CN105030825A - mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其增强性制备方法和CTL细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其增强性制备方法，方法步骤包括：获取肺癌干细胞的mRNA、以及IL-2和IFN-γ；将mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中后，进行体外培养。本发明的方法过程，基于DC能够接受外源mRNA并进行翻译，以及密码子具有通用性的技术基础；以肺癌干细胞的mRNA导入后表达成抗原蛋白替换灭活蛋白刺激的方式对DC进行刺激，携带的抗原信息更为全面；而且能避免外源刺激的抗原蛋白失活、断裂等进一步会造成抗原信息缺失的不足；同时将IL-2和IFN-γ转染至DC中在免疫应答过程中即开始成熟诱导，可以大大缩短通常培养基中诱导的时间，提升细胞成熟的效率，增强了免疫反应。本发明还提出采用上述mRNA-DC肺癌治疗性疫苗与T淋巴细胞共培养所获得的细胞毒性T淋巴细胞。

Description

mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其增强性制备方法和CTL细胞

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其制备方法和CTL细胞。

背景技术

对肺癌的过继免疫治疗是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增后，再转输给肿瘤患者，从而提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗的目的。目前在临床中使用最多的过继免疫细胞主要是DC(dendriticcell，树突状细胞)和CIK(Cytokine-InducedKiller，细胞因子诱导的杀伤细胞)。

其中，DC是从骨髓组织、血液中分离得到，具有很强的捕获抗原、呈递抗原的能力和分泌能力，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应。在DC制备中为了使其具备肺癌特异性的免疫能力，一般在DC培养时将肺癌肿瘤细胞灭活后刺激DC细胞，通过肺癌肿瘤细胞携带的抗原信息刺激来提升DC的抗原提呈性能。但是这一种抗原刺激的方式存在不足，首先本身肺癌细胞携带的抗原信息相对于肺癌全面抗原信息是不完整的，只能将一部分的抗原信息传递给DC；其次，某种蛋白质的产生量不够的话，或者产生一些断裂蛋白的话，抗原性又会更进一步降低；第三，由于肺癌细胞扩增能力远远强于DC，为避免在DC培养中肺癌细胞造成DC生长受抑制而最终无法收获到DC的情形，对DC刺激之前要进行灭活，灭活中很多的抗原簇被破坏掉了；所以现有针对肺癌培养得到的过继免疫的DC，引发的免疫反应较弱，杀瘤能力不强。

发明内容

本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种肺癌抗原信息更全，且免疫反应性更强的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其增强性制备方法和CTL细胞。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，包括如下步骤：

获取肺癌干细胞的mRNA，以及IL-2和IFN-γ；

将所述mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中；

将转染有所述肺癌干细胞mRNA、IL-2和IFN-γ的DC进行体外培养。

本发明还提出一种采用上述方法制备得到的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗。

本发明的方法过程，基于DC能够接受外源mRNA并进行翻译，以及密码子具有通用性的技术基础；以肺癌干细胞mRNA导入后表达成抗原蛋白替换灭活蛋白刺激的方式对DC进行刺激，携带的抗原信息更为全面；而且能避免外源刺激的抗原蛋白失活、断裂等进一步会造成抗原信息缺失的不足；同时将IL-2和IFN-γ转染至DC中在免疫应答过程中即开始成熟诱导，可以大大缩短通常培养基中诱导的时间，提升细胞成熟的效率，增强了细胞的免疫反应。

本发明进一步还提出一种采用本发明的上述mRNA-DC肺癌治疗性疫苗与T淋巴细胞体外混合共培养之后得到的细胞毒性T淋巴细胞(简称：CTL细胞)。该CTL细胞，可以在MHC限制的条件下，直接、连续、特异性的杀伤靶细胞，并且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤，且适用于肺癌的类型更多更广泛。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例制备mRNA过程中用Trizol法提取的总RNA后电泳检测结果。(Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，市面上均有Trizol提取试剂销售。)

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，包括如下步骤：

S10，获取肺癌干细胞的mRNA，以及IL-2和IFN-γ；

S20，将肺癌干细胞的mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中；

S30，将步骤S20转染有肺癌干细胞的mRNA、IL-2和IFN-γ的DC进行体外培养。

本发明的上述治疗性疫苗制备，以DC细胞免疫为基础，在DC的成熟和抗原刺激上采用肺癌干细胞的mRNA转染的方式实现；经过对DC的试验和考察，其能够接受外源mRNA并进行翻译，由于所有生物从最低等的病毒直至人类密码子具有通用性，翻译之后会得到肺癌干细胞的抗原性蛋白，该蛋白可以对DC产生免疫刺激，从而最终获得具有捕获、呈递抗原能力并能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应的DC。

同时，经过观察和考量，由于转染了肺癌干细胞mRNA之后，DC需要进行较多的外源性的肺癌干细胞的mRNA的翻译和表达，导致其自身的生长代谢和抗原提呈性状的产生大大被降低和抑制了，往往正常培养过程下其性状成熟的过程大大被延长，不利于规模化的产业应用；而经过对免疫细胞代谢过程的考量，由于DC内进行肺癌干细胞mRNA的表达，可以通过在mRNA表达的过程中同时加快诱导其免疫应答的过程和成熟。其中，IL-2(白细胞介素)是T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，可以显著促进淋巴细胞的生长和增殖，但对淋巴细胞的毒活性没有作用；在本发明中处于DC细胞外源负担加大的情形下，IL-2可以提升其生长和代谢活性。而IFN-γ本身是属于Ⅱ型干扰素类型，可以增强细胞表面膜的敏感度和通透强度，利于细胞因子的诱导功效发挥，促进细胞性状成熟的效率。所以本发明中通过直接转染的方式将mRNA、IL-2和IFN-γ一并转染至DC中，使其在外源性肺癌干细胞的mRNA表达时可以直接促进细胞性状成熟；避免在DC产生免疫应答之后，常规在培养基中添加IL-2和IFN-γ诱导其成熟效果不明显的缺陷。

本发明mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法将IL-2及IFN-γ的mRNA一并导入DC，使DC可以分泌更多的细胞因子，促使DC成熟，同时增强了细胞的免疫反应。

在本发明经过反复的试验和考量，步骤S10选取用来对DC进行免疫刺激的物质为肺癌干细胞的mRNA。在肺癌细胞所携带的表面抗原信息在不完整的情况下，经过分析，抗原蛋白的上游是转录生成的mRNA。在代谢的过程中，mRNA是细胞体内携带了细胞全部“有效”成分的最基本物质，mRNA通过转录合成，最后在细胞质中指导蛋白质的翻译过程；基本上mRNA在转录过程中提取了DNA的信息，其自身也就负载了细胞的全部有效信息，所以细胞内所有产生的蛋白基本上全部都涵盖在mRNA所携带的密码子信息中，所以在DC具备接收外源mRNA并翻译的情形下，采用mRNA作为抗原刺激的物质对DC进行刺激，所能够得到的肺癌的抗原信息较为全面。

同时，本发明中采用mRNA来自于肺癌干细胞，相比其他普通的肺癌细胞的mRNA，细胞的区别在于肺癌干细胞本身属于癌症干细胞的一类，具有“自我复制”以及“具有多细胞分化”的性能，有更强的传播性；不仅造成原位癌的生长，还可以随血液移动，造成肿瘤的扩散。在对比分析和试验之后，肺癌干细胞的mRNA转染进树突状细胞(DC)中，由于其细胞的分化程度比较低，mRNA中所具有的肺癌抗原蛋白的信息类型比普通的肺癌细胞的mRNA要均衡；刺激树突状细胞产生肿瘤免疫反应效果优于选用进行肿瘤免疫刺激的效果。所以本发明采用肺癌干细胞mRNA作为抗原性物质进行DC的诱导和成熟。

进一步，步骤S20将步骤S10所获取的携带有较为全面、均衡的肺癌信息的肺癌干细胞的mRNA以及IL-2和IFN-γ进行转染的过程是使将肺癌干细胞的mRNA以及IL-2和IFN-γ导入至DC中。转染的操作过程需要注意的是，转染操作过程时间尽量加快，并且保证确认无RNase污染的，且也尽量避免和质粒DNA转染混用。不过由于本发明中提取的mRNA是人的肺癌干细胞的mRNA，真核的哺乳动物的mRNA分子带有5'端帽子结构和3'端PolyA尾巴，此外还有成为IRES(internalribosomalentrysite，内部核糖体进入位点序列)的核糖体结合区，这些结构或者有助于提高mRNA的稳定性；所以，在保证无RNase污染和无菌条件下仔细一点进行转染操作，基本上就能得到比较好的结果。

同时，虽然实施过程中，真核mRNA具有上述自身的稳定修饰结构，但是本身mRNA的稳定性不如双螺旋的DNA高，转染之后还有一点需要担心的是DC细胞自身很可能会对这一外源性的mRNA进行免疫攻击，对其进行破坏和降解，最终导致转染后的mRNA所携带的抗原信息无法翻译和表达；所以基于这一情形，本发明中采用在转染之前，即步骤S20之前、步骤S10之后，将步骤S10获得的肺癌干细胞的mRNA进行稳定性修饰，修饰的方法为将mRNA分子上的尿嘧啶进行修饰，成为1-甲基假尿嘧啶。经过该甲基修饰和替换后的mRNA可以避免DC启动具有潜在危险性的炎性免疫应答反应，有效的避开了DC的防御系统，增强了mRNA在DC内的稳定性，甚至能够选择这种导入后持续的周期。

当然，在该步骤S20中经过反复的实验和考察，mRNA转染的用量必须要控制，因为mRNA的量决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞；mRNA量如果少了固然表达不好，太多也会对DC细胞有毒性的问题。当然，如果转染过程对细胞没有太大影响，将mRNA和细胞共同孵育的时间越长越好。所以基于上述情形，本发明中在转染的过程中，按照2.5×10⁶～5×10⁶数量的DC细胞个数，用mRNA转染量为50μg～250μg的量比范围进行转染，即mRNA转染量：DC细胞个数的比例为1×10^-5～1×10^-4(μg/个)。通过反复的考量和验证，在该大致的对应转染范围量下，转染之后DC自身的生长代谢还比较正常，之后进行培养过程中肺癌干细胞mRNA也能进行良好地翻译和表达。而进一步加大转染的量之后，再将DC进行培养的过程中，肺癌干细胞mRNA的表达量增大，加大了DC自身的生长代谢的负担使得DC生长逐渐受到抑制，持续一段时间之后就基本就走向死亡了。

同时，由于本身转染的过程中外源性的IL-2和IFN-γ也会影响DC自身的代谢，所以在转染时也需要对这两者转染的量进行合理的控制；经过试验和观察，转染过程中按照IL-2转染量与DC细胞个数量比为1×10^-6～2×10^-6μg/个进行转染。IFN-γ按照IFN-γ转染量与DC细胞个数量比为0.4×10^-6～0.8×10^-6μg/个进行转染。

同时，由于本身DC在转染之后仍然需要保持或者维持其细胞性状，在转染的过程中经过研究，如果采用转染试剂与mRNA形成复合体进行转染，转染试剂之后一直会结合在DC的细胞膜上，持续影响DC的细胞膜结构，不利于保持DC的代谢活性。所以在本发明中该步骤S20的转染过程采用电转染的方式进行，通过脉冲电压在DC细胞膜上产生mRNA导入孔而进行导入。当然，相比转染试剂转染的方式，电转染在脉冲电击时对细胞的伤害比较大，但是比较短暂，持续性比较低，后续细胞膜本身流动性自动修复以后基本上性状和代谢情况影响不大。同时，为了进一步减低电击中对细胞的影响，采用于4℃的温度下用700～800V的电压脉冲时程200～250μs进行瞬间稳定转染，这样将电击细胞的伤害减到最小。

步骤S20的转染过程结束之后，步骤S30将导入有肺癌干细胞的mRNA以及IL-2和IFN-γ的DC进行培养，在培养的过程中肺癌干细胞的mRNA在DC内翻译成抗原蛋白，从而刺激DC产生免疫应答，进行抗原信息的负载，得到肺癌细胞的靶向杀伤功能。

在该步骤S30中DC培养采用含8～12％胎牛血清的RPMI-1640培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养至DC细胞性状成熟后，收获细胞即可。

本发明的治疗性疫苗制备过程，以肺癌干细胞的mRNA导入后表达成抗原蛋白替换直接用灭活抗原的方式，作为抗原刺激物对DC进行刺激；首先，针对的不是普通的肺癌细胞而是可能造成癌症复发并随血液转移到患者其他器官组织的肺癌干细胞，携带的抗原信息更为全面；而且自行表达生成抗原蛋白还进一步避免了外源刺激的抗原蛋白失活、断裂等进一步会造成抗原信息缺失的不足。

在上述mRNA-DC肺癌治疗性疫苗增强性制备方法的基础上，本发明进一步还提出一种有上述方法制备的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗，根据上述制备方法收获到的实质上是DC免疫细胞。其细胞由于收到的抗原刺激信息更加全面和多样，所以细胞具有更加完整和多样的表面抗原表型，具有更强的免疫疫苗反应效果。

而进一步，本发明由于上述制备得到的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗实质上是DC免疫细胞，因此具体使用时可以借助于CTL(cytotoxicTlymphocyte，细胞毒性T淋巴细胞)技术进行，具体的过程可以有两种方式：一种是直接作为注射型疫苗将上述负载肿瘤抗原的DC细胞通过静脉回输给病人或经皮下注射，注射后在患者体内刺激患者的自体T细胞转变为CTL(即细胞毒性T淋巴细胞)产生强烈的抗肿瘤免疫应答，发挥长期肿瘤监视作用和肿瘤杀伤作用，达到消灭肿瘤的目的；而另一种可以是先获取自体的T淋巴细胞，将上述负载肿瘤抗原的DC细胞与该T淋巴细胞在体外共培养，体外共培养的过程中对T淋巴细胞进行刺激使其产生细胞毒性T淋巴细胞，然后再将这些细胞毒性T淋巴细胞，通过静脉回输给病人，直接杀伤肿瘤细胞。

所以基于上述CTL技术的体外共培养的应用，本发明进一步还提出一种采用本发明的上述mRNA-DC肺癌治疗性疫苗与T淋巴细胞体外混合共培养之后得到的细胞毒性T淋巴细胞。该CTL细胞，可以在MHC限制的条件下，直接、连续、特异性的杀伤靶细胞，并且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤，且适用于肺癌的类型更多更广泛。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明利用利用肺癌干细胞mRNA转染的方式代替原有的抗原蛋白进行免疫刺激获得的肺癌治疗性疫苗的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S11，获取人肺腺癌细胞系A549(购自中国医学科学院肿瘤细胞库)；

S12，将步骤S11获取的肺腺癌细胞系A549进行体外3D培养，培养的过程中A549细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640完全培养基，置于37℃、5％CO₂、相对湿度90％的培养箱中培养。取对数生长期细胞悬液，以1×10⁴个细胞/孔的浓度200μl接种于铺好基础培养基的96孔板里，到期后用分散酶消化基础培养基、回收液回收细胞。

S13，用流式细胞仪检测对步骤S12获得的细胞进行免疫表型检测，鉴定干细胞。其中，检测的表型为CD44、CD24和CD326，其中检测结果为CD44表型率16.69±0.47％、CD24表型率61.24±1.88％，CD326表型率1.09±0.17％。CD44、C326阳性率升高，CD24阳性率降低为干细胞鉴定指标，确定3D培养后得到的为肺癌干细胞。

S14，将步骤S12获得的肺癌干细胞用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：

S141，先500rpm离心5min沉淀细胞，然后大约每5×10⁶个细胞加1mlTrizol抽提试剂，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；

S142，将步骤S141的细胞Trizol裂解液转入EP管中，15～30℃下放置5分钟；

S143，在步骤S142得到的EP管中，按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下放置2～3分钟后，4℃低温12000g离心15分钟，去上层水相置于新EP管中；

S144，按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的量向步骤S143的新EP管中加入异丙醇，在室温下放置10分钟后，4℃低温12000g离心10分钟；弃上清后，按照每1mlTrizol加1ml75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，4℃低温下7500g离心5分钟，取沉淀即为RNA，然后在室温在自然干燥；用无水的RNA酶溶解制成溶液；

S145，将上述步骤S144中Trizol法提取的总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性，具体步骤如下：

清洗用具：电泳槽以及制胶用具等均去污剂浸泡过夜洗干净，水冲洗后用，3％H₂O₂灌满电泳槽，室温放置10min，用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯的，一种强烈RNA酶抑制剂)水冲洗。

制胶：称取0.5g琼脂糖粉末，加入放有36.5ml的DEPC水的锥形瓶中，加热使琼脂糖完全溶解；稍冷却后加入5ml的10×电泳缓冲液、8.5ml的甲醛，然后在胶槽中灌制凝胶，插好梳子，水平放置待凝固后使用；

电泳加样：在一个洁净的小离心管中混合以下试剂：2μl电泳缓冲液、3.5ml甲醛、10ml甲酰胺、3.5μlRNA样品，混匀，置60℃保温10min，冰上速冷。加入3μl的上样缓冲液混匀，取适量加样于凝胶点样孔内；同时点RNA标准样品；

跑胶：打开电泳仪，稳压7.5V/cm电泳，直至电泳结束后通过紫外透视仪观察RNA完整质量可靠；紫外透视仪下观察的胶片的结果如图1。

S15，将步骤S14制备的总RNA继续用磁珠mRNA提取试剂盒(OMEGA购得)提取mRNA，操作过程按照磁珠mRNA提取试剂盒的说明书进行。

S20，转染：将经外周血分离得到的DC细胞悬液(6～8×10⁶个/ml，0.5ml)与步骤S15肺癌干细胞的mRNA(50μl质量浓度约为3μg/μl)、5μg的IL-2、2μg的IFN-γ混合均匀，应用BTX2001细胞穿孔仪进行瞬间稳定电转染(800V、脉冲时程200μs、反应温度4℃)，所有操作均在无菌条件下进行；

S30，将步骤S20电击转染后30min加入含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃、5％CO₂培养箱中培养30h后，收获细胞。(通过显微观察，发现该细胞培养24h即可达到形状和状态不变，相比通常2～3d的后续成熟培养时间缩短的比较明显，确实转染的方式相比在培养基中添加细胞成熟的效率有提升)

由于步骤S30所制备收获的DC细胞自身是抗原提呈性细胞，不具有杀死肿瘤的能力，为了进一步验证本发明的制备的DC的品质和进步性的免疫效果，本发明中采用CTL技术进行验证和试验，具体：

S40，将步骤S30与分离自机体的T淋巴细胞进行共培养，培养的方式和过程可以参照常规的CTL技术的体外培养的方式进行，培养完成之后收获CTL细胞。

然后用步骤S40所获得的CTL细胞验证肿瘤细胞的杀伤性，具体步骤如下：

S51，靶细胞的制备：将肺癌细胞用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基体外培养，收集细胞，离心洗涤2次后，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，取1mL置10mL血清瓶中，加入100μCiNa₂ ⁵¹CrO₄，温度37℃孵育90分钟，充分洗涤细胞除去未结合的⁵¹Cr，再用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基调整细胞密度为约1×10⁵个/mL，作为靶细胞；

S52，在96孔U型板中，每孔分别按效靶比(E/T)为100∶1、50∶1和25∶1加入本发明步骤S40收获的CTL细胞和靶细胞，每种效靶比设3个复孔，同时设最大释放组(用浓度为2mol/L的盐酸替代效应细胞)和最小释放组(用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI1640培养基替代效应细胞)；将96孔板500r/min离心30秒后，温度37℃孵育4小时，1000r/min离心10分钟，各孔取上清100μL，用γ计数器测定每分钟放射活性(cpm值)，按公式计算杀伤率：杀伤率(％)＝[(实验组cpm均值-最小释放组cpm均值)/(最大释放组cpm均值-最小释放组cpm均值)]×100％。

同时，为了验证本发明的细胞的靶向杀伤性能，采用通常肿瘤灭活刺激培养的DC制备的CTL进行对照，同样以上述过程进行杀伤率验证。

整体的试验的结果如下表：

E/T	本发明疫苗组杀伤率(％)	对照组杀伤率(％)
			25∶1	39.79±7.82	9.15±6.37
50∶1	63.77±5.78	17.53±7.09
			100∶1	86.30±8.12	25.53±4.68

从上表的结果中，可以看出本发明的疫苗在各效靶比对肺癌细胞均有特异性杀伤作用，且随着效靶比增大，特异性杀伤作用逐渐增强，当E/T为100∶1时，杀伤率最大为86.30±8.12％，而对照组(现有疫苗组)对肺癌细胞杀伤率为25.53±4.68％，表明本发明的治疗性疫苗能够有效提升T淋巴细胞产生对肿瘤细胞的特异性杀伤效应。并且主要是转染之后，其培养DC至成熟的时间上约30h小时及能完成，相比采用常规的方式效率上有明显的提升。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取肺癌干细胞的mRNA，以及IL-2和IFN-γ；

将所述mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中；

将转染有所述mRNA、IL-2和IFN-γ的DC进行体外培养。

2.如权利要求1所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，获取所述mRNA、IL-2和IFN-γ的步骤之后、将所述mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中的步骤之前，还包括：

将所述mRNA分子上的尿嘧啶修饰为1-甲基假尿嘧啶。

3.如权利要求1或2所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，将所述mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中的步骤中，

按所述mRNA转染量与DC细胞个数量比为1ｘ10^-5～1ｘ10^-4μg/个进行转染。

4.如权利要求1或2所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，将所述mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中的步骤中，

所述IL-2转染量与DC细胞个数量比为1ｘ10^-6～2ｘ10^-6μg/个。

5.如权利要求1或2所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，将所述mRNA、IL-2和IFN-γ转染至DC中的步骤中，

所述IFN-γ转染量与DC细胞个数量比为0.4ｘ10^-6～0.8ｘ10^-6μg/个。

6.如权利要求1或2所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，所述转染为脉冲电击转染。

7.如权利要求6所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，所述脉冲电击转染过程中电压为700～800V；

和/或，所述脉冲电击转染过程中脉冲时程200～250μs。

8.如权利要求1或2所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法，其特征在于，将转染有所述mRNA、IL-2和IFN-γ的DC进行体外培养步骤中，采用的培养基为含8～12%胎牛血清的RPMI-1640培养基。

9.一种根据权利要求1至8任一项所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的增强性制备方法制备的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗。

10.一种通过权利要求9所述的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗与T淋巴细胞进行共培养获得的CTL细胞。