CN105051188A - 新颖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中来增强所述细胞的效力(例如，增强至全能状态)的方法。本发明还涉及用于制备具有增强效力细胞的方法和试剂盒，以及所述细胞的用途。

Description

新颖方法

发明领域

本发明涉及通过将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞以增强细胞效力的方法。本发明还涉及用于制备具有增强效力的细胞的方法和试剂盒，以及所述细胞的用途。

发明背景

据认为，干细胞的使用可以从根本上改变人类疾病的治疗。已知干细胞具有高水平的效力和自我更新，这意味着它们可以分化成多种细胞类型。这种有利的特性可以在器官和组织的产生或修复中使用。

胚胎干(ES)细胞的分离已经在干细胞技术和研究中带来很大进步。ES细胞是多能的，因此它们可被诱导分化成随后可被利用的多种细胞类型，例如，在科学动物模型或细胞移植疗法中使用。然而，ES细胞尚未满足它们作为在疾病的治疗中现在所面对的大多数问题的方案的预期。例如，已被证实的是，ES细胞的移植面临与当前器官移植一样的排斥问题。此外，鉴于在收获ES细胞期间胚胎遭到破坏的事实，这些细胞的使用引发了伦理问题。

最近，科学家已开发出产生诱导多能干(iPS)细胞(如WO2007/069666中所述)的方法，所述方法允许患者自身的体细胞去分化成多能状态，从而克服与ES细胞相关的伦理问题。然而，来自人和啮齿动物谱系之外的其它哺乳动物的iPS细胞和ES细胞在几乎所有的情况下都缺少完全的多能性。

此外，作为多能细胞，来自任何物种的ES和iPS细胞不能形成胚外谱系的组织，并且必须注射到宿主囊胚以产生完整的有机体。

WO2010/037001描述使用TET蛋白家族来调节和检测DNA的胞嘧啶甲基化状态以便重编程干细胞的方法。

因此需要产生具有更高效力的细胞(如全能细胞)以用于在干细胞技术中使用的方法。

发明概述

根据本发明的第一方面，提供增强细胞效力的方法，其中所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中。

根据本发明的另一方面，提供制备具有增强效力的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中。

根据本发明的另一方面，提供可通过本文所定义的方法获得的具有增强效力的细胞。

根据本发明的另一方面，提供包含SEQIDNO:11或13的TET3同工型的核酸。

根据本发明的另一方面，提供包含如本文所定义的核酸的载体。

根据本发明的另一方面，提供如本文所定义的核酸或如本文所定义的载体在增强细胞效力的方法中的用途。

根据本发明的另一方面，提供用于在疗法中的使用的如本文所定义的具有增强效力的细胞。

根据本发明的另一方面，提供试剂盒，所述试剂盒包括含有TET家族基因、其衍生物或片段的载体，和根据如本文所定义的方法来使用所述试剂盒的说明书。

附图简述

图1：5'Tet3基因座的示意图。图不是按比例绘制。虚线代表多个外显子和内含子。箭头表示用于启动子使用分析的qRT-PCR引物的位置(参见实施例部分)。所指示的起始密码子与全长TET3蛋白同框。‘Cat’＝催化结构域。

图2：启动子使用和编码CXXC的外显子的并入。示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。除了卵母细胞(其具有单个值)，所示的值是两个生物学平行测定值的平均值，范围被示出为误差线条。EB：胚状体。

图3：在由Tet3变体1转染的分选细胞中通过qPCR进行的候选基因的表达分析。示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。Mut：催化非活性突变体。

图4：在由Tet3变体1转染的分选细胞中通过qPCR进行的对照基因的表达分析。示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。Mut：催化非活性突变体。

图5：在由Tet3变体3转染的分选细胞中通过qPCR进行的候选基因的表达分析。示出了相对于参考基因Atp5b和Hspcb的平均值的转录水平。Mut：催化非活性突变体。

图6：由Tet3变体1转染的分选细胞中的表达水平的散点图。每个点代表单个基因。用黑色来指示通过qPCR检测的候选基因(参见实施例4)和几个家族成员，其中用箭头标记一些示例性基因。

图7：由Tet3变体1催化突变体转染的分选细胞中的表达水平的散点图。每个点代表单个基因。用黑色来指示通过qPCR检测的候选基因(参见实施例4)和几个家族成员，其中用箭头标记一些示例性基因。

图8：示出表达Tet3变体1的胚胎干细胞中单细胞表达数据的结果的热图。

图9：指示表达TET3的亚群中类全能细胞比例的图。

图10：TET3表达的定量RT-PCR分析。示出了相对于E14(＝1)的转录水平。值是两个独立平行测定值的平均值；误差线条指示范围。

图11：6天转分化测定后的菌落形态的相差显微镜检查。图像代表观察到的菌落形态的范围。

图12：6天转分化测定后的CD40表达的流式细胞分析。在TS细胞培养基中培养6天后，将细胞用山羊α-CD40一次抗体(R&DSystem)、然后抗山羊AlexaFluor647二次抗体(Invitrogen)染色。A：点图针对单个细胞，在Y-轴上示出正向散射宽度值(FSC-W)，并且在X-轴上示出640nm的荧光值(即CD40信号)。指示了针对称为CD40阳性的阈值，以及超过这个水平的细胞百分比。对总细胞群体中的学生t检验表明对于两种过表达TET3的细胞系来说，在CD40阳性细胞中相对于E14ES细胞的非常显著增加(在两种情况下p<0.0001)。B.每个细胞系中称为CD40阳性的细胞百分比的定量。

发明详述

根据本发明的第一方面，提供增强细胞效力的方法，其中所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞。

本文提到的‘增强效力’涉及具有增加的分化成不同细胞类型的能力的细胞。已知全能细胞是具有最高效力的细胞。其次是多能、多潜能、寡能和单能细胞。

在一个实施方案中，细胞的效力被增强至多能状态，如真实多能状态。

本文提到的‘多能’涉及具有分化成不同细胞类型的潜力的细胞。这些细胞比全能细胞更受限，原因在于单独的多能细胞不能发育成胎儿或成年生物体，因为多能细胞不能分化成胚外细胞。因此，必须使用供体囊胚细胞以产生完整的有机体。

如本文所述，产生iPS细胞的方法在本领域中是公知的，然而这些细胞已被证明缺乏完全的多能性，因为它们保留其供体体细胞的表观遗传记忆(Kim等人(2011)Nature467,285-290页)。因此，这些细胞不被认为是真实多能的，因为它们不具有如天然的多能细胞分化成多种细胞类型一样的能力。

因此，本文提到的‘真实多能状态’涉及具有如天然的多能细胞分化成多种细胞类型一样的能力(即它们是完全的多能)的细胞。特别是，真实/完全的多能细胞可以分化成胚胎的三个胚层(即内胚层、中胚层或外胚层)中的任何层。

在一个实施方案中，细胞的效力被增强至多能状态。

因此，根据本发明的另一方面，提供将细胞重编程至全能状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞。

本文提到的‘全能’涉及具有分化成不同细胞类型的潜力的细胞，包括包含胚外组织的细胞。因此，全能细胞具有能够发育成完整的生物，而不需要使用宿主产生的囊胚细胞的优点。应理解，提到的‘全能’细胞包括‘类全能’细胞(即与全能细胞有高度的相似性的细胞)，例如与全能细胞的高程度转录或表观遗传相似性(参见Macfarlan等(2012)Nature487,57-63页，描述了产生全能性获得的基因表达转移)。此外，如本文所用提到的‘全能’或‘类全能’细胞是指具有比多能细胞更高效力的细胞。

本文提到的‘体细胞’是指构成生物体的任何类型的细胞，但排除生殖细胞和未分化的干细胞。体细胞因此包括例如皮肤、心脏、肌肉、骨骼或血液细胞。

由于细胞分化为特定细胞类型(例如皮肤、肌肉、血液等)，它们失去其成为不同细胞类型的能力(或潜力)。因此，重编程细胞回到多能状态或全能状态，使得它们可以被操作成所期望的细胞类型是有利的。

本文提到的‘重编程’是指细胞被转换回到不同的分化状态的过程。本文所述的发明将细胞重编程至全能状态，从而提高其效力和分化成多种细胞类型的能力。

当前干细胞技术依赖于ES细胞和iPS细胞的使用。然而，这两种细胞类型都具有一些缺点。例如，iPS细胞已被证实保留它们的供体体细胞的表观遗传记忆，所述表观遗传记忆在天然多能细胞中是不存在的(Kim等(2011)Nature467,285-290页)。此外，来自人和啮齿动物谱系之外的其它哺乳动物的ES和iPS细胞已被证实不是真实多能的。本发明提供增强细胞的效力的状态(例如，增强至全能状态)的方法，从而克服这些与人ES和iPS细胞相关联的问题。

如本文所示，使用TET家族基因(例如Tet3基因)可以增加细胞培养基中的类全能干细胞的数量(参见图9)。类全能干细胞的亚群已被证实具有增强效力，如通过其转分化至类滋养层细胞的能力所精确计量的(参见实施例7)。因此，这些细胞能够形成胚外组织(如滋养层)，而不需要供体囊胚细胞。

在一个实施方案中，细胞是多能细胞。在替代实施方案中，细胞是体细胞。

在一个实施方案中，多能细胞来自哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物是人。

多能细胞可获自各种来源，例如胚胎干(ES)细胞或诱导的多能干(iPS)细胞，其可商业获得或者可以使用WO2007/069666中描述的方法获得。在一个实施方案中，多能细胞是诱导的多能干(iPS)细胞。在替代实施方案中，多能细胞是胚胎干(ES)细胞。在另一个实施方案中，胚胎干(ES)细胞是E14胚胎干(ES)细胞。

哺乳动物的10-11易位(ten-eleventranslocation，TET)家族包含三种蛋白质(TET1、TET2和TET3)，它们的C-末端催化结构域之间全部共享高度同源性(Iyer等(2009)CellCycle8,1698-1710页)。它们都被证实将5-甲基胞嘧啶(5mC)转换成另一种称为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的DNA甲基化形式。5hmC的功能尚不清楚，尽管它被认为通过去除甲基(即通过脱甲基作用)来调节基因表达。三种蛋白质具有相当不同的表达图谱，并且迄今为止的研究已证实TET1在胚胎干(ES)细胞中的作用、TET2在造血发育和癌中的作用，以及TET3在受精卵中的作用。特别地，已经发现与TET1和TET2的低水平相比，TET3在卵母细胞和受精的合子中高度表达(Gu等(2011)Nature477,606-610页；Wossidlo等(2011)Nature,2,241页)。三种蛋白质家族之间的功能差异尚不清楚。

重编程细胞至多能性的一个主要方面是改变它们的表观遗传景观(landscape)，尤其是它们的DNA甲基化分布图。作为去甲基化过程的一部分，5-甲基胞嘧啶被氧化，这是由TET蛋白的催化功能来介导。因此，TET蛋白的异位表达可通过复位DNA甲基化标记来促进从体细胞到多能细胞的重编程(Costa等Nature495,370-374页,WO2010/037001)。此外，多能细胞中的TET1和TET2表达较高，如DNA中的氧化的5-甲基胞嘧啶残基的水平。

然而，本发明人惊奇地发现，TET蛋白的表达(例如TET3)可以增强细胞对全能状态的效力。这种效力的增强也可能在重编程期间影响体细胞。出乎意料的是，这种效力的增强不取决于TET蛋白的催化功能，并且因此不与DNA去甲基化相连。因此，接近全能性的效力膨胀是TET蛋白先前未曾描述的功能。

本文提到的‘TET家族基因’是指编码10-11易位(TET)家族的三种蛋白质：TET1、TET2或TET3中的一种的基因。这类提到的基因包括具有与TET1、TET2或TET3，特别是人TET1、TET2或TET3至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高序列同一性的基因。

本发明还包括使用TET家族基因的片段的方法。这种片段通常编码至少5个氨基酸长度的蛋白质。在优选实施方案中，它们可以编码6至10、11至15、16至25、26至50、51至75、76至100或101至250或250至500、500至1000、1000至1500或1500至2000个氨基酸的蛋白质。片段可以包含缺失一个或多个氨基酸的序列，例如，C-末端截短蛋白质。片段还可以包含编码不含特殊结构域的蛋白质的核酸，例如，缺乏CXXC(DNA-结合)结构域或催化结构域的片段。

提到的‘TET家族衍生物’指的是编码TET家族蛋白质的蛋白质变体的核酸，所述核酸具有与原始基因不同的核酸序列，但是产生被认为在形状、结构和/或功能相当的蛋白质。导致化学相似的氨基酸序列生产的改变包括在本发明的范围内。本发明的多肽的变体可以天然发生，例如，通过突变发生，或者可例如用如定点诱变的多肽工程改造技术来进行，这些技术在氨基酸取代的领域中是已知的。

目标TET家族基因的核酸序列中的变化可以导致氨基酸序列中的保守变化或保守取代。因此，本发明包括具有保守变化或保守取代的多肽。本发明包括所进行的保守取代不会损坏目标TET家族蛋白质的活性的序列。

本发明的发明人得到了惊人的发现：引入酶的TET家族的成员(特别是TET3)引起细胞效力的增加，例如，增加至全能状态。

在一个实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段是TET2或TET3基因、其衍生物或片段。在另一个实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段是TET3基因、其衍生物或片段。在又一个实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段是TET3，特别是人TET3。

在一个实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段是选自SEQIDNO:11、12或13的TET3同工型，特别是选自SEQIDNO:11或13的TET3同工型。在一个实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段是SEQIDNO:11的TET3同工型(Tet3变体1)。在替代实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段是SEQIDNO:13的TET3同工型(Tet3变体3)。

TET家族基因、其衍生物或片段可以包含具有与SEQIDNO:11或13至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更高的序列同一性。

在一个实施方案中，引入步骤包括用含有TET家族基因、其衍生物或片段的载体转染细胞。在另一个实施方案中，载体是转座子载体。

载体被用于使用本领域已知的技术将靶序列酸引入宿主细胞中(例如，参见本文所描述实施例3)。载体还可以含有各种控制靶序列的转录和翻译的调控序列。载体的实例包括：病毒载体、转座子载体、质粒载体或粘粒载体。

用于本发明的可能的载体可从各种供应商处购得，例如从Invitrogen,Inc.(例如CloningTechnology)、AmershamBiosciences,Inc.和Promega,Inc.购得。

转座子载体利用已知作为转座子的可移动遗传元件、使用“剪切和粘贴”机制以移动靶序列至载体和染色体，并且从载体和染色体移出靶序列。转座子载体的实例包括PiggyBac载体(SystemBiosciences)或EZ-Tn5^TM转座子构建载体(Illumina,Inc.)。

病毒载体病由基因工程改造的病毒内的DNA或RNA组成。病毒载体可用于将靶序列整合至宿主细胞基因组中(即整合型病毒载体)。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺病毒相关载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体(例如HIV)。

质粒载体通常由环状、双链DNA组成。如同大多数工程改造的载体，质粒载体具有多克隆位点(MCS)，所述多克隆位点为含有几个常用限制位点的短区，所述限制位点允许目标DNA片段的易于插入。

本文提到的‘转染’是指将载体引入宿主细胞以便靶序列可得以表达的过程。用载体转染宿主细胞的方法包括本领域技术人员所熟知的电穿孔、超声穿孔或光学转染的方法。

但是应当注意到，可以设想其他类型的转染用于本发明，例如利用纳米技术的基于颗粒的方法。在一个实施方案中，TET家族基因、其衍生物或片段附着于纳米颗粒。然后可以使用纳米颗粒来转染细胞，例如通过使用将纳米颗粒直接递送进细胞核中的‘基因枪’(或‘生物粒子递送系统’)进行。

一旦载体被转染入细胞，所述细胞可被诱导以表达所述靶序列。例如转座子载体的某些载体可以使用基于切除的方法以切除来自载体的靶序列，并将其递送进进行表达的宿主细胞的基因组中。基于切除的方法的实例包括piggyBAC技术、SleepingBeauty(SB)转座子，LINE1(L1)逆转录转座子或CreloxP重组。

基于切除的方法可以使用转座子以将靶序列递送进宿主基因组中。piggyBAC转座子具有特别的优点，即能够切除靶序列而不留下任何可影响重编程过程的外源DNA保留部分。

根据本发明的另一方面，提供制备具有增强效力的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中。

根据本发明的另一方面，提供制备重编程全能细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞中。

在一个实施方案中，细胞是多能细胞。

在替代实施方案中，细胞是体细胞。在另一个实施方案中，当所述细胞是体细胞时，所述方法还包括以下步骤：将Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因和c-Myc基因引入体细胞中。

本文定义的方法可以用于诱导体细胞(例如，从患者获得的体细胞)进入多能状态或全能状态。应理解，这可以在一个步骤中实现，或通过诱导体细胞至多能状态，然后至全能状态。例如，TET(例如TET3)过表达与现有的过表达系统(例如Yamanaka因子)相一致，可以允许在基本上一个实验步骤中对来自体细胞的全能细胞进行衍生作用(derivation)。

本领域存在可广泛用于诱导体细胞成多能状态的方法，例如通过引入Yamanaka因子(即如WO2007/069666中所述的Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因)。可以使用含有所述四种因子的载体来引入这些因子，如使用可得自www.addgene.org的质粒20959(PB-TET-MKOS)来引入。因此，可以使用如本文所述的方法通过共转染体细胞与包含TET家族基因，其衍生物或片段的载体，以及包含Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因的载体将体细胞重编程至全能状态。

本文提到的‘重编程全能细胞’是指已经通过由TET家族基因、其衍生物或片段的引入增加其效力被诱导至全能状态的细胞。

将目标核酸序列引入宿主细胞的方法是本领域已知的。例如，一种基本方案涉及以下步骤：

a)核酸靶序列(例如TET家族基因、其衍生物或片段)的扩增；

b)将靶序列重组到载体(例如病毒载体)中；

c)使用可选择标记(例如绿色荧光蛋白)成功鉴定重组体；

d)将重组载体转染至宿主细胞中(例如多能细胞或体细胞)；

e)将靶序列整合至宿主细胞基因组中(例如，使用piggyBAC技术)；

f)使用可选择标记(例如嘌呤毒素)鉴定成功的整合；

g)靶序列的诱导表达(例如，使用强力霉素)；以及

h)成功表达靶序列的重编程全能细胞的选择(例如使用流式细胞术)。

在一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：在引入TET家族基因、其衍生物或片段之后培养所述细胞。

一旦基因、其衍生物或片段已经引入细胞中，就将细胞培养足够的时间以供细胞获得全能性和增殖。例如，培养可在1000-100000个的细胞密度下，例如约5万个/皿细胞培养物的密度下持续。

增强效力的细胞或重编程全能细胞可例如通过培养12小时或更长时间，例如1天或更长、通过使用适当的培养基用于制备全能或多能细胞来获得，所述培养基例如用于胚胎干细胞的培养基(例如，用于人ES细胞的培养基)。本文描述的方法可需要连续培养2天或更长时间，例如5天或更长时间、7天或更长时间和10天或更长时间。

在一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：选择过表达TET家族基因、其衍生物或片段的一种或多种细胞。

在一个实施方案中，使用标记基因选择一种或多种细胞。

在一个实施方案中，标记基因可选自药物抗性基因、荧光蛋白基因、显色酶基因或其组合。在另一个实施方案中，标记基因是药物抗性基因或荧光蛋白基因。

药物抗性基因的实例可以包括：嘌呤霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因或氯霉素抗性基因。可以在含有适当药物的培养基(即选择培养基)上培养细胞，并且只有并入和表达药物抗性基因的那些细胞将存活。因此，通过使用选择培养基培养细胞，可以容易地选择包含药物抗性基因的细胞。

荧光蛋白基因的实例包括：绿色荧光蛋白(GFP)基因，黄色荧光蛋白(YFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因或水母蛋白基因。表达荧光蛋白质基因的细胞可以使用荧光显微镜检测，并且使用细胞分选仪(例如流式细胞仪)选择。荧光激活细胞分选(FACS)是流式细胞术的专门类型，其可用于选择表达荧光蛋白的细胞。

在一个实施方案中，使用流式细胞术选择一种或多种细胞。

显色酶基因的实例包括：β-半乳糖苷酶基因，β-葡糖醛酸糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、或分泌的碱性磷酸酶SEAP基因。可以通过应用适当的显色底物(例如用于β-半乳糖苷酶的X-gal)来检测表达这些显色酶基因的细胞，使得表达所述标记基因的细胞将产生可检测的颜色(例如蓝-白筛选测试中的蓝色)。

本文所述的所有标记基因是本领域技术人员熟知的。例如，包含这种标记基因的载体可购自Invitrogen，Inc.(例如CloningTechnology)、AmershamBiosciences，Inc.和Promega,Inc.。

根据本发明的另一方面，提供可通过本文所定义的方法获得的具有增强效力的细胞。

根据本发明的另一方面，提供可通过本文所定义的方法获得的重编程全能细胞。

根据本发明的另一方面，提供包含SEQIDNO:11或13的TET3同工型的核酸。

根据本发明的另一方面，提供包含如本文所定义的核酸的载体。

根据本发明的另一方面，提供如本文所定义的核酸或如本文所定义的载体在增强细胞效力的方法中的用途。

根据本发明的另一方面，提供在如本文所定义的核酸或如本文所定义的载体在将细胞至重编程全能状态的方法中的用途。

本发明的增强效力的细胞或重编程全能细胞例如在医学、化学和农业行业中具有多种用途。

本发明的增强效力的细胞或重编程全能细胞可以用在治疗中，例如用在细胞或组织再生中。人ES和iPS细胞不显示原始态多能性，因此它们在细胞替代治疗和用作疾病的模型中的应用是有限的。本发明能够将多能细胞移动到能克服这个问题的较高效力水平。

本发明的增强效力的细胞或重编程全能细胞可以用在家畜的生产和大型动物模型的产生中。目前用于较大的动物克隆和遗传操作的方法依赖于体细胞核转移(SCNT)技术，其可以通过经修饰细胞的较差自我更新能力而被限制。大型动物模型中的ES和iPS细胞的发展具有在人ES和iPS细胞中观察到的相同效力丧失(如上所述)。本发明提供关键能够在培养基中增殖并操作的真实多能或全能细胞的产生，从而简化在患病家畜和大动物模型中的遗传修饰。‘大型动物’包括如狗、猪、绵羊、山羊、牛和马的动物。

本发明的增强效力的细胞或重编程全细胞可以用在药物筛选的方法中。例如，为了测试可以施用至分化细胞的化合物或药物，可以将细胞分化为目标体细胞、组织或器官以评估它们的生理活性或毒性。

根据本发明的另一方面，提供用于在疗法中使用的如本文所定义的具有增强效力的细胞。

根据本发明的另一方面，提供用于在疗法中使用的如本文所定义的重编程全能细胞。

在一个实施方案中，疗法包括组织再生。

本文提到的‘组织再生’是指通过重建丧失或受损组织来恢复患病和受损器官与组织的功能的疗法。

干细胞具有发育成多种类型的组织的能力，因此为了治疗疾病或损伤，可以将这些细胞引入至受损组织中。可使用本发明的增强效力的细胞或重编程全能细胞来治疗的疾病或损伤的实例包括：贫血、自身免疫疾病(例如关节炎、炎性肠病、局限性回肠炎、糖尿病、多发性硬化)、出生缺陷、失明、癌症、心血管疾病(例如充血性心力衰竭、心肌梗塞、中风)、肝硬化、耳聋、退化性疾病(例如帕金森病)、遗传疾病、移植物对抗宿主疾病、免疫缺陷、不育症、局部缺血、溶酶体缺陷症，肌肉损伤(例如心脏损伤)、神经元损伤(例如脑损伤，脊髓损伤)、神经变性疾病(例如阿尔茨海默氏病、痴呆、亨廷顿病)，视力障碍和伤口愈合。

根据本发明的另一方面，提供试剂盒，所述试剂盒包括含有TET家族基因、其衍生物或片段的载体，和根据本文所定义的方法来使用所述试剂盒的说明书。

试剂盒可以包括用于实施方法的一种或多种制品和/或试剂。例如，TET家族基因、其衍生物或片段，适用于本文所述的方法的扩增引物的寡核苷酸探针和/或探针对可以分离的形式提供，并且可以是试剂盒的一部分，例如，提供在合适的如小瓶的容器中，容器中的内容物受保护不受外部环境影响。试剂盒可以包括例如在PCR中使用核酸的说明书。意图将核酸用于PCR中的试剂盒可包括反应所需的一种或多种其它试剂，如聚合酶、核苷酸、缓冲液等。

在一个实施方案中，试剂盒还包括至少一种多能细胞。在替代实施方案中，试剂盒还包括至少一种体细胞。

在一个实施方案中，试剂盒还包括用于培养细胞的培养基，和用于依照本文所定义的方法制备增强效力的细胞或重编程全能细胞的说明书。

根据本发明的另一方面，提供将细胞重编程至多能状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：将TET3基因、其衍生物或片段引入细胞中。在一个实施方案中，细胞是体细胞。

应理解，这种方法可以包括与本文所定义的用于将细胞重编程至全能状态步骤相同的方法步骤。将TET3引入细胞中导致效力的改变，例如，改变至多能状态。因此，将TET3引入体细胞中导致诱导的多能干细胞增加的生产。

以下研究说明本发明：

实施例1：Tet3转录变体的鉴定

Tet3基因结构的初始注释是由RefSeq(登录号：NM_183138)提供。然而，根据这项注释，在上游存在大的开放阅读框架指示基因结构可能是不完整的。在ES细胞和体组织中，使用GeneRacer试剂盒(Invitrogen)进行cDNA末端的5'扩增，所述试剂盒带有对编码外显子1和3特异的引物(表1)。这个分析鉴定了两种启动子，指定为“经典(Canonical)”启动子和“下游”启动子。

表1：设计用于cDNA末端的5’扩增的引物。

引物	序列	SEQ ID NO.
			RACE正向1	AACCCACTCACACCAACCCTCAG	1
RACE正向2	CTGGACACACCGGCCAAGAAG	2
			RACE反向1	AAGCCTGGGAGGTGGAATGAGAAG	3
RACE反向2	GGGCTCTCTAGCACCATTGACC	4
			RACE反向3	GCCCTGCGGGAAATCATAAAG	5

来自卵母细胞(Smallwood等(2011)Nat.Genet.43,811-814页)、ES细胞(Cloonan等,2008)和多种体细胞组织(Cloonan等(2008)Nat.Methods5,613-619页；ESTsfromGenBank)的高通量RNA测序(RNA-seq)数据的检测表明存在使用起来似乎限于卵母细胞(指定为“卵母细胞”)的另一上游启动子。

上游启动子可以提供用于卵母细胞和因此合子的机制以积累高水平的TET3，然后切换至在其它组织中更低水平的生产。另外，在卵母细胞特异性外显子内，存在预测的翻译起始位点，所述起始位点与TET3蛋白的其余部分同框。所述小肽可以在调节卵母细胞中的TET3的功能中起某种作用。RNA-seq数据也表明，卵母细胞中产生的转录物主要缺乏Tet3基因的编码CXXC结构域的第一外显子。这个结构域具有其它表观遗传修饰基因中的同系物，如对于通过结合至CpG岛而靶向蛋白质有重要作用的DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶1(DNMT1)和甲基-CpG结合结构域蛋白质1(MBD1)。最近的研究表明，TET1CXXC结构域能够结合除了未甲基化的胞嘧啶之外的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)。因此，这个结构域的差分并入可以导致卵母细胞和其它组织之间的TET3蛋白功能的变化。还值得注意的是由‘下游’启动子产生的转录物将缺少编码CXXC的外显子，从而允许在不同于卵母细胞的细胞中的蛋白质变化。

实施例2：组织特异性转录物变化的分析

为确认推定卵母细胞启动子的特异性并研究编码CXXC的外显子1在不同细胞类型中的含入(inclusion)，如图1所示，将引物设计在三种启动子中的每一个与外显子1或外显子3之间(参见表2)。实际上，前者捕获含有编码CXXC的外显子的转录物，而后者捕获缺少这种外显子的转录物。因此，这些转录物分别被称为每个启动子的CXXC(+)变体或CXXC(-)变体，其中只能产生CXXC(-)变体的下游启动子除外。

表2：用于启动子分析的引物设计

引物	序列	SEQ ID NO.
			卵母细胞，正向	GGGGTCGCACATGTTCCTC	6
经典，正向	GAAACTTTGCCCCTTTGTGC	7
			下游，正向	CTCGGCGGGGATAATGG	8
外显子1，反向	CTTGGCTGGGTGGGTTCT	9
			外显子3，反向	GCTTAGCTGCCTTGAATCTCCA	10

使用Trizol(Invitrogen)从E14胚状体、E14ES细胞、皮质、小脑、肺和脾中提取RNA，并且用不含DNA的试剂盒(Ambion)进行DNA酶处理。使用oligo(dT)引物，利用SuperScriptIII第一链合成系统(Invitrogen)来制备cDNA。

使用BrilliantIISYBRGreenqPCRMaster混合试剂(Agilent)在StratageneMx3005P实时系统(Agilent)上完成定量PCR。检测技术平行测定值的C_t值以确保小于0.5个周期的差异。将这些平行测定值取平均值，并且使用ΔC_t方法、针对两个参考基因Atp5b和Hspcb的平均值进行标准化(Pfaffl(2004)RealTimePCR，63-82页)。结果总结在图2中。

这个数据确认：卵母细胞启动子的有意义使用限于被检查的组织中的卵母细胞，并且进一步证明：卵母细胞独有地使用这个启动子。这表明，卵母细胞中观察到的TET3的高表达是启动子使用的作用。

另外，卵母细胞中超过98％的TET3转录物缺乏编码CXXC的外显子。这与生物信息学分析一致，从而证实将卵母细胞外显子剪接成外显子1产生截短的蛋白质。相反，其它细胞类型使用经典启动子和下游启动子产生具有或不具有编码CXXC的外显子的转录物。因此，存在于卵母细胞和因此合子中的TET3蛋白含有独特编码序列，并且另外与几乎完全缺乏CXXC外显子含入(exoninclusion)的其它受检测组织形成对比。这些转录特征可以与全能细胞中的TET3的特定作用相关。

总之，本文呈现的数据鉴定出从Tet3基因座产生的三种主要转录变体(参见表3)。

表3：所鉴定Tet3变体的概述

变体	SEQ ID NO.
		变体1：卵母细胞CXXC(-)	11
变体2：经典CXXC(-)	12
		变体3：经典CXXC(+)	13

实施例3：ES细胞中Tet3变体的克隆和过表达

用Gateway系统(Invitrogen)，通过几种中间载体将Tet3变体序列克隆至可诱导过表达载体中。使用被设计来允许使用piggyBAC系统(Ding等(2005)Cell122、473-483页；Wilson等(2007)Mol.Ther.15、139-145页)进行基因组合并的过表达载体，所述系统另外含有克隆序列的IRES-EGFP3'(以下称为pBAC)。

鉴于限于全能细胞，选择变体1(SEQIDNO:11)用于初始过表达分析。

在37℃下，含有5％CO₂的潮湿气氛中，在0.1％的明胶涂板中，在补充有15％FBS(胎牛血清，测试的ES细胞，Invitrogen)、1xMEM非必需氨基酸(Gibco)、1x青霉素-链霉素(Gibco)、0.05mMB-巯基乙醇(1:1000，Gibco)和10³个单位/mlLIF(白血病抑制因子，ESGRO，Millipore)的DMEM(含L-谷氨酰胺、4500mg/LD-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠；Gibco)中培养E14ES细胞。每天更换培养基，并且根据到达接近汇合的指示来分开细胞，选择时除外。

使用FuGENE6.0(Roche)，利用各为2μg的pBAC构建体和piggyBAC系统的以下其它组分来转染1x10⁶个E14ES细胞：编码piggyBAC转座酶的质粒，和嘌呤霉素可选择rtTA反式激活因子。转染后第二天，通过加入1μg/mL嘌呤霉素至培养基并随后维持来应用选择。

在细胞收集的前一天，将1μg/mL强力霉素加入培养基以诱导TET3和绿色荧光蛋白(GFP)的同时表达。然后，使用标准流式细胞技术将细胞胰酶消化并分选成单独的GFP阳性(GFP+)群体和GFP阴性(GFP-)群体。

实施例4：初步基因表达分析

使用DNA/RNAAllPrepMicro试剂盒(Qiagen)从分选的细胞中提取RNA，并且用不含DNA的试剂盒(Ambion)进行DNA酶处理。使用SuperScriptIII第一链合成系统(Invitrogen)从1μgRNA制备cDNA。

先前的工作已证实，ES细胞的小群体(称为‘2-细胞ES细胞’)上调基因与全能2-细胞胚胎阶段的合子基因组激活相关联的基因，并且显示全能性的标志，如有助于胚外谱系的能力(Macfarlan等(2012)Nature487,57-63页)。鉴于TET3的表达主要限制于卵母细胞和受精卵，并且作为在此阶段的唯一同工型而存在，假设ES细胞中的TET3过表达将扩展或增强这个群体。因此，基于观察到的它们在2-细胞阶段和在2-细胞ES细胞中的上调来选择下列候选者(Macfarlan等(2012)Nature487,57-63页)：MuERV-L，Zscan4c、Fgf5、Tbx3，Fbxo15，Pramel7、Mbd5、Calcoco2，Gm4340，Zfp352，Sp110、Tdpoz2、Tcstv3。

另外，选择在ES细胞中表达但预期不上调的一些基因作为对照：Tet1、Tcl1、Ooep。

还检测了Tet3转录物以验证其过表达。

设计用于这些基因中的每一个的引物来用于定量RT-PCR，在可能的情况下跨越内含子-外显子边界进行设计(参见表4)。

表4：基因表达分析引物的概述

使用BrilliantIISYBRGreenqPCRMaster混合试剂(Agilent)在C1000TouchCFX384实时系统(BioRad)完成定量PCR。检测技术平行测定值的C_t值以确保小于0.5个周期的差异。将这些平行测定值取平均值，并且使用ΔC_t方法、针对两个参考基因Atp5b和Hspcb的平均值进行标准化(Pfaffl(2004)RealTimePCR，63-82页)。用于Tet3变体1的结果汇总在图3(候选基因)和图4(对照基因)中，以及用于Tet3变体3的结果汇总在图5(候选基因)中。

GFP阳性细胞中的Tet3如所期望被上调。显著地，所有受检测候选基因显示在细胞中的增加的表达，所述细胞表达Tet3变体1和它的催化非活性对应物——包括表达上调约10倍的一些基因——而对照基因保持相对稳定。可能的是，细胞亚群中发生大的表达变化并且因所述整体表达分析淡化，而不是整个群体更适度的上调。在任一情况下，这个数据支持向全能2-细胞阶段的转录程序的转移，从而导致过表达TET3的细胞的增强效力。

实施例5：通过mRNA-seq的全基因组基因表达分析

使用DynabeadsmRNA纯化试剂盒(Invitrogen)从2μg总RNA分离信使RNA，并且用RNA断裂试剂(Ambion)片段化。使用SuperScriptIII第一链合成系统和3μgμl^-1随机六聚物(Invitrogen)进行第一链cDNA合成，随后用DNA聚合酶I和RNA酶H进行第二链合成。纯化后，使用在PE2.0上利用Sanger索引获得的配对双末端接头(Illumina)和Illumina的NEBNextDNALibraryPrepMasterMixSet(NEB)由双链cDNA生成测序文库。在IlluminaHi-Seq2000的一个通道上利用单端50bp方案对样品测序；针对每个编索引样品获得的测序读长的数量在表5中给出。使用TopHat(v1.4.1，选项-g1)结合来自Ensemblrelease61的基因模型将信使RNA-Seq数据映射至小鼠基因组(装配体NCBIM37)。

表5：用于mRNA-seq数据集的读长计数

样品	读长
		变体1GFP-	52955484
变体1GFP+	47627618
		变体1MutGFP-	57632592
变体1MutGFP+	45503316

在初步分析中，检测在上述qPCR数据中显示最大上调的候选基因用于与它们的基因家族的一些成员一起上调：Pramel3、Pramel5、Pramel7、Sp110、Tdpoz1、Tdpoz3、Tdpoz4、Tdpoz5、Tet3、Zfp352、Zscan4c、Zscan4d、Zscan4e、Zscan4f和Zscan4-ps2。

在散点图上比较GFP阳性细胞和GFP阴性细胞，并且使用SeqMonkv0.23.1突出以上基因列表(图6和7)。再次，Tet3如预期地在GFP阳性细胞中强烈上调。显著地，这个分析表明：候选基因及其家族成员都在通过无偏全基因组测序鉴定的大多数上调的基因之中。与qPCR数据一致，Tet3变体1或其催化失活对应物的过表达对基因表达上具有在相似效果，从而表明氧化酶功能对于转移到更“类全能”转录程序不是必须的。

实施例6：类全能亚群的分析

胚胎干细胞培养物相对于基因表达和发育能力是不同的。它们可以分成亚群的特征在于不同的标记基因的表达。通过不同的表达模式它们以单个细胞周期在不同的亚群之间移动。在相同胚胎干细胞培养物中的亚群的丰度相对较稳定。在野生型ES细胞中，很小比例的细胞(5％)显示出非常早期植入前胚胎的特征性表达谱。据认为与大多数ES细胞相比，这些细胞具有膨胀的效力的表型，并且它们对ES细胞贡献的在聚合实验中的胚外谱系的极罕见情况负责。

评估表达Tet3变体1的ES细胞中的类全能亚群的丰度。使用C1系统(Fluidigm)和SMARTercDNA扩增(Clontech)分离来自单独GFP-和GFP+细胞的cDNA。利用EvaGreenqPCR化学法(Bio-Rad)、使用BiomarkHDmicrofluidics系统(Fluidigm)来分析稳态表达水平。下列基因用作用于类全能亚群的标记(表6中以粗体突出显示)：Zscan4c、MuERV-L、Arg2、Dub2a、Tcstv3、Lgals4。

设计用于这些基因中的每一个的引物来用于定量RT-PCR，在可能的情况下跨越内含子-外显子边界(参见表6)。

表6：单个基因表达分析引物的概述

引物	序列	SEQ ID NO.
			Mervl_polnew_F	CCAACAGCAGAAACCAACACT	48
Mervl_polnew_R	AAGGCAAATCCATAACCAGAATA	49
			Arg2_F	CTGGATCAAACCTTGCCTCTC	50
Arg2_R	ATCCCAAGTCGATCAATCTCTCTC	51
			Dub2a_F	AATGCCTATGTGCTCTTCTATGTG	52
Dub2a_R	AGGTTTCTTTGGTTGCTTTCTTCT	53
			Tcstv3_F	GAATCTTGGACTTTACTTCCTCTCC	34(参见表4)
Tcstv3_R	GTGGCTTTGCTCTTTGCTGA	35(参见表4)
			Lgals4_F	CAGCTTTATGAATGGCTCTTGG	54
Lgals4_R	ATCTGGACGTAGGACAAGGTGA	55
			Stat3_F	CGAGAGCAGCAAAGAAGGAG	56
Stat3_R	GGGTAGAGGTAGACAAGTGGAGAC	57
			Serpine2_F	TTCCTTTCTTCATCTTGACCACA	58
Serpine2_R	ATCTTCTTCAGCACTTTACCAACTC	59
			Stella_F	ATGAAGGACCCTGAAACTCCTC	60
Stella_R	ACTCTTGTTCTCCACAGGTACGG	61
			Krt8_F	GACATCGAGATCACCACCTACC	62
Krt8_R	TTTCAATCTTCTTCACAACCACAG	63
			Esrrb_F	GTATGCTATGCCTCCCAACGA	64
Esrrb_R	TACACGATGCCCAAGATGAGA	65
			Tet2_F	GCCATTCTCAGGAGTCACTGC	66
Tet2_R	ACTTCTCGATTGTCTTCTCTATTGAGG	67
			Ascl2_F	AGCCCGATGGAGCAGGAG	68
Ascl2_R	CCGAGCAGAGGTCAGTCAGC	69
			Gata3_F	TCTGGAGGAGGAACGCTAATG	70
Gata3_R	GAGAGATGTGGCTCAGGGATG	71
			Gata4_F	AGCAGCAGCAGTGAAGAGATG	72
Gata4_R	CGATGTCTGAGTGACAGGAGATG	73
			Abcb5_F	GGTAGCACACAGGCTCTCCAC	74
Abcb5_R	ATGTCCTTGATTCCATTTGTTCAT	75
			Tgfb2_F	CCTTCGCCCTCTTTACATTGAT	76
Tgfb2_R	GCTTCGGGATTTATGGTGTTG	77
			Tdrd7_F	CCAATAGCAGGTTCAGTCCAAAG	78
Tdrd7_R	TAAGAGGCAGGAGGCGTGATA	79
			Gata6_F	TCTACACAAGCGACCACCTCA	80
Gata6_R	GCCAGAGCACACCAAGAATC	81
			Zfp352_F	GGTTCACACATCCATCCCTACA	18(参见表4)
Zfp352_R	CCTGGCTGGGAAGCACCT	19(参见表4)
			Eomes_F	CACTGGATGAGGCAGGAGATTT	82
Eomes_R	GAGAAGGTGAAGGTCTGAGTCTTG	83
			Brachyury_F	ATAACGCCAGCCCACCTACT	84
Brachyury_R	TCATACATCGGAGAACCAGAAGAC	85
			Sox2_F	CAGCTCGCAGACCTACATGAAC	86
Sox2_R	CTGGAGTGGGAGGAAGAGGTAA	87

Tet1_F	CCATTCTCACAAGGACATTCACA	42(参见表4)
			Tet1_R	GCAGGACGTGGAGTTGTTCA	43(参见表4)
Oct4_F	GCTGCTGAAGCAGAAGAGGAT	88
			Oct4_R	TCCTGAAGGTTCTCATTGTTGTC	89
Nanog_F	TACCTCAGCCTCCAGCAGATG	90
			Nanog_R	CCAGATGCGTTCACCAGATAG	91
Atp5b_F	GGCCAAGATGTCCTGCTGTT	92
			Atp5b_R	GCTGGTAGCCTACAGCAGAAGG	93
Hsp90_F	GCTGGCTGAGGACAAGGAGA	94
			Hsp90_R	CGTCGGTTAGTGGAATCTTCA	95

使用SINGuLAR分析工具组2.0(Fluidigm)分析单个细胞表达数据，并且无监测聚类的结果显示为以较浅颜色表示较高表达的热图(图8)。基因在一个水平方向上成簇集中。用于类全能状态的标记基因密切相关并且以粗体突出显示。单个基因在一个水平方向上成簇集中。密切相关细胞的亚群显示非常高的类全能标记基因的表达水平(由水平框突出显示)，并且因此命名为‘类全能’亚群。落入所述类别的细胞的比例显著上升在Tet3变体1的表达之上。而在TET3没有或非常低地表达的细胞中仅5％的细胞是所述亚群的一部分，在TET3表达细胞中所述比例增加至40％(图9)。因此，观察到的朝向类全能表达谱系的转移跨过由类全能亚群的突然膨胀所调节的群体。

实施例7：通过转分化测定论证增强效力

ES细胞是多能的，因为它们可以产生许多不同细胞类型的胚胎，但不能产生胚外组织如滋养层。因此在生长条件下形成用于滋养层干细胞(TS)培养的类滋养层细胞的能力提供膨胀的效力的离体测定(Ng等人(2008)NatCellBiol.10,1280-1290)。所述测试应用于野生型E14ES细胞和两种过表达Tet3变体1的组成型ES细胞系(称为Tet3克隆2和Tet3克隆7)。作为阳性对照，平行测试已知经历明显转分化的过表达Ras转基因(称为iRas)或缺乏Oct4表达(称为ZHBTc4)的遗传修饰细胞系(Niwa等(2000)Nat.Genet.24,372-376；Niwa等(2005)Cell123,917-929)。

为了将任何可观察到的变化与TET3表达的水平相关联，在如以上所述野生类型E14ES细胞和两个Tet3过表达ES细胞系上进行qRT-PCR分析(图10)。Tet3克隆7表达TET3超过Tet3克隆2约2倍；相对于E14细胞，这两种细胞系具有显著增加的Tet3转录水平。

转分化测定

由补充有20％FBS、1mM丙酮酸钠、50U/mL青霉素-链霉素和0.05mMB-巯基乙醇的RPMI1640组成的TS基础培养基通过以下方式调节：在细胞培养皿上培养照射过的小鼠胚胎纤维(MEF)细胞两天，并且通过0.22μm过滤器。通过将70％条件培养基、30％TS基础培养基、20ng/mLβ-胎儿生长因子和1μg/mL肝素混合来制备完全TS细胞培养基。

在完全TS细胞培养基中培养6天后，通过形态学评估转分化(图11)和TS细胞标记CD40的流式细胞术分析(图12)。

对代表性相差图象的检测揭示：在过表达TET3的细胞系中针对ZHBTc4细胞的类滋养层形态的显著转移，所述类滋养层形态在E14细胞中大程度缺失。这个效果在Tet3克隆7细胞系中更显著。

CD40是用于区分TS和ES细胞的确定标记(Rugg-Gunn等(2012)Cell22,887-901)。流式细胞分析表明在TET3过表达之后，CD40阳性细胞的数量有明显上升。总细胞群体的统计学测试确定相对于E14ES细胞用于过表达TET3的细胞系的高度显著增加(学生t检验；在两种情况下p<0.0001)。再者，Tet3克隆7细胞系中的变化更广泛，CD40阳性细胞达到与阳性对照iRas细胞系中观察到的几乎相等的水平。

这个数据显示：ES细胞中TET3的过表达导致转分化至类全能状态能力的增强，从而证明发育效力的增强。此外，效力的这种扩展与细胞所接收的TET3的剂量相关；在两种分析中，具有较高的TET3表达的细胞系(克隆7)显示出更大的效果。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种增强细胞效力的方法，其中所述方法以下步骤：包括将TET3基因、其衍生物或片段引入所述细胞中。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞被增强至全能状态。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞被增强至多能状态，如真实多能状态。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述TET3基因、其衍生物或片段是SEQIDNO:11或13的TET3同工型。

5.如权利要求1、2或4中任一项所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，如胚胎干(ES)细胞，特别是E14胚胎干(ES)细胞。

6.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞是体细胞。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括用含有所述TET3基因、其衍生物或片段的载体转染所述细胞。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述载体是转座子载体。

9.一种制备具有增强效力的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将TET3基因、其衍生物或片段引入细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，如胚胎干(ES)细胞，特别是E14胚胎干(ES)细胞。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞是体细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其还包括以下步骤：将Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因和c-Myc基因引入所述体细胞中。

13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在引入所述TET3基因、其衍生物或片段之后培养所述细胞。

14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：选择过表达所述TET3基因、其衍生物或片段的一种或多种细胞。

15.如权利要求14所述的方法，其中使用流式细胞术选择所述一种或多种细胞。

16.一种具有增强效力的细胞，所述细胞可通过如权利要求1至15中任一项所述的方法获得。

17.一种包含SEQIDNO:11或13的TET3同工型的核酸。

18.一种包含如权利要求17所述的核酸的载体。

19.如权利要求17所述的核酸或如权利要求18所述的载体在增强细胞效力的方法中的用途。

20.如权利要求16所述的具有增强效力的细胞，所述细胞用于在疗法中使用。

21.如权利要求20所述的用于使用的具有增强效力的细胞，其中所述疗法包括组织再生。

22.一种试剂盒，其包括含有TET3基因、其衍生物或片段的载体，和根据如权利要求1至15中任一项所述的方法来使用所述试剂盒的说明书。

23.如权利要求22所述的试剂盒，其还包括至少一种多能细胞，如胚胎干(ES)细胞，特别是E14胚胎干(ES)细胞。

24.如权利要求22所述的试剂盒，其还包括至少一种体细胞。

25.如权利要求23或24所述的试剂盒，其还包括用于培养所述细胞的培养基，和用于根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备具有增强效力的所述细胞的说明书。

说明或声明(按照条约第19条的修改)

按照条约第19条修改的声明

申请人认为国际检索报告中引用的文件都没有描述TET3在增强细胞效力的方法中的具体用途。实际上，现有技术文件D1(US2011/0236894)描述了应当使用TET3抑制剂，以对干细胞进行重编程(参见D1的[0091]段)，这给出了与需要提高TET3水平以增强细胞效力的本发明相反的教导。

因此，申请人认为权利要求1以及直接或间接引用权利要求1，或与权利要求1属于同一发明构思的权利要求2-25具有新颖性和创造性。

Claims (27)

1.一种增强细胞效力的方法，其中所述方法以下步骤：包括将TET家族基因、其衍生物或片段引入所述细胞中。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞被增强至全能状态。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞被增强至多能状态，如真实多能状态。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述TET家族基因、其衍生物或片段是TET2或TET3。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述TET家族基因、其衍生物或片段是TET3。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述TET家族基因、其衍生物或片段是SEQIDNO:11或13的TET3同工型。

7.如权利要求1、2或4至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，如胚胎干(ES)细胞，特别是E14胚胎干(ES)细胞。

8.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是体细胞。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述引入步骤包括用含有所述TET家族基因、其衍生物或片段的载体转染所述细胞。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述载体是转座子载体。

11.一种制备具有增强效力的细胞的方法，所述方法包括以下步骤：将TET家族基因、其衍生物或片段引入细胞。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是多能细胞，如胚胎干(ES)细胞，特别是E14胚胎干(ES)细胞。

13.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是体细胞。

14.如权利要求13所述的方法，其还包括以下步骤：将Oct3/4基因、Sox2基因、Klf4基因和c-Myc基因引入所述体细胞中。

15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：在引入所述TET家族基因、其衍生物或片段之后培养所述细胞。

16.如权利要求11至15中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：选择过表达所述TET家族基因、其衍生物或片段的一种或多种细胞。

17.如权利要求16所述的方法，其中使用流式细胞术选择所述一种或多种细胞。

18.一种具有增强效力的细胞，所述细胞可通过如权利要求1至17中任一项所述的方法获得。

19.一种包含SEQIDNO:11或13的TET3同工型的核酸。

20.一种包含如权利要求19所述的核酸的载体。

21.如权利要求19所述的核酸或如权利要求20所述的载体在增强细胞效力的方法中的用途。

22.如权利要求18所述的具有增强效力的细胞，所述细胞用于在疗法中使用。

23.如权利要求22所述的用于使用的具有增强效力的细胞，其中所述疗法包括组织再生。

24.一种试剂盒，其包括含有TET家族基因、其衍生物或片段的载体，和根据如权利要求1至17中任一项所述的方法来使用所述试剂盒的说明书。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其还包括至少一种多能细胞，如胚胎干(ES)细胞，特别是E14胚胎干(ES)细胞。

26.如权利要求24所述的试剂盒，其还包括至少一种体细胞。

27.如权利要求25或26所述的试剂盒，其还包括用于培养所述细胞的培养基，和用于根据权利要求1至17中任一项所述的方法制备具有增强效力的所述细胞的说明书。