CN105018526A - 小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法 - Google Patents
小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105018526A CN105018526A CN201510424777.5A CN201510424777A CN105018526A CN 105018526 A CN105018526 A CN 105018526A CN 201510424777 A CN201510424777 A CN 201510424777A CN 105018526 A CN105018526 A CN 105018526A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- mouse
- pcdh
- mouse model
- liver
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 56
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 title claims abstract description 29
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 15
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims abstract description 14
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims abstract description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 55
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 44
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 19
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 18
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 9
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 claims description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 claims description 6
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims description 6
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 4
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 claims description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 4
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 claims description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 claims description 2
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 9
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 4
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- 102100027221 CD81 antigen Human genes 0.000 description 3
- 101000914479 Homo sapiens CD81 antigen Proteins 0.000 description 3
- 101001086785 Homo sapiens Occludin Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 102100032604 Occludin Human genes 0.000 description 3
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 2
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 2
- 238000012505 colouration Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000655352 Homo sapiens Telomerase reverse transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 101150013552 LDLR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012632 fluorescent imaging Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种以慢病毒基因转染法和静脉高压注射转染法为基础的小鼠肝脏特异性基因转染方法。该方法将慢病毒基因转染法和静脉高压注射转染法巧妙地结合在一起，通过该方法可以使外源基因特异性地在小鼠肝脏中表达，且对肝脏的损伤可在短时间内恢复。通过本转染方法可在小鼠肝脏内表达外源基因，该技术可以用于转基因人源化小鼠模型的建立。用本发明的方法可以作为建立疾病动物模型的一种手段。
Description
技术领域
本发明属于生物学领域，涉及小鼠肝脏特异性基因转染方法以及转基因人源化小鼠模型的构建方法，包括肝脏高效表达调控元件调控的肝脏特异性重组慢病毒载体构建，肝脏高效表达调控元件调控的重组慢病毒制备，通过水动力基因转染技术建立的持续表达HCV入侵分子hCD81和hOCLN并可被HCV自然感染的转基因人源化小鼠模型的建立。本发明涉及该模型在未来的抗HCV药物筛选和疫苗评价中的医学应用。
背景技术
慢病毒基因转染法是以慢病毒作为载体的基因转染方法。该技术作为一种常规的基因转染方法，可以将外源基因递送到分裂期细胞或者不处于分裂期的细胞，通常被用于基因治疗或转基因动物模型的建立。慢病毒载体系统是在人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)基因组的基础上改造而成。该载体系统由包装质粒、包膜质粒和表达质粒构成，其中表达质粒是慢病毒载体的核心质粒。慢病毒载体系统相对于腺病毒载体或重组逆转录病毒载体具有不可比拟的优势，可稳定整合于靶细胞基因组，实现基因的持续稳定表达。然而，该技术由于诱导宿主天然免疫反应导致慢病毒的清除，从而造成转染失败。
水动力基因转移技术是一种简便、高效的体内基因转染方法，近年来已有成熟发展。它是在高压下经小鼠尾静脉快速注射含目的基因重组质粒的生理盐水，从而在小鼠体内(主要在小鼠肝脏)实现目的基因的高效表达，常用于动物实验和实验动物的造模。然而，这种经典的小鼠活体动物转染技术也存在许多局限性，例如转入的目的基因重组质粒在小鼠体内存留时间短，不能整合到宿主染色体内，从而无法实现基因的持续表达。然而，该技术由于转染时间短，不易诱导宿主免疫反应。
发明内容
针对现有的转基因人源化小鼠模型构建方法(慢病毒基因转染法和水动力基因转移技术)中转染失败和表达时间短等问题，本发明的目的联合慢病毒基因转染法和水动力基因转移技术，提供一种在肝脏中特异、持续表达外源基因的转基因人源化小鼠模型构建方法。
本发明所提供的基因转染方法，是将大于105IFU携带有目的基因的重组慢病毒溶解于相当于小鼠体重8％-12％的生理盐水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，24小时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达。
在上述基因转染方法中，所述携带有目的基因的重组慢病毒的注射量优选为106IFU，所述生理盐水的注射量优选为小鼠体重的10％，所述注射速度优选为3秒，所述目的基因的表达时间优选为24小时以上。
在上述基因转染方法中，所述目的基因可以根据需要构建的小鼠模型进行选择,外源基因既可以是表达指示作用的报告基因,如萤火虫荧光素酶基因,还可以是介导外源病原体进入肝细胞的分子编码基因,如介导HCV进入肝细胞的hCD81和hOCLNcDNA。
在上述基因转染方法中，用于构建携带有目的基因重组慢病毒质粒的出发质粒可为任何一种表达外源基因的慢病毒表达质粒，如以pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为出发质粒构建的携带Fluc基因的重组表达质粒为pCDH-EF1-Fluc。
所述的小鼠模型可根据需要构建的小鼠模型进行选择，如成年鼠、新生鼠或乳鼠，优选6-8周龄的成年鼠。
本发明还提供了一种转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
1)携带目的基因的重组慢病毒载体构建；
2)重组慢病毒制备；
3)将携带有目的基因的重组慢病毒溶解于相当小鼠体重8％-12％的生理盐水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，24小时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达，得到转基因小鼠模型。
其中目的基因、出发质粒、小鼠类型均参考上述基因转染方法的内容。
在肝脏特异性转基因小鼠模型构建中，所述目的基因为编码介导HCV感染肝脏的基因，具体可为肝脏特异性增强子和启动子调控的hCD81和hOCLN cDNA。
具体肝脏特异性转基因人源化小鼠模型的构建，包含以下步骤：
(1)以pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为出发载体构建嵌合肝脏特异性增强子和启动子序列调控的慢病毒表达载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro；
(2)将hCD81和hOCLN cDNA插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro中，分别构建重组慢病毒表达质粒命名为pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-OCLN；
(3)将质粒pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN分别转入包装细胞得到慢病毒；
(4)将hCD81和hOCLN基因的慢病毒各105IFU，溶解于生理盐水中，通过尾静脉将两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，转染24h后得到肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型。
在肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN的转基因小鼠模型也属于本发明。
所述转基因小鼠模在疫苗评价或抗HCV药物筛选中的应用也属于本发明。
基于上述提供的基因转染方法、转基因小鼠模型构建方法、小鼠人源化肝脏特异性基因转染方法，本发明联合了慢病毒基因转染技术和水动力基因转移技术，将慢病毒基因整合特性和水动力的肝脏特异转染特性巧妙地结合在一起，通过该方法可以使外源性基因特异性地在小鼠肝脏中表达，且验证对肝脏组织所造成的损伤可在4天左右恢复。该方法可实现包含人源基因的重组慢病毒质粒在小鼠肝脏内表达目的蛋白。该技术可用于HCV感染小鼠模型的建立和HCV疫苗评价和抗HCV药物筛选，例如，通过转染介导HCV入侵靶细胞的分子hCD81和hOCLN cDNA到6～8周的Balb-C小鼠，可以建立持续表达HCV入侵分子的转基因人源化小鼠模型。用本发明的方法可以评价转基因人源化小鼠模型的肝脏对嗜肝性病原体的易感性改变，也是建立疾病动物模型的一种手段，应用前景广泛。
下面结合具体实施对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-Luc构建示意图
图2A和图2B为活体荧光成像结果显示慢病毒水动力法转染重组慢病毒pCDH-AlbEhAATP-Luc后不同时间点小鼠肝脏中萤火虫荧光素酶的表达情况
图3A和图3B为慢病毒水动力法转染重组慢病毒pCDH-AlbEhAATP-Luc后不同时间点小鼠肝功能转氨酶ALT和AST的检测结果
图4为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81构建示意图
图5为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hOCLN构建示意图
图6显示实时定量RT-PCR法检测转基因人源化小鼠模型肝脏中hCD81和hOCLNmRNA的转录
图7显示免疫组化法检测转基因人源化小鼠模型肝脏中hCD81(A)和hOCLN(B)分子的表达
图8显示实时定量RT-PCR法检测HCV阳性血清感染小鼠的肝脏中病毒核酸含量
图9显示实时定量RT-PCR法检测HCVcc感染小鼠的肝脏中病毒核酸含量
具体实施方式
针对现有的转基因人源化小鼠模型构建(慢病毒基因转染法和水动力基因转移技术)分别存在转染失败和表达时间短的问题，本发明联合慢病毒基因转染法和水动力基因转移技术，提供一种在肝脏中特异、持续表达外源基因的转基因人源化小鼠模型构建方法。实施例基于前述技术方案，是对技术方案的详细说明，不应理解为对其的限制。实施例中使用了具体的目的基因、出发载体及各种实验材料以达到具体公开的目的，与其类似功能的材料可以做等同替换，也属于本发明公开内容。
下述实施例中所用方法如无特殊说明均未常规方法。实施例中PCR法扩增目的基因所需引物见表1，RT-PCR法测定转基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表达所需引物见表2。
表1:PCR法扩增目的基因所需引物
表2:RT-PCR法测定转基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表达所需引物
实施例1、慢病毒水动力基因转染方法的建立
该实施例以具有表达指示作用的报告基因萤火虫荧光素酶基因作为外源基因的代表，说明慢病毒水动力基因转染方法的成功建立。
一、重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-Luc的构建
重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-Luc是将AlbEhAATP-Luc序列(序列表中序列1)插入慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自SBI公司)的SpeI和NotI位点间得到的载体。
具体制备如下：
以慢病毒质粒pGL3(Promega公司)为模板，加入扩增目的基因的引物(见表1)，PCR方法扩增萤火虫荧光素酶(Luc)基因，经XbaI和Not I双酶切后插入慢病毒骨架载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro的酶切位点之间，构建为重组慢病毒表达载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-Luc(见图1)。
二、重组慢病毒的包装和浓缩
将质粒pCDH-AlbEhAATP-Luc利用脂质体介导的方法转入包装细胞293FT，进行慢病毒的包装。收集转染3天的细胞培养上清，33500rpm，4℃，离心2h超速离心，得到浓缩的重组慢病毒。
三、慢病毒水动力基因转染方法的建立
将步骤二中浓缩的重组慢病毒，选择6～8周的雄性Balb-C小鼠5只(购自军事医学科学院实验动物中心)，将105IFU的病毒溶解于小鼠体重10％的生理盐水中，以4秒的速度注入小鼠尾静脉中，分别在转染后的3天，7天，15天和30天，按照150mg/Kg的用量小鼠腹腔注射Fluc的作用底物D-Luciferin(购自Promega公司)，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体荧光成像仪进行监测。通过活体成像技术可以观测到小鼠腹部肝脏位置有强烈的信号，结果如图2A所示，萤火虫荧光素酶表达量见图2B。在转染后的第2天和第4天分别对小鼠进行尾静脉取血，进行转氨酶ALT和AST的测定，结果如图3A和图3B所示，表明在转染后的第四天小鼠肝功恢复到正常水平。
如前所述，本实施例慢病毒水动力基因转染，是将大于105IFU的重组慢病毒溶解于相当于小鼠体重8-10％的生理盐水中，以小于5秒的速度注射于小鼠尾静脉中，3天后即能检测到目的基因在小鼠肝脏处获得了表达。
实施例2、慢病毒水动力基因转染方法构建hCD81和hOCLN的转基因人源化小鼠模型
将实施例1建立的转基因方法实际应用到生物医学相关实践当中，本实施例通过该方法构建HCV感染的动物模型。
一、重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN的构建
重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN为分别将AlbEhAATP-hCD81(序列表中序列2)和AlbEhAATP-hOCLN(序列表中序列3)插入慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自SBI公司)的SpeI和NotI位点间得到的载体。
具体制备如下：
分别以小鼠肝癌细胞Hepa1-6(吕丽萍,贾帅争,王海平,詹林盛,王全立.人LDLR基因的克隆及在Hepal-6细胞中的表达.军事医学科学院院刊,2004；28:212-214)和人肝癌细胞(Huh7.5.1)的DNA为模板，设计扩增目的基因的引物(表1)，使用PCR方法扩增小鼠肝脏特异性白蛋白增强子序列(AlbE)和人肝脏特异性α-抗胰蛋白启动子序列(AATP)，平端连接后构建为嵌合肝脏特异性增强子序列和启动子序列(In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-SpecificPromoters)，经SpeI和XbaI双酶切后插入处理好的慢病毒骨架载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自SBI公司)的酶切位点之间，构建为嵌合肝脏特异性增强子和启动子序列调控的慢病毒表达载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro。
设计扩增目的基因的引物(表1)，利用TRIzol(Promega)从QSG 7701细胞(肝内皮细胞系，吕丽萍等，Hepatocytes transduced with human TERT geneacquire a prolonged lifespan in culture and retain permissiveness tohepatitis B virus.Acta virologica,2013；57:305-311)进行总RNA的提取，以提取的RNA为模板，Oligod(T)15为引物，进行反转录PCR，以合成的cDNA为模板，分别加入扩增目的基因(hCD81或hOCLN)的特异性引物进行PCR扩增。扩增hCD81的反应程序为94℃2min预变性后，94℃30sec,58℃30sec,72℃30sec,35个循环后，72℃7min。扩增hOCLN的反应程序为94℃2min预变性后，94℃30sec,58℃30sec,72℃1.5min,35个循环后，72℃7min。1％琼脂糖凝胶电泳后回收目的片断，与T-Vector的连接后转化，挑取阳性克隆进行序列测定。测定结果显示扩增的序列正确。挑取测序正确的克隆进行摇菌扩增，提取质粒，利用限制性内切酶XbaI和NotI将目的片断切下，插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro中，分别构建了重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81(图4)和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN(图5)。
二、重组慢病毒的包装和浓缩
将质粒pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN利用脂质体介导的方法分别转入包装细胞293FT，进行慢病毒的包装。收集转染3天的细胞培养上清，33500rpm，4℃，离心2h超速离心，得到浓缩的慢病毒。
三、慢病毒水动力基因转染方法建立肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型
收集并浓缩带有hCD81和hOCLN基因的慢病毒各105IFU，溶解于相当于BALB/c小鼠(6～8周，购自军事医学科学院实验动物中心)体重10％的生理盐水中，以4秒的速度通过尾静脉将两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，24小时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达，即能得到肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型，该模型可持续到转染后的第14天仍保持稳定。
通过以下实验确证肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型的构建成功：
(1)转染14天后，将小鼠脱臼处死，取肝脏后加入液氮用组织碾磨器碾碎，利用TRIzol法提取总RNA，实时定量RT-PCR法检测hCD81和hOCLN mRNA的转录，各反应成分的加量为2×SYBR Premix Ex Taq 10μl(大连TaKaRa公司)，上下游引物(表2)0.5μl(内对照基因GAPDH)，cDNA模板1ul，ddH2O28ul，反应参数为：98℃预变性2min,95℃变性5sec，56℃退火20sec，72℃延伸15sec，40个循环后进行熔链曲线分析，95℃15sec，将实时定量PCR产物从60℃缓慢而均匀地升温至95℃，升温时间为10min，定时读取荧光值，由实时荧光定量PCR仪自动计算出各基因的表达水平并绘制出熔链曲线。定量RT-PCR结果如图6。
(2)免疫组化法检测hCD81和hOCLN在小鼠肝脏中的表达。
转染14天后，将小鼠脱臼处死，取出肝脏，固定24h以上。将固定后的组织精细取材后，于4℃下脱水、透明，52℃低熔点石蜡浸蜡包埋制成蜡块。切片机对蜡块进行连续切片，厚度为4μm，贴于载玻片上，56℃烘箱内烤干备用。免疫组化法采用SP法：制片后常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸钠缓冲液进行微波抗原修复，PBS洗片3次，每次5min,放入湿盒中。0.3％H2O2孵育，室温10min。PBS洗片3次，每次5min。正常血清(1：10)孵育，室温20min。除去多余血清滴加鼠抗人CD81抗体(1：200)一抗(购自Santa Cruz公司)100μl于切片上，4℃，12-16h。PBS洗3次，每次5min。滴加HRP标记的山羊抗小鼠IgG(购自北京中杉金桥公司)100μl于切片上，室温30min。PBS洗3次，每次5min。DAB显色10min(购自北京中杉金桥公司)。充分水洗，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检及显微镜摄影记录结果。hOCLN的检测步骤同上，兔抗人OCLN一抗(购自Invitrogen)的孵育浓度为1：200。检测结果如图7，其中A幅箭头指示hCD81阳性的小鼠肝细胞(彩图中棕色着色部分)，B幅箭头指示hOCLN阳性的小鼠肝细胞(彩图中棕色着色部分)。
实施例3、HCV感染的小鼠模型的建立及检测
一、HCV 1b株感染的小鼠模型的建立及检测
将实施例2建立的转基因人源化小鼠模型感染HCV 1b型血清，具体步骤为：实验组和对照组各取5只BALB/c小鼠,实验组(transgenic mouse)和对照组(control)每只小鼠经尾静脉注射约3×106IU/mL的HCV阳性血清。在感染后的3、7和14天肝组织取材，提取总RNA，实时定量RT-PCR法检测小鼠肝脏中HCV RNA，具体实验方法参照上海科华的HCV实时定量试剂盒使用说明进行。检测结果如图8，显示实验组和对照组中在接种HCV阳性血清后(inoculum)，在小鼠体内均检测到HCV RNA，但实验组要高于对照组，但3天后，实验组HCV RNA有下降但维持低水平复制，对照组则下降到检测水平以下。
二、HCV 2a株感染的小鼠模型的建立及检测
将实施例2建立的转基因人源化小鼠模型感染HCV 2a病毒液，具体步骤为：实验组(transgenic mouse)和对照组(control)各取5只BALB/c小鼠,实验组和对照组每只小鼠经尾静脉注射约2.5×108IU/mL的HCV 2a病毒液。在感染后的3、7和14天肝组织取材，提取总RNA，实时定量RT-PCR法检测小鼠肝脏中HCV RNA，具体实验方法参照上海科华的HCV实时定量实际盒使用说明进行。检测结果如图9，显示实验组和对照组中在接种HCVcc后(inoculum)，在小鼠体内均检测到HCV RNA，但实验组要高于对照组，但3天后，实验组HCV RNA有下降但维持低水平复制，对照组则下降到检测水平以下。
Claims (10)
1.以慢病毒基因转染法和静脉高压注射转染法为基础的小鼠肝脏特异性基因转染方法，是将大于105IFU携带有目的基因的重组慢病毒溶解于相当于小鼠体重8％-12％的生理盐水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，24小时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达。
2.根据权利要求1所述的基因转染方法，所述携带有目的基因的重组慢病毒的注射量优选于106IFU，所述生理盐水的注射量优选与于小鼠体重的10％，所述注射速度优选于3秒，所述目的基因的表达时间优选于24小时。
3.根据权利要求1或2所述的基因转染方法，其特征在于，所述目的基因可以是根据需要构建的小鼠模型进行选择,外源基因既可以是表达指示作用的报告基因,如萤火虫荧光素酶基因,还可以是介导外源病原体进入肝细胞的分子编码基因,如介导HCV进入肝细胞的hCD81和hOCLN cDNA。
4.根据权利要求1或2或3所述的基因转染方法，其特征在于：用于构建携带有目的基因重组慢病毒质粒的出发质粒可为任何一种表达外源基因的慢病毒表达质粒；以pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为出发质粒构建的携带Fluc基因的重组表达质粒命名为pCDH-EF1-Fluc。
5.根据权利要求1-4任一项所述的基因转染方法，其特征在于，所述的小鼠可根据需要构建的小鼠模型(Balb-C或C57)进行选择，如成年鼠、新生鼠或乳鼠，优选6-8周龄的成年鼠。
6.一种转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：
1)携带目的基因的重组慢病毒载体构建；
2)重组慢病毒制备；
3)用权利要求1至5任一所述方法将所述重组慢病毒转染到小鼠体内,得到转基因小鼠模型。
7.根据权利要求6所述的转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：所述目的基因为编码介导HCV感染肝脏的基因，具体为hCD81和hOCLN cDNA。
8.根据权利要求7所述的转基因人源化小鼠模型的构建方法，其特征在于：包含以下步骤：
(1)以pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为出发载体构建嵌合肝脏特异性增强子和启动子序列调控的慢病毒表达载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro；
(2)将hCD81和hOCLN cDNA插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro中，分别构建重组慢病毒表达质粒命名为pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-OCLN；
(3)将质粒pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN分别转入包装细胞得到慢病毒；
(4)将hCD81和hOCLN基因的慢病毒各105IFU，溶解于生理盐水中，通过尾静脉将两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，转染24h后得到肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型。
9.权利要求6或7或8所述方法构建得到的转基因小鼠模型。
10.权利要求9所述的转基因小鼠模在疫苗评价或抗HCV药物筛选中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510424777.5A CN105018526B (zh) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | 小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510424777.5A CN105018526B (zh) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | 小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105018526A true CN105018526A (zh) | 2015-11-04 |
| CN105018526B CN105018526B (zh) | 2019-01-15 |
Family
ID=54408827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510424777.5A Active CN105018526B (zh) | 2015-07-17 | 2015-07-17 | 小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105018526B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106497977A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-03-15 | 河南省华隆生物技术有限公司 | 一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用 |
| CN113025650A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-06-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374587A (zh) * | 2012-04-13 | 2013-10-30 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种小动物肝脏特异性基因转染方法以及以其为基础的转基因小动物模型的构建方法 |
| CN103642839A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-03-19 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 基于慢病毒转导质粒的hbv小鼠模型 |
-
2015
- 2015-07-17 CN CN201510424777.5A patent/CN105018526B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103374587A (zh) * | 2012-04-13 | 2013-10-30 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种小动物肝脏特异性基因转染方法以及以其为基础的转基因小动物模型的构建方法 |
| CN103642839A (zh) * | 2013-11-20 | 2014-03-19 | 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 | 基于慢病毒转导质粒的hbv小鼠模型 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ZHANG G 等: "High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA", 《HUM GENE THER》 * |
| 彭秀华 等: "利用高压水动力法建立乙型肝炎病毒转染小鼠模型及初步评价", 《实验动物与比较医学》 * |
| 李文博 等: "携带不同数量增强子的嵌合型肝脏特异性启动子的构建及其体外实验研究", 《中国生物工程杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106497977A (zh) * | 2016-11-30 | 2017-03-15 | 河南省华隆生物技术有限公司 | 一种基于pCDH的荧光素酶的重组载体及其应用 |
| CN113025650A (zh) * | 2021-03-08 | 2021-06-25 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用 |
| CN113025650B (zh) * | 2021-03-08 | 2022-07-12 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105018526B (zh) | 2019-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107349226B (zh) | 甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用 | |
| Dandri et al. | Mouse models of hepatitis B and delta virus infection | |
| CN107156059A (zh) | 一种利用干细胞构建人源化慢性乙型肝炎鼠模型的方法 | |
| CN103966227B (zh) | 密码子优化的mg53蛋白的编码核苷酸序列、其重组体及其应用 | |
| CN103981155B (zh) | 靶向肝癌溶瘤腺病毒的构建法和应用 | |
| CN103520724A (zh) | Hsd17b13蛋白或其编码基因的抑制剂的新用途 | |
| CN111705080A (zh) | Hbv非人动物模型的构建方法及其应用 | |
| CN117899238A (zh) | Pglyrp2基因的用途及其相关药物 | |
| CN105018526A (zh) | 小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法 | |
| CN105925609A (zh) | 带有标记基因的Tet-on诱导过表达的重组载体及构建方法 | |
| Hollinshead et al. | Identification of a soluble transplantation antigen from the membrane fraction of adenovirus tumour cells | |
| EP2865263B1 (en) | A method for constructing a cd81 and ocln double transgenic mouse | |
| CN101878747B (zh) | 一种RdRp可调控表达和活体观测的小鼠模型的构建方法 | |
| CN104212835B (zh) | 一种乙型肝炎病毒感染的小鼠模型的构建方法 | |
| CN103374587B (zh) | 一种小动物肝脏特异性基因转染方法以及以其为基础的转基因小动物模型的构建方法 | |
| CN104258414B (zh) | 自噬基因atg10参与rna病毒复制的功能及应用 | |
| Zhang et al. | Identification and characterization of metastatic factors by gene transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model | |
| CN108465108A (zh) | 一种预防或治疗脑胶质瘤的特异性基因靶点 | |
| Xiong et al. | Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice | |
| CN113025650A (zh) | 诱发型炎癌转化小鼠模型及其建立方法和应用 | |
| CN106310294B (zh) | 一种治疗慢性乙型肝炎和肝脏的纤维化的小干扰rna药物 | |
| CN103432593B (zh) | 一种用于预防或治疗食管癌的药物组合物 | |
| CN113876809B (zh) | 一种表达TgMIF蛋白的巨噬细胞在制备治疗肝纤维化药物中的应用 | |
| CN101705226A (zh) | 检测乙肝病毒复制能力和抗病毒药物敏感性的方法 | |
| Wang et al. | Interfering growth of malignant melanoma with Ang2-siRNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |