CN105030819B

CN105030819B - 一种3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的用途

Info

Publication number: CN105030819B
Application number: CN201510395542.8A
Authority: CN
Inventors: 张兴元; 李军配; 杨树; 罗伯特·海德; 文森索·阿巴特; 孔小乐; 贺晨; 张国庆
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: University of Science and Technology of China USTC
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2035-07-06
Also published as: CN105030819A

Abstract

本发明公开了一种3‑羟基‑4‑吡啶酮类高分子铁螯合剂的用途，所述高分子铁螯合剂具有抗菌作用，可作为抗菌材料使用，其中特别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有优异的抗菌效果。本发明利用高分子铁螯合剂中的叔胺或仲胺正离子结构形成的阳离子模拟抗菌肽机理，正电荷区域与细胞膜上的负电荷区域相互作用，还结合铁螯合剂对于铁元素的螯合作用，破坏细菌周围正常生长环境，导致细菌的生长受到抑制，使其不能够生长繁殖，本发明的3‑羟基‑4‑吡啶酮类高分子铁螯合剂其大分子特性不被皮肤吸收，不产生毒副作用，可以作为一种双重抗菌作用的抗菌材料。

Description

一种3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的用途

一、技术领域

本发明涉及一种螯合剂的用途，具体地说是一种3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的用途。

二、背景技术

抗菌材料指自身具有杀灭或抑制微生物功能的一类新型功能材料，在医疗领域、家庭用品、家用电器、食品包装等领域有极其广阔的应用前景，在人们对环境卫生要求日益提高的今天，抗菌材料的应用受到更加广泛的关注。目前国内抗菌、杀菌材料普遍使用抗生素，如邻苯基苯酚、甲基异噻唑啉酮和二氯苯氧氯酚等，抗生素虽然对于野生细菌有较高的抗菌活性，但其对于抗药性的菌种没有任何效果。现今，抗生素的滥用已达到很严重的地步，抗生素的滥用会导致抗药性极强的超级细菌产生，如果这种情况继续恶化下去，很可能使人类面临感染时无药可用的境地。另外抗生素由于是小分子，它会随着血液循环到人体的一些并未被细菌感染的部位，从而带来较大的毒副作用。抗生素对于具有特异性体质的人身有容易产生过敏反应，过敏反应严重时可能致命。而且使用过的抗生素类杀菌剂进入水循环系统也是二次污染。当用抗菌药物抑制或杀死敏感的细菌后，有些不敏感的细菌或霉菌却继续生长繁殖，造成新的感染，即“二重感染”，这在长期滥用抗菌药物的病人中很多见，会导致治疗困难、病死率高。

微生物需要吸收环境中的铁离子来保障其体内的一系列生理活动的进行，比如ATP合成过程中氧气的还原、DNA前提物质核苷酸的还原、血红素的合成以及其它一系列重要的反应都需要铁的参与。同时，铁也是微生物的一种重要营养元素，它对于保持细胞内许多酶的活性必不可少。为了获得维持生命活动所必须的铁元素，微生物会在体内合成并分泌一类对Fe³⁺具有较强络合力的有机小分子化合物——铁载体，所以如果周围环境中有对铁亲和性很高的螯合剂与微生物的铁载体竞争铁，使细菌不能够得到足够的铁元素，其生长就会受到抑制，便不能够生长繁殖。所以合成一种具有不被人体吸收的、具有高亲和铁能力的、铁容量大的高分子铁螯合剂将会对治疗微生物感染性疾病有一定的应用前景。自20世纪60年代在欧美首先发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)医院感染以来，它在金黄色葡萄球菌感染中所占的比例越来越高，已成为医院感染重要的致病菌之一。因其传播途径广泛，易致院内暴发流行；又由于其致病性强，呈多重耐药而成为临床上治疗的难点。因此，预防和治疗MRSA的感染是医院感染学所面临的重要课题。

抗菌肽是一种经生物体内诱导产生的多肽，是先天免疫响应的组成部分。其具有热稳定性和高效抗菌活性。2003年开始，美国、日本等国陆续开始有课题组从事聚多肽类人工抗菌肽研究；2005年，美国UCLA大学的Wong教授课题组开始从事高分子型人工抗菌肽研究；2009年，美国密歇根大学Kuroda课题组开始从分子生物学角度对高分子型人工抗菌肽的研究，并详细探讨了功能性基团的化学环境对于抗菌效果的影响。利用高分子合成的手段，模拟天然抗菌肽的分子结构，可以合成出廉价且不易生物降解的人工合成的聚合物，尤其是通过结构设计得到的阳离子型聚合物能够与细胞膜表面相互作用，使细菌膜的通透性改变，其中的正电荷区域与细胞膜上的负电荷区域相互作用，使高分子的疏水端插入细胞膜的脂质膜中，进而改变脂质膜结构，与细胞膜作用后形成跨膜电位，打破酸碱平衡，影响渗透压平衡，抑制呼吸作用，继而起到很好的抗菌作用。

不管是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，它们的生长都需要铁，如果结合高分子铁螯合剂的铁亲和能力和大分子不被人体皮肤吸收的特性，加上利用抗菌肽的正电荷抗菌作用机理，将会得到一种非常有效的双重抗菌材料。

三、发明内容

本发明旨在提供一种3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的用途，其中3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂是通过聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯与含有胺基的3-羟基-4-吡啶酮类化合物发生开环反应制得，利用3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂中的叔胺或仲胺的正电子结构，正电荷区域与细菌细胞膜上的负电荷区域相互作用，使高分子的疏水端插入细胞膜的脂质膜中，进而改变脂质膜结构，与细胞膜作用后形成跨膜电位，打破酸碱平衡，影响渗透压平衡，抑制呼吸作用，加上3-羟基-4-吡啶酮类化合物的高铁亲和能力，吸收细菌表面的微量元素，尤其是三价铁元素，使其生长受到抑制。

本发明3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的结构式如下：

n的取值范围20-200。

本发明3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂是将聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯与含有胺基的3-羟基-4-吡啶酮类化合物与环氧基团发生开环反应，将3-羟基-4-吡啶酮类化合物共价连接到聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯侧链得到的高分子铁(III)螯合剂，具体制备过程如下：

将100质量份的聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯(M_n＝1000-10000)加入到单口瓶中，然后加入200-300质量份无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入50-100质量份三乙胺和100-1000质量份含有胺基的3-羟基-4-吡啶酮类化合物，保持55-80℃反应2-36小时，向反应液中加入2000-3000质量份的乙醚沉降产物，过滤沉淀后干燥，随后加入200-300质量份无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后放入透析袋中透析3-5天(每天换四次蒸馏水，透析袋截留分子量为3000)去除过量的含有胺基的3-羟基-4-吡啶酮类化合物，得到高分子铁(III)螯合剂。

所述含有胺基的3-羟基-4-吡啶酮类化合物选自1-(氨基-4,7,10-三氧十三烷基)-2-甲基-3-羟基-4-(1H)-吡啶酮(1)、1-氨基乙基-2-甲基-3-羟基-4-(1H)-吡啶酮(2)、1-甲氨基丙基-2-甲基-3-羟基-4-(1H)-吡啶酮(3)或2-甲基-3-羟基-4-(1H)-5-甲氨基甲基-吡啶酮(4)，其结构式如下：

本发明3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂具有抗菌作用，可作为抗菌材料使用，其中特别对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有优异的抗菌效果。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂，不仅结合了天然抗菌肽的阳离子抗菌机理，还结合铁螯合剂对于铁元素的螯合作用，破坏细菌周围正常生长环境，可以作为一种双重作用的抗菌材料。

2、本发明结合了聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯的无毒、与材料相容性好，得到的材料铁螯合容量大大提升，最大为1196μmol/g，作为抗菌材料使用时可非常有效地吸收细菌生长所必须的铁元素，导致细菌的生长受到抑制，使其不能够生长繁殖。

3、本发明3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂，利用结构中的叔胺或仲胺阳离子结构，吸附在带有负电荷的细菌细胞膜上，当数量达到一定程度时就像地毯一样覆盖在膜表面，以“去垢剂”的作用方式靶向攻击、破坏细菌细胞膜而引起细胞死亡，利用地毯模型(carpet-like)作用细胞膜。该模型作用机理不会对接近电中性的人体细胞膜有任何作用，经溶血实验测试，对上皮细胞无毒副作用，而且水溶性好，可以配置成抗菌溶液广泛使用，其大分子特性不被皮肤吸收，不产生毒副作用，如果以抗菌添加剂添加到材料中可解决了目前小分子抗菌剂添加到高分子材料耐迁移性差的问题。

四、附图说明

图1为使用紫外-可见分光光度法测定三价铁离子含量与本发明实施例1制备的高分子铁螯合剂8K21水溶液的吸光度关系图。

图2为本发明实施例1和实施例2制备的高分子铁螯合剂7K21和7TD在空气孵化器孵化24小时后对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌率和浓度关系的柱状图。

图3为本发明实施例1和实施例2制备的高分子铁螯合剂7K21和7TD的上皮细胞毒性测试结果图。

五、具体实施方式

实施例1：

将0.2g聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯PGMA1(M_n＝12800g·mol^-1)和1.3g 1-(氨基-4,7,10-三氧十三烷基)-2-甲基-3-羟基-4-(1H)-吡啶酮加入到单口瓶中，然后加入8mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，再加入1mL三乙胺，保持55℃反应36小时，向反应液中加入80mL乙醚沉降产物，过滤沉淀后干燥，放入透析袋中透析3天(每天换四次水，透析袋截留分子量为3000)去除过量的单体得到高分子铁螯合剂7K21，其中小分子螯合剂在高分子铁螯合剂中的含量约为70wt％。取0.1克7K21分别溶解于1mL水和丙酮、丁酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜中，可以形成溶液，没有任何不溶物遗留在溶液中。通过核磁共振氢谱计算聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯中重复单元个数，计算得到高分子铁螯合剂的数均分子量M_n＝50100。

若保持其它条件不变，将反应物中0.2g PGMA1替代为0.2g聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯PGMA2(M_n＝10300g mol^-1)，可得到高分子铁螯合剂8K21，其中小分子螯合剂在高分子铁螯合剂中的含量约为70wt％。

实施例2：

将0.2g聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯PGMA2(M_n＝10300g·mol^-1)和0.29g1-甲氨基丙基-2-甲基-3-羟基-4-(1H)-吡啶酮加入到单口瓶中，然后加入8mL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入1mL三乙胺，保持80℃反应2小时，向反应液中加入80mL乙醚沉降产物，过滤沉淀后干燥，放入透析袋中透析3天(每天换四次蒸馏水，透析袋截留分子量为3000)去除过量的单体得到高分子铁螯合剂8K41，其中小分子螯合剂在高分子铁螯合剂中的含量约为58wt％。

若保持其它条件不变，将反应物中0.2g PGMA2、0.29g1-甲氨基丙基-2-甲基-3-羟基-4-(1H)-吡啶酮分别替代为0.2g聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯PGMA1、0.24g 2-甲基-3-羟基-4-(1H)-5-甲氨基甲基-吡啶酮，可得到高分子铁螯合剂7TD，其中小分子螯合剂在高分子铁螯合剂中的含量约为70wt％。通过核磁共振氢谱计算聚甲基丙烯酸缩水甘油醚酯中重复单元个数，计算得到高分子铁螯合剂的数均分子量M_n＝33100。

应用实施例：

选择上述实施例1合成得到的8K21进行铁螯合容量的测定，以探究不同分子量长度的螯合铁高分子，不同配体形成的高分子铁螯合剂的铁离子(III)螯合容量。具体操作如下：取干燥好的螯合铁高分子分别称量好(5.39mg 8K21)，加入0.4mL二甲基亚砜形成溶液，再取5μL上述溶液加入到1.4mL水形成螯合铁高分子的水溶液(二甲基亚砜的量忽略不计)，通过计算得到高分子化合物8K21的浓度为48.13μg/mL。本实验采用氯化铁水溶液(0.8953mM,FeCl₃)进行滴定，每5分钟滴定5微升氯化铁水溶液，通过紫外可见吸收光谱(250-600nm)对化合物的铁螯合容量进行测量，因为高分子化合物和铁离子螯合后，在可见光范围内有吸收，随着铁螯合剂浓度的增加，紫外-可见吸光度增加，当铁离子和高分子形成的螯合剂饱和时，吸光度将不再变化，此时可根据滴加铁溶液中铁离子的含量计算得到高分子的铁螯合容量，最终测得8K21的铁螯合容量为1196μmol/g。图1为使用紫外-可见分光光度法测定三价铁离子含量与本发明实施例1制备的高分子铁螯合剂8K21水溶液的吸光度关系图。

将菌株接种在新鲜的大豆蛋白冻(TSB，2.5mL)中，之后在37℃的恒温培养箱中培养18小时。从中取40μL培养液，稀释到含有100μg/mL氨苄青霉素的TSB中(4mL)，再在37℃的恒温培养箱中培养约3小时。离心使菌株沉降(金黄色葡萄球菌转速为10000rpm，其它菌种为5000rpm，离心5min)，除去上清液，之后利用2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸盐(HEPES)缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)洗剩余的菌株两次。得到的菌液放入96微孔板中进行杀菌实验，利用二倍稀释的方法，将3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的HEPES缓冲液加入96微孔板中。将高分子铁螯合剂利用HEPES稀释至150μL，在加入50μL菌液。将微孔板放置于37℃的恒温培养箱中培养3个小时，通过10倍稀释法在96微孔板中将细菌稀释，之后在Müeller-Hinton(MH)琼脂板中培养12小时，控制参比样(PC)的菌株数目在80～120之间。表1为该抗菌实验使用的高分子铁螯合剂浓度数据表。图2为本发明实施例1和实施例2制备的高分子铁螯合剂7K21和7TD在空气孵化器孵化24小时后对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌率和浓度关系的柱状图。

表1

表2为不同浓度的高分子铁螯合剂7K21和7TD在空气孵化器孵化24小时后对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌杀菌率数据表。从表中可以看出，高分子铁螯合剂7K21和7TD分别在6μM(0.301mg/mL)和12μM(0.397mg/mL)的浓度下就可以具有99.9％的杀菌率。

表2

利用2倍稀释法，在96微孔板中配好3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的PBS缓冲溶液。之后取0.1mL小鼠上皮细胞液，利用磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液洗涤小鼠血细胞。之后利用PBS将小鼠血细胞稀释，保证小鼠血细胞浓度约为2.5×10⁴cells/μL。将160μL小鼠血细胞分散液和40μL3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂的PBS缓冲溶液混合，参比样用50％曲拉松与小鼠细胞混合，37℃的恒温培养箱中培养1小时，控制摇床晃动速率为200rpm。然后将微孔板中的混合液以800rcf的转速离心5min，取50μL加入96微孔板中，在414nm波长下测其吸光度，并以50％曲拉松与小鼠细胞混合样品的吸光度定义为100％。图3为本发明实施例1和2制备的高分子铁螯合剂7K21和7TD的上皮细胞毒性测试结果图。该图表明高分子铁螯合剂7TD较7K21具有更小的细胞毒性，7TD基本没有细胞毒性。

Claims

1.一种3-羟基-4-吡啶酮类高分子铁螯合剂在制备抗菌材料中的应用，其特征在于：所述高分子铁螯合剂作为抗菌材料使用；

所述高分子铁螯合剂为：

n的取值范围20-200。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述高分子铁螯合剂具有双重抗菌作用，一方面抑制细菌的呼吸作用，另一方面通过吸收细菌表面的三价铁元素使细菌的生长受到抑制。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述高分子铁螯合剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有优异的抗菌效果。