CN105008383A - 在非离子有机聚合物和正电性表面存在下的蛋白质纯化 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种将所需蛋白质从制品中纯化的方法，所述方法包括(a)以在原始产生培养基中存在有少于约5％的染色质的形式提供所述制品；(b)使所述制品与非离子有机聚合物和盐接触，非离子有机聚合物的浓度足以使所述所需的蛋白质沉淀或使得它附着在亲水性表面上，或将它维持在沉淀的状态或附着在所述亲水性表面上，所述盐浓度足以产生大于生理电导率；以及(c)使所述制品与至少一种正电性表面接触，所述所需的蛋白质基本上没有吸附到所述至少一种正电性表面上，同时没有阻止酸性污染物吸附到所述至少一种正电性表面上，所述接触任选地在足以产生大于生理电导率的盐浓度存在下进行。

Description

在非离子有机聚合物和正电性表面存在下的蛋白质纯化

相关申请的声明

本申请要求2013年2月26日提交的美国临时申请号61/769,416的优先权，该美国临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景技术

本文公开的这些实施方案涉及用于纯化包括抗体在内的蛋白质的方法，所述抗体包括IgG单克隆抗体。使用诸如聚乙二醇(PEG)之类的非离子有机聚合物使蛋白质沉淀的技术是已知的。它最常在低盐浓度下，在不添加盐的情况下使用，但是例外情况是已知的(D.Gervais等人的美国专利申请2010/0204455A1；K.Ingham,Arch.Biochem.Biophys.186(1978)106-113；K.Yamamoto等人,Virology,40(1970)734-744；S.Branston等人,Biotechnol.Progr.28(2012)129-136)。

空间排阻色谱的技术是已知的(J.Lee等人,J.Chromatogr.A 1270(2012)162-170；还参见PCT/SG2012/000199，该文献以引用的方式并入本文并且作为附录A随附)。它利用非离子亲水性表面，通过诸如PEG之类的非离子有机聚合物引起所需产物在所述表面上的保留。已经报道NaCl浓度升高会提高病毒结合效率(Lee等人(同上))。已经报道在升高浓度的NaCl存在下在流化颗粒上进行所述技术会提高IgG制剂的回收率和纯度(P.Gagnon等人,J.Chromatogr.A,2014,1324,171-180)。

阴离子交换色谱是已知的，并且广泛地用于蛋白质的纯化。它利用带正电荷的表面，当施用于无盐或少盐的水溶液中时，蛋白质自发地结合在所述表面上。在PEG存在下阴离子交换色谱的性能是已知的，其中与在不存在PEG的情况下相比，PEG的存在使得蛋白质在更高的盐浓度下从填充有多孔颗粒阴离子交换剂的柱中洗脱，并且其中蛋白质越大，则洗脱所述蛋白质所需的盐浓度的增加越大(P.Gagnon等人,J.Chromatogr.A 743(1996)51-55)。

已经描述了用于降低含有单克隆抗体的细胞培养收获物中染色质的含量的方法(H.Gan等人,J.Chromatogr.A,1291(2013)33-40)。染色质已知包括处于被称为核小体的稳定缔合体中的DNA和组蛋白。Gan等人报道了染色质和它的分解代谢物还与抗体形成缔合体，这限制了后续的分级分离方法的功效。他们报道了实现99％的染色质减少的方法，并且进一步报道了这种减少提高了通过阳离子交换色谱所获得的纯化的质量。由Gan等人报道的技术的一种变化方案已经由Gagnon等人(2013，同上)报道以提高通过在流化亲水性颗粒上进行空间排阻色谱所分级分离的IgG的回收率和纯度。

发明内容

本发明提供了一种从制品中纯化所需蛋白质的方法，所述方法包括(a)以在原始产生培养基中存在有少于约5％的染色质的形式提供所述制品；(b)使所述制品与非离子有机聚合物和盐接触，其中非离子有机聚合物的浓度足以使所述所需蛋白质沉淀或使得它附着在亲水性表面上，或将它维持在沉淀的状态或附着在所述亲水性表面上，所述盐浓度足以产生大于生理电导率；以及(c)使所述制品与至少一种正电性表面接触，其中所述所需的蛋白质基本上不吸附到所述至少一种正电性表面上，同时不阻止酸性污染物吸附到所述至少一种正电性表面上，所述接触任选地在足以产生大于生理电导率的盐浓度存在下进行。

具体实施方式

已经惊人地发现在对已经被调节以去除至少95％的染色质的不纯制品进行PEG介导的分级分离方法时，所述PEG介导的方法可以实现比已知的高功能的生物学亲和色谱方法更高程度的蛋白质纯化，并且所述PEG介导的方法包括其中沉淀混合物含有升高浓度的盐的至少一个阶段，以及其中存在至少一种正电性表面的至少一个阶段，以及其中PEG和所需蛋白质的混合物与至少一种正电性表面在相对缺乏盐的情况下发生接触的至少一个阶段。

在一些实施方案中，提供了用于从被调节以去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化所需蛋白质的多步方法，所述方法包括以下步骤：(i)在同时存在足以产生大于正常生理电导率的电导率的浓度的盐的情况下，使所述不纯制品与足以引起所需抗体被沉淀的量的非离子有机聚合物接触；(ii)在至少一种正电性表面存在下从所述混合物中减少或消除盐；(iii)使所述非离子有机聚合物减少到不足以将所需的蛋白质维持在沉淀状态的浓度；以及(iv)将所述至少一种正电性表面与所述制品分离，留下被高度纯化的所需蛋白质，如果需要的话，可以通过另外的分级分离方法对所述所需蛋白质进行进一步纯化。在一个这样的实施方案中，所需蛋白质是IgG。

在一些实施方案中，提供了用于从被调节以去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化所需蛋白质的多步方法，所述方法包括以下步骤：(i)在同时存在足以产生大于正常生理电导率的电导率的浓度的盐的情况下，使所述不纯制品与足以引起所需蛋白质被沉淀的量的非离子有机聚合物接触；(ii)从所述混合物中减少或消除盐；(iii)在至少一种正电性表面存在下，使所述非离子有机聚合物减少到不足以将所需的蛋白质维持在沉淀状态的浓度；以及(iv)将所述至少一种正电性表面与所述制品分离，留下被高度纯化的蛋白质，如果需要的话，可以通过另外的分级分离方法对所述蛋白质进行进一步纯化。在一个这样的实施方案中，所需蛋白质是IgG。

在一些实施方案中，提供了用于从被调节以去除至少99％的染色质的不纯制品中纯化所需蛋白质的多步方法，所述方法包括以下步骤：(i)使所述不纯制品与足以引起所需蛋白质被沉淀的量的非离子有机聚合物接触；(ii)将盐添加到经过调节的收获物和非离子有机聚合物的组合中，达到足以产生大于正常生理电导率的电导率的浓度；(iii)在至少一种正电性表面存在下从所述混合物中减少或消除盐；(iv)在至少一种正电性表面存在下，使所述非离子有机聚合物减少到不足以将所需蛋白质维持在沉淀状态的浓度；以及(v)将所述至少一种正电性表面与所述制品分离，留下被高度纯化的蛋白质，如果需要的话，可以通过另外的分级分离方法对所述蛋白质进行进一步纯化。在一个这样的实施方案中，所需蛋白质是IgG。

在一些实施方案中，提供了用于从被调节以去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化所需蛋白质的多步方法，所述方法包括以下步骤：(i)使所述不纯制品与足以引起所需蛋白质被沉淀的量的非离子有机聚合物接触；(ii)将盐添加到经过调节的收获物和非离子有机聚合物的组合中，达到足以产生大于正常生理电导率的电导率的浓度；(iii)从所述混合物中减少或消除盐；(iv)在至少一种正电性表面存在下，使所述非离子有机聚合物减少到不足以将所需蛋白质维持在沉淀状态的浓度；以及(v)将所述至少一种正电性表面与所述制品分离，留下被高度纯化的IgG，如果需要的话，可以通过另外的分级分离方法对所述IgG进行进一步纯化。在一个这样的实施方案中，所需蛋白质是IgG。

在一些实施方案中，提供了用于从被调节以去除至少95％的染色质的不纯制品中纯化所需蛋白质的多步方法，所述方法包括以下步骤：(i)在同时存在足以产生大于正常生理电导率的电导率的浓度的盐的情况下，使所述不纯制品与足以引起所需蛋白质被沉淀的量的非离子有机聚合物接触；(ii)从所述混合物中减少或消除盐；(iii)使所述非离子有机聚合物减少到不足以将所需蛋白质维持在沉淀状态的浓度，然后使所述混合物与至少一种正电性表面接触；以及(iv)将所述至少一种正电性表面与所述制品分离，留下被高度纯化的蛋白质，如果需要的话，可以通过另外的分级分离方法对所述蛋白质进行进一步纯化。在一个这样的实施方案中，所述蛋白质是IgG。

在一些实施方案中，所述方法的至少一个阶段涉及所需蛋白质与至少一种正电性表面在基本上阻止所述所需蛋白质吸附到该表面的条件下发生接触。在一些这样的实施方案中，所述所需蛋白质是IgG抗体。在一些这样的实施方案中，所述所需蛋白质是单克隆IgG抗体。

在一些实施方案中，所述方法的至少一个阶段涉及所需蛋白质与至少一种正电性表面在使得基本上全部的所需蛋白质吸附到该至少一种正电性表面上的条件下发生接触。在一些这样的实施方案中，所述所需蛋白质是IgM抗体。在一些这样的实施方案中，所述所需蛋白质是单克隆IgM抗体。在一些实施方案中，所述所需蛋白质是非抗体蛋白质。在一些这样的实施方案中，所述所需蛋白质是凝血因子。在一些这样的实施方案中，所述所需的蛋白质是纤维蛋白原。在一些实施方案中，所述所需蛋白质是因子VIII。在一些这样的实施方案中，所述所需蛋白质是因子VIII和血管性血友病因子(von Willebrand factor)的复合体，所述复合体也被称为抗血友病因子。

在先前实施方案中的任一个中，所述至少非离子亲水性表面可以任选地存在于所述方法的任何阶段直到将所述至少一种正电性表面与被纯化的蛋白质分离。在一些这样的实施方案中，所述至少一种非离子亲水性表面是整体柱(monolith)。在一些这样的实施方案中，所述至少一种非离子亲水性表面呈膜的形式。在一些这样的实施方案中，所述至少一种非离子亲水性表面由多个颗粒组成。在一些这样的实施方案中，非离子亲水性颗粒可以具有10纳米、或100纳米、或1微米、或10微米、或100微米、或者中间尺寸或更大尺寸的平均尺寸。在一些这样的实施方案中，所述颗粒可以是磁性的或顺磁性的，从而使得能够在磁场中或在磁性表面上对它们进行收集。

在先前实施方案中的任一个中，至少一种正电性表面可以呈多个流化正电性颗粒的形式。在一些这样的实施方案中，所述颗粒可以是被制造用于在柱中进行色谱的颗粒。在一些这样的实施方案中，所述颗粒可以被称为阴离子交换色谱颗粒。在一些实施方案中，所述颗粒可以被称为混合模式的色谱颗粒，指的是如下的情形，其中除了具有正电性之外，所述颗粒还体现出参与和抗体制品的组分发生的其它类型的化学相互作用的能力，所述化学相互作用如疏水性相互作用、氢键合、以及配位键合或金属亲和相互作用。在一些实施方案中，所述颗粒还可以包括负电荷，只要所述颗粒上的净电荷是正的即可。在一些实施方案中，正电性颗粒可以具有10纳米、或100纳米、或1微米、或10微米、或100微米、或者中间尺寸或更大尺寸的平均尺寸。在一些实施方案中，所述颗粒可以是磁性的或顺磁性的，从而使得能够在磁场中或在磁性表面上对它们进行收集。

在其中所述至少一种正电性表面包含多个颗粒的一些实施方案中，颗粒的比例可以占在添加颗粒时制品体积的1％、或2％、或3％、或4％、或5％、或10％、或更少的比例、或更多的比例、或中间的比例。将认识到的是，颗粒的实际比例将随颗粒的尺寸、它们的表面特征、IgG的特征、以及仍存在于制品中的污染物的量和特征而变。为了实现初始的实验目的，以IgG制品的体积/体积比例计，以2％至5％的颗粒开始将是适宜的。

在先前实施方案中的任一个中，至少一种正电性表面可以呈多孔膜的形式。在一些这样的实施方案中，膜的平均孔径可以是100nm、或220nm、或450nm、或1微米、或2微米、或更小的尺寸、中间的尺寸、或更大的尺寸。在一些这样的实施方案中，膜的平均孔径可以是220nm。在一些这样的实施方案中，膜的平均孔径可以是450nm。鉴于膜的功能将在于保留PEG诱导的沉淀物和/或亲水性颗粒，具有保留那些物质的最大孔径分布的膜将是优选的，这是因为它还将支持最高的跨膜流体传输速率，这进而将支持最短的处理时间。在一些这样的实施方案中，所述膜可以被称为阴离子交换色谱膜或阴离子交换膜吸附器。在一些实施方案中，所述膜可以被称为混合模式的色谱膜，指的是如下的情形，其中除了具有正电性之外，所述膜还体现出参与和不纯制品的组分发生的其它类型的化学相互作用的能力，所述化学相互作用如疏水性相互作用、氢键合、以及配位键合或金属亲和相互作用。在一些实施方案中，所述膜还可以包括负电荷，只要在正常操作条件下所述膜上的净电荷是正的即可。

在一些实施方案中，至少一种正电性表面的正电性可以是由含氮化合物赋予的。在一些这样的实施方案中，所述含氮化合物可以是伯氨基、或仲氨基、或叔氨基、或季氨基、或这些基团的组合或聚合物。在一些这样的实施方案中，所述含氮化合物可以是三(2-氨乙基)胺(TREN)。在一些实施方案中，带正电荷的含氮基团可以是亚胺、或吡啶、或其它正电性基团。在一些实施方案中，含氮化合物的正电荷可以存在于除氮原子以外的残基(如硫原子)上。

在一些实施方案中，可以使用切向流过滤设备中所容纳的正电性膜来实施所公开的方法，所述设备可以根据需要在不同的程度上被自动化。在一些这样的实施方案中，正电性膜还可以发挥保留被沉淀的IgG的功能，包括在IgG制品含有部分阻止或高度阻止或完全阻止膜上的正电荷与不纯制剂的组分上的负电荷之间的静电相互作用的浓度的盐时。

在一些实施方案中，在至少一种正电性表面不发挥保留被沉淀的IgG的功能的情况下，它可以由膜装置或整体柱、或填充颗粒的柱组成。

在一些实施方案中，可以使用切向流过滤设备中标称不带电荷的膜实施所述方法，其中所述不带电荷的膜发挥保留被沉淀的IgG的功能。在一个这样的实施方案中，所述不带电荷的膜还可以发挥保留正电性颗粒的功能。在一个相关实施方案中，所述不带电荷的膜可二者择其一地发挥保留正电性颗粒的功能。

在一些实施方案中，可以使用死端过滤介质来实施所述方法，其中沉淀物被保留，而未沉淀的污染物通过并且因此被消除。

在一些实施方案中，可以使用离心来实施所述方法，其中使沉淀物沉降，从而使得能够处置含有污染物的上清液。

在一些实施方案中，在其中酸性污染物被认为与至少一种正电性表面结合的低盐阶段或无盐阶段，IgG制品中PEG的浓度可以是容许IgG变得可溶的PEG的最高浓度，意图是PEG促进污染物与膜的结合。在其它实施方案中，在重新溶解的IgG中PEG的浓度可以是最低的可能的浓度以最小化样品的粘度和/或有助于其随后的去除。已知在溶解的IgG中PEG的浓度可以具有一定的实际价值，进行简单的实验来鉴定在具体的情形下最佳服务于实验利益的浓度在本领域普通技术人员的能力范围内。

在一些实施方案中，足以产生大于正常生理电导率的电导率的盐的浓度可以显著大于正常的生理电导率。在正常的电导率可以在12mS/cm至16mS/cm的范围的情况下，被认为是显著更大的值可以包括20mS/cm、或30mS/cm、或40mS/cm、或50mS/cm、或60mS/cm、或70mS/cm、或80mS/cm、或90mS/cm、或100mS/cm、或150mS/cm、或200mS/cm、或者中间的值或更高的值，例如高达饱和NaCl溶液的电导率。实验数据表明可以在约50mS/cm至150mS/cm的范围或对应于约0.5M至1.5M的范围的NaCl浓度的范围获得最有效的污染物减少和IgG回收。在其它情况下，术语大于生理电导率可以被理解为是17mS/cm、或18mS/cm、或19mS/cm、或中间值。应当了解的是，每一种IgG的表现均不同并且其中存在IgG的不纯制品的组分也会施加影响，因此将需要进行简单的实验来确定最有利的电导率以适应具体的IgG制剂。重要的是认识到，除了使得能够进行PEG沉淀以实现更高的纯度水平、减少包括酸性污染物在内的污染物的优势之外，还降低了由至少一种正电性表面所需的容量，这使得它更有效并且还可以容许该表面的尺寸减小。

在一些实施方案中，用于提高电导率的盐可以是中性盐，如氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾。在一些实施方案中，所述盐可以是离液盐，如乙酸胍、盐酸胍、硫酸胍、磷酸盐、硫氰酸钠、或硫氰酸钾等。在一些实施方案中，将避免使用沉淀盐，包括硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、柠檬酸钠、柠檬酸钾、柠檬酸铵、磷酸钾，这是因为它们有强烈的造成自发相分离、从而使得浓缩的PEG溶液浮在浓缩的盐溶液顶部上的倾向。为了实现大部分的目的，并且特别是作为起始点，NaCl一般将是所选择的盐。

在一些实施方案中，盐的浓度大于2.0M、或大于2.5M、或大于3M、或大于4M、最高至饱和溶液。在一些这样的实施方案中，盐是NaCl。在一些这样的实施方案中，盐是KCl。

在一些实施方案中，在其中电导率高于生理电导率、特别是包括显著高于生理电导率的值的工艺阶段期间，可以减少或暂停对优化操作pH值的需要。在低电导率值下，pH值调节了蛋白质间的电荷相互作用。当蛋白质处在它们的等电点时，它们的净电荷是零并且它们最低限度地自斥。当pH值高于它们的等电点时，它们具有净负电荷，并且随着pH值升高，变得越来越自斥。当pH值低于它们的等电点时，它们具有净正电荷，并且随着pH值降低，变得越来越自斥。因此当给定的IgG处在或接近它的等电点时，一般有利于通过PEG进行沉淀。由于盐离子与溶液中带电体之间的静电相互作用竞争，因此所述盐离子降低了蛋白质之间在远离它们的等电点的pH值下的排斥程度，这减小或消除了pH值的影响。在所公开的方法的背景下实际意义在于在一些实施方案中，产生高电导率的浓度的盐的存在消除了对调节pH值的需要。为了实现为具体的不纯制品中的具体IgG定制方法的目的，7.0的中性pH值成为良好的起始点，并且可能不需要对它进行调节。

在一些实施方案中，pH值调节可以被延迟直到其中IgG制品与IgG在不存在过量的盐的情况下发生接触的阶段为止。在这个阶段时，可能有利的是，将pH值调节到接近IgG的等电点的值以使将抗体维持在沉淀状态所需的PEG的浓度最小化。在这个阶段和/或在期间至少一种正电性表面与IgG制品发生接触的阶段(在一些实施方案中，这两个阶段可以是同一个阶段)，将有利的是，对pH值进行调节以使至少一种正电性表面结合酸性污染物的能力最大化。已知给定的IgG的等电点可能是有帮助的，但与表面的结合还受蛋白质上的电荷分布的影响，这一般是预先不可知的，因此使用不同的pH值进行简单的实验将是鉴定最适pH值的最有效的方式。8.0的pH值对于大部分的人类IgG1单克隆抗体来说是适当的起始点。

在其中盐以大于2M的浓度存在的一些实施方案中，溶液的pH值是7、或8、或8.5、更高、或6、或6.5、或6至8.5的另一个值、或低于6。

在一些这样的实施方案中，盐是NaCl或KCl、或其组合。

在一些实施方案中，在其中酸性污染物与至少一种正电性表面结合的阶段，盐浓度理想地是零，或维持抗体的溶解度所需的最低浓度。

在一些实施方案中，非离子有机聚合物可以是聚乙二醇(PEG)、或聚丙二醇、或葡聚糖、或纤维素、或淀粉、或聚乙烯吡咯烷酮等等。

在一些实施方案中，非离子有机聚合物将是聚合物尺寸为约2,000道尔顿(D)、或3,000D、或4,000D、或5,000D、或6,000D、或8,000D、或10,000D、或12,000D、或中间聚合物尺寸的PEG。经验证实平均聚合物尺寸越小，实现沉淀所需的浓度越高。这不是简单地对质量进行调节；存在由以下事实所介导的渐进性影响，即PEG聚合物的功效与它们独立于流体动力学半径的质量成比例，因此具有相同质量，但是具有不同的支化度的PEG聚合物具有不同的介导沉淀的能力。

在一些实施方案中，PEG将是PEG-6000，并且用于在生理电导率值或更低的电导率值下实现IgG沉淀或在这些电导率值下将IgG维持在沉淀状态的PEG的浓度可以在12％至18％或14％-16％的范围。在一些实施方案中，在足以产生约80mS/cm的电导率的浓度的盐中，如在1M NaCl中，PEG-6000的浓度将需要被升高以实现IgG沉淀和/或将IgG维持在沉淀状态。在其中在生理浓度实现沉淀所需的PEG-6000的浓度是15％-16％的一个这样的实施方案中，在1M NaCl存在下实现沉淀所需的PEG-6000的浓度是18％-22％。这反映了盐的一个已知的，但是一般被忽视的影响，借此它减小了PEG的流体动力学半径。这些浓度可以被用作准则或起始点，应理解的是将需要优化对每一种IgG克隆和其中存在它的不纯制品的各独特特征的适应。

在一些实施方案中，不纯的IgG制品可以由细胞培养收获物组成，所述细胞培养收获物诸如来自哺乳动物细胞、酵母或细菌。在一些实施方案中，不纯的制品可以由培养细胞的提取物组成。在一些实施方案中，不纯的IgG制剂可以由体液组成，如血浆、血清、乳汁或其它体液。

在一些实施方案中，不纯的制剂可以是已经被处理以去除细胞的细胞培养收获物。在一个这样的实施方案中，可以通过诸如离心和过滤的物理方法对收获物进行先前调节。

在所有先前的实施方案中，对已经被调节以去除至少95％的染色质和相关的分解代谢物的不纯制品实施所公开的方法不成比例地提高了系统实现高度纯化的能力。在一些这样的实施方案中，可以通过与一种或多种带正电荷的表面接触来调节所述收获物，其中所述正电荷是由表面上固定的多价有机离子赋予的。在另一个这样的实施方案中，所述调节方法涉及使所需产物制品与可溶性多价有机离子接触。在另一个这样的实施方案中，所述调节方法涉及使所需产物制品与可溶性和/或不溶性多价有机离子接触。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯制品包括使样品与可溶性正电性有机添加剂接触。在一些这样的实施方案中，正电性有机添加剂包括来自由以下各项组成的组的至少一种物质：依沙吖啶(ethacridine)、亚甲蓝、十六烷基三甲基溴化铵。在一些这样的实施方案中，这种物质的浓度或物质组合的合计浓度在0.001％至1％、或0.01％至0.1％、或0.02％至0.05％、或0.01％至0.1％的范围、或是中间值。在一些这样的实施方案中，可以将制品的pH值调节到不会造成所需IgG的回收率显著降低的碱性值。在一个这样的实施方案中，可以将pH值调节到抗体等电点的半个pH单位内的pH值，或如果实验结果表明抗体回收率是可接受的，调节到更高pH单位内的pH值，但是这样的调节一般是不必要的。就进行任何pH值调节来说，蛋白质等电点的1个pH单位内的值将足矣，或1.5个pH单位内的值将足矣。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯制品包括使样品与可溶性负电性有机添加剂接触。在一些这样的实施方案中，所述负电性有机添加剂包括来自由以下各项组成的组的至少一种物质：庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝。在一些这样的实施方案中，这种物质的浓度或物质组合的总浓度在0.001％至10％、或0.01％至1％、或0.1％至0.5％的范围。在一些这样的实施方案中，可以将制品的pH值向下调节到不会造成所需蛋白质的回收率显著降低的酸性值。在一些这样的实施方案中，可以将制品的pH值调节到3.5至6.5、4.0至6.0、4.5至5.5、5.0至5.3、5.15至5.25的范围、或5.2或另一个中间值。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯制品包括使样品与未溶解的尿囊素接触。在一些这样的实施方案中，所添加的存在于不纯制品中的尿囊素可以总计约0.6％至50％、或0.7％至20％、或0.8％至10％、或0.9％至5％、或1％至2％、或中间值。在前述实施方案中的一个或多个中，干尿囊素的平均粒度被选择为可获得的最小尺寸，目标在于实现过饱和溶液中未溶解的尿囊素的最高总表面积。在一个这样的实施方案中，对尿囊素进行造粒以产生较小的粒度。

在一些实施方案中，在被固定在固体表面上的多模式有机离子为正电性的情况下，被固定的多模式有机离子可以是含氮基团，如伯氨基、或仲氨基、或叔氨基、或季氨基、或这些基团的组合或聚合物。在一些这样的实施方案中，所述含氮化合物可以是三(2-氨乙基)胺(TREN)。在一些实施方案中，带正电荷的含氮基团可以是亚胺、或吡啶、或其它正电性基团。在一些实施方案中，含氮化合物的正电荷可以存在于除氮原子以外的残基(如硫原子)上。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯的制品包括使样品与非离子表面活性剂或两性离子表面活性剂接触，所述表面活性剂的浓度低于它的临界胶束浓度。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯的制品包括(i)提供第一组分，所述第一组分是具有负电性表面的第一固体基质；(ii)使所述不纯的制品与所述第一组分接触，其中操作条件基本上阻止所需蛋白质与所述第一组分结合；以及(iii)将具有降低的染色质含量的所需蛋白质与所述第一组分分离。在一些这样的实施方案中，第一负电性表面可以伴以第二负电性表面。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯的制品包括(i)提供第一组分，所述第一组分是具有正电性表面的第一固体基质；(ii)使所述不纯的制品与所述第一组分接触，其中操作条件基本上阻止所需蛋白质与所述第一组分结合；以及(iii)将具有降低的染色质含量的所需蛋白质与所述第一组分分离。在一些这样的实施方案中，所述第一正电性表面带有三(2-氨乙基)胺的残基。在一些这样的实施方案中，第一正电性表面可以伴以第二正电性表面。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯的制品包括(i)提供第一组分，所述第一组分是具有正电性表面的第一固体基质；(ii)提供第二组分，所述第二组分是具有负电性表面的第二固体基质；(iii)使所述不纯的制品与所述第一组分和所述第二组分接触，其中所述第一组分和所述第二组分被配置为使得所述不纯的制品可以同时接触这两种组分，其中操作条件基本上阻止所需蛋白质与所述第一组分或所述第二组分结合；以及(iv)将具有降低的染色质含量的所需蛋白质与所述第一组分和所述第二组分分离。在一些这样的实施方案中，所述第一正电性表面带有三(2-氨乙基)胺(TREN)的残基。

在前述实施方案中的一个或多个中，使用有机多价离子调节不纯的制品包括(i)使所述不纯的制品与至少一种固体表面接触，所述固体表面包含能够结合金属的至少一种表面结合配体，其中所述能够结合金属的表面结合配体最初基本上不含金属，其中操作条件被选择为基本上阻止所需蛋白质与所述至少一种固体表面结合；以及(ii)将所述不纯的制品与所述至少一种表面结合配体分离。

在前述实施方案中的一个或多个中，已经过可溶性正电性或负电性有机添加剂和/或带有负电性、正电性、或金属亲和配体的固体表面处理的不纯的制品可随后流过装置，所述装置的流体接触表面包含正电荷。

在说明了针对染色质的澄清方法的应用的一个实施方案中，将尿囊素以1％(v/v)的量添加到细胞培养收获物中。所述细胞培养物可以含有细胞，或细胞可以先前已经被去除。添加亚甲蓝达到0.025％(w/v)的浓度。或者，可以添加依沙吖啶达到0.025％的浓度。或者，可以添加0.025％的十六烷基三甲基溴化铵达到0.025％的浓度。或者，可以0.025％的组合浓度使用这些或其它正电性有机添加剂的组合。然后，将混合物在搅拌下孵育2小时。以2％-5％(v:v)的量添加带有正电性金属亲和配体三(2-氨乙基)胺(TREN)的颗粒。将混合物在搅拌下孵育4小时，然后通过任何适宜手段去除固体。可以任选地使含有所需蛋白质的剩余的溶液流过深度过滤器，所述深度过滤器在它的流体接触表面上带有正电荷。

在说明了针对染色质的澄清方法的应用的另一个实施方案中，将尿囊素以1％(v/v)的量添加到细胞培养收获物中。所述细胞培养物可以含有细胞，或细胞可以先前已经被去除。添加0.7％的庚酸。或者，添加0.6％的庚烯酸。或者，添加0.4％的辛酸。或者，添加0.4％的辛烯酸。或者，添加0.3％的壬酸(pelargonic acid/nonanoic acid)。或者，添加0.4％的壬烯酸。或者，添加0.2％的癸酸。或者，添加0.5％的甲基蓝。或者，可以使用这些或其它负电性有机添加剂的组合。然后，将混合物在搅拌下孵育2小时。以2％-5％(v:v)的量添加带有正电性金属亲和配体三(2-氨乙基)胺(TREN)的颗粒。将混合物在混合下孵育4小时，然后通过任何适宜方法去除固体。可以任选地使含有所需蛋白质的剩余的溶液流过深度过滤器，所述深度过滤器在它的流体接触表面上带有正电荷。

在一些实施方案中，特定的调节方法的染色质减少程度是通过测量DNA减少的程度以及组蛋白减少的程度，并且取这两个值的平均值来估算的。在一些这样的实施方案中，DNA是通过嵌入染料测定来测量的，而组蛋白通常是通过免疫测定来测量的。在一些这样的实施方案中，由于组蛋白的量是染色质结构的正函数，因此总组蛋白含量可以通过测定1种组蛋白的含量，并且按照与染色质中其它组蛋白的相对比例来比例调整该量来测量。举例来说，总组蛋白可以是通过测量组蛋白H1，然后乘以9以考虑到完整的染色质中H1与其它组蛋白的质量比来估算的。或者，总组蛋白可以是通过测量H2a、H2b、H3、或H4，并且将来自它们中的任一种的结果乘以4.5来估算。或者，可以对H1和H2a、和H2b、和H3、和H4进行测定，并且将结果加在一起。DNA测定可以可选择地通过聚合酶链反应技术来辅助。然而，实验数据表明使用DNA来估算总染色质可能会由于在生产期间在细胞死亡后酶介导的DNA水解而造成总染色质被低估。组蛋白测定和DNA测定这两者可能都需要特殊的提取程序以获得准确的结果。

在一些实施方案中，在所述方法的一个或多个阶段期间，可以使IgG制品与一种或多种抗病毒化合物接触。在一些这样的实施方案中，所述一种或多种抗病毒化合物选自由以下各项组成的组：依沙吖啶、亚甲蓝、苯扎氯铵、氯己定、十六烷基三甲基溴化铵、磷酸三(正丁基)酯。

在一些实施方案中，在执行所述方法期间所利用的非离子亲水性颗粒是纳米颗粒或微粒。在某些这样的实施方案中，所述非离子亲水性颗粒是多孔的。在一些实施方案中，粒度是约50nm至约500μm、或约50nm至约50μm、或约50nm至约4μm、或约50nm至约3μm、或约50nm至约1μm、或约100nm至约1μm、或约200nm至约2μm、或约200nm至约500nm、或约500nm至约1μm、或约5μm至约50μm。在一些实施方案中，所述颗粒是磁性的。

在一些实施方案中，提供了从制品中纯化所需蛋白质的方法，所述方法包括(a)以在原始生产培养基中存在有少于约5％的染色质的形式提供所述制品；(b)使所述制品与非离子有机聚合物和盐接触，其中非离子有机聚合物的浓度足以使所述所需的蛋白质沉淀或使得它附着在亲水性表面上，或将它维持在沉淀的状态或附着在所述亲水性表面上，所述盐浓度足以产生大于生理电导率；以及(c)使所述制品与至少一种正电性表面接触，其中所述所需的蛋白质基本上不吸附到所述至少一种正电性表面上，同时不阻止酸性污染物吸附到所述至少一种正电性表面上，所述接触任选地在足以产生大于生理电导率的盐浓度存在下进行。

在一些实施方案中，方法进一步包括(d)使所述制品与至少一种非离子亲水性表面接触。

在一些实施方案中，在步骤(a)和(b)期间盐浓度是相同的。

在一些实施方案中，方法进一步包括在多孔膜上保留沉淀的所需蛋白质，同时可溶性污染物通过穿过所述多孔膜而被消除。

在一些实施方案中，方法进一步包括在基本上惰性的微孔膜上保留沉淀的所需蛋白质，同时可溶性污染物通过穿过所述微孔膜而被消除，而与盐浓度无关。

在一些实施方案中，方法进一步包括在电导率大于生理电导率时，在正电性的微孔膜上保留沉淀的所需蛋白质，同时可溶性污染物穿过所述微孔膜。

在一些实施方案中，在单个集成设备中执行所述方法。

在一些实施方案中，非离子有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。

在一些实施方案中，非离子有机聚合物的平均聚合物尺寸在来自由以下各项组成的组的一个范围：(a)约1,500道尔顿至约15,000道尔顿；(b)约2,000道尔顿至约12,000道尔顿；(c)约3,000道尔顿至约10,000道尔顿；(d)约4,000道尔顿至约8,000道尔顿；以及(e)约5,000道尔顿至约6,000道尔顿。

在一些实施方案中，电导率比生理电导率大了至少1mS/cm。在一些实施方案中，电导率比生理电导率大了高于1mS/cm、高于5mS/cm、高于10mS/cm、高于20mS/cm、高于40mS/cm、高于80mS/cm、高于160mS/cm，最高至对应于所选的一种或多种盐的溶液的饱和溶液的电导率、或中间的增量。

在一些实施方案中，所述盐选自由以下各项组成的组：氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、盐酸胍、以及其组合。

在一些实施方案中，所述盐是氯化钠，所述氯化钠的浓度选自由以下各项组成的组：(a)约0.5M至约1.5M；(b)约2.0M至约3.0M、以及其中间范围。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性表面是具有选自由以下各项组成的组的平均尺寸的孔的膜：(a)约100nm；(b)约220nm；(c)约450nm；(d)约1微米；(e)约2微米；以及其中间值。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性固体是多个颗粒。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性固体是选自包括以下各项的组的色谱装置的一部分：基于整体柱的色谱装置、基于膜的色谱装置、基于颗粒的色谱装置、基于支撑水凝胶的大网状骨架的装置、以及其组合。

在一些实施方案中，盐浓度选自包括以下各项的组：零量、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、以及其中间浓度。

在一些实施方案中，在步骤(a)期间pH值在选自由以下各项组成的组的范围：(a)约8至约9；(b)约8至约8.5；(c)约7.5至约8.5；(d)约7.25至约8.25；(e)约7.0至约8.0；(f)约6至约7；以及其中间pH值范围。

在一些实施方案中，在步骤(b)期间pH值在选自由以下各项组成的组的范围：(a)约5至约9；(b)约6至约8；(c)约6.5至约7.5；(d)约7.5至约8.5；以及其中间pH值范围。

在一些实施方案中，所述至少一种亲水性表面包括选自由膜、整体柱、以及多个颗粒组成的组的一种，其中所述多个颗粒任选地是磁性的。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性表面包括来自由膜、整体柱、以及多个颗粒组成的组的一种，其中所述多个颗粒任选地是磁性的。

在一些实施方案中，所述制品是选自由以下各项组成的组的一种：细胞培养基、来自所培养的生物体的提取物、以及体液。

对术语进行定义以使得可以更容易地理解实施方案。附加定义阐述于整个详细说明中。

“染色质”指的是染色体的基本组成。在它在活细胞中的完整形式中，它主要包含DNA和组蛋白，其与较少量的其它蛋白质和肽缔合。它被组织成核小体，所述核小体包含由1.65圈DNA缠绕的组蛋白的八聚体，所述八聚体包括各2个的组蛋白2a、组蛋白2b、组蛋白3以及组蛋白4。核小体在线性区域中由接头DNA的区段连接，这些区段与组蛋白H1缔合。染色质在细胞死亡同时开始分解。在诸如用于产生重组蛋白质的细胞培养过程中，染色质和它的分解产物被排出到细胞培养基中，其中它们可以与包括所需的重组产物在内的细胞培养基的成分形成缔合体。术语“染色质分解代谢物”可以用于指染色质分解产物。这些分解产物包括含有2-30个或更多的核小体、单个核小体、核小体片段、DNA、以及组蛋白的阵列(Gan等人(同上)；Gagnon等人(2013)(同上))。“组蛋白”被理解为代表染色质分解代谢物。“DNA”无论它的尺寸如何均被理解成代表染色质分解代谢物中的一种。单个“核小体”和核小体阵列被理解成代表染色质分解代谢物。

“空间排阻色谱”指的是一种纯化方法，其中抗体分子(例如IgG或其它抗体产物)的保留是由诸如PEG之类的非离子有机聚合物与抗体和非离子颗粒的亲水性表面同时相互空间排阻所介导的。认为在蛋白质表面与颗粒表面之间不存在直接的化学相互作用。这独特地赋予所述方法在比诸如离子交换色谱或疏水性相互作用色谱之类的传统色谱方法所可能的更宽的条件范围内维持结合的能力。

“水合表面”或“高度水合表面”或“亲水性表面”指的是潜在地经由氢键合、电致伸缩、或这两种机制的某种组合与水发生强烈的相互作用的表面。这些相互作用可以由诸如羟基、负电荷、或正电荷、或不带电荷的极性基团之类的化学基团来介导。可水合的化学基团的存在可以是诸如颗粒或对流色谱材料之类的给定材料的天然组成的基本特征，或者它可以通过化学修饰以将这些基团固定在表面上来被增添或增强，包括但不限于碳水化合物和酰脲。所谓的疏水性表面一般被认为是没有被高度水合的，然而，包括可强烈水合的基团与疏水性残基的组合的表面仍可以被充分地水合以实施本文公开的实施方案。

“聚集体”指的是两个或更多个分子的缔合，这种缔合在生理条件下是稳定的并且可以在广范围的pH值和电导率条件下保持稳定。聚集体经常包含至少一种生物分子，如蛋白质、核酸或脂质；以及另外的分子或金属离子。所述缔合可以经由任何类型的化学相互作用或化学相互作用的任何组合而发生。抗体的聚集体可以分为以下两个类别：“同型聚集体”指的是两个或更多个抗体分子的稳定缔合；“异型聚集体”指的是一个或多个抗体分子与一个或多个非抗体分子的稳定缔合。所述非抗体组分可以由来自由以下各项组成的组的一种或多种实体组成：核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白质、脂质、或细胞培养基组分。

“抗体”指的是源自于人类细胞系或其它哺乳动物细胞系的IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE类别的免疫球蛋白，包括天然形式或遗传修饰的形式，如人源化抗体、人类抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体、以及体外产生的抗体。“抗体”还可以包括复合形式，包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白、或通过IgG与另外的功能部分的合成性键合所产生的免疫缀合物，所述功能部分包括另外的抗体、酶、荧光团或其它信号产生部分、生物素、药物、或其它功能部分。

“抗体产物”指的是一种蛋白质实体，其至少一部分包含抗体或抗体的一部分。最简单的实例是抗体。化合物实例包括Fc融合蛋白，所述Fc融合蛋白含有通过重组手段与抗体的Fc部分共价结合的非抗体功能部分。另一个化合物实例是抗体缀合物或免疫缀合物，它由最常通过合成手段与另外的部分连接的抗体组成，以提高抗体的功能性，例如使它发荧光以使它可以被用于免疫测定中、或使它与酶结合以用于同一目的、或与细胞毒素结合以杀灭癌细胞、或与其它部分结合以用于其它目的。其它抗体产物是二价化合物(如两个抗体片段之间的融合体)，所述二价化合物具有对两个单独的靶标具有结合特异性的两个结构域。

“内毒素”指的是在革兰氏阴性细菌的外膜中存在的在裂解时从细胞中释放的一种毒性热稳定性脂多糖物质。内毒素一般可以由于它们的磷酸残基和羧基残基含量高而具有酸性，并且可以由于脂质-A区的脂肪酸含量而具有高疏水性。内毒素可以为氢键合提供广泛的机会。

“非离子有机聚合物”指的是天然存在的烃或合成烃，所述烃由缺少带电荷的基团的连接的重复有机亚单元构成。它可以是线性的、主要是线性的而具有一定支化的、或主要是支化的。适合于实施本文所公开的实施方案的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、以及聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH₂-CH₂-O)_n-H。实例包括但不限于具有在小于100道尔顿至大于10,000道尔顿的范围的平均聚合物分子量的组合物。市售PEG制剂的平均分子量通常由用连字符连接的后缀指示。举例来说，PEG-6000指的是具有约6,000道尔顿的平均分子量的制剂。这些试剂的有效浓度随聚合物的特性和由本文所公开的实施方案处理的抗体产物的特征而变。

“阴离子交换色谱”指的是利用与固体表面共价结合的正电荷以用于介导样品组分间的分级分离的表面的一种方法，这些样品组分具有不同的电荷特征，因此酸性(负电性)污染物倾向于与所述正电荷结合，碱性(正电性)污染物倾向于排斥所述正电荷，并且不带电荷的或电中性的污染物倾向于不结合所述正电荷。这些系统的选择性通常由pH值和电导率控制，其中随着pH值升高和/或盐浓度降低，结合通常变得更强。

“阴离子交换膜”或“正电性膜”指的是一种多孔膜，所述多孔膜的表面以正电荷为主。膜孔可以在5nm或更小至1微米或更大的范围。具有小于200nm的孔的膜经常被称为超滤膜，而具有大于200nm的孔的膜经常被称为微滤膜。正电性可以由包括但不限于以下各项的化学基团赋予：弱阴离子交换基团，如氨基、乙二氨基、二乙氨基乙基、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺；强阴离子交换基团，如季氨基；组合的弱-强交换剂，如聚赖氨酸、聚精氨酸、或三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树枝状体(乙二胺核心)、或上述物质的任何组合。在带正电荷的膜上产生混合的化学特征的次级官能团可以由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水性基团、π-π键合基团、氢键键合基团、或金属螯合基团组成。次要官能团可以作为合成颗粒的制造材料或工艺的无意的副产物存在于膜表面上，或它们可以通过有意的设计而存在。次要官能团的浓度可以在每毫升颗粒少于1毫当量至每毫升多于100毫当量的范围。

“阴离子交换颗粒”或“正电性颗粒”指的是一种多孔的或无孔的颗粒，所述颗粒的表面以正电荷为主。粒度可以在小于50nm至大于200微米的范围。所述颗粒可以包含聚合物结构、结晶结构、或陶瓷结构，所述结构还可以包括如下的特征，所述特征允许它们通过不涉及或干扰它们执行本文所公开的要求保护的实施方案的能力，但可以提供一定的整体促进作用的手段被隔离。实例包括但不限于赋予使得能够漂浮的低密度、促进快速沉降的高密度、和/或使得能够在磁场中对它们进行收集的磁性的特征。正电性可以由包括但不限于以下各项的化学基团赋予：弱阴离子交换基团，如氨基、乙二氨基、二乙氨基乙基、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺；强阴离子交换基团，如季氨基；组合的弱-强交换剂，如聚赖氨酸、聚精氨酸、或三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树枝状体(乙二胺核心)、或上述物质的任何组合。在带正电荷的膜上产生混合的化学特征的次级官能团可以由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水性基团、π-π键合基团、氢键合基团、或金属螯合基团组成。次级官能团可以作为合成颗粒的制造材料或工艺的无意的副产物存在于膜表面上，或它们可以通过有意的设计而存在。次级要官能的浓度可以在每毫升颗粒少于1毫当量至每毫升多于100毫当量的范围。

“有机多价离子”指的是天然或合成来源的有机分子、离子或盐，所述有机分子、离子或盐体现至少一个电荷和至少一个另外的化学官能团，从而使它是多价的。在一些实施方案中，在有机多价离子中，所述至少一个另外的化学官能团是另外的电荷，因此所述有机多价离子带有两个或更多个同样的或不同的电荷。有机多价离子可以带有净正电荷、净负电荷、或净中性电荷。在有机多价离子带有净正电荷的情况下，它可以连同阴离子一起提供，所述阴离子诸如氯化物、溴化物、硫酸盐、有机酸、乳酸盐、葡糖酸盐、以及不与所述方法不相容的任何其它阴离子。在一些实施方案中，有机多价离子的某些正电荷是由胺、亚胺或其它氮部分提供的。有机多价离子此外还可以具有混合的化学特征并且包括疏水性残基、其它功能部分和/或它可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括例如参与氢键、疏水性相互作用、π-π键合、金属配位以及嵌入的能力。在一些实施方案中，带正电荷的有机多价离子的实例包括但不限于二氨基酸、二元同型肽(homo-peptide)或异型肽(hetero-peptide)、三元同型肽或异型肽、或更多元的同型肽或异型肽，如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸；聚乙烯亚胺；聚烯丙胺；聚苄菊酯(polydimethrine)、聚甲基丙烯酰胺基丙基三甲基氨；聚二烯丙基二甲基氨；聚乙烯基苯甲基三甲基氨；聚乙烯基胍；聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶)；DEAE-葡聚糖；DEAE-纤维素；依沙吖啶(CAS编号442-16-0；7-乙氧基吖啶-3,9-二胺)；三(2-氨乙基)胺；胍；氯己定；阿来西定；适翠达(citricidal)、鱼精蛋白；精胺；亚精胺；鲑精蛋白；壳聚糖；以及上述物质的变体和衍生物。举例来说，依沙吖啶的变体和衍生物被理解为包括9-氨基吖啶(氨吖啶(aminacrine))、3,6-吖啶二胺(普鲁黄素(proflavin))、吖啶琐辛(acrisorcin)、吖啶氯(acrizane)(酚吖啶(phenacridane))、吖啶橙(acridine orange)、奎纳克林(quinacrine)、乐杀螨(acricide)、吖啶酮(acridone)、吖啶-9-甲酸、氯甲氧吖胺(acranil)(1-[(6-氯代-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红(phenosafranin)、吩嗪、吩噻嗪、吖啶黄(acriflavine)(氯化-3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺)、以及其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)。另一类别的有效的正电性多价有机离子包括噻嗪，如亚甲蓝、它的衍生物、类似物、以及其盐。在有机多价离子具有净负电性的情况下，它可以连同阳离子一起提供，所述阳离子诸如钠或钾、或不与所述方法不相容的任何其它阳离子。在一些实施方案中，有机多价离子的某些负电荷是由羧基、二氧磷基、或磺基部分提供的。有机多价离子此外还可以具有混合的化学特征并且包括疏水性残基、其它功能部分和/或它可以具有参与其它类型的化学相互作用的能力，包括例如参与氢键、疏水性相互作用、π-π键合、金属配位以及嵌入的能力。在一些实施方案中，带负电荷的有机多价离子的实例包括但不限于脂肪酸，如庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝、阴离子聚合物、以及其盐(例如氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)。

“多核苷酸”指的是由共价键合成链的多个核苷酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可以具有高度的形成氢键的倾向。

“蛋白质”指的是含有碳、氢、氧、氮、以及通常硫并且主要由通过肽键连接的氨基酸的一条或多条链构成的一组复杂的有机大分子中的任一种。蛋白质可以具有天然来源或重组来源。蛋白质可以用非氨基酸部分修饰，诸如经由糖基化、聚乙二醇化、或与其它化学部分缀合。蛋白质的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶、以及肽激素。

“蛋白质制品”指的是含有目标蛋白质的任何水性溶液或主要呈水性的溶液，如含有细胞的细胞培养收获物、(基本上)不含细胞的细胞培养上清液、或含有来自纯化阶段的目标蛋白质的溶液。

“不纯的制品”指的是含有目标蛋白质的任何水性溶液或大部分呈水性的溶液，如含有细胞的细胞培养收获物、(基本上)不含细胞的细胞培养上清液、或细胞提取物、或体液、或含有来自纯化阶段的目标蛋白质的溶液。

“表面活性剂”包括“表面活性试剂”，如一般包含疏水部分和亲水部分、从而使得它们被称为两亲性的一类有机分子。在水溶液中足够的浓度下，表面活性剂可以自缔合成簇集体，其中疏水部分集中在中心处以使得与水的接触减到最低程度，并且亲水部分向外辐射以使得与水的接触达到最大程度。在生物制品存在下，特别是含有具有疏水特征或具有疏水特征区域的材料的那些生物制品，表面活性剂的疏水部分倾向于与所述疏水材料的一些部分自发地缔合并且经由表面活性剂的亲水部分的影响提高它们的溶解度。它们还可以用于调节在均被溶解在水性溶剂中的不同的疏水材料之间存在的疏水性相互作用。适合于实施本文所公开的实施方案中的一些实施方案的表面活性剂的实例包括但不限于非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯表面活性剂(例如吐温20(Tween 20)、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯、以及吐温80、聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)以及Triton(例如聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)；以及两性离子表面活性剂，如CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸内盐)、CHAPSO(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-2-羟基-1-丙磺酸内盐)、以及辛基葡糖苷(例如(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基烷-3,4,5-三醇)。

“合成颗粒”可以具有在小于100nm至大于100微米的范围的尺寸。它们可以是多孔的或无孔的。它们可以是由聚合物制成的，由例如聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、琼脂糖、纤维素、葡聚糖、或其它聚合物构成，或它们可以是无机的，如二氧化硅。它们可以整体具有均匀结构，或它们可以是复合的，由诸如金属合金或疏水性聚合物之类的一种材料的内核组成，并且包被有被高度水合或容许连接化学基团以产生高度水合表面的应用表面。“合成颗粒”可以包括被设计用于色谱应用的颗粒，或旨在用于与色谱领域完全不同的应用的颗粒。

“酰脲”指的是天然或合成来源的环状或无环有机分子，所述有机分子包含一个或多个脲部分或其衍生物。在一些实施方案中，提供了酰脲，如脲、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(CAS编号97-59-6；铝克洛沙(alcloxa)、尿囊素铝(aldioxa)、hemocane(尿囊素)、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代-4-咪唑烷基脲)、嘌呤、以及其衍生物。在一些实施方案中，提供了式R-CO-NH-CO-NH₂或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R”NH-CO-NR”'R””的有机分子，其中相关的“R基团”可以是H或任何有机部分。

“病毒”或“病毒粒子”指的是仅在活的宿主，主要是细菌、植物以及动物的细胞内复制的超微结构(具有约20nm至300nm的直径)、代谢惰性感染因子：由RNA核心或DNA核心、蛋白质外壳，以及在更复杂的类型中，周围的包膜构成。

在一些实施方案中，在流化亲水性非离子颗粒上进行空间排阻色谱(SXC)。在一些实施方案中，所述SXC颗粒是可以在小于10微米至大于200微米的范围的微粒。在一些实施方案中，所述SXC颗粒是可以具有在小于10nm至1000nm的范围的尺寸的纳米颗粒。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以是无孔的。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以是微孔的。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以是大孔的。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以下述方式构成，使得能够在磁性表面上或在磁场中对它们进行捕集。

在一些实施方案中，在流化亲水性非离子颗粒上进行SXC。在一些实施方案中，在流化亲水性正电性颗粒上进行SXC。在一些实施方案中，在流化亲水性负电性颗粒上进行SXC。在一些实施方案中，所述SXC颗粒是可以在小于10微米至大于200微米的范围的微粒。在一些实施方案中，所述SXC颗粒是可以具有在小于10nm至1000nm的范围的尺寸的纳米颗粒。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以是无孔的。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以是微孔的。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以是大孔的。在一些实施方案中，所述SXC颗粒可以下述方式构成，使得能够在磁性表面上或在磁场中对它们进行捕集。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性表面可以由多个颗粒组成。在某些这样的实施方案中，所述颗粒是具有可以在小于10微米至大于200微米的范围的平均尺寸的微粒。在一些实施方案中，所述微粒可以是无孔的。在一些实施方案中，所述微粒可以是微孔的。在一些实施方案中，所述微粒可以是大孔的。在一些实施方案中，所述微粒可以下述方式构成，使得能够在磁性表面上或在磁场中对它们进行捕集。在一些实施方案中，所述颗粒是具有可以在小于10nm至大于200nm的范围的平均尺寸的纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒可以是无孔的。在一些实施方案中，所述纳米颗粒可以是微孔的。在一些实施方案中，所述纳米颗粒可以是大孔的。在一些实施方案中，所述纳米颗粒可以下述方式构成，使得能够在磁性表面上或在磁场中对它们进行捕集。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性表面由一个或多个多孔膜组成。在一些实施方案中，孔可以具有0.1微米至5微米范围的平均直径。在一些实施方案中，孔可以具有100nm至5nm范围的平均直径。

在一些实施方案中，所述至少一种正电性表面的正电性可以由包括但不限于以下各项的化学基团赋予：弱阴离子交换基团，如氨基、乙二氨基、二乙氨基乙基、聚烯丙胺、聚乙烯亚胺；强阴离子交换基团，如季氨基；组合的弱-强交换剂，如聚赖氨酸、聚精氨酸、或三(2-氨乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树枝状体(乙二胺核心)、或上述物质的任何组合。

在一些实施方案中，至少一种正电性表面的正电性可以伴以产生混合的化学特征的一种或多种次级官能团。在一些实施方案中，所述表面可以带有负电荷，只要正电性仍是主要的表面化学性质即可。在一些实施方案中，所述表面可以包括疏水性基团、π-π键合基团、氢键合基团、或金属螯合基团。次级官能团可以作为合成颗粒的制造材料或工艺的无意的副产物存在于膜表面上，或它们可以通过有意的设计而存在。

在一些实施方案中，在洗涤步骤中可以使用除NaCl以外的一种或多种盐。这些盐可以包括所谓的离液盐，所述离液盐有时被称为结构破坏盐，实例有异硫氰酸钠或异硫氰酸钾；或所谓的亲液盐，所述亲液盐有时被称为结构形成盐，实例有硫酸铵、柠檬酸钠、或磷酸钾。在一些实施方案中，除盐以外的洗涤剂可以与盐组合使用或代替盐来使用，如非离子离液剂，如脲；或非离子或两性离子表面活性剂，如CHAPS、CHAPSO、八葡糖苷(octaglucoside)、吐温、或Triton；或非离子有机溶剂，如乙二醇或丙二醇；或糖，如蔗糖或山梨糖醇；或螯合剂。由于它们的离子性质以及它们有可能会干扰阴离子交换过程，因此相对于诸如EDTA之类的负电性螯合剂，诸如TREN之类的正电性螯合剂可以是优选的。还可以考虑其它洗涤剂，诸如氨基酸(如精氨酸)，其中出于与螯合剂同样的原因，以正电性为主的种类是优选的。

在一些实施方案中，以单个单元操作执行所述方法。

在一些实施方案中，用于促进IgG在空间排阻色谱颗粒上的保留的PEG可以具有8kDa、或6kDa、或4kDa、或3kDa、或2kDa、或1kDa的平均尺寸。在一些实施方案中，用于促进IgG在空间排阻色谱颗粒上的保留的物质可以是除PEG以外的聚合物，例如聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、或另外的非离子有机聚合物。

在一些实施方案中，所需抗体产物是完全完整的抗体，如具有约150kDa的分子质量的IgG。

在一些实施方案中，样品由经过调节的细胞培养上清液(CCS)组成。在一些实施方案中，通过离心、或絮凝、或过滤、或这些技术的若干组合对CCS进行调节。在一些实施方案中，通过更具涵盖性的手段对CCS进行调节，包括使用降低，特别是降低制品的染色质含量和/或聚集体含量的化学添加剂。在一些实施方案中，通过去除99％或更多的染色质，并且同时实现大量去除非组蛋白宿主蛋白、内毒素、以及病毒以及使聚集体含量降低到1％或更少，同时支持90％-99％的抗体回收率的方法来使CCS澄清。

在一些实施方案中，本文所公开的要求保护的实施方案降低聚集体含量。在一些实施方案中，本文所公开的要求保护的实施方案降低抗体片段的含量。

在一些实施方案中，所需的蛋白质与正电性表面结合。在一个这样的实施方案中，应用所公开的方法以将IgM单克隆抗体纯化。在一个这样的实施方案中，最初使IgM与足以使IgM沉淀或使它附着在亲水性表面上的浓度的PEG接触，所述接触任选地在升高浓度的、如0.5M至1.5M的NaCl存在下进行。在后续的洗涤步骤中将NaCl去除，而足够的PEG依然保持IgM被沉淀或与亲水性颗粒缔合。将PEG浓度充分地降低以使IgM重新溶解。如果存在颗粒的话，将所述颗粒去除，并且使IgM接触到正电性表面，它与所述正电性表面结合。较弱结合污染物一般不能结合并且因此被消除。将IgM从正电性表面洗脱，而更强结合的酸性污染物仍结合并且因此被消除。将是明显的是，许多非IgG蛋白质将以类似方式表现，并且可以成功地应用所述方法的许多变化方案而不脱离所公开的方法的基本原理。

在先前实施方案中的一个或多个中，通过在使不纯的IgG制品与正电性表面接触之前使它接触负电性表面来对它进行处理。在一个这样的实施方案中，所述抗体与负电性表面结合，而PEG则不会，并且后者因此被消除。将认识到的是，这潜在地使得能够进行如下的步骤，在所述步骤中，以所谓的流通模式使IgG与正电性表面进行接触，其中抗体不结合，而酸性污染物大部分却结合。在一些这样的实施方案中，所述负电性表面由膜、整体柱、或多个颗粒组成。在一些这样的实施方案中，负电性官能性伴以其它官能性，所述其它官能性赋予表面参与氢键合、疏水性相互作用、和/或配位键的能力。

本领域技术人员将认识到的是，可以利用上述方法的许多变化方案而不脱离它的基本要素。举例来说，实施方案可以涉及使方法步骤分开，以使得它以两个、或三个、或更多个单元操作来进行。

在一些实施方案中，可以在本文所公开的要求保护的实施方案之前、或之后、或之前和之后进行其它纯化方法。在一些这样的实施方案中，尤其可以在所公开的方法之后进行分级分离方法，借此将所需的IgG保留在表面上，以使得可以洗掉残余的PEG并且随后将抗体从上面保留它的表面洗脱，所述抗体现在不含PEG。在一些这样的实施方案中，上面保留抗体的表面可以是来自由以下各项组成的组的色谱介质：阳离子交换色谱介质、磷灰石介质、结合了正电荷和疏水性的混合模式介质。在一个这样的实施方案中，结合了正电荷和疏水性的混合模式色谱介质的代表为以名称Capto adhere(通用电气医疗公司(GE Healthcare))销售的市售色谱产品。

在一些实施方案中，通过调节方法使制品的染色质降低到比原始生物流体低至少99％的水平，所述调节方法包括使收获物与一种或多种多价有机离子接触。在一些这样的实施方案中，所述多价有机离子是正电性的。

在一些实施方案中，所述一种或多种多价有机离子包括可溶性正电性多价离子，所述可溶性正电性多价离子是来自由以下各项组成的阳离子组中的一种或多种：亚甲蓝、依沙吖啶、氯己定、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵。

在一些实施方案中，所述一种或多种多价有机离子借助于共价连接到表面上而是不溶性的。

在一些实施方案中，所述一种或多种多价有机离子是不溶性正电性多价离子，所述不溶性正电性多价离子是来自由以下各项组成的组的一种或多种：伯氨基、仲氨基、叔氨基、季氨基、含有由一种或多种类型的氨基所赋予的多于一个正电荷的络合阳离子。

在一些实施方案中，所述不溶性正电性多价离子是三(2-氨乙基)胺(TREN)。

在一些实施方案中，所述一种或多种多价有机离子是负电性的。

在一些实施方案中，所述一种或多种多价有机离子包括可溶性负电性多价离子，所述可溶性负电性多价离子是来自由以下各项组成的阴离子组的一种或多种：庚酸、辛酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸、癸酸、甲基蓝。

在一些实施方案中，所述不溶性负电性多价离子是来自由以下各项组成的组的一种或多种：二氧磷基、羧基、磺基、含有由一种或多种类型的带负电荷的基团所赋予的多于一个负电荷的络合阴离子。

在一些实施方案中，所述一种或多种多价有机离子是不溶性络合负电性多价有机离子，所述不溶性络合负电性多价有机离子可以是亚氨基二乙酸或次氮基乙酸。

在一些实施方案中，不溶性多价离子对金属离子具有1:1的亲和力。

在一些实施方案中，尿囊素可以以来自由以下各项组成的组的范围的过饱和浓度任选地存在：0.6％至50％、0.7％至20％、0.8％至10％、0.9％至5％、1％至2％、或中间值。

在一些实施方案中，鉴于在所公开的方法结束时IgG制品将含有非IgG沉淀浓度的非离子有机聚合物，可以特定地选择后续的纯化方法以从制品中减少或消除该聚合物。在一个这样的实施方案中，可以使IgG与至少一种负电性表面结合，而非离子有机聚合物不与所述负电性表面结合，并且因此被消除。在一个这样的实施方案中，所述至少一种负电性表面可以是所谓的阳离子交换剂，诸如已知和销售用于进行包括IgG制品在内的蛋白质的色谱分级分离的目的的阳离子交换剂。在一个这样的实施方案中，所述阳离子交换剂可以呈膜、整体柱、填充颗粒的柱、或另外的物理形式的形式。在另一个实施方案中，至少一种负电性表面可以由所谓的多模式色谱材料组成，所述多模式色谱材料具有容许它除了经由它的负电性参与静电相互作用之外还参与疏水性相互作用和/或氢键结合相互作用的表面组成。在另一个实施方案中，可以利用正电性色谱材料，所述正电性色谱材料具有还允许它参与疏水性相互作用和氢键合的表面组成。在一个这样的实施方案中，在1M NaCl(pH 7.0)下将含有PEG的IgG制品施加到填充有Capto adhere的柱中。抗体结合，而PEG不结合并且因此被消除。将抗体通过将NaCl浓度降低到0.3M(此时IgG被洗脱)洗脱。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加聚乙二醇(PEG)达到IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与所述颗粒结合的污染物的液体例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液。可以联同洗涤缓冲液的添加一起或在添加洗涤缓冲液之后添加正电性颗粒。除了存在PEG之外，缓冲液配方适合于使残余的污染物与正电性颗粒结合，而抗体保持未结合。再次例如通过经由膜过滤去除液体。将SXC颗粒和正电性颗粒悬浮在缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离，并且污染物由正电性颗粒结合。在使污染物与正电性颗粒结合的充分的一段时间之后，例如通过经由膜过滤来收集IgG，所述膜截留SXC颗粒和正电性颗粒，可以将它们丢弃或再循环。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。可以联同高盐洗涤缓冲液的添加一起或在添加高盐洗涤缓冲液之后添加正电性颗粒。将高盐洗涤缓冲液例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG之外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。去除洗涤缓冲液。将SXC颗粒和正电性颗粒悬浮在缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离，并且污染物由正电性颗粒结合。在使污染物与正电性颗粒结合的充分的一段时间之后，例如通过经由膜过滤来收集IgG，所述膜截留SXC颗粒和正电性颗粒，可以将它们丢弃或再循环。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。将高盐洗涤缓冲液例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG之外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。去除洗涤缓冲液。将SXC颗粒和正电性颗粒悬浮在缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离。添加正电性颗粒，并且污染物由所述正电性颗粒结合。在使污染物与正电性颗粒结合的充分的一段时间之后，例如通过经由膜过滤来收集IgG，所述膜截留SXC颗粒和正电性颗粒，可以将它们丢弃或再循环。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。将高盐洗涤缓冲液例如通过经由正电性膜过滤来去除，并且替换为缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG以外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。通过经由正电性膜过滤来去除洗涤缓冲液。将SXC颗粒悬浮在缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离，并且污染物由正电性膜结合。在使污染物与正电性膜结合的充分的一段时间之后，例如通过经由正电性膜过滤来收集IgG，所述膜截留SXC颗粒和酸性颗粒。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。将高盐洗涤缓冲液例如通过经由相同的膜过滤来去除，并且替换为缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG以外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。通过经由正电性膜过滤来去除洗涤缓冲液。将SXC颗粒悬浮在缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离，并且污染物由正电性膜结合。在使污染物与正电性膜结合的充分的一段时间之后，例如通过经由正电性膜过滤来收集IgG，所述膜截留SXC颗粒和酸性污染物。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。将高盐洗涤缓冲液例如通过经由相同的膜过滤来去除，并且替换为缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG以外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。通过经由膜过滤来去除洗涤缓冲液。将SXC颗粒悬浮在缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液中，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离。例如通过经由正电性膜过滤来收集IgG，所述膜截留SXC颗粒和酸性污染物。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由标准微滤膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。将高盐洗涤缓冲液例如通过经由相同的膜过滤来去除，并且替换为缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG以外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。使洗涤缓冲液连续地循环穿过具有约7.5nm至20nm(一般对应于100kDa至300kDa的尺寸的球状蛋白)的平均孔径的正电性膜。将缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液输注到系统中，逐渐地将PEG从系统中置换，结果是IgG以可溶形式与颗粒解离，并且污染物由正电性膜结合。在使污染物与正电性膜结合的充分的一段时间之后，保留的IgG从保留物管线被收集，而所述膜截留酸性污染物。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

在一些实施方案中，将SXC颗粒添加到含有单克隆IgG抗体的细胞培养上清液中。添加PEG达到在也存在于溶液中的0.8M NaCl存在下、IgG将由所述颗粒保留所需的水平。将含有没有与污染物结合的污染物的液体例如通过经由标准微滤膜过滤来去除，并且替换为清洁的PEG-NaCl缓冲液，所述缓冲液在下文中被称为高盐洗涤缓冲液。使含有悬浮的SXC颗粒的高盐洗涤缓冲液连续地循环穿过具有约7.5nm至20nm(一般对应于100kDa至300kDa的尺寸的球状蛋白)的平均孔径的正电性膜。将缺少NaCl或NaCl不足的清洁PEG缓冲液输注到系统中直到高盐被置换为止，所述缓冲液在下文中被称为洗涤缓冲液，所述洗涤缓冲液除了存在PEG以外，适合于使酸性污染物与正电性表面结合，而抗体不会结合。使洗涤缓冲液连续地循环穿过所述正电性膜。将缺少PEG或PEG不足，但是在其它方面类似于洗涤缓冲液的缓冲液输注到系统中，逐渐地将PEG从系统中置换，结果IgG以可溶形式与颗粒解离，并且污染物由正电性膜结合。在使污染物与正电性膜结合的充分的一段时间之后，保留的IgG从保留物管线被收集，而所述膜截留酸性污染物。在一个密切相关的实施方案中，用于SXC的颗粒可以从整个方法中被省去。

本文所公开的实施方案的另外的目的和优势将部分地在随后的说明中被阐述，并且部分地将因所述说明而是明显的，或可以通过实施本文所公开的实施方案来了解。本文所公开的实施方案的目的和优势将借助于权利要求书中所指明的要素和组合来实现和达到。

应当理解的是，上述一般说明和以下详细说明这两者均仅仅是示例性的和说明性的而不限制本文所公开的要求保护的实施方案。

实施例

实施例1：定义用于使IgG与空间排阻色谱介质结合的条件。进行实验以确定支持从由哺乳动物细胞培养产生的抗HER2单克隆抗体中最有效减少宿主细胞蛋白质的盐浓度。使用具有约30微米的平均直径的非离子亲水性淀粉颗粒进行实验。将所述颗粒与细胞培养上清液(CCS)的不同等分部分混合。CCS的宿主蛋白质浓度是约243,011百万分率(ppm)。用尿囊素、依沙吖啶、阴离子交换颗粒以及阳离子交换颗粒处理样品，将宿主蛋白质浓度降低到165,213ppm。添加PEG-6000达到18％的最终浓度。然后将NaCl添加到不同的等分部分中以产生含有0.0M、0.2M、0.4M、0.8M、以及1.0M的系列。在经过处理的样品中，宿主细胞蛋白质污染物水平是15,558ppm、1,994ppm、662ppm、90ppm、以及266ppm。在0.8M进行的纯化因此代表了99.95％的改进；大于3个对数的减少。

实施例2：确定用于阴离子交换处理的盐浓度。通过VEAX评价实施例1的抗体。将样品施加到在独立的实验中在3至9范围的不同pH值、但是缺少盐下被平衡的VEAX柱中。还将样品施加到处于pH 8、但是包括0M至1M的不同水平的盐的VEAX柱中。在pH 8.0、不存在盐的情况下，实现最有效的污染物减少。后续的实验将目标pH值精确到8.2。在pH 8.15和pH 8.25这两者，性能都较次。在这些条件下，VEAX实现了高达99.8％的宿主蛋白质减少，包括宿主蛋白质、DNA、病毒、以及内毒素。这些条件限定了用于通过阴离子交换联同SXC对这种抗体进行污染物提取的条件。

实施例3：确定用于阴离子交换处理的盐浓度。将实验1和2的抗体施加到呈堆叠的平膜和中空纤维形式的阴离子交换膜。污染物减少与在针对VEAX的相同条件下基本上相同。这些实验结果证实SXC与阴离子交换膜的整合可以实现大于6个对数的纯化(99.9999％)。

实施例4：SXC与正电性颗粒的组合。在19％PEG-6000存在下，在1M NaCl下，使来自细胞培养上清液的HER2IgG与淀粉颗粒结合。还存在4％w/v的量的正电性颗粒，所述正电性颗粒呈Dowex AG1x8(200-400筛目)的形式。将流体通过经由具有0.22微米孔的膜过滤来去除，然后替换为含有19％PEG-6000、1M NaCl、以及50mM Tris(pH 8.0)的清洁缓冲液。将流体去除并且替换为含有19％PEG-6000和50mM Tris(pH 8.0)的清洁缓冲液。重复这个步骤，然后通过过滤去除流体。将流体替换为50mMTris(pH 8.0)。宿主细胞蛋白质从原始样品中的142,000百万分率(ppm)减少到约120ppm。

实施例5：SXC与正电性颗粒的组合。重复实施例4的形式，不同的是在将淀粉颗粒用19％PEG-6000和50mM Tris(pH 8.0)洗涤之后，再添加正电性颗粒。将流体去除，然后替换为50mM Tris(pH 8.0)以使IgG与SXC颗粒解离。宿主细胞蛋白质从原始样品中的142,000百万分率(ppm)减少到约少于1ppm。

实施例6：SXC与正电性颗粒的组合。重复实施例5的形式，不同的是使用UNOsphere Q颗粒代替Dowex颗粒。宿主细胞蛋白质减少的结果是相等的，但是IgG回收率更高。

实施例7：SXC与正电性颗粒的组合。重复实施例6的形式，其中在IgG与SXC颗粒解离之后，使颗粒暴露的持续时间呈增大变化以确定实现最佳的结果需要多长时间。结果在30分钟和60分钟时基本上相同，但是在更短的暴露时间下较差。

实施例8：将含有275,357ppm的宿主细胞蛋白质、5283ppm的DNA、以及13.96％的聚集体的含有IgG的细胞培养收获物通过以下步骤调节：添加1％的尿囊素，然后添加0.025％的依沙吖啶，然后混合15分钟。MacroPrepHigh Q、MacroPrep High S、Macroprep tButyl、以及Chelex-100(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories))的等量混合物通过用50mM HEPES、100mMNaCl(pH 7.0)洗涤预先平衡。将平衡的混合颗粒以2％(v:v)的量添加到不纯的IgG制品中，然后在4℃-8℃混合过夜。通过微滤去除固体。将1.25mg涂有淀粉的200nm磁性颗粒添加到20mL的经过调节的不纯IgG制品中。逐步地添加20mL的含36％PEG-6000的1.6M NaCl、50mM HEPES(pH7.0)，同时在涡旋混合器上以500rpm混合以产生18％的PEG-6000和0.8MNaCl的最终浓度。继续涡旋混合30分钟，然后以磁力收集负载IgG的颗粒。将负载IgG的颗粒用新鲜的50mM HEPES、0.8M NaCl(pH 7.0)洗涤，并且去除洗涤溶液。去除洗涤缓冲液并且再次以相同方式洗涤颗粒。将洗涤缓冲液去除，并且使抗体重新溶解在50mM HEPES、1M NaCl(pH 7)中。将1mL柱填充以正电性疏水性色谱介质(Capto adhere，通用电气医疗公司)并且平衡到相同的条件。将溶解的IgG施加到所述柱中，其中IgG结合并且一些污染物被认为已经结合，同时残余的PEG结合。然后以平衡缓冲液施加5倍柱体积的洗涤液以更充分地将未结合的组分从系统中消除。将IgG用终止于50mM HEPES、300mM NaCl(pH 7.0)的10倍柱体积的线性梯度洗脱。纯化性能由下表指示，其中post-con指示在调节后，post-NP指示在纳米颗粒后，并且post-CA指示在Capto adhere后。在回收率下的左侧值指示该步骤的回收率，而右侧值指示先前步骤加上该步骤的累积回收率。bld指示低于检测限度。关于更多的细节，参见Gagnon等人,2014(同上)：

实施例9：将含有176,244ppm的宿主蛋白质污染物和19％的聚集体的含有IgG的细胞培养收获物通过以下步骤调节：添加1％的尿囊素、4％的正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，Bio-Works公司)，在室温混合4小时。被取出用于分析的样品显示宿主蛋白减少到90,259ppm，并且聚集体减少到1.2％。将pH值降低到5.2，添加0.5％辛酸，并且将混合物孵育2小时。被取出用于分析的样品显示1,758ppm的宿主蛋白质和约0.4％的聚集体。经由正电性深度过滤器(Sartorius PC1)去除固体。宿主蛋白减少到135ppm并且聚集体减少到少于0.05％。将抗体通过在18％的PEG-6000中在pH 7.0沉淀来纯化。然后将沉淀物用1.8M硫酸铵洗涤以去除PEG，然后使抗体重新溶解在50mM Hepes(pH 7.0)中。宿主蛋白质减少到32ppm。在施加到在50mM Tris(pH 8.0)下以空隙排阻模式操作的阴离子交换色谱柱(UNOsphere Q，伯乐公司(Bio-Rad))之后，宿主蛋白质减少到少于1ppm。不同之处仅在于在800mM NaCl存在下进行PEG沉淀的平行实验使宿主蛋白减少到少于1ppm。阴离子交换步骤使宿主蛋白质和聚集体减少到不可检出的水平。

实施例10：将含有286,010ppm宿主蛋白质污染物和23％聚集体的含有IgG的细胞培养收获物通过以下步骤调节：添加1％尿囊素和0.025％依沙吖啶，并且在室温在搅拌下孵育1小时。将颗粒(Chelex-100、MacroPreptButyl、Macroprep High Q，伯乐公司)的1:1:1混合物混合，平衡到生理条件，并且将沉降的混合颗粒以5％的组合量添加到收获物中，然后在室温混合2小时。宿主蛋白质被降低到43,058ppm并且聚集体被降低到3.4％。在pH 8.0进行的一系列实验中，将样品用PEG-6000、在其中浓度为600mM、800mM、900mM、以及1000mM(1M)的独立的实验中进行沉淀来分级分离。然后在PEG、50mM Tris(pH 8.0)中洗涤沉淀物，之后使抗体重新溶解在50mM Tris(pH 8.0)中。在该系列中，宿主蛋白质分别被降低到51ppm、55ppm、45ppm以及41ppm。将Dowex AG1X2(伯乐公司)形式的阴离子交换颗粒以5％v/v的量添加到每一种样品中并且混合60分钟。在该系列中，宿主蛋白质被降低到16ppm、17ppm、15ppm、以及13ppm。进行另一系列实验，这些实验在所有细节上均相同，除了在pH 7.0进行初始的PEG沉淀。在PEG步骤之后宿主蛋白质是44ppm(对于600mM NaCl途径)、43ppm(对于800mM途径)、29ppm(对于900mM途径)、以及31ppm(对于1000mM途径)。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别减少到20ppm、17ppm、12ppm以及16ppm。

实施例11：将含有286,010ppm宿主蛋白质污染物和23％聚集体的含有IgG的细胞培养收获物通过以下步骤调节：添加1％尿囊素和0.025％依沙吖啶，并且在室温在搅拌下孵育1小时。将颗粒(Chelex-100、MacroPreptButyl、MacroPrep High Q，来自伯乐公司)和正电性金属亲和颗粒(TREN 40high，来自Bio-Works公司)的1:1:1:1混合物混合，平衡到生理条件，并且将沉降的混合颗粒以5％的组合量添加到收获物中，然后在室温混合2小时。宿主蛋白质减少到38,061ppm并且聚集体减少到1.4％。在pH 8.0进行的一系列实验中，在其中NaCl浓度是600mM、800mM、900mM、以及1000mM(1M)的独立的实验中，将样品通过使用PEG-6000进行沉淀来分级分离。然后在PEG、50mM Tris(pH 8.0)中洗涤沉淀物，之后使抗体重新溶解在50mM Tris(pH 8.0)中。宿主蛋白质分别减少到79ppm、69ppm、56ppm、以及57ppm。将Dowex AG1X2(伯乐公司)的形式的阴离子交换颗粒以5％v/v的量添加到每一种样品中并且混合60分钟，所述阴离子交换颗粒呈。在该系列中，宿主蛋白质减少到18ppm、17ppm、16ppm、以及13ppm。进行另一系列实验，这些实验在所有细节上均相同，除了在pH 7.0进行初始的PEG沉淀。在PEG步骤之后宿主蛋白质对于600mMNaCl途径是94ppm、对于800mM途径是62ppm、对于900mM途径是67ppm、以及对于1000mM途径是46ppm。在Dowex处理之后，宿主蛋白质分别减少到28ppm、9ppm、23ppm以及17ppm。

实施例12：将含有321,483ppm宿主蛋白质和26％聚集体的含有IgM的细胞培养收获物通过以下步骤来调节：添加1％尿囊素、0.025％依沙吖啶、以及NaCl以产生25mS/cm的电导率。将混合物孵育1小时，通过离心去除固体，并且使液体流过填充有相等比例的MacroPrep tButyl、Macroprep High Q、Macroprep High S、以及Chelex 100的柱，其中柱与收获物的体积比是5％。宿主蛋白质减少到73,663ppm并且聚集体减少到0.8％。将样品在平行的、但是独立的实验中分级分离，这两个实验均在pH7使用13％的PEG-6000，一个实验使用100mM的NaCl，另一个使用800mM的NaCl。然后将沉淀物用13％PEG、50mM Hepes(pH 7.0)洗涤以去除过量的盐，然后使用50mM Hepes(pH 7.0)使IgM重新溶解。在100mMNaCl下，宿主蛋白质减少到7,411ppm。在800mM NaCl下，宿主蛋白质减少到417ppm。聚集体含量增加到1.1％。将样品在pH 7.0施加到阴离子交换整体柱(CIM QA，BIA Separations公司)中，并且使用氯化钠梯度洗脱。在对应于在100mM NaCl下进行PEG沉淀的样品中宿主蛋白质减少到1,424ppm。在对应于在800mM NaCl下进行PEG沉淀的样品中宿主蛋白质减少到63ppm。这两种制品的聚集体都少于0.01％。

本文公开的本发明实施方案可以与其它纯化方法组合以实现更高水平的纯化。这些其它纯化方法的实例包括但不限于通常用于纯化IgG的其它方法，如蛋白A和其它形式的亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、固定金属亲和色谱、以及另外的混合模式色谱方法；以及沉淀方法、结晶方法和液-液萃取方法。为各种方法研发适当的条件以及使它们与本文所公开的实施方案整合以实现对具体抗体的必要纯化是在本领域普通技术人员的能力范围内的。

本文所引用的所有参考文献以引用的方式整体并入本文，并且出于所有目的，该引用的程度就如同每一篇单独的出版物或专利或专利申请均被明确地并且单独地表明出于所有目的以引用的方式整体并入本文一样。如果以引用的方式被并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公开内容矛盾，那么本说明书意图取代和/或优先于任何这样的矛盾内容。

在本说明书和权利要求书中所使用的表示成分的量、色谱条件等的所有数字均将被理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求书中所列的数值参数是近似值，所述近似值可以根据由本文所公开的本发明实施方案所试图获得的所需性能而变化。

可以对本文所公开的实施方案进行许多修改和变化而不脱离它的精神和范围，如将对于本领域技术人员来说所显而易见的。本文所述的具体实施方案仅通过举例的方式提供而不意味着以任何方式具有限制性。本说明书和实施例仅意图被认为是示例性的，本文所公开的实施方案的真正范围和精神由以下权利要求书表明。

Claims (21)

1.一种将所需的蛋白质从制品中纯化的方法，其包括：

(a)以在原始产生培养基中存在有少于约5％的染色质的形式提供所述制品；

(b)使所述制品与非离子有机聚合物和盐接触，其中非离子有机聚合物的浓度足以使所述所需蛋白质沉淀或使得它附着在亲水性表面上，或将它维持在沉淀的状态或附着在所述亲水性表面上，所述盐浓度足以产生大于生理电导率；以及

(c)使所述制品与至少一种正电性表面接触，其中所述所需蛋白质基本上不吸附到所述至少一种正电性表面上，同时不阻止酸性污染物吸附到所述至少一种正电性表面上，所述接触任选地在足以产生大于生理电导率的盐浓度存在下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括(d)使所述制品与至少一种非离子亲水性表面接触。

3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)和(b)期间所述盐浓度是相同的。

4.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在多孔膜上保留所述沉淀的所需蛋白质，同时可溶性污染物通过穿过所述多孔膜而被消除。

5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括在基本上惰性的微孔膜上保留被沉淀的所需蛋白质，同时可溶性污染物通过穿过所述微孔膜而被消除，而与所述盐浓度无关。

6.如权利要求1所述的方法，其进一步包括当电导率大于生理电导率时，在正电性的微孔膜上保留被沉淀的所需蛋白质，同时可溶性污染物穿过所述微孔膜。

7.如权利要求1所述的方法，其中在单个集成设备中执行所述方法。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述非离子有机聚合物是聚乙二醇(PEG)。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述非离子有机聚合物的平均聚合物尺寸在来自由以下各项组成的组的范围：(a)约1,500道尔顿至约15,000道尔顿；(b)约2,000道尔顿至约12,000道尔顿；(c)约3,000道尔顿至约10,000道尔顿；(d)约4,000道尔顿至约8,000道尔顿；以及(e)约5,000道尔顿至约6,000道尔顿。

10.如权利要求1所述的方法，其中电导率比生理电导率大至少1mS/cm。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述盐选自由以下各项组成的组：氯化钠、氯化钾、乙酸钠、乙酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸钾、盐酸胍、以及其组合。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述盐是氯化钠，所述氯化钠的浓度选自由以下各项组成的组：(a)约0.5M至约1.5M；(b)约2.0M至约3.0M；以及其中间范围。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种正电性表面是具有选自由以下各项组成的组的平均尺寸的孔的膜：(a)约100nm、(b)约220nm、(c)约450nm、(d)约1微米、(e)约2微米、以及其中间值。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种正电性固体是多个颗粒。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种正电性固体是选自包括以下各项的组的色谱装置的一部分：基于整体柱的色谱装置、基于膜的色谱装置、基于颗粒的色谱装置、基于支撑水凝胶的大网状骨架的装置、以及其组合。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述盐浓度选自包括以下各项的组：零量、1mM、2mM、5mM、10mM、25mM、50mM、100mM、以及其中间浓度。

17.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)期间pH值在选自由以下各项组成的组的范围：(a)约8至约9、(b)约8至约8.5、(c)约7.5至约8.5、(d)约7.25至约8.25、(e)约7.0至约8.0、(f)约6至约7、以及其中间pH值范围。

18.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)期间pH值在选自由以下各项组成的组的范围：(a)约5至约9、(b)约6至约8、(c)约6.5至约7.5、(d)约7.5至约8.5、以及其中间pH值范围。

19.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种亲水性表面包括选自由以下各项组成的组的一种：膜、整体柱、以及多个颗粒，其中所述多个颗粒任选地是磁性的。

20.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种正电性表面包括来自由以下各项组成的组的一种：膜、整体柱、以及多个颗粒，其中所述多个颗粒任选地是磁性的。

21.如权利要求1所述的方法，其中所述制品是选自由以下各项组成的组的一种：细胞培养基、来自所培养的生物体的提取物、以及体液。