2050至PNY2115[MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66]的构建过程如下。

Pdc1Δ：：P[PDC1]-AIS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66

为将alsS整合进PNY2050的pdc1Δ：：loxP66/71基因座(使用内源PDC1启动子)，从pLA71(SEQIDNO：52)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的乙酰乳酸合酶基因，所述基因带有FBA1启动子和CYC1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFI和引物895(SEQIDNO：72)和679(SEQIDNO：73)进行PCR。每种引物的PDC1部分来源于所述编码序列的上游的60bp和位于终止密码子上游53bp的50bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2050，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为681(SEQIDNO：74)，其位于3’编码区的外部，和92(SEQIDNO：75)，其位于URA3基因内部。然后制备阳性转化子基因组DNA，并且通过PCR进行筛选，所用引物为N245(SEQIDNO：76)和N246(SEQIDNO：77)。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为PNY2090，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxP，his3Δ，pdc1Δ：：loxP71/66，pdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66。

Pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66

为了删除内源PDC6编码区，从pLA78(SEQIDNO：57)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种格氏李斯特菌(Listeriagrayi)的kivD基因，所述基因带有杂合的FBA1启动子和TDH3终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi和引物896(SEQIDNO：78)和897(SEQIDNO：79)进行PCR。每种引物的PDC6部分来源于所述编码序列上游的60bp和所述编码区下游的59bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2090，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为365(SEQIDNO：80)和366(SEQIDNO：81)，其为PDC6基因的内部引物。然后通过菌落PCR筛选产物不存在的转化子，N638(SEQIDNO：82)，其位于所述基因的5’端，和740(SEQIDNO：83)，其位于FBA1启动子内部。制备阳性转化子的基因组DNA并使用PDC6编码序列的两个外部引物通过PCR进行筛选。阳性整合子会产生4720bp的产物，而PDC6野生型转化子会产生2130bp的产物。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34进行转化，并且在30℃涂布在不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为PNY2093，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66。

Adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66

为了删除内源ADH1编码区并且使用内源ADH1启动子整合BiADH，从pLA65(SEQIDNO：63)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckii)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi和引物856(SEQIDNO：84)和857(SEQIDNO：85)进行PCR。每种引物的ADH1部分来源于ADH1起始密码子上游的5’区50bp和所述编码区的最后50bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2093，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为BK415(SEQIDNO：86)，其位于5编码区的外部，和N1092(SEQIDNO：87)，其位于BiADH基因内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为413(SEQIDNO：88)，其位于3′编码区的外部，和92(SEQIDNO：75)，其位于URA3标记内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为PNY2101，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP71/66fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-1oxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66。

Fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66

为将BiADH整合至PNY2101的fra2Δ基因座，从pLA65(SEQIDNO：63)PCR扩增整合盒，其包含来自菌种印度拜叶林克氏菌(Beijerinckiiindica)的醇脱氢酶，所述醇脱氢酶带有ILV5启动子和ADH1终止子以及URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点以允许体内同源重组以及后续的URA3标记移除。通过使用KAPAHiFi和引物906(SEQIDNO：89)和907(SEQIDNO：90)进行PCR。每种引物的FRA2部分来源于始于ATG处的编码序列的最初60bp和终止密码子下游的56bp。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2101，并且在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为667(SEQIDNO：91)，其位于5’编码区的外部，和749(SEQIDNO：92)，其位于ILV5启动子内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为PNY2110，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/712-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66。

GPD2缺失

为删除内源GPD2编码区，从pLA59(SEQIDNO：21)PCR扩增缺失盒，其包含URA3标记，所述URA3标记侧接简并loxP位点允许体内同源重组以及后续移除URA3标记。通过使用KAPAHiFi和引物LA512(SEQIDNO：47)和LA513(SEQIDNO：48)进行PCR。每种引物的GPD2部分来源于GPD2起始密码子上游的5′区50bp和终止密码子下游的3′区50bp，使得URA3盒整合导致整个GPD2编码区的置换。使用标准遗传技术将所述PCR产物转化进PNY2110，在30℃不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上选择转化子。通过菌落PCR验证正确的整合来筛选转化子，所用引物为LA516(SEQIDNO：49)，其位于5′编码区的外部，和LA135(SEQIDNO：18)，其位于URA3内部。然后通过菌落PCR筛选阳性转化子，所用引物为LA514(SEQIDNO：50)和LA515(SEQIDNO：51)，其位于GPD2编码区的内部。URA3标记的回收是通过用包含在GAL1启动子控制下的CRE重组酶的pLA34(SEQIDNO：27)进行转化，并且涂布在30℃不含组氨酸并补充了1％乙醇的合成完全培养基上。将转化子涂布在补充了1％乙醇和0.5％半乳糖的丰富培养基上以诱导重组酶。通过将菌落接种至不含尿嘧啶并补充了1％乙醇的合成完全培养基上，生长的抑制确认了标记的移除。所得经鉴定的菌株称为PNY2115，其具有基因型：MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-μpdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66。

实例1.在位置90和93处组合诱变K9SB2_SH以生成K9YW文库

选择位置90和93(编号是基于来自Anaerostipescaccae的全长KARI酶；SEQIDNO：93)用于AnaerostipescaccaeKARI变体K9SB2_SH(SEQIDNO：94)的组合诱变。先前在筛选K9SB2ePCR文库时观察到在这些位置处的替换。生成一组变体，其包含以下每种可能的组合：在位置90处的Lys、Ala、Met、Leu或Tyr和在位置93处的Thr、Leu、Ile、Val或Ala。用K9SB2_SH_DHAD(SEQIDNO：95)作为起始模板，通过在位置90和93处的顺序诱变制备了25个变体。两次诱变过程的起始是通过使用诱变引物的混合物的PCR步骤，之后将所述PCR产物作为巨型引物(megaprimer)进行第二个反应。

对于在位置90处的诱变的PCR反应是采用PFUultra聚合酶(目录号600380；AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)进行的。在混合物中的引物(表1；位置90处)和引物SB2_r1(TGGACCGGTAATGTAGTCACC；SEQIDNO：96)是由IntegratedDNATechnologies，Inc(CoralvilleIA)商业合成的。所述PCR反应是由1μl的K9SB2_SH-DHAD(SEQIDNO：95)(50ng/μl)、4μl的90混合物(10uM)、4ulSB2_r1(10uM)、10ul的10×PFUultra缓冲液、1μl的10mMdNTP混合物、1μl的PFUultraDNA聚合酶和34μl的ddH₂O组成的。使用的PCR反应条件如下：起始温度为95℃2.0分钟，之后进行35个加热/冷却循环。每个循环由95℃30秒、55℃30秒和68℃30秒组成。在温度循环结束时，将样品在68℃再保持10.0分钟，然后在4℃将待测样品回收。按照制造商建议，通过琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖、1XTBE缓冲液)将反应产物与模板分开，并且使用illustraGFXPCRDNAandGelBandPurificationkit(目录号28-9034-70，GEHealthcareLifeSciences，Piscataway，NJ)进行回收。

表1.用于组合诱变的引物

针对位置90处的正向引物组
	SB2_K90(天然的)：Cccagatgaaaagcaggctaccatgtacaaaaacg(SEQ ID NO：97)
SB2_K90M_f：Cccagatgaaatgcaggctaccatgtacaaaaacg(SEQ ID NO：98)
	SB2_K90L_f：Cccagatgaattgcaggctaccatgtacaaaaacg(SEQ ID NO：99)
SB2_K90Y_f：Cccagatgaataccaggctaccatgtacaaaaacg(SEQ ID NO：100)
	SB2_K90A_f：Cccagatgaagctcaggctaccatgtacaaaaacg(SEQ ID NO：101)
针对位置93处的正向引物组

SB2_T93(天然的)：caggctaccatgtacaaaaacgacatcgaacc(SEQ ID NO：102)
	SB2_T93I_f：caggctatcatgtacaaaaacgacatcgaacc(SEQ ID NO：103)
SB2_T93A_f：caggctgctatgtacaaaaacgacatcgaacc(SEQ ID NO：104)
	SB2_T93L_f：caggctttgatgtacaaaaacgacatcgaacc(SEQ ID NO：105)
SB2_T93V_f：caggctgttatgtacaaaaacgacatcgaacc(SEQ ID NO：106)

所述分离的反应产物被用作巨型引物，使用Lightning定点诱变试剂盒(目录号200523；AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)以生成位置90处变体组。除了引物、模板和ddH₂O，随试剂盒提供了这里所用的所有试剂。所述反应混合物包含1μlK9SB2_SH_DHAD(50ng/μl)、4μl的K90巨型引物、5μl的10×反应缓冲液、1μl的dNTP混合物、1.5ulQuikSolution、1ulQuikChangeLightning酶和37.5μl的ddH₂O。使用的反应条件如下：起始温度为95℃2分钟，随后是18个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、60℃10秒和68℃14分钟组成。温度循环结束后，所述样品在68℃温育7分钟，然后在4℃回收待测样品。每个反应加入2μl的DpnI(10U/μl)，并且将所述混合物在37℃温育5分钟。

将4μl的每个诱变反应转化进包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(目录号L1004，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上的OneTop10化学感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，目录号C404003)，并且在37℃温育过夜。然后选择多个转化子用于基于TempliPhi^TM(GEHealthcare)的DNA测序，所用引物为pHR81-F(ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC；SEQIDNO：107)和pHR81-Rev(CTAGTGTACAGATGTATGTCGG；SEQIDNO：108)。具有已证实为KARI序列的转化子被接种至包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基并且在37℃下以225rpm摇动温育。使用QIAprepSpinMiniprepKit(目录号2706；Qiagen，Valencia，CA)按照制造商提供的规程从所述细胞分离质粒DNA。将克隆混合进K90质粒混合物。

如上所述进行针对在位置93处诱变的PCR反应，有改动。在93混合物(表1)中的所述引物是由IntegratedDNATechnologies，Inc(CoralvilleIA)商业合成的。所述PCR反应是由1μl的K9SB2_SH-DHAD(SEQIDNO：95)(50ng/μl)、4μl的93混合物(10uM)、4ulSB2_r1、10ul的10×PFUultra反应缓冲液、1μl的10mMdNTP混合物、1μl的PFUultraDNA聚合酶和34μl的ddH₂O组成。如上所述采用Lightning定点诱变试剂盒进行后续反应，有改动。所述反应混合物包含1μlK90质粒混合物(50ng/μl)、4μl的K90巨型引物、5μl的10×反应缓冲液、1μl的dNTP混合物、1.5ulQuikSolution、1ulQuikChangeLightning酶和37.5μl的ddH₂O。

在两个突变步骤和基于templiphi的DNA测序后，分离25种变体的质粒并再次确认DNA序列。在表2中提供了针对各种变体的氨基酸替换。

表2.K9YW文库中的KARI变体

实例2.针对K9YW变体的酵母异丁醇生产

在48孔板上，采用在位置90和93处组合诱变所得的25个质粒来评估在厌氧条件下生长的酵母的中异丁醇生产。通过将包含KARI变体的编码序列的质粒转化宿主PNY2259(MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc6Δpdc1Δ：：P[PDC1]-DHAD|ilvD_Sm-PDC1t-P[FBA1]-ALS|alsS_Bs-CYC1tpdc5Δ：：P[PDC5]-ADH|sadB_Ax-PDC5tgpd2Δ：：loxPfra2Δ：：P[PDC1]-ADH|adh_Hl-ADH1tadh1Δ：：UAS(PGK1)P[FBA1]-kivD_Lg(y)-ADH1typrcΔ15Δ：：P[PDC5]-ADH|adh_Hl-ADH1tymr226cΔald6Δ：：loxP)并且接种至不含尿嘧啶(1％乙醇作为碳源)的合成培养基上来制备异丁醇生产菌株。在30℃温育3-5天后，在SE-Ura平板上出现得自转化的酵母菌落。将来自每种变体的至少三个菌落接种至新鲜SE-Ura平板并在30℃温育。

酵母培养条件：

有氧培养培养基：具有2g/l乙醇的SE-Ura培养基。

厌氧培养培养基：具有30g/l葡萄糖和1g/l乙醇，补充有10mg/l麦角固醇、50mMMES缓冲液(pH5.5)、30mg/l硫胺素、和30mg/l烟酸的SEG-Ura。

48-孔平板：Axygen目录号P-5ML-48-C-S，5ml/孔的总体积，培养物体积为1.5ml/孔。

对于有氧培养，用可渗透的粘合剂膜(VWR；目录号60941-086)覆盖平板。在30℃以225rpm摇动平板。对于厌氧培养，通过在厌氧箱中平衡2小时，对用可渗透的膜覆盖的新鲜接种的平板来清除氧气。将所述平板的覆盖更换为可粘附的铝质覆盖(VWR；目录号89049-034)，并且将每个平板放置于带有新的氧气清除剂包(MitsubishiGasChemicalAmerica，Inc；NewYork，NY；目录号10-01)的密闭塑料盒(MitsubishiGasChemicalAmerica，Inc；NewYork，NY；目录号50-25)中。从厌氧箱中取出整个组件(密封的气密性塑料盒中的平板和氧气清除剂包)并在30℃以225rpm摇动。

实验规程

将SE-Ura琼脂平板上的单个酵母菌落划线接种至新的SE-Ura琼脂平板，并且在30℃温育直至生长出密集成片的细胞。用这些细胞的接种环接种了48-孔平板中的液体预培养物，用于初始的有氧培养。摇动过夜后，通过将每一孔中的0.15ml转移至平底96-孔板中并用MolecularDevices酶标仪(Sunnyvale，CA)测量每一孔在600nm的吸光度，测量了每一培养物孔的OD600。将基于以实验方式确定的校准线的线性转化应用于这些酶标仪测量的光密度，以将它们转化成就基于比色杯的分光光度计而言可比较的吸光度值。

将每一有氧预培养孔的经计算的部分接种至具有1.5mlSEG-Ura培养基的新鲜的48-孔平板的相应孔中，以达到0.2(以比色杯分光光度计吸光度单位计)的初始OD600。在接种新鲜平板的过程中，离心有氧预培养平板，从每一孔移除了上清液，并将每一孔中的细胞重悬在新鲜的SEG-Ura培养基中。摇动该厌氧培养平板2天。通过HPLC测量了培养物上清液中的异丁醇浓度(表3)。

表3.异丁醇滴度

实例3.在位置90、93和94处组合诱变K9SB2SH以生成K9JM文库

基于在位置90、93和93处(编号基于全长AnaerostipescaccaeKARI)的组合突变制备K9SB2_SH的另外的衍生物。生成的变体在位置90处包含Lys、Met、或Tyr，在位置93处包含Ala、Ile、Thr或Val，在位置94处包含Ile、Leu、Met或Phe。诱变是通过使用诱变引物的起始PCR步骤，随后将所述PCR产物作为巨型引物进行一组反应来进行的。在表4中列出的诱变引物是由IntegratedDNATechnologies，Inc(CoralvilleIA)商业合成的。

表4.用于诱变的引物

引物号	序列	SEQ IDNO：
			1	ccagatgaaAAGcaggctACCTTGtacaaaaacgacatcg	133
2	ccagatgaaAAGcaggctATCATGtacaaaaacgacatcg	134
			3	ccagatgaaAAGcaggctATCATCtacaaaaacgacatcg	135
4	ccagatgaaAAGcaggctATCTTGtacaaaaacgacatcg	136
			5	ccagatgaaAAGcaggctGCCATCtacaaaaacgacatcg	137
6	ccagatgaaAAGcaggctGCCTTGtacaaaaacgacatcg	138
			7	ccagatgaaAAGcaggctGTCATGtacaaaaacgacatcg	139
8	ccagatgaaATGcaggctACCATCtacaaaaacgacatcg	140
			9	ccagatgaaATGcaggctACCTTGtacaaaaacgacatcg	141
10	ccagatgaaATGcaggctATCATGtacaaaaacgacatcg	142
			11	ccagatgaaTACcaggctACCATGtacaaaaacgacatcg	143
12	ccagatgaaATGcaggctGCCATGtacaaaaacgacatcg	144
			13	ccagatgaaAAGcaggctACCTTCtacaaaaacgacatcg	145
14	ccagatgaaAAGcaggctGTCATCtacaaaaacgacatcg	146
			15	ccagatgaaAAGcaggctGTCTTGtacaaaaacgacatcg	147
16	ccagatgaaATGcaggctATCATCtacaaaaacgacatcg	148
			17	ccagatgaaATGcaggctATCTTGtacaaaaacgacatcg	149
18	ccagatgaaTTGcaggctACCATCtacaaaaacgacatcg	150
			19	ccagatgaaTTGcaggctACCTTGtacaaaaacgacatcg	151
20	ccagatgaaTTGcaggctATCATGtacaaaaacgacatcg	152
			21	ccagatgaaTTGcaggctGCCATGtacaaaaacgacatcg	153
22	ccagatgaaTACcaggctGCCATGtacaaaaacgacatcg	154
			23	ccagatgaaTACcaggctACCATCtacaaaaacgacatcg	155
24	ccagatgaaTACcaggctACCTTGtacaaaaacgacatcg	156
			25	ccagatgaaTACcaggctATCATGtacaaaaacgacatcg	157
26	ccagatgaaATGcaggctGCCATCtacaaaaacgacatcg	158
			27	ccagatgaaATGcaggctGCCTTGtacaaaaacgacatcg	159
28	ccagatgaaATGcaggctGTCATGtacaaaaacgacatcg	160
			29	ccagatgaaAAGcaggctATCTTCtacaaaaacgacatcg	161
30	ccagatgaaAAGcaggctGCCTTCtacaaaaacgacatcg	162
			31	ccagatgaaATGcaggctACCTTCtacaaaaacgacatcg	163

32	ccagatgaaTTGcaggctATCATCtacaaaaacgacatcg	164
			33	ccagatgaaTTGcaggctATCTTGtacaaaaacgacatcg	165
34	ccagatgaaTTGcaggctGCCATCtacaaaaacgacatcg	166
			35	ccagatgaaTTGcaggctGCCTTGtacaaaaacgacatcg	167
36	ccagatgaaTACcaggctGCCATCtacaaaaacgacatcg	168
			37	ccagatgaaTACcaggctGCCTTGtacaaaaacgacatcg	169
38	ccagatgaaTTGcaggctGTCATGtacaaaaacgacatcg	170
			39	ccagatgaaTACcaggctATCATCtacaaaaacgacatcg	171
40	ccagatgaaTACcaggctATCTTGtacaaaaacgacatcg	172
			41	ccagatgaaTACcaggctGTCATGtacaaaaacgacatcg	173
42	ccagatgaaATGcaggctGTCATCtacaaaaacgacatcg	174
			43	ccagatgaaATGcaggctGTCTTGtacaaaaacgacatcg	175
44	ccagatgaaATGcaggctATCTTCtacaaaaacgacatcg	176
			45	ccagatgaaATGcaggctGCCTTCtacaaaaacgacatcg	177
46	ccagatgaaAAGcaggctGTCTTCtacaaaaacgacatcg	178
			47	ccagatgaaTTGcaggctACCTTCtacaaaaacgacatcg	179
48	ccagatgaaTACcaggctACCTTCtacaaaaacgacatcg	180
			49	ccagatgaaTTGcaggctGTCATCtacaaaaacgacatcg	181
50	ccagatgaaTTGcaggctGTCTTGtacaaaaacgacatcg	182
			51	ccagatgaaTACcaggctGTCATCtacaaaaacgacatcg	183
52	ccagatgaaTACcaggctGTCTTGtacaaaaacgacatcg	184
			53	ccagatgaaTTGcaggctATCTTCtacaaaaacgacatcg	185
54	ccagatgaaTTGcaggctGCCTTCtacaaaaacgacatcg	186
			55	ccagatgaaTACcaggctGCCTTCtacaaaaacgacatcg	187
56	ccagatgaaTACcaggctATCTTCtacaaaaacgacatcg	188
			57	ccagatgaaTTGcaggctGTCTTCtacaaaaacgacatcg	189
58	ccagatgaaTACcaggctGTCTTCtacaaaaacgacatcg	190
			反向	gctgaaaacacaccttgtaatatccacttacatgactttgg	191

用诱变引物PCR

将引物组合为六组。1组：引物1-10；2组：引物11-20；3组：引物21-30；4组：引物31-40；5组：引物41-50；6组：引物51-58。将每种引物的10μL等分试样置于无菌1.5mLEppendorf管中。然后用分子生物学等级水将所述引物混合物稀释10倍，至10μM的最终总体浓度。将反向因为稀释10倍至10μM的最终浓度。

使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)进行PCR；除了引物、DNA模板和分子生物学等级水，所有试剂随聚合酶一起提供。所用的DNA模板是质粒K9SB2_SH_DHAD(SEOIDNO：95)。所述PCR反应是由10μL5XPhusionHF缓冲液、2μL5mMdNTP、2.5μl的10μM正向引物混合物、2.5μl的10μM反向引物、2μL50ng/μL模板DNA、0.5μLPhusionDNA聚合酶和30.5μL分子生物学等级水组成。所有反应所用的条件如下：起始温度为98℃30秒，之后进行30个加热/冷却循环。每个循环由98℃10秒、58℃15秒、和72℃2.0分钟组成。在温度循环结束时，最终的72℃步骤运行5.0分钟，所述样品保持在4℃直至样品回收。

使用凝胶电泳分离所期望的PCR产物。每个样品中加入5.5μL10xLoadingDye(Invitrogen，10816-015)。在1％琼脂糖凝胶的泳道中加载每个样品20μl，所述凝胶在140V下，1XTBE缓冲液中运行(电泳)30分钟将DNA大小分离。所期望的片段大小大约为3500bp，从凝胶中切下该大小的条带并放置在预先称重了的无菌eppendorf管中。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704，Qiagen，Valencia，CA)按照制造商的规程将来自凝胶的管纯化，改动如下。用750μLPE缓冲液洗涤过滤单元三次。然后将回收的PCR产物用作所述方法中下一个步骤的引物。

用巨型引物扩增酵母表达质粒

采用Agilent的QuikchangeLightning定点诱变试剂盒(目录号210518；AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)进行PCR步骤，其扩增了质粒并且引入了突变。所述反应是由250ng纯化的巨型引物PCR产物、100ngK9SB2_SH_DHAD模板DNA(SEQIDNO：95)，5μL10X反应缓冲液、1.5μLQuikSolution、1μLdNTP混合物和一定体积的分子生物学等级的水(将整个反应体积补足至50μL)组成。除了所述引物、模板、和ddH₂O，这里所用的所有试剂随上述提到的试剂盒一起提供。两个反应所用的条件如下：起始温度为95℃30秒，之后进行16个加热/冷却循环。每个循环由95℃30秒、55℃30秒、和68℃6.0分钟组成。温度循环结束后，在4℃回收待测样品。每个反应加入1μl的DpnI(10U/μl)，并且将所述混合物在37℃温育1小时。

按照制造商的说明，将2μl的每个诱变反应转化进OneTOP10化学感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，目录号C404003)。将所述转化子涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(目录号L1004，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。然后选择多个转化子用于基于TempliPhi^TM(GEHealthcare)的DNA测序，所用引物为pHR81-F(ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC；SEQIDNO：107)和pHR81-Rev(CTAGTGTACAGATGTATGTCGG；SEQIDNO：108)。具有已证实为KARI序列的转化子被接种至包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基并且在37℃下以225rpm摇动温育。使用QIAprepSpinMiniprepKit(目录号2706；Qiagen，Valencia，CA)按照制造商提供的规程从所述细胞分离质粒DNA。鉴定KARIsJM1-JM31(表5)并且分析异丁醇生产(实例4)。

表5.KARI变体

进行第二轮迭代诱变以生成另外的变体。

生成巨型引物的PCR

表4中的引物子组被混合为三组。S-1组：引物31、44、45、48、55、56和58；S-2组：引物22、25、28和41；S-3组：引物24、37、40、43和52.将每种引物的10μL等分试样置于无菌1.5mLEppendorf管中。然后用分子生物学等级水将所述引物混合物稀释10倍，至10μM的最终总体浓度。将反向因为稀释10倍至10μM的最终浓度。

使用PhusionDNA聚合酶(NewEnglandBioLabs；Ipswich，MA)进行PCR；除了引物、DNA模板和分子生物学等级水，所有试剂随聚合酶一起提供。用于组S-1、S-2和S-3的DNA模板是JM31(SEQIDNO：222)、JM29(SEQIDNO：220)和JMl6(SEQIDNO：207)。所述巨型引物PCR反应是由10μL5XPhusionHF缓冲液、1μL10mMdNTP、2.5μl的10μM正向引物混合物、2.5μl的10μM反向引物、2.5μL1ng/μL模板DNA、0.5μLPhusionDNA聚合酶和1μL50mMMgCl₂和32.5μL分子生物学等级的水组成。所有反应所用的条件如下：起始温度为98℃30秒，之后进行30个加热/冷却循环。每个循环由98℃10秒、60℃15秒和72℃2分钟20秒组成。在温度循环结束时，最终的72℃步骤运行5.0分钟，所述样品保持在4℃直至样品回收。

用巨型引物扩增酵母表达质粒

采用Agilent的QuikchangeLightning定点诱变试剂盒(目录号210518；AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)进行PCR，其中扩增了质粒并导入所述突变。所述反应是由250ng纯化的巨型引物PCR产物、100ngK9SB2_SH_DHAD模板DNA(SEQIDNO：95)，5μL10X反应缓冲液、1.5μLQuikSolution、1μLdNTP混合物和一定体积的分子生物学等级的水(将整个反应体积补足至50μL)组成。除了所述引物、模板、和ddH₂O，这里所用的所有试剂随上述提到的试剂盒一起提供。两个反应所用的条件如下：起始温度为95℃30秒，之后进行16个加热/冷却循环。每个循环由95℃30秒、55℃30秒、和68℃6.0分钟组成。温度循环结束后，在4℃回收待测样品。每个反应加入1μl的DpnI(10U/μl)，并且将所述混合物在37℃温育1小时。

按照制造商的说明，将2μl的每个诱变反应转化进OneTOP10化学感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，目录号C404003)。将所述转化子涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(目录号L1004，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。然后选择多个转化子用于基于TempliPhi^TM(GEHealthcare)的DNA测序，所用引物为pHR81-F(ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC；SEQIDNO：107)和pHR81-Rev(CTAGTGTACAGATGTATGTCGG；SEQIDNO：108)。具有已证实为KARI序列的转化子被接种至包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基并且在37℃下以225rpm摇动温育。使用QIAprepSpinMiniprepKit(目录号2706；Qiagen，Valencia，CA)按照制造商提供的规程从所述细胞分离质粒DNA。鉴定KARIsJM32-JM44(参见表6)并且分析异丁醇生产(实例5)。

表6.KARI变体

实例4.PNY2259中JM变体生产异丁醇

生长培养基

在酵母菌株的生长过程中使用了三种类型的培养基：SE-ura回收平板、有氧预培养培养基和厌氧培养培养基。除非另外指明，所有化学品购自Sigma(St.Louis，MO)

酵母转化回收平板(SE-ura)：50mMMES(pH5.5)，6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)、1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，0.2％乙醇，0.01％w/v亮氨酸，0.01％w/v组氨酸，和0.002％w/v色氨酸。

有氧预培养培养基(SE-Ura-His)：6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，0.2％乙醇，0.2％葡萄糖，0.01％w/v亮氨酸，0.1％w/v组氨酸，和0.002％w/v色氨酸。

厌氧培养培养基(SEG-Ura-His)：50mMMES(pH5.5)，6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，0.1％乙醇，3％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.1％组氨酸，0.002％色氨酸，30mg/L烟酸，30mg/L硫胺素和10mg/L麦角固醇，组成50/50v/vTween/乙醇溶液。

深孔板生长过程

将1.5mL有氧预培养培养基的等分式样分装至Axygen48深孔板(#P-5mL-48-C-S，Axygen，UnionCity，CA)的每个孔中，用生长在SE-Ura-His琼脂平板上的细胞接种。使用透气覆盖件(#60941-086，VWR，Radnor，PA)密封培养平板。将所述平板置于30℃培养箱中，摇动生长24小时，当达到1.5至2.0的目标OD₆₀₀值；由SpectraMax384Plus酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)测定。记录下OD₆₀₀值。使用HeraeusMultifugeX1R离心机(ThermoScientific，Waltham，MA)和M-20平板转头(#41102742，ThermoScientific，Waltham，MA)通过离心沉淀平板中的细胞，弃去所得上清液。将细胞沉淀物转移至Coy厌氧袋(CoyAnaerobicBag)(GrassLake，MI)，其中将沉淀重悬于0.1mL厌氧生长培养基(如上所述)，所述厌氧生长培养基已经平衡至厌氧状态至少24小时。用沉淀/培养基悬浮液接种至Axygen48深孔板(#P-5mL-48-C-S，Axygen，UnionCity，CA)中的1.5mL厌氧培养培养基等分式样至0.2的起始目标OD₆₀₀值。然后用无菌金属薄片密封件(60941-076，VWR，Radnor，PA)密封所述平板，置于带有除氧包(#50-25，#10-01，MGCAnaeroPacSystem，Japan)的MGC2.5L厌氧广口瓶中，然后将广口瓶密封。将厌氧广口瓶从CoyAnaerobicBag移出，置于30℃的培养箱中，摇动生长69小时。在第一个厌氧世代的末尾，离心细胞，保存上清液样品用于HPLC分析。如实验所指定，将沉淀用于接种后续的厌氧世代；后续的世代生长24-72小时。对于每种变体评估三个转化子(表7中给出了结果)。在血清小瓶研究中分析所选择的变体(表8中给出了结果)。

血清小瓶生长过程

将125mL带过滤塞的烧瓶中的10mL有氧预培养培养基的等分式样用在SE-Ura-His琼脂平板上生长的细胞进行接种。所述有氧预培养物在30℃摇动有氧生长约24小时，直至获得约1.5至2的目标OD₆₀₀值。使用Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，Wilmington，DE)测定OD₆₀₀值并记录下来。将培养物转移至50mL管(#89039-666，VWR，Radnor，PA)，通过离心沉淀细胞并且弃去上清液。将细胞沉淀物转移至Coy厌氧袋(CoyAnaerobicBag)(GrassLake，MI)，其中将沉淀重悬于1.0mL有氧生长培养基(SEG-Ura-His)。将重悬的细胞沉淀物接种至50mL血清瓶(Wheaton，223748，Millville，NJ)中的30mLSEG-Ura-His培养基至0.2的目标起始OD₆₀₀值。在接种前使所有的厌氧培养基、血清小瓶、塞子和卷边在厌氧袋中抽气至少24小时。将血清瓶加塞、卷边并移出厌氧袋，在30℃以240rpm摇动生长。厌氧培养物生长24至72小时至至少1.2的目标OD₆₀₀值。另外的厌氧生长步骤使用来自先前厌氧培养步骤的细胞作为接种剂，保存一份上清液等分式样用于HPLC分析。对于每种变体评估三个转化子(表8中给出了结果)。

HPIC分析

取样用于HPLC分析和获取厌氧生长期结束时的OD₆₀₀值。使用带有ShodexSugarSH-G前置柱和ShodexSugarSH1011分离柱(Shodex，JMScience，GrandIsland，NY)的Waters2695分离单元，2996光电二极管阵列检测器和2414折射指数检测器(Waters，Milford，MA)，进行HPLC分析。用0.01N硫酸以0.5mL/min的流速梯度洗脱来分离化合物。用WatersEmpowerPro软件分析色谱图。

表7.异丁醇滴度K9JM变体深孔板分析

表8：异丁醇滴度：K9JM选择变体血清小瓶分析

实例5.在PNY2115中K9JM变体和衍生物的异丁醇生产

针对酵母菌株PNY2115(MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66)中异丁醇生产对实例3和实例11中制备的多个变体进行分析。

生长培养基

在酵母菌株的生长过程中使用了四种类型的培养基：SE-ura琼脂平板、SAG-2-ura琼脂平板、有氧预培养培养基和厌氧培养培养基。除非另外指明，所有化学品购自Sigma(St.Louis，MO)。

葡萄糖适应性平板(SAG-2-Ura)：50mMMES(pH5.5)，6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)、1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，3mM乙酸钠(pH7.0)，2％w/v葡萄糖，0.01％w/v亮氨酸，0.01％w/v组氨酸，0.002％w/v色氨酸。

有氧预培养培养基(SAG-0.2-Ura)：6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，3mM乙酸钠(pH7.0)，0.2％葡萄糖，0.01％w/v亮氨酸，0.01％w/v组氨酸，和0.002％w/v色氨酸。

厌氧培养培养基(SAG-3-Ura-)：50mMMES(pH5.5)，6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，3mM乙酸钠(pH7.0)，3％w/v葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.01％组氨酸，0.002％色氨酸，30mg/L烟酸，30mg/L硫胺素和10mg/L麦角固醇，组成50/50v/vTween/乙醇溶液。

转化和葡萄糖适应

制备PNY2115感受态细胞，采用Frozen-EZYeastTransformation(酵母转化)II试剂盒(ZymoResearch；Orange，CA)用1μl纯化的质粒(～0.4-0.8μg总DNA)进行转化。将转化混合物涂布至SE-ura平板，在30℃温育4天。对于每个转化子选择三个菌落涂布至SE-ura平板，在30℃温育2天。对于K9SB2_SH、K9ALL3(SEQIDNO：237)，和K9JM11采用了六个转化子。然后通过涂布至SAG-2-Ura平板并且在30℃生长2天使所述变体进行葡萄糖适应。

如上所述，将1.5mL有氧预培养培养基的等分式样分装至VWR48深孔板(#82004-674，VWR，Radnor，PA)的每个孔中，用在SAG-2-Ura琼脂平板上生长的细胞接种。使用透气覆盖件(#60941-086，VWR，Radnor，PA)密封培养平板。将所述平板置于30℃培养箱中，摇动生长24小时，当达到1.5至2.0的目标OD₆₀₀值；由SpectraMax384Plus酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)测定。记录下OD₆₀₀值。通过HeraeusMultifugeX1R离心机(ThermoScientific，Waltham，MA)和M-20平板转头(#41102742，ThermoScientific，Waltham，MA)离心沉淀平板中的细胞，弃去所得上清液。将细胞沉淀物转移至Coy厌氧袋(CoyAnaerobicBag)(GrassLake，MI)，其中将沉淀重悬于0.1mL厌氧生长培养基(如上所述)，所述厌氧生长培养基已经平衡至厌氧状态至少24小时。用沉淀/培养基悬浮液接种至VWR48深孔板(#82004-674，VWR，Radnor，PA)中的1.5mL厌氧培养培养基等分式样至0.2的起始目标OD₆₀₀值。然后用无菌金属薄片密封件(60941-076，VWR，Radnor，PA)密封所述平板，置于带有除氧包(#50-25，#10-01，MGCAnaeroPacSystem，Japan)的MGC2.5L厌氧广口瓶中，然后将广口瓶密封。将厌氧系统从CoyAnaerobicBag移出，置于30℃的培养箱中，摇动生长69小时。在第一个厌氧世代的末尾，离心细胞，保存上清液样品用于HPLC分析。如实验所指定，将沉淀用于接种后续的厌氧世代；后续的世代生长24-72小时。对于每种变体评估三个转化子。在血清小瓶研究中分析选择的变体。

血清小瓶生长过程

将在CM+glucose琼脂平板(#C3080，Teknova，Hollister，CA)上生长的细胞用20μL3M无菌乙酸钠(pH7.0)吹散，接种至125mL带过滤塞烧瓶中的10mL有氧预培养培养基的等分式样。所述有氧预培养物在30℃摇动有氧生长约24小时，直至获得约1.5至2的目标OD₆₀₀值。使用Cary300分光光度计(AgilentTechnologies，Wilmington，DE)测定OD₆₀₀值并记录下来。将培养物转移至50mL管(#89039-666，VWR，Radnor，PA)，通过离心沉淀细胞并且弃去上清液。将细胞沉淀转移至Coy厌氧袋(CoyAnaerobicBag)(GrassLake，MI)，其中将沉淀重悬于1.0mL有氧生长培养基(SAG-Ura)。将重悬的细胞物沉淀接种至50mL血清瓶(Wheaton，223748，Millville，NJ)中的30mLSAG-Ura培养基至0.2的目标起始OD₆₀₀值。在接种前使所有的厌氧培养基、血清小瓶、塞子和卷边在厌氧袋中抽气至少24小时。将血清瓶加塞、卷边并移出厌氧袋，在30℃以240rpm摇动生长。厌氧培养物生长24至72小时至至少1.2的目标OD₆₀₀值。另外的厌氧生长步骤使用来自先前厌氧培养步骤的细胞作为接种剂，保存一份上清液等分式样用于HPLC分析。对于每种变体评估三个转化子。

HPLC分析

表9.异丁醇滴度

实例6.K9JM和K9YW变体的动力学鉴定

对于特性，通过用PmeI和SfiI消化并连接至JEA1.PS.pBAD质粒(SEQIDNO：238)的对应位点，将KARI变体基因亚克隆进大肠杆菌(E.coli)表达质粒。用BioRadGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc.，Hercules，CA)所得的大肠杆菌(E.coli)转化进大肠杆菌(E.coli)Bw25113(ΔilvC)的电感受态菌株(被描述于美国专利8,129,162，该文献全文以引用方式并入本文)。将转化的克隆涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(#101320-154，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。将针对每个菌株的单个转化子划线接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。用来自这些平板的每一个的单个菌落接种至含3mLLB肉汤(含100μg/mL氨苄青霉素和0.025％(w/v)阿拉伯糖)，以225rpm摇动生长过夜。通过4000xg离心5分钟收获培养物。将细胞重悬于300ulMasterMix(EMDSciences，目录号71456-4)中。将所述混合物以16,000xg离心10分钟，收集上清液。

用BioRad蛋白质测定试剂(BioRadLaboratories，Inc.，Hercules，CA94547)测量细胞裂解液的蛋白质浓度。将0.2至1.0毫克的蛋白质粗提物添加至反应缓冲液，其包含100mMMOPSKOH，pH6.8，10mMMgCl₂，1mMEDTA，1mM葡萄糖-6-磷酸(Sigma-Aldrich)，0.2单位的肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Sigma-Aldrich)，和各种浓度的NADH或NADPH，总体积为90mL。通过加入10mL的[R/S]-乙酰乳酸至5mM的最终浓度和100mL的最终体积来起始反应。在30℃温育10分钟后，通过取出50mL的反应混合物并且添加至150mL0.1％的甲酸使反应淬灭。为了测量与NADH的反应的动力学参数，所用的辅因子浓度为0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1mM。针对与NADPH的反应所用的辅因子浓度为0.0003、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3和1mM。

为了分析2，3-二羟基异戊酸，将2mL用甲酸淬灭的反应混合物注入配备有WatersSQD质谱仪(WatersCorporation，Milford，MA)的WatersAcquityHPLC。色谱法条件为：流速(0.5ml/min)，用WatersAcquityHSST3柱(直径2.1mm，长100mm)。缓冲液A包含0.1％(v/v)水溶液，缓冲液B是0.1％甲酸的乙腈。用1％缓冲液B(缓冲液A中)分析样品1分钟，之后进行从1分钟1％缓冲液B至1.5分钟的75％缓冲液B的线性梯度洗脱。使用-30V锥孔电压电喷射离子化，通过在m/z＝133处的离子化检测所述反应产物，2，3-二羟基异戊酸。通过与可靠标准比较计算产物2，3-二羟基异戊酸的量。

为了计算V_max和辅因子K_M值，在微软EXCEL中使用最小二乘回归法，将DHIV形成速率数据拟合到单底物米氏公式(Michaelis-Mentonequation)。在表10中提供了针对与NADPH和与NADH反应的动力学参数。K9SB2_SH衍生物对于NADPH的K_M表现出1.7-3.2倍提高，对于NADHd的K_M表现出小于1.7倍变化。

表10.包含K9SB2_SH变体的大肠杆菌(E.coli)提取物的动力学参数

实例7.K9_Ursula的易错PCR

进行K9_Ursula(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)的易错PCR以生成能筛选具有对NADH减小的K_M值变体的文库。用IIEZClone域诱变试剂盒(目录号200552；AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)进行诱变PCR。引物K9G9_EZ_F1(AAACATGGAAGAATGTAAGATGGC；SEQIDNO：256)和K9G9_EZ_R1(TCAGTTGTTAATCAACTTGTCTTCG；SEQIDNO：257)是由IntegratedDNATechnologies，Inc(CoralvilleIA)商业合成的。除引物、模板、和ddH₂O外，这里所用试剂随上文提到的试剂盒提供。诱变PCR混合物包含6μl的K9_Ursula在pBAD.KARI载体(SEQIDNO：258)(243ng/μl)中、每种引物1.25μl(100ng/μl原液)、5μl的10×MutazymeII反应缓冲液、1μl的40mMdNTP混合物、1.5μl的MutazymeIIDNA聚合酶和34μl的ddH₂O。PCR反应所用条件如下：起始温度为95℃2.0分钟，之后进行30个加热/冷却循环。每个循环由95℃30秒、48℃30秒、和72℃2.0分钟组成。在温度循环结束时，将样品在72℃再保持10.0分钟，然后在4℃将待测样品回收。通过琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖，1XTBE缓冲液)将反应产物与模板分离，如制造商推荐用QIAquick凝胶提取试剂盒(目录号28704，QiagenIncorporated，Valencia，CA)进行回收。

将所分离的反应产物用作巨型引物以生成如上所述试剂盒的“EZClone反应”中的基因文库。除了巨型引物、模板和ddH₂O，这里所用的试剂随以上所述的试剂盒提供。所述反应是由25μl的2×EZClone酶混合物，6μl的巨型引物(99ng/μl)，2μl的在pBAD.KARI载体(SEQIDNO：258)(24ng/μl)中的K9_Ursula，3μl的EZClone溶液和14μl的ddH₂O组成。反应所用的条件如下：起始温度为95℃1.0分钟，之后进行30个加热/冷却循环。每个循环由95℃50秒、60℃50秒、和68℃10.0分钟组成。在温度循环结束时，将样品在72℃再保持10.0分钟，然后在4℃将待测样品回收。加入1μl的DpnI(10U/μl)，将所述混合物在37℃温育2.5小时。用DNAClean&Concentrator^TM-5(目录号D4004，ZymoResearch，IrvineCA)将所述混合物浓缩至8ul。

然后如制造商推荐，将4μl的经DpnI消化并且浓缩的“EZClone反应”产物转化50μlUltracompetent(超感受态)大肠杆菌(E.coli)细胞(在IIEZClone域诱变试剂盒中提供)。将所述转化子涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(目录号L1004，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。用含M9盐的溶液将所得的XL-Gold中的文库从琼脂平板刮下，合并，稀释进包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素的培养基，在37℃温育过夜。使用QIAprepSpinMiniprepKit(目录号2706；Qiagen，Valencia，CA)按照制造商提供的规程从所述细胞分离文库DNA。然后采用BioRadGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc.，Hercules，CA)用所扩增的文库转化大肠杆菌(E.coli)的电感受态菌株Bw25113(ΔilvC)。将转化的克隆涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(#101320-154，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。如实例8中所述，将克隆进行高通量筛选。

实例8.针对具有降低的KmNADH的变体筛选K9-UrsulaePCR文库

K9-UrsulaePCR文库的高通量筛选分析

如本文所述进行突变型KARI酶基因文库的高通量筛选：用分子纯水制备10×冷冻培养基，其包含554.4g/L甘油，68mM的(NH₄)₂SO4，4mMMgSO₄，17mM柠檬酸钠，132mMKH₂PO₄，36mMK₂HPO₄，并过滤灭菌。通过用LB培养基稀释10×冷冻培养基来制备冷冻培养基。96孔存档平板(cat#3370，CorningInc.Corning，NY)的每个孔使用了1×冷冻培养基的一份等分式样(200μL)。

选择来自LB琼脂平板的克隆并接种至包含冷冻培养剂的96孔存档平板上，在37℃静置生长过夜。然后将所述存档平板储存在-80℃。如美国专利8,129,162所述，通常将用pBAD-HisB(Invitrogen)转化的大肠杆菌(E.coli)菌株Bw25113(ΔilvC)作为负对照。所述文库的正对照是大肠杆菌(E.coli)菌株Bw25113(ΔilvC)中的pBAD.KARI载体(SEQIDNO：258)中的K9_Ursula。

将来自存档平板的克隆接种至96深孔平板。每个空包含来自解冻的存档平板的3.0μl的细胞，200μl包含100μg/ml氨苄青霉素和0.02％(w/v)阿拉伯糖(作为诱导剂)的LB培养基。细胞在80％的湿度、37℃下摇动(900rpm)生长过夜，通过离心(3750rpm，5分钟，25℃)(Eppendorf离心机，BrinkmannInstruments，Inc.Westbury，NY)收获细胞，细胞沉淀物储存在-20℃用于后续分析。

如Aulabaugh和Schloss(Aulabaugh和Schloss，Biochemistry，29：2824-2830，1990)所述合成测定底物(R，S)-乙酰乳酸。该测定法中使用的所有其它化学品购自Sigma。由KARI进行乙酰乳酸至α，β-二羟基异戊酸的酶促转化，随后用酶标仪(Saphire2，Tecan，Mannedorf，Switzerland)在340nm测量来自所述反应的辅因子NADH的氧化。使用6220M^-1cm^-1NADH的摩尔消光系数来计算活性。

同时将深孔平板和BugBuster(Novagen71456，Darmstadt，Germany)中的冷冻细胞沉淀物在室温下升温30分钟，用平板振荡器重悬细胞。升温30分钟后将75μl的50％BugBuster(v/v的水)加入每孔，使用平板振荡器重悬细胞。将带有细胞沉淀物/50％BugBuster悬浮液的平板在室温温育30分钟。用75μL重蒸水稀释细胞裂解液得到0.5X的裂解液。稀释的无细胞提取物的测定是在30℃下缓冲液中进行的，所述缓冲液包含2.4mM(R/S)-乙酰乳酸、100mMHEPESpH6.8、100mMKCl、10mMMgCl₂、75或200μMNADH和6.25或12.5μl的0.5X细胞裂解液。

鉴定K9-Urusla变体：初筛

对于每体积细胞裂解液，针对每种变体和阳性对照孔(每个平板2个)计算在75μMNADH下测得的NADH氧化与在200μMNADH下测得的NADH氧化的比率。计算出对于正对照孔的比率(每份细胞裂解液104)的平均值和标准偏差。

如果变体的这个比率高于0.785(比阳性对照高三个标准差)同时小于1，就认为该变体孔包含初始命中。在两个细胞裂解液体积之间，从5404个潜在变体库中鉴定出总共630个命中。这些初始命中被合并，从而形成一个较小的库，CL1，用于进一步分析。

鉴定K9-Ursula变体：次级筛选

采用多个方法来评估来自合并库的变体。在一种方法中，以类似于初筛的方式进行次级筛选，有改动。将合并的命中文库(CL1)以生物学一式三份培养，制备无细胞提取物并如上所述进行测定。收集速率数据并如下所述进行分析。对于CL1文库的每体积细胞裂解液，针对每种变体和阳性对照孔(每个平板2个)计算在75μMNADH下测得的NADH氧化与在200μMNADH下测得的NADH氧化的比率。这些比率被用于用下列公式计算KmNADH，其可从对于两个底物浓度的米氏公式的比率导出：

“HTS”K_m＝75(1-R)/(R-75/200)其中R＝速率比率

如果Km小于125μM并且在200μMNADH下的速率大于0.8，则认为该变体孔包含初始命中。也从显示出速率比率大于0.617的变体(不管在200μMNADH下的速率)收集命中。表11中提供了这些变体的比率和“HTS”Km值。

在另一个方法中，用酶标仪手动进行酶测定测量了来自合并文库的多个变体的NADHK_M值。将来自CL1存档平板的克隆接种至96深孔板。每个空包含来自解冻的存档平板的3.0μl的细胞，200μl包含100μg/ml氨苄青霉素和0.02％(w/v)阿拉伯糖(作为诱导剂)的LB培养基。细胞在80％的湿度、37℃下摇动(900rpm)生长过夜，通过离心(3750rpm，5分钟，25℃)(Eppendorfcentrifuge，BrinkmannInstruments，Inc.Westbury，NY)收获细胞并且在-20℃下储存细胞沉淀物用于后续分析。

将细胞沉淀解冻并重悬于20μLBugBusterMasterMix(Novagen#)中，在室温温育15分钟。每孔加入140μl的20mMHEPES(pH6.8)。将平板在4℃下以4,000rpm离心10分钟。将120μl的上清液(CFE)转移至96孔板(Corning3370)。

为了测定“平板”对于NADH的K_M，在各种NADH浓度(50，100，200和400μM)下测定CFE。在30℃下包含100mMHEPES(pH6.8)，10mMMgCl₂，5.2mM(R/S)-乙酰乳酸和一定浓度NADH的缓冲液中进行测定。在96孔平底板(Corning3370)的每个孔中加入所述缓冲液的180μL等分式样，每孔加入20μl的CFE以起始反应。通过使用SpectraMax384plus酶标仪(MolecularDevices)在340nm处测量NADH至NAD⁺的氧化速率来测定S-乙酰乳酸至DHIV的转化速率。所有检测长2分钟，每个孔每15秒钟被读取一次。通过比活性(U/mg)对辅因子浓度作图计算K_M值，所述数据拟合米氏公式。在表11中包括了通过上述HTS筛选鉴定的命中的“平板”K_M值。

K9-Ursula变体的序列分析

使用TempliPhi^TM(GEHealthcare)完成在次级HTS筛选中鉴定的变体的DNA测序，所用引物为pBAD-For(ATGCCATAGCATTTTTATCC；SEQIDNO：260)和pBAD-Rev(CTGATTTAATCTGTATCAGGCT；SEQIDNO：261)。表11中示出了所述序列。

表11.KARI变体

na-不能从该数据计算出Km值

实例9.K9_Ursula衍生物的动力学鉴定

选择来自实例8的若干K9_Ursula衍生物用于动力学鉴定。在大肠杆菌(E.coli)中表达多个变体并如实例6所述进行分析。表12中提供了以NADH和NADPH作为辅因子的KARI反应的动力学参数。分析了包含T191S(#1和#2)的相同氨基酸替换的两个独立克隆。观察到在位置58和191处的氨基酸替换降低了NADH的K_M。

表12.包含K9_Ursula衍生物的大肠杆菌(E.coli)提取物的动力学参数

实例10.制备和鉴定在位置53处带有替换的K9_Ursula衍生物

在K9_Ursula中位置53处变体的生成

通过定点诱变将位置53处的氨基酸替换单个地掺入，在大肠杆菌(E.coli)中表达所得的变体并进行鉴定。用QuikChangeLightning定点诱变试剂盒(目录号210518；AgilentTechnologies，StratageneProductsDivision，LaJolla，CA)进行K9_Ursula的定点诱变。在表13中列出的引物是由IntegratedDNATechnologies，Inc(CoralvilleIA)商业合成的。如表13中所示，引物被合并为四种混合物(标记为“混合物”的列)。

表13.定点诱变采用的引物混合物

除了引物、模板和ddH₂O，随上述试剂盒提供了这里所用的所有试剂。诱变反应混合物包含1μl在pBAD.KARI(50ng/μl)中的K9_Ursula，1μl的每种引物混合物(总引物浓度11.5uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。反应所用条件如下：起始温度为95℃2分钟，随后是18个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、60℃10秒、和68℃4.0分钟组成。在温度循环结束时，将样品在68℃温育5.0分钟，然后在4℃将待测样品回收。每个反应加入2μl的DpnI，并且将所述混合物在37℃温育30分钟。

按照制造商的说明，将2μl的每个诱变反应转化进OneTOP10化学感受态大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，目录号C404003)。将所述转化子涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(目录号L1004，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。然后选择多个转化子用于基于TempliPhi^TM(GEHealthcare)的DNA测序，所用引物为pBAD-For(ATGCCATAGCATTTTTATCC；SEQIDNO：260)和pBAD-Rev(CTGATTTAATCTGTATCAGGCT；SEQIDNO：261)。具有已证实为KARI序列的转化子被接种至包含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基并且在37℃下以225rpm摇动温育。使用QIAprepSpinMiniprepKit(目录号2706；Qiagen，Valencia，CA)按照制造商提供的规程从所述细胞分离质粒DNA。

位置53处的变体的鉴定

在大肠杆菌(E.coli)菌株Bw25113(ΔilvC)中表达K9_Ursula和在位置53处包含替换的衍生物子组，并且如实例6中所述进行鉴定。表14中提供了与NADH和与NADPH反应的动力学参数。将包含替换F53L和F53I的K9_Ursula衍生物分别命名为K9_Lucy(SEQIDNO：300)和K9_Ilya(SEQIDNO：301)(表14)。

表14A.包含Phe53变体的大肠杆菌(E.coli)裂解液的动力学参数

表14B.在K9_Ursula、K9_Lucy、K9_Ilya中的氨基酸替换

变体	氨基酸SEQ ID NO：	氨基酸替换
			K9_Ursula	239	Y53F，S56V，K57E，S58E，N87P
K9_Lucy	300	Y53L，S56V，K57E，S58E，N87P
			K9_Ilya	301	Y53I，S56V，K57E，S58E，N87P

K9_Lucy和K9_Ilya的纯化和动力学分析

对于表达和鉴定，采用BioRadGenePulserII(Bio-RadLaboratoriesInc.，Hercules，CA)将大肠杆菌(E.coli)质粒(pBAD.KARI)用于转化大肠杆菌(E.coli)Bw25113(ΔilvC)的电感受态菌株。将转化的克隆涂布在包含LB培养基和100μg/ml氨苄青霉素(#101320-154，TeknovaInc.Hollister，CA)的琼脂平板上，在37℃温育过夜。将针对每个菌株的单个转化子划线接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。将来自这些平板的每一个的单个菌落接种带有100μg/mL氨苄青霉素的10mLLB肉汤。这些培养物在37℃下，在带有通气过滤塞的125mL带挡板烧瓶中摇动培养8小时。用200μl的该培养物接种两个带有通气过滤塞的500mL带挡板烧瓶，其包含带有100μg/mL氨苄青霉素和0.2％(w/v)阿拉伯糖的LB肉汤。所述表达培养物在37℃下摇动培养16-18小时。通过离心收获细胞为40mL等分式样；弃去上清液，将细胞沉淀物冻存在-80℃直至纯化。

使用相同方法纯化K9_Lucy和K9_Ilya变体。将两份细胞沉淀物(每个代表40mL细胞培养物等分式样)重悬于4mLBugBusterMasterMix(Novagen71456，Darmstadt，Germany)中，在室温温育15分钟，之后是60℃温育15分钟。在4℃下通过7,000rpm离心30分钟获得变性蛋白质和细胞碎片沉淀。滗出上清液，用Acrodisc0.2μm注射器过滤器(PN4192，Pall，AnnArbor，MI)过滤。使用GEHealthcareHiLoad26/60Superdex200凝胶过滤柱(17-1071-01，Buckinghamshire，England)从过滤热处理过的无细胞提取物纯化K9_Lucy和K9_Ilya。在加载蛋白质之前，用0.2柱体积的50mMHEPES(pH7.5)5mMMgCl₂缓冲液以2.0mL/min的流速预平衡柱子。经1.5柱体积的等梯度步骤洗脱K9_Lucy和K9_Ilya，其包括50mMHEPES(pH7.5)5mMMgCl₂缓冲液以2.0mL/min的流速。用Frac-950级分收集器(Buckinghamshire，England)以螺线型模式收集体积为2.5mL的级份。变体全部洗脱在级份D5-E5或D6-E4之间。用15mLAmiconUltraYM-30spinfilter(超滤管)(UFC903008，Millipore，Billercia，MA)合并级份并用10mL100mMHEPES(pH6.8)和10mMMgCl₂缓冲液洗涤。弃去滤液，用1mL包含100mMHEPES(pH6.8)和10mMMgCl₂的缓冲液将经纯化的蛋白质从膜上洗脱。以如实例6中所述对于大肠杆菌(E.coli)粗提物相同的方式测定经纯化的蛋白质的动力学参数(表15)。

表15.经纯化的K9_Ursula衍生物的动力学值

实例11.定点诱变K9YW和K9JM变体和衍生物

进行K9SB2_SH衍生物的定点诱变以掺入另外的氨基酸替换。如实例10中所述进行诱变，有改动。对于用在酵母穿梭质粒中的变体进行的诱变反应，在温度循环过程中的68℃步骤从4.0分钟增加至10分钟。

变体K9ALL3(在酵母穿梭质粒中)来源于K9YW25，所用引物为AlaLL1(CCAGATGAAGCTCAGGCTTTGTTGTACAAAAACGACATCGAACC；SEQIDNO：807)和AlaLL1rev(GGTTCGATGTCGTTTTTGTACAACAAAGCCTGAGCTTCATCTGG；SEQIDNO：808)。所述诱变反应包含1μlK9YW25_DHAD(通过实例1中诱变K9SB2_SH_DHAD生成)(50ng/μl)，1ul的引物ALL1和ALL1rev混合物(每种10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。为了在大肠杆菌(E.coli)中表达，将K9ALL3基因亚克隆进JEA1.PS.pBAD质粒(SEQIDNO：238)的PmeI和SfiI位点。

变体K9ALL191(在大肠杆菌(E.coli)表达质粒中)来源于K9ALL3，所用引物为T191S(CTTGGAAACTACCTTCAGATCCGAAACTGAAACCGACTTGTTC；SEQIDNO：809)和T191Srev(GAACAAGTCGGTTTCAGTTTCGGATCTGAAGGTAGTTTCCAAG；SEQIDNO：810)。所述诱变反应包含1μl在pBAD.KARI(SEQIDNO：530)质粒(50ng/μl)中的K9ALL3，1μl的引物混合物(每种10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。

变体K9ALL254(在大肠杆菌(E.coli)表达质粒中)来源于K9ALL3，所用引物为Y254F(GTTTCTCCGGTATGCGTTTCTCTATCTCCAACACTG；SEQIDNO：811)和Y254Frev(CAGTGTTGGAGATAGAGAAACGCATACCGGAGAAAC；SEQIDNO：812)。诱变反应包含1μl在pBAD.KARI质粒(50ng/μl)中的K9ALL3，1μl上述引物的混合物(每种10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。

变体K9ALL278(在大肠杆菌(E.coli)表达质粒中)来源于K9ALL3，所用引物为K278M(CATTACTGAAGATACCAAGATGGCTATGAAGAAGATTTTGTCTGAC；SEQIDNO：813)和K278Mrev(GTCAGACAAAATCTTCTTCATAGCCATCTTGGTATCTTCAGTAATG；SEQIDNO：814)。所述诱变反应包含1μl在pBAD.KARI质粒(50ng/μl)中的K9ALL3，1μl上述引物的混合物(每种10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。

变体K9JM191(在大肠杆菌(E.coli)表达质粒中)来源于K9JM11，所用引物为T191S(CTTGGAAACTACCTTCAGATCCGAAACTGAAACCGACTTGTTC；SEQIDNO：815)和T191Srev(GAACAAGTCGGTTTCAGTTTCGGATCTGAAGGTAGTTTCCAAG；SEQIDNO：816)。所述诱变反应包含1μl在pBAD.KARI(SEQIDNO：259)(50ng/μl)中的K9JM11，1μl引物的混合物(每种10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。针对酵母研究，将K9JM191亚克隆进K9_David_DHAD的PmeI和SfiI位点。

变体K9YW25-T191S(在大肠杆菌(E.coli)表达质粒中)来源于K9YW25，所用引物为T191S(CTTGGAAACTACCTTCAGATCCGAAACTGAAACCGACTTGTTC；SEQIDNO：817)和T191Srev(GAACAAGTCGGTTTCAGTTTCGGATCTGAAGGTAGTTTCCAAG；SEQIDNO：818)。所述诱变反应包含1μl在pBAD.KARI(50ng/μl)中的K9YW25，1μl的T191S和T191Srev混合物(每种为10uM)，2.5μl的10×反应缓冲液，0.5μl的dNTP混合物，0.75μl的QuikSolution试剂，0.5μl的QuikChangeLightning酶和19.25μl的ddH₂O。反应所用条件如下：起始温度为95℃2分钟，随后是18个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、60℃10秒、和68℃3.0分钟组成。在温度循环结束时，将样品在68℃温育5.0分钟，然后在4℃将待测样品回收。

变体K9ALL258(在酵母穿梭质粒中)来源于K9ALL3，所用引物为258-1(GGTATGCGTTACTCTATCTCCTCCACTGCTGAATACGGTGACTAC；SEQIDNO：819)

和258-1r(GTAGTCACCGTATTCAGCAGTGGAGGAGATAGAGTAACGCATACC；SEQIDNO：820)。所述诱变反应包含1μlpLH689：：ALL3(SEQIDNO：304)(50ng/μl)，1ul引物258-1和258-1r的混合物(每种10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH2O。

采用包含K9ALL3和K9JM11模板的诱变反应制备在酵母穿梭质粒中另外的变体。每个反应包含0.5μlK9JM11_DHAD(50ng/μl)，0.5μlK9ALL3_DHAD(SEQIDNO：533)(50ng/μl)，1μl表中列出引物的混合物(每种引物10uM)，5μl的10×反应缓冲液，1μl的dNTP混合物，1.5μl的QuikSolution试剂，1μl的QuikChangeLightning酶和39.5μl的ddH₂O。

表16.用于定点诱变K9ALL3/K9JM11的引物混合物

在表中提供了所制备变体的氨基酸替换。

表17.K9SB2_SH变体的氨基酸替换

实例12.定点K9变体的动力学鉴定

在大肠杆菌(E.coli)中表达在实例11中制备的所述变体的子组，并如实例6所述进行分析。将实例3中所述的三个另外的变体(K9JM36、K9JM43、K9JM44)亚克隆至JEAl.PS.pBAD质粒(SEQIDNO：238)的PmeI和SfiI位点，在大肠杆菌(E.coli)中表达，并且以相同方式进行分析。表18中提供了以NADH和NADPH作为辅因子的KARI反应的动力学参数。

表18.包含K9变体的大肠杆菌(E.coli)提取物的动力学参数

实例13

构建靶向位置158的位点饱和基因文库并且在PNY2068中筛选所得变体的异丁醇生产

使用正向引物混合物(在本实例中称为K9158f)和反向引物K9_309T_111711r：CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(SEQIDNO：415：在本实例中称为K9_309Tr)来创建靶向K9KARI的位置158的单位置包含文库，所述正向引物混合物包含编码在对应于野生型AnaerostipescaccaeKARI序列(SEQIDNO：93)(表19)的位置158处的所有19种单个氨基酸改变的引物。包含变体K9SB2_SH(质粒K8SB2_SH_81；SEQIDNO：532)的质粒被用作模板。

简而言之，通过常规PCR制备巨型引物。所述巨型引物PCR混合物由45ml的SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA，#10572063)，2.0ml的K9_158f(20mM)，2.0ml的K9_309Tr(20mM)和1.0ml的模板(50ng/μl)组成。用于制备巨型引物的PCR程序为：起始温度为95℃1.0分钟，之后进行35个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、55℃20秒、和72℃1.0分钟组成。然后用实例5中所示的相同步骤(提交于2012年3月23日的美国申请13/428585，以引用方式并入本文)，用巨型引物将突变导入K9SB2_SH。将所述PCR产物转化进大肠杆菌(E.coli.)Bw25113(ΔilvC)，并且对克隆测序。.

分析所得的带有独特序列连同K8SB2_SH_81的变体在酵母菌株PNY2068中的异丁醇生产(每个突变体三次)。将具有K9KARI变体的质粒和质粒pYZ067ΔADHΔKivD转化进酵母菌株PNY2068。经转化的细胞涂布在不含组氨酸和尿嘧啶的合成培养基上(1％乙醇作为碳源)。将三个转化子转移至相同培养基的新平板上。在48孔平板(Axygen，UnionCity，CA#391-05-061)中，在厌氧条件下测试所述转化子的异丁醇生产。还在15ml血清小瓶中，在厌氧条件下测试有希望的转化子的异丁醇生产。

在5-7天后出现了在SE-Ura-His平板上转化而成的酵母菌落。将来自每种变体的三个菌落接种至新的SE-Ura-His平板，在30℃温育3天。

生长培养基和步骤

在酵母菌株的生长过程中使用了两种类型的培养基：一种有氧预培养培养基和一种厌氧培养培养基。除非另外指明，所有化学品购自Sigma(St.Louis，MO)。

有氧预培养培养基(SE-Ura)：6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，0.2％乙醇，0.2％葡萄糖，0.01％w/v亮氨酸，0.002％w/v组氨酸，和0.002％w/v色氨酸。

厌氧培养培养基(SEG-Ura-His)：50mMMES(pH5.5，6.7g/L酵母氮源基础不含氨基酸(Difco，291940，Sparks，MD)，1.4g/L酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶，0.1％乙醇，3％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.002％w/v组氨酸，0.002％色氨酸，30mg/L烟酸，30mg/L硫胺素和10mg/L麦角固醇，组成50/50v/vTween/乙醇溶液。

将小块的细胞接种至48孔板。每个孔包含1.5ml有氧培养基。将所述平板用可渗透的箔覆盖，在30℃摇动培养过夜。然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。计算出使得每孔具有0.2的最终OD₆₀₀的1.5ml细胞悬液的细胞数量，用厌氧培养基制备1.5ml细胞悬液并加入每个孔。使用厌氧箱按照制造商规程(CoyLaboratoryProductsInc.GrassLake，MI)除去48孔板中的氧气。然后将细胞在30℃摇动培养两天。厌氧培养两天后，然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。细胞在4,000g离心5分钟，收集上清液使用液相色谱/质谱(LC/MS)测量异丁醇。

基于48孔板的数据，选择表现最佳的制成小块。将小块的细胞接种至24孔板。每个孔包含3.0ml有氧培养基。将所述平板用可渗透的箔覆盖，在30℃摇动培养过夜。然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。计算出使得每个小瓶具有0.2的最终OD₆₀₀的10ml细胞悬液(在厌氧培养基中)的细胞数量，用厌氧培养基制备10ml细胞悬浮液并加入至每个小瓶。将每个小瓶封盖，然后细胞在30℃下摇动培养两天。厌氧培养两天后，然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。细胞在4,000g离心5分钟，收集上清液使用液相色谱/质谱(LC/MS)测量异丁醇。

液相色谱/质谱(LC/MS)分析具有K9KARI突变体的酵母菌株

在厌氧生长期结束时取样用于液相色谱/质谱(LC/MS)分析。采用带有WatersAcQuityUPLCHSST3分离柱(Waters，Milford，MA)的WatersAcQuityUPLC分离单元和AcQuityTQDtriplequad质谱仪(Waters，Milford，MA)进行液相色谱/质谱(LC/MS)分析。使用水(+0.1％甲酸)和乙腈(+0.1％甲酸)的反向梯度分离化合物，所述反向梯度以99％水溶液起始，以99％有机溶液结束，流速为0.5mL/min。用WatersMasslynx4.1软件(Waters，Milford，MA)分析色谱图。用WatersQuanlynx软件(Waters，Milford，MA)，利用标准品的一式三份分析的校准曲线来计算异丁醇的微摩尔收率。

表19.正向引物

表20.在菌株PNY2068中一些K9变体的异丁醇生产

实例14

构建靶向位置67的位点饱和基因文库并且在PNY2115中筛选所得变体的异丁醇生产

使用正向引物混合物(在本实例中称为K967f)和反向引物K9_309T_111711r：CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(SEQIDNO：415；在本实例中称为K9_309Tr)来创建靶向K9KARI的位置67的单位点饱和文库，所述正向引物混合物包含编码在对应于野生型AnaerostipescaccaeKARI序列(SEQIDNO：93)(表21)的位置67处的所有19种单个氨基酸改变的引物。包含变体K9SB2_SH(K8SB2_SH_81；SEQIDNO：532)的质粒被用作模板。

简而言之，通过常规PCR制备巨型引物。所述巨型引物PCR混合物由45ml的SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA，#10572063)，2.0ml的K9_67f(20mM)，2.0ml的K9_309Tr(20mM)和1.0ml的模板(50ng/μl)组成。用于制备巨型引物的PCR程序为：起始温度为95℃1.0分钟，之后进行35个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、55℃20秒、和72℃1.0分钟组成。如制造商建议用DNAcleaningkit(DNA纯化试剂盒)(目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA)纯化PCR产物。

然后使用QuickChangeLightningkit(Stratagene#210518，LaJollaCA)，用巨型引物生成基因文库。25ml的反应混合物包含：2.5ml的10x反应缓冲液，0.5ml的50ng/μl模板，20.25ml的巨型引物，0.5ml的40mMdNTP混合物，0.5ml的酶混合物和0.75mlQuickSolution。除了巨型引物和模板，这里所用的所有试剂随上述试剂盒提供。将该反应混合物置于薄孔的容量为200ml的PCR管中，PCR所用反应如下：起始温度为95℃2分钟，随后是20个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、60℃10秒和68℃5分钟组成。在温度循环结束时，再将样品保持在68℃10分钟，然后保持4℃用于后续处理。在反应完的PCR反应混合物中加入0.5ml的DpnI，然后在37℃温育2小时。如制造商建议用DNAcleaningkit(DNA纯化试剂盒)(目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA)纯化PCR产物。将所述PCR产物转化进大肠杆菌(E.coli)Bw25113(ΔilvC)，并将克隆测序。

分析所得的带有独特序列连同K8SB2_SH_81的变体在酵母菌株PNY2115中的异丁醇生产(每个突变体三次)。将具有K9KARI变体的质粒和质粒pYZ067ΔADHΔKivD转化进酵母宿主PNY2115。经转化的细胞涂布在不含组氨酸和尿嘧啶的合成培养基上(1％乙醇作为碳源)。将三个转化子转移至相同培养基的新平板上。在48孔平板(Axygen，UnionCity，CA#391-05-061)中，在厌氧条件下测试所述转化子的异丁醇生产。还在15ml血清小瓶中，在厌氧条件下测试有希望的转化子的异丁醇生产。

生长培养基和步骤

将小块的细胞接种至48孔板。每个孔包含1.5ml有氧培养基。将所述平板用可渗透的箔覆盖，在30℃摇动培养过夜。然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。计算出使得每孔具有0.2的最终OD₆₀₀的1.5ml细胞悬液的细胞数量，用厌氧培养基制备1.5ml细胞悬液并加入每个孔。用铝箔密封48孔平板。然后将细胞在30℃摇动培养三天。厌氧培养三天后，然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。细胞在4,000g离心5分钟，收集上清液使用液相色谱/质谱(LC/MS)测量异丁醇。

基于48孔板的数据，选择表现最佳的制成小块。将小块的细胞接种至24孔板。每个孔包含3.0ml有氧培养基。将所述平板用可渗透的箔覆盖，在30℃摇动培养过夜。然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。计算出使得每个小瓶具有0.2的最终OD₆₀₀的10ml细胞悬液(在厌氧培养基中)的细胞数量，用厌氧培养基制备10ml细胞悬浮液并加入至每个小瓶。将每个小瓶封盖，然后细胞在30℃下摇动培养两天。厌氧培养三天后，然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。细胞在4,000g离心5分钟，收集上清液使用液相色谱/质谱(LC/MS)测量异丁醇。

液相色谱/质谱(LC/MS)分析具有K9KARI突变体的酵母菌株

表22.正向引物

表23.在菌株PNY2115中一些K9变体的异丁醇生产

实例15

构建靶向位置162的位点饱和基因文库并且在PNY2115中筛选所得变体的异丁醇生产

使用正向引物混合物(在本实例中称为K9162f)和反向引物K9_309T_111711r：CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(SEQIDNO：415；在本实例中称为K9_309Tr)来创建靶向K9KARI的位置162的单位点饱和文库，所述正向引物混合物包含编码在对应于野生型AnaerostipescaccaeKARI序列(SEQIDNO：93)(表24)的位置162处的所有19种单个氨基酸改变的引物。包含变体K9SB2_SH(或K8SB2_SH_81)的质粒被用作模板。

简而言之，通过常规PCR制备巨型引物。所述巨型引物PCR混合物由45ml的SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA，#10572063)，2.0ml的K9_162f(20mM)，2.0ml的K9_309Tr(20mM)和1.0ml的模板(50ng/μl)组成。用于制备巨型引物的PCR程序为：起始温度为95℃1.0分钟，之后进行35个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、55℃20秒、和72℃1.0分钟组成。如制造商建议用DNAcleaningkit(DNA纯化试剂盒)(目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA)纯化PCR产物。

生长培养基和步骤

基于48孔板的数据，选择表现最佳的制成小块。将小块的细胞接种至24孔板。每个孔包含3.0ml有氧培养基。将所述平板用可渗透的箔覆盖，在30℃摇动培养过夜。然后测量细胞密度(OD600)。计算出使得每个小瓶具有0.2的最终OD₆₀₀的10ml细胞悬液(在厌氧培养基中)的细胞数量，用厌氧培养基制备10ml细胞悬浮液并加入至每个小瓶。将每个小瓶封盖，然后细胞在30℃下摇动培养两天。厌氧培养三天后，然后测量细胞密度(OD₆₀₀)。细胞在4,000g离心5分钟，收集上清液使用液相色谱/质谱(LC/MS)测量异丁醇。

液相色谱/质谱(LC/MS)分析具有K9KARI突变体的酵母菌株

表25.正向引物

表26.在菌株PNY2115中一些K9变体的异丁醇生产

实例16

构建靶向位置312的位点饱和基因文库并且在PNY2115中筛选所得变体的异丁醇生产

使用正向引物混合物(在本实例中称为K9312r)和反向引物K9_219_032212f：GAAGCTGCTAAGAAGGCTGACATC(SEQIDNO：473；在本实例中称为K9219f)来创建靶向K9KARI的位置312的单位点饱和文库，所述正向引物混合物包含编码在对应于野生型AnaerostipescaccaeKARI序列(SEQIDNO：93)(表27)的位置312处的所有19种单个氨基酸改变的引物。包含变体K9SB2_SH(或K8SB2_SH_81)的质粒被用作模板。

简而言之，通过常规PCR制备巨型引物。所述巨型引物PCR混合物由45ml的SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA，#10572063)，2.0ml的K9_219f(20mM)，2.0ml的K9_312r(20mM)和1.0ml的模板(50ng/μl)组成。用于制备巨型引物的PCR程序为：起始温度为95℃1.0分钟，之后进行35个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、55℃20秒、和72℃1.0分钟组成。如制造商建议用DNAcleaningkit(DNA纯化试剂盒)(目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA)纯化PCR产物。

生长培养基和步骤

液相色谱/质谱(LC/MS)分析具有K9KARI突变体的酵母菌株

表28.正向引物

表29.在菌株PNY2115中K9变体的异丁醇生产

表30.在菌株PNY2115中K9变体的异丁醇生产

实例17

构建靶向位置169的位点饱和基因文库并且在PNY2115中筛选所得变体的异丁醇生产

使用正向引物混合物(在本实例中称为K9_169f)和反向引物K9_309T_111711r：CTTTCTCATAGCCTTAGTGTGGAC(SEQIDNO：415；在本实例中称为K9_309Tr)来创建靶向K9KARI的位置169的单位置包含文库，所述正向引物混合物包含编码在对应于野生型AnaerostipescaccaeKARI序列(SEQIDNO：93)(表31)的位置169处的所有19种单个氨基酸改变的引物。包含变体K9SB2_SH(或K8SB2_SH_81)的质粒被用作模板。

简而言之，通过常规PCR制备巨型引物。所述巨型引物PCR混合物由45ml的SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA，＃10572063)，2.0ml的K9_169f(20mM)，2.0ml的K9_309Tr(20mM)和1.0ml的模板(50ng/μl)组成。用于制备巨型引物的PCR程序为：起始温度为95℃1.0分钟，之后进行35个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、55℃20秒、和72℃1.0分钟组成。如制造商建议用DNAcleaningkit(DNA纯化试剂盒)(目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA)纯化PCR产物。

然后使用QuickChangeLightningkit(Straagene#210518，LaJollaCA)，用巨型引物生成基因文库。25ml的反应混合物包含：2.5ml的10x反应缓冲液，0.5ml的50ng/μl模板，20.25ml的巨型引物，0.5ml的40mMdNTP混合物，0.5ml的酶混合物和0.75mlQuickSolution。除了巨型引物和模板，这里所用的所有试剂随上述试剂盒提供。将该反应混合物置于薄孔的容量为200ml的PCR管中，PCR所用反应如下：起始温度为95℃2分钟，随后是20个加热/冷却循环。每个循环由95℃20秒、60℃10秒和68℃5分钟组成。在温度循环结束时，再将样品保持在68℃10分钟，然后保持4℃用于后续处理。在反应完的PCR反应混合物中加入0.5ml的DpnI，然后在37℃温育2小时。如制造商建议用DNAcleaningkit(DNA纯化试剂盒)(目录号D4003，ZymoResearch，Orange，CA)纯化PCR产物。将所述PCR产物转化进大肠杆菌(E.coli)Bw25113(ΔilvC)，并将克隆测序。

生长培养基和步骤

液相色谱/质谱(LC/MS)分析具有K9KARI突变体的酵母菌株

表31.正向引物

表31.在菌株PNY2115中K9变体的异丁醇生产

实例18K9_Lucy_SH变体

制备基于K9_Lucy_SH(nucleicacidSEQIDNO：806)的另外的变体：缺失5个N-末端氨基酸的K9_Lucy的截短形式，并亚克隆进酵母表达质粒pLH689(SEQIDNO：306)的PmeI和SfiI位置。将质粒转化进菌株PNY2115，并如实例5中所述分析异丁醇生产。

表32.异丁醇滴度和LucySH变体的氨基酸替换

实施例19

用承载KARI变体的菌株发酵

表33中列出了7种包含异丁醇生物合成途径的酿酒酵母菌株。示出的这些菌株全部基于亲本菌株PNY2145(公开于PCT公开WO/2013/102147和美国申请公布20130252296，两者以引用方式并入)，并且除了KARI变体(其显示于表中)，表33中所有的菌株包含下列异丁醇生物合成途径的催化底物至产物转化的酶(其中用“(y)”标明的，由针对酵母表达优化过密码子的基因编码)：乙酰乳酸合酶(“AlsS”；氨基酸SEQIDNO：827和编码SEQIDNO：826；二羟酸脱水酶(“L2V4”；分别为SEQIDNO：821和822；酮异戊酸脱羧酶(“kivD_Lg”；分别为SEQIDNO：825和543)，和醇脱氢酶(“Bi”；分别为SEQIDNO：823和824)。供参考，提供了与在指定菌株中异源表达的KARI相关联体外动力学测量。

以相同规程进行发酵，虽然没有并行运行。制备每种菌株并与甘油冻存。将每种菌株的小瓶解冻，并用于生成实验室培养基(酵母氮源基础不含氨基酸(Difco)，6.7g/L；酵母氨基酸缺陷型合成培养基补充剂不含组氨酸和尿嘧啶(Formedium)，3.7g/L；硫胺素HCl，2mg；烟酸，2mg；MES缓冲液，100mM；pH5.5)中的种菌，在2L的带挡板烧瓶中的终体积为200mL，在30℃下以260rpm(摇动)培养，至在600nM下测得约1OD的细胞密度。

用经过滤灭菌并带有下述添加的玉米醪同时进行种子增殖发酵和生产发酵。使用带温度控制和搅拌器的加热板(VWR，USA)在开口容器中通过液化制备过滤灭菌的玉米醪。将5350g自来水预热至约50℃。将用于液化的SpezymeFRED-L(Genencor，USA)制备成47g/L原液，离心并过滤灭菌。将100mL的酶原液加入容器中。加入约3000g的玉米固体。将温度控制在55℃搅拌20分钟。之后，将温度升高到85℃。将温度控制在85℃搅拌90分钟。此后关闭加热板。当温度冷却至50℃时，对玉米醪和容器称重，替换因蒸发损失的水。将容器的内容物分配到八个1L离心瓶，在SorvallRC12(USA)落地式离心机中以8000rpm离心40分钟。用4层纱布过滤上清液。将滤液分配至六个1L玻璃瓶中，在121℃高压消毒20分钟。将滤液以5000RPM另外离心90分钟。将滤清加热至35-40℃并在0.22微米的过滤瓶(Nalgene)中过滤。

用烧瓶培养基接种带有增殖培养基的2LSartorius发酵罐(接种后的终浓度：过滤灭菌的玉米醪，350mL；尿素，2g/L；酵母提取物(Difco)，2g/L；烟酸，30mg/L；硫胺素，30mg/L；去离子水，至终体积560mL培养基)；使用140mL的培养物和560mL的增殖培养基。运行发酵罐，将溶解氧控制在5％，气流为0.3SLPM，用2MKOH控制pH为5.2，温度控制在30℃。定期加入DistillaseL400(Genencor；用去离子水制备成1.2g/80mL的原液，通过0.2μm的滤器过滤)以保持葡萄糖过量。培养进行直至获得在600nM处测得约4-5OD的细胞密度。

在2LSartorius发酵罐中用生产培养基进行生产发酵(过滤灭菌的玉米醪，790mL；尿素，2g/L；烟酸，30mg/L；硫胺素，30mg/L)，用110mL的增殖培养物接种。运行生产发酵，带有0.3SLPM氮叠层，用2MKOH控制pH为5.2，温度控制在30℃，搅拌速度控制在300rpm。定期加入DistillaseL400以保持葡萄糖过量。发酵运行45-52小时。定期取样以测量所有途径中间体和其它代谢物，以及OD和干细胞重。培养物上清液中葡萄糖、异丁醇、和其它发酵副产物的测量通过HPLC进行，使用了Bio-RadAminexHPX-87H柱(Bio-Rad，USA)、折射率(RI)和二极管阵列(210nm)检测器、WatersHPLC(Waters，USA)。色谱分离使用0.01NH2SO4作为流动相，以0.6mL/min流速和40℃的柱温进行。通过质谱(Thermo)分析来自发酵的废气为N2，O2，CO2，和异丁醇。通过酶分析法分析淀粉，用淀粉葡萄糖苷酶(Roche)水解淀粉，之后对所得葡萄糖进行HPLC分析。

在每个发酵结束时测量得自葡萄糖的甘油和异丁醇的摩尔收率，并示于图3中。计算对于每个发酵的碳平衡并用于校正在发酵过程中的异丁醇损失。K9JB4PKARI菌株得到的摩尔收率为甘油0.17mol/mol和异丁醇0.79mol/mol。将用包含KARIK9SB2或K9SB2-SH的菌株发酵聚在一起，得到摩尔收率为甘油0.13-0.15mol/mol和异丁醇0.82-0.83mol/mol。用带有KARIK9ALL3、K9JM36、K9JM43或K9JM44的菌株发酵得到摩尔收率为甘油0.12-0.13mol/mol和异丁醇0.85-0.86mol/mol。

在表12中示出了在发酵试验中评估的多个KARI的体外动力学特征并列在下面的表33中。在表中也示出了通过本领域描述的方法(参见，例如，美国申请公布US20130071898A1，实例18，以引用方式并入本文)收集的K9JB4P和K9SB2(描述于美国申请公布US20130071898A1，以引用方式并入本文)纯化的蛋白质的特性(单位是V_maxofU/mg纯化蛋白质)。图3A-3B示出了对于每种发酵的甘油摩尔收率(图3A)和异丁醇摩尔收率(图3B)。表34中总结了计算出的对于每种菌株在厌氧生产阶段的初始生长速率。

表33：在发酵试验中评估的多个KARI的体外动力学特征

表33中的菌株说明如下：(1)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYClt-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒：pLH689：L2V4)；(2)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYClt-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒：pRS413：：BiADH-kivD_Lg)；(3)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒pRS413：：BiADH-kivD_Lg)；(4)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒：pLH689-L2V4：：ALL3*，pRS413：：BiADH-kivD_Lg)；(5)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒：pLH689-L2V4：：JM36*，pRS413：：BiADH-kivD_Lg)；(6)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒：pLH689-L2V4：：JM43*，pRS413：：BiADH-kivD_Lg)；和(7)MATaura3Δ：：loxPhis3Δpdc5Δ：：P[FBA(L8)]-XPK|xpk1_Lp-CYCt-loxP66/71fra2Δ2-μ质粒(CEN.PK2)pdc1Δ：：P[PDC1]-ALS|alsS_Bs-CYC1t-loxP71/66pdc6Δ：：(UAS)PGK1-P[FBA1]-KIVD|Lg(y)-TDH3t-loxP71/66adh1Δ：：P[ADH1]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66fra2Δ：：P[ILV5]-ADH|Bi(y)-ADHt-loxP71/66gpd2Δ：：loxP71/66amn1Δ：：AMN1(质粒：pRS413：：BiADH-kivD_Lg，pLH689-L2V4：：JM4)。

表34：在该实例中所述条件下承载不同KARI的菌株的初始生长速率

菌株	KARI	μ，1/hr
			PNY2318	K9JB4P	0.05
PNY2351	K9SB2	0.047
			PNY2352	K9SB2-SH	0.069
PNY2328	K9ALL3	0.106
			PNY2329	K9JM36	0.088

Claims

1.一种提高重组宿主细胞的异丁醇产量的方法，所述方法包括：

(a)提供重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径和具有酮醇酸还原异构酶(KARI)活性的异源多肽或其片段；

其中所述异源多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的非赖氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的非苏氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的非甲硫氨酸的氨基酸残基；以及

(b)在其中产生异丁醇的条件下，使所述重组宿主细胞与碳底物接触；

其中所述重组宿主细胞产生的异丁醇比包含异丁醇生物合成途径但不包含所述异源多肽或其片段的重组宿主细胞产生的异丁醇多。

2.一种提高重组宿主细胞的NADH利用率的方法，所述方法包括：

其中所述重组宿主细胞的NADH利用率比包含异丁醇生物合成途径但不包含所述异源多肽或其片段的重组宿主细胞的NADH利用率高。

3.一种提高重组宿主细胞的生长速率的方法，所述方法包括：

其中所述重组多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的非赖氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的非苏氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的非甲硫氨酸的氨基酸残基；以及

(b)在其中产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触；

其中所述重组宿主细胞的生长速率比包含异丁醇生物合成途径但不包含所述异源多肽或其片段的重组宿主细胞的生长速率大。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组多肽或其片段包含下列中的一个或多个：(i)对应于SEQIDNO：93的位置90处的为酪氨酸或丙氨酸的氨基酸残基；(ii)对应于SEQIDNO：93的位置93处的为缬氨酸、丙氨酸或亮氨酸的氨基酸残基；和(iii)对应于SEQIDNO：93的位置94处的为亮氨酸的氨基酸残基。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NADH利用率的提高是NADH/NADPH的比率的提高。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是酵母宿主细胞。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母来自下列属：酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、或毕赤酵母属(Pichia)。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述异源多肽或片段是由与SEQIDNO：761、752、759或760具有至少约85％、至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性的序列编码的。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述异源多肽或片段包含与SEQIDNO：237、227、233或234具有至少约85％、至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性的序列。

11.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径和

a.具有酮醇酸还原异构酶活性的异源多肽，所述异源多肽与下列之一具有至少约85％、至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性：K9JM2(SEQIDNO：193)、K9JM3(SEQIDNO：194)、K9JM4(SEQIDNO：195)、K9JM5(SEQIDNO：196)、K9JM6(SEQIDNO：197)、K9JM7(SEQIDNO：198)、K9JM8(SEQIDNO：199)、K9JM9(SEQIDNO：200)、K9JM10(SEQIDNO：201)、K9JM11(SEQIDNO：202)、K9JM12(SEQIDNO：203)、K9JM13(SEQIDNO：204)、K9JM14(SEQIDNO：205)、K9JM15(SEQIDNO：206)、K9JM16(SEQIDNO：207)、K9JM17(SEQIDNO：208)、K9JM18(SEQIDNO：209)、K9JM19(SEQIDNO：210)、K9JM20(SEQIDNO：211)、K9JM21(SEQIDNO：212)、K9JM22(SEQIDNO：213)、K9JM23(SEQIDNO：214)、K9JM24(SEQIDNO：215)、K9JM25(SEQIDNO：216)、K9JM26(SEQIDNO：217)、K9JM27(SEQIDNO：218)、K9JM28(SEQIDNO：219)、K9JM29(SEQIDNO：220)、K9JM30(SEQIDNO：221)、K9JM31(SEQIDNO：222)、JM32(SEQIDNO：223)、JM33(SEQIDNO：224)、JM34(SEQIDNO：225)、JM35(SEQIDNO：226)、JM36(SEQIDNO：227)、JM37(SEQIDNO：228)、JM38(SEQIDNO：229)、JM39(SEQIDNO：230)、JM40(SEQIDNO：231)、JM42(SEQIDNO：232)、JM43(SEQIDNO：233)、JM44(SEQIDNO：234)、K9SB2(SEQIDNO：235)、K9_DAVID_SH(SEQIDNO：236)、K9ALL3(SEQIDNO：237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)、JM41(SEQIDNO：240)、K9ALL148(SEQIDNO：241)、K9JM148(SEQIDNO：242)、K9ALL156(SEQIDNO：243)、K9JM156(SEQIDNO：244)、K9ALL191(SEQIDNO：245)、K9JM191(SEQIDNO：246)、K9ALL254(SEQIDNO：247)、K9ALL278(SEQIDNO：248)、K9ALL37(SEQIDNO：249)、K9JM37S(SEQIDNO：250)、K9ALL66(SEQIDNO：66)、K9JM66(SEQIDNO：252)、K9ALL8Q(SEQIDNO：253)、K9JM8Q(SEQIDNO：254)、K9ALL45(SEQIDNO：255)、K9_LUCY(SEQIDNO：300)、K9_ILYA(SEQIDNO：301)、K9ALL258(SEQIDNO：302)、K9YW25-T191S(SEQIDNO：303)、F53L(SEQIDNO：307)、F53I(SEQIDNO：308)、F53M(SEQIDNO：309)、F53V(SEQIDNO：310)、F53P(SEQIDNO：311)、F53S(SEQIDNO：312)、F53A(SEQIDNO：313)、F53E(SEQIDNO：314)、F53Q(SEQIDNO：315)、T11-1(SEQIDNO：316)、T11-2(SEQIDNO：317)、T11-3(SEQIDNO：318)、T11-4(SEQIDNO：319)、T11-5(SEQIDNO：320)、T11-6(SEQIDNO：321)、T11-7(SEQIDNO：322)、T11-10(SEQIDNO：323)、T11-12(SEQIDNO：324)、T11-13(SEQIDNO：325)、T11-14(SEQIDNO：326)、T11-15(SEQIDNO：327)、T11-16(SEQIDNO：328)、T11-18(SEQIDNO：329)、T11-19(SEQIDNO：330)、T11-21(SEQIDNO：331)、T11-22(SEQIDNO：332)、T11-25(SEQIDNO：333)、T11-27(SEQIDNO：334)、T11-28(SEQIDNO：335)、T11-29(SEQIDNO：336)、T11-30(SEQIDNO：337)、T11-32(SEQIDNO：338)、T11-33(SEQIDNO：339)、T11-35(SEQIDNO：340)、T11-36(SEQIDNO：341)、T11-37(SEQIDNO：342)、T11-38(SEQIDNO：343)、T11-39(SEQIDNO：344)、T11-42(SEQIDNO：345)、T11-43(SEQIDNO：346)、T11-44(SEQIDNO：347)、T11-45(SEQIDNO：348)、T11-46(SEQIDNO：349)、T11-47(SEQIDNO：350)、T11-49(SEQIDNO：351)、T11-50(SEQIDNO：352)、T11-52(SEQIDNO：353)、T11-54(SEQIDNO：354)、T11-55(SEQIDNO：355)、T11-56(SEQIDNO：356)、T11-57(SEQIDNO：357)、T11-58(SEQIDNO：358)、T11-59(SEQIDNO：359)、T11-60(SEQIDNO：360)、T11-61(SEQIDNO：361)、T11-62(SEQIDNO：362)、T11-64(SEQIDNO：363)、T11-66(SEQIDNO：364)、T11-67(SEQIDNO：365)、T11-69(SEQIDNO：366)、T11-70(SEQIDNO：367)、T11-72(SEQIDNO：368)、T11-74(SEQIDNO：369)、T11-75(SEQIDNO：370)、T11-76(SEQIDNO：371)、T11-79(SEQIDNO：372)、T11-80(SEQIDNO：373)、T11-81(SEQIDNO：374)、T11-83(SEQIDNO：375)、T11-84(SEQIDNO：376)、T11-85(SEQIDNO：377)、T11-86(SEQIDNO：378)、T11-87(SEQIDNO：379)、T11-88(SEQIDNO：380)、T11-91(SEQIDNO：381)、T11-94(SEQIDNO：382)、T11-95(SEQIDNO：383)、T11-96(SEQIDNO：384)、T11-97(SEQIDNO：385)、T11-99(SEQIDNO：386)、T11-103(SEQIDNO：387)、T11-104(SEQIDNO：388)、T11-109(SEQIDNO：389)、T11-110(SEQIDNO：390)、T11-111(SEQIDNO：391)、T11-114(SEQIDNO：392)、T11-116(SEQIDNO：393)、T11-117(SEQIDNO：394)、T11-119(SEQIDNO：395)、T11-121(SEQIDNO：396)、T11-122(SEQIDNO：397)、T11-124(SEQIDNO：398)、T11-125(SEQIDNO：399)、T11-128(SEQIDNO：400)、T11-130(SEQIDNO：401)、T11-131(SEQIDNO：402)、T11-134(SEQIDNO：403)、E147V(SEQIDNO：552)、G164D(SEQIDNO：404)、G304V(SEQIDNO：405)、N258S(SEQIDNO：406)、T71S(SEQIDNO：407)、V184I(SEQIDNO：408)、A279D(SEQIDNO：409)、D98V(SEQIDNO：410)、M169F(SEQIDNO：411)、M169K(SEQIDNO：412)、M169L(SEQIDNO：413)、E100Q_M312K(SEQIDNO：414)、ECB11(SEQIDNO：534)、EC2A2(SEQIDNO：535)、EC2B12(SEQIDNO：536)、EGC10(SEQIDNO：537)、EGD9(SEQIDNO：538)、EGG8(SEQIDNO：539)、EHG1(SEQIDNO：540)、EHG2(SEQIDNO：541)、EHH6(SEQIDNO：520)、EHH9(SEQIDNO：521)、EHH10(SEQIDNO：522)、EHH12(SEQIDNO：523)、EKC5(SEQIDNO：546)、EKG4(SEQIDNO：547)、EJF5(SEQIDNO：548)、EJB8(SEQIDNO：549)、EJA1(SEQIDNO：550)、EJB10(SEQIDNO：551)、K9_Lucy_SH(SEQIDNO：553)、或K9JM1(SEQIDNO：192)、或其活性片段；或

b.编码a)的异源多肽的异源多核苷酸。

12.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径和

a.具有酮醇酸还原异构酶活性的异源多肽，所述异源多肽与下列具有至少约90％同一性、至少约95％、或至少约98％同一性：K9JM2(SEQIDNO：193)、K9JM3(SEQIDNO：194)、K9JM4(SEQIDNO：195)、K9JM5(SEQIDNO：196)、K9JM6(SEQIDNO：197)、K9JM7(SEQIDNO：198)、K9JM8(SEQIDNO：199)、K9JM9(SEQIDNO：200)、K9JM10(SEQIDNO：201)、K9JM11(SEQIDNO：202)、K9JM12(SEQIDNO：203)、K9JM13(SEQIDNO：204)、K9JM14(SEQIDNO：205)、K9JM15(SEQIDNO：206)、K9JM16(SEQIDNO：207)、K9JM17(SEQIDNO：208)、K9JM18(SEQIDNO：209)、K9JM19(SEQIDNO：210)、K9JM20(SEQIDNO：211)、K9JM21(SEQIDNO：212)、K9JM22(SEQIDNO：213)、K9JM23(SEQIDNO：214)、K9JM24(SEQIDNO：215)、K9JM25(SEQIDNO：216)、K9JM26(SEQIDNO：217)、K9JM27(SEQIDNO：218)、K9JM28(SEQIDNO：219)、K9JM29(SEQIDNO：220)、K9JM30(SEQIDNO：221)、K9JM31(SEQIDNO：222)、JM32(SEQIDNO：223)、JM33(SEQIDNO：224)、JM34(SEQIDNO：225)、JM35(SEQIDNO：226)、JM36(SEQIDNO：227)、JM37(SEQIDNO：228)、JM38(SEQIDNO：229)、JM39(SEQIDNO：230)、JM40(SEQIDNO：231)、JM42(SEQIDNO：232)、JM43(SEQIDNO：233)、JM44(SEQIDNO：234)、K9SB2(SEQIDNO：235)、K9_DAVID_SH(SEQIDNO：236)、K9ALL3(SEQIDNO：237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)、JM41(SEQIDNO：240)、K9ALL148(SEQIDNO：241)、K9JM148(SEQIDNO：242)、K9ALL156(SEQIDNO：243)、K9JM156(SEQIDNO：244)、K9ALL191(SEQIDNO：245)、K9JM191(SEQIDNO：246)、K9ALL254(SEQIDNO：247)、K9ALL278(SEQIDNO：248)、K9ALL37(SEQIDNO：249)、K9JM37S(SEQIDNO：250)、K9ALL66(SEQIDNO：66)、K9JM66(SEQIDNO：252)、K9ALL8Q(SEQIDNO：253)、K9JM8Q(SEQIDNO：254)、K9ALL45(SEQIDNO：255)、K9_LUCY(SEQIDNO：300)、K9_ILYA(SEQIDNO：301)、K9ALL258(SEQIDNO：302)、K9YW25-T191S(SEQIDNO：303)、F53L(SEQIDNO：307)、F53I(SEQIDNO：308)、F53M(SEQIDNO：309)、F53V(SEQIDNO：310)、F53P(SEQIDNO：311)、F53S(SEQIDNO：312)、F53A(SEQIDNO：313)、F53E(SEQIDNO：314)、F53Q(SEQIDNO：315)、T11-1(SEQIDNO：316)、T11-2(SEQIDNO：317)、T11-3(SEQIDNO：318)、T11-4(SEQIDNO：319)、T11-5(SEQIDNO：320)、T11-6(SEQIDNO：321)、T11-7(SEQIDNO：322)、T11-10(SEQIDNO：323)、T11-12(SEQIDNO：324)、T11-13(SEQIDNO：325)、T11-14(SEQIDNO：326)、T11-15(SEQIDNO：327)、T11-16(SEQIDNO：328)、T11-18(SEQIDNO：329)、T11-19(SEQIDNO：330)、T11-21(SEQIDNO：331)、T11-22(SEQIDNO：332)、T11-25(SEQIDNO：333)、T11-27(SEQIDNO：334)、T11-28(SEQIDNO：335)、T11-29(SEQIDNO：336)、T11-30(SEQIDNO：337)、T11-32(SEQIDNO：338)、T11-33(SEQIDNO：339)、T11-35(SEQIDNO：340)、T11-36(SEQIDNO：341)、T11-37(SEQIDNO：342)、T11-38(SEQIDNO：343)、T11-39(SEQIDNO：344)、T11-42(SEQIDNO：345)、T11-43(SEQIDNO：346)、T11-44(SEQIDNO：347)、T11-45(SEQIDNO：348)、T11-46(SEQIDNO：349)、T11-47(SEQIDNO：350)、T11-49(SEQIDNO：351)、T11-50(SEQIDNO：352)、T11-52(SEQIDNO：353)、T11-54(SEQIDNO：354)、T11-55(SEQIDNO：355)、T11-56(SEQIDNO：356)、T11-57(SEQIDNO：357)、T11-58(SEQIDNO：358)、T11-59(SEQIDNO：359)、T11-60(SEQIDNO：360)、T11-61(SEQIDNO：361)、T11-62(SEQIDNO：362)、T11-64(SEQIDNO：363)、T11-66(SEQIDNO：364)、T11-67(SEQIDNO：365)、T11-69(SEQIDNO：366)、T11-70(SEQIDNO：367)、T11-72(SEQIDNO：368)、T11-74(SEQIDNO：369)、T11-75(SEQIDNO：370)、T11-76(SEQIDNO：371)、T11-79(SEQIDNO：372)、T11-80(SEQIDNO：373)、T11-81(SEQIDNO：374)、T11-83(SEQIDNO：375)、T11-84(SEQIDNO：376)、T11-85(SEQIDNO：377)、T11-86(SEQIDNO：378)、T11-87(SEQIDNO：379)、T11-88(SEQIDNO：380)、T11-91(SEQIDNO：381)、T11-94(SEQIDNO：382)、T11-95(SEQIDNO：383)、T11-96(SEQIDNO：384)、T11-97(SEQIDNO：385)、T11-99(SEQIDNO：386)、T11-103(SEQIDNO：387)、T11-104(SEQIDNO：388)、T11-109(SEQIDNO：389)、T11-110(SEQIDNO：390)、T11-111(SEQIDNO：391)、T11-114(SEQIDNO：392)、T11-116(SEQIDNO：393)、T11-117(SEQIDNO：394)、T11-119(SEQIDNO：395)、T11-121(SEQIDNO：396)、T11-122(SEQIDNO：397)、T11-124(SEQIDNO：398)、T11-125(SEQIDNO：399)、T11-128(SEQIDNO：400)、T11-130(SEQIDNO：401)、T11-131(SEQIDNO：402)、T11-134(SEQIDNO：403)、E147V(SEQIDNO：552)、G164D(SEQIDNO：404)、G304V(SEQIDNO：405)、N258S(SEQIDNO：406)、T71S(SEQIDNO：407)、V184I(SEQIDNO：408)、A279D(SEQIDNO：409)、D98V(SEQIDNO：410)、M169F(SEQIDNO：411)、M169K(SEQIDNO：412)、M169L(SEQIDNO：413)、E100Q_M312K(SEQIDNO：414)、ECB11(SEQIDNO：534)、EC2A2(SEQIDNO：535)、EC2B12(SEQIDNO：536)、EGC10(SEQIDNO：537)、EGD9(SEQIDNO：538)、EGG8(SEQIDNO：539)、EHG1(SEQIDNO：540)、EHG2(SEQIDNO：541)、EHH6(SEQIDNO：520)、EHH9(SEQIDNO：521)、EHH10(SEQIDNO：522)、EHH12(SEQIDNO：523)、EKC5(SEQIDNO：546)、EKG4(SEQIDNO：547)、EJF5(SEQIDNO：548)、EJB8(SEQIDNO：549)、EJA1(SEQIDNO：550)、EJB10(SEQIDNO：551)、K9_Lucy_SH(SEQIDNO：553)、或K9JM1(SEQIDNO：192)；

b.或其活性片段；或

c.编码a)的多肽的异源多核苷酸；

其中所述具有酮醇酸还原异构酶活性的异源多肽对于NADH具有小于约50的K_M。

13.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞。

14.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述酵母选自酵母细胞，所述酵母细胞是下列属的成员：酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、或毕赤酵母属。

15.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。

16.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述异丁醇生产途径包括下列底物至产物的转化：

a.丙酮酸至乙酰乳酸；

b.乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；

c.2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；

d.2-酮异戊酸至异丁醛；以及

e.异丁醛至异丁醇；

其中多于一种的底物至产物的转化是由与所述宿主细胞异源的酶催化的。

17.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所有的底物至产物的转化均是由与所述宿主细胞异源的酶催化的。

18.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述异丁醛至异丁醇的底物至产物的转化是由利用NADH作为辅因子的醇脱氢酶催化的。

19.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低或消除的乙酰乳酸还原酶活性。

20.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞具有降低或消除的醛脱氢酶活性。

21.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母且具有降低或消除的丙酮酸脱羧酶活性。

22.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含异丁醇生产途径，所述异丁醇生产途径包括下列底物至产物的转化：

a.丙酮酸至乙酰乳酸；

b.乙酰乳酸至2，3-二羟基异戊酸；

c.2，3-二羟基异戊酸至2-酮异戊酸；

d.2-酮异戊酸至异丁醛；以及

e.异丁醛至异丁醇；

其中所述底物至产物的转化是由基本上位于细胞溶胶的酶催化的。

23.根据前述权利要求中任一项所述的宿主细胞，其中在与表Z中给出的KARI序型HMM进行比较时，所述具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽具有＜10^-3的E值。

24.一种用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：

a.提供前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞；

b.在其中产生异丁醇的条件下，使a)的宿主细胞与碳底物接触。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触的至少一部分发生在厌氧条件下。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中异丁醇对甘油的摩尔比大于1。

27.一种用于生产异丁醇的方法，所述方法包括：

a.提供产生异丁醇的重组宿主细胞；

b.在其中产生异丁醇的条件下，使a)的宿主细胞与碳底物接触；

其中所述接触的至少一部分发生在厌氧条件下；并且

其中所产生的异丁醇对甘油的比率大于1。

28.一种组合物，所述组合物包含异丁醇和前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞。

29.一种多肽，所述多肽与下列包括至少约90％同一性、或至少约95％同一性、或至少约99％同一性：K9JM2(SEQIDNO：193)、K9JM3(SEQIDNO：194)、K9JM4(SEQIDNO：195)、K9JM5(SEQIDNO：196)、K9JM6(SEQIDNO：197)、K9JM7(SEQIDNO：198)、K9JM8(SEQIDNO：199)、K9JM9(SEQIDNO：200)、K9JM10(SEQIDNO：201)、K9JM11(SEQIDNO：202)、K9JM12(SEQIDNO：203)、K9JM13(SEQIDNO：204)、K9JM14(SEQIDNO：205)、K9JM15(SEQIDNO：206)、K9JM16(SEQIDNO：207)、K9JM17(SEQIDNO：208)、K9JM18(SEQIDNO：209)、K9JM19(SEQIDNO：210)、K9JM20(SEQIDNO：211)、K9JM21(SEQIDNO：212)、K9JM22(SEQIDNO：213)、K9JM23(SEQIDNO：214)、K9JM24(SEQIDNO：215)、K9JM25(SEQIDNO：216)、K9JM26(SEQIDNO：217)、K9JM27(SEQIDNO：218)、K9JM28(SEQIDNO：219)、K9JM29(SEQIDNO：220)、K9JM30(SEQIDNO：221)、K9JM31(SEQIDNO：222)、JM32(SEQIDNO：223)、JM33(SEQIDNO：224)、JM34(SEQIDNO：225)、JM35(SEQIDNO：226)、JM36(SEQIDNO：227)、JM37(SEQIDNO：228)、JM38(SEQIDNO：229)、JM39(SEQIDNO：230)、JM40(SEQIDNO：231)、JM42(SEQIDNO：232)、JM43(SEQIDNO：233)、JM44(SEQIDNO：234)、K9SB2(SEQIDNO：235)、K9_DAVID_SH(SEQIDNO：236)、K9ALL3(SEQIDNO：237)、K9_URSALA(K9SB2+A56V)(SEQIDNO：239)、JM41(SEQIDNO：240)、K9ALL148(SEQIDNO：241)、K9JM148(SEQIDNO：242)、K9ALL156(SEQIDNO：243)、K9JM156(SEQIDNO：244)、K9ALL191(SEQIDNO：245)、K9JM191(SEQIDNO：246)、K9ALL254(SEQIDNO：247)、K9ALL278(SEQIDNO：248)、K9ALL37(SEQIDNO：249)、K9JM37S(SEQIDNO：250)、K9ALL66(SEQIDNO：66)、K9JM66(SEQIDNO：252)、K9ALL8Q(SEQIDNO：253)、K9JM8Q(SEQIDNO：254)、K9ALL45(SEQIDNO：255)、K9_LUCY(SEQIDNO：300)、K9_ILYA(SEQIDNO：301)、K9ALL258(SEQIDNO：302)、K9YW25-T191S(SEQIDNO：303)、F53L(SEQIDNO：307)、F53I(SEQIDNO：308)、F53M(SEQIDNO：309)、F53V(SEQIDNO：310)、F53P(SEQIDNO：311)、F53S(SEQIDNO：312)、F53A(SEQIDNO：313)、F53E(SEQIDNO：314)、F53Q(SEQIDNO：315)、T11-1(SEQIDNO：316)、T11-2(SEQIDNO：317)、T11-3(SEQIDNO：318)、T11-4(SEQIDNO：319)、T11-5(SEQIDNO：320)、T11-6(SEQIDNO：321)、T11-7(SEQIDNO：322)、T11-10(SEQIDNO：323)、T11-12(SEQIDNO：324)、T11-13(SEQIDNO：325)、T11-14(SEQIDNO：326)、T11-15(SEQIDNO：327)、T11-16(SEQIDNO：328)、T11-18(SEQIDNO：329)、T11-19(SEQIDNO：330)、T11-21(SEQIDNO：331)、T11-22(SEQIDNO：332)、T11-25(SEQIDNO：333)、T11-27(SEQIDNO：334)、T11-28(SEQIDNO：335)、T11-29(SEQIDNO：336)、T11-30(SEQIDNO：337)、T11-32(SEQIDNO：338)、T11-33(SEQIDNO：339)、T11-35(SEQIDNO：340)、T11-36(SEQIDNO：341)、T11-37(SEQIDNO：342)、T11-38(SEQIDNO：343)、T11-39(SEQIDNO：344)、T11-42(SEQIDNO：345)、T11-43(SEQIDNO：346)、T11-44(SEQIDNO：347)、T11-45(SEQIDNO：348)、T11-46(SEQIDNO：349)、T11-47(SEQIDNO：350)、T11-49(SEQIDNO：351)、T11-50(SEQIDNO：352)、T11-52(SEQIDNO：353)、T11-54(SEQIDNO：354)、T11-55(SEQIDNO：355)、T11-56(SEQIDNO：356)、T11-57(SEQIDNO：357)、T11-58(SEQIDNO：358)、T11-59(SEQIDNO：359)、T11-60(SEQIDNO：360)、T11-61(SEQIDNO：361)、T11-62(SEQIDNO：362)、T11-64(SEQIDNO：363)、T11-66(SEQIDNO：364)、T11-67(SEQIDNO：365)、T11-69(SEQIDNO：366)、T11-70(SEQIDNO：367)、T11-72(SEQIDNO：368)、T11-74(SEQIDNO：369)、T11-75(SEQIDNO：370)、T11-76(SEQIDNO：371)、T11-79(SEQIDNO：372)、T11-80(SEQIDNO：373)、T11-81(SEQIDNO：374)、T11-83(SEQIDNO：375)、T11-84(SEQIDNO：376)、T11-85(SEQIDNO：377)、T11-86(SEQIDNO：378)、T11-87(SEQIDNO：379)、T11-88(SEQIDNO：380)、T11-91(SEQIDNO：381)、T11-94(SEQIDNO：382)、T11-95(SEQIDNO：383)、T11-96(SEQIDNO：384)、T11-97(SEQIDNO：385)、T11-99(SEQIDNO：386)、T11-103(SEQIDNO：387)、T11-104(SEQIDNO：388)、T11-109(SEQIDNO：389)、T11-110(SEQIDNO：390)、T11-111(SEQIDNO：391)、T11-114(SEQIDNO：392)、T11-116(SEQIDNO：393)、T11-117(SEQIDNO：394)、T11-119(SEQIDNO：395)、T11-121(SEQIDNO：396)、T11-122(SEQIDNO：397)、T11-124(SEQIDNO：398)、T11-125(SEQIDNO：399)、T11-128(SEQIDNO：400)、T11-130(SEQIDNO：401)、T11-131(SEQIDNO：402)、T11-134(SEQIDNO：403)、E147V(SEQIDNO：552)、G164D(SEQIDNO：404)、G304V(SEQIDNO：405)、N258S(SEQIDNO：406)、T71S(SEQIDNO：407)、V184I(SEQIDNO：408)、A279D(SEQIDNO：409)、D98V(SEQIDNO：410)、M169F(SEQIDNO：411)、M169K(SEQIDNO：412)、M169L(SEQIDNO：413)、E100Q_M312K(SEQIDNO：414)、ECB11(SEQIDNO：534)、EC2A2(SEQIDNO：535)、EC2B12(SEQIDNO：536)、EGC10(SEQIDNO：537)、EGD9(SEQIDNO：538)、EGG8(SEQIDNO：539)、EHG1(SEQIDNO：540)、EHG2(SEQIDNO：541)、EHH6(SEQIDNO：520)、EHH9(SEQIDNO：521)、EHH10(SEQIDNO：522)、EHH12(SEQIDNO：523)、EKC5(SEQIDNO：546)、EKG4(SEQIDNO：547)、EJF5(SEQIDNO：548)、EJB8(SEQIDNO：549)、EJA1(SEQIDNO：550)、EJB10(SEQIDNO：551)、K9_Lucy_SH(SEQIDNO：553)、或K9JM1(SEQIDNO：192)、或其活性片段，其中所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性。

30.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码前述权利要求中任一项所述的多肽。

31.一种将乙酰乳酸转化成2，3-二羟基异戊酸的方法，所述方法包括：

a.提供前述权利要求中任一项所述的多肽；

b.在其中产生2，3-二羟基异戊酸的条件下，使a)的多肽与乙酰乳酸接触。

32.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含前述权利要求中任一项所述的异源多肽。

33.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含异丁醇生物合成途径。

34.一种生产异丁醇的方法，所述方法包括：

提供前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞；以及

在其中产生异丁醇的条件下，使所述宿主细胞与碳底物接触。

35.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQIDNO：692-806的任何之一具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％同一性的核酸序列。

36.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个启动子。

37.根据前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至一个或多个终止区。

38.一种重组载体，所述重组载体包含前述权利要求中任一项所述的一个或多个多核苷酸。

39.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含前述权利要求中任一项所述的一个或多个多核苷酸。

40.一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含前述权利要求中任一项所述的一个或多个载体。

41.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞。

42.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述酵母来自下列属：酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属、或毕赤酵母属。

43.根据前述权利要求中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述酵母是酿酒酵母。