CN104984357B - 不含明胶的疫苗保护剂组合物及流感减毒活疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，其中包含的组分及其浓度为：人血清白蛋白1.0～15.0g/L、蔗糖15.0～95.0g/L、谷氨酸钠0.5～15.0g/L。本发明还提供一种用本发明的组合物制备流感减毒活疫苗的方法，其包括以下步骤：将本发明的组合物的各个组分依次溶于pH缓冲液中；将pH调节到指定值；过滤除菌；加入病毒原液，即得所述流感减毒活疫苗。本发明还提供用作注射剂或鼻喷雾剂的流感减毒活疫苗。
Description
技术领域
本发明属于疫苗生产工艺技术领域，具体地，本发明涉及一种不含明胶的液体疫苗保护剂组合物，以及包含所述液体疫苗保护剂组合物的流感减毒活疫苗。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒引起的一种严重危害人类健康的急性呼吸道感染疾病。流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三个型别，其中甲型流感病毒的抗原性经常出现变异，在历史上曾多次引起世界性大流行。甲型流感也在猪和禽类中传播，并引起流感流行，造成大量动物死亡。而人乙、丙型流感仅在人之间转播。乙型流感病毒对人类致病性较低。丙型流感病毒主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。据WHO估计，在爆发性流行时，流感病毒可在全世界迅速传播，影响总人口的10％～20％。即使在非爆发性流行的年份，流感每年也造成300万～500万例严重病例和25万～50万例死亡。
迄今为止，接种流感疫苗是防治流感的最有效的手段。疫苗接种不仅可以降低高危人群的发病率和死亡率，也可减轻症状，降低并发症的发生、降低继续传播的机率。
流感减毒活疫苗采用鼻粘膜途径进行免疫，具有模拟天然感染的优点。与灭活疫苗相比，流感减毒活疫苗除了能诱导体液免疫外，还能诱导产生局部中和抗体以及细胞免疫应答，并且免疫应答持续时间持久。另外流感减毒活疫苗使用方便，易于进行大规模免疫。
流感减毒活疫苗一般为冻干粉针剂型。虽然冷冻干燥技术已经成熟，但还存在一些缺点：首先，冻干粉针剂在使用过程中需要复溶，不便于使用并且增加了污染的机会；其次，生物制品的冷冻干燥工艺复杂、工艺过程耗时长、流感病毒滴度损失较大；第三，真空冷冻干燥设备投资大、能耗高、生产成本高，疫苗生产能力有限，尤其是在流感大爆发时，疫苗生产厂商很难在短时间内生产出足够剂量的疫苗。
2003年，MedImmune公司的流感减毒活疫苗FluMist获得了FDA的批准。该产品是一种冷适应三价病毒疫苗，为水针剂型。该产品需要在约15℃及以下储藏、运输，但由于药房或学校通常都没有处理冷冻产品的设备，使得FluMist不能大范围使用。
2005年，MedImmune公司提交了名为“冷藏温度稳定的流感疫苗组合物”的专利(专利申请号PCT/US2005/035614)，提供了一个可使流感疫苗在4～8℃保持稳定的、含有水解明胶组分的液体制剂组合物。然而，该组合物中的明胶或明胶衍生物可直接引起使被接种者过敏的变态反应和非细胞介导免疫反应。
因此，为克服冷冻干燥技术成本高和水解明胶组分易引起变态反应和免疫反应的缺点，需要开发出不含明胶的疫苗液体制剂保护剂以及包含其的流感减毒活疫苗。
发明内容
发明人经过研究，发明了一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，该组合物中不含明胶成分，对人体的刺激性小，并且用该组合物制备的流感减毒活疫苗在冷藏条件下可保持较好的稳定性和较长有效期。
因此，本发明提供一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，其中包含的组分及其浓度为：人血清白蛋白1.0～15.0g/L，优选1.5～12.0g/L，更优选2.5～10.0g/L；蔗糖15.0～95.0g/L，优选40.0～85.0g/L，更优选50.0～75.0g/L；谷氨酸钠0.5～15.0g/L，优选0.5～12.0g/L，更优选0.5～10.0g/L；其中，所述组合物的pH为5.0～9.0，优选为pH 5.5～8.5，更优选为pH 6.0～8.0，最优选为pH 6.0～7.4。
本发明的组合物中还包括尿素，其浓度为0～8.0g/L，优选0.5～6.0g/L，更优选1.0～4.0g/L；精氨酸，其浓度为0～10.0g/L，优选1.0～10.0g/L，更优选1.4～10.0g/L；组氨酸，其浓度为0～2.0g/L，优选为0.5～1.5g/L；山梨醇，其浓度为0～70.0g/L，优选15.0～60.0g/L，更优选25.0～50.0g/L；甘氨酸，其浓度为0～20.0g/L，优选3.0～15.0g/L；甘露醇，其浓度为0～30.0g/L，优选10.0～20.0g/L。
此外，本发明还提供了本发明的组合物用于提高疫苗稳定性和安全性的用途以及用于制备流感减毒活疫苗的用途。
此外，本发明还提供一种流感减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，使用本发明的组合物作为保护剂。
具体实施方式
因此，本发明提供一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，其中包含的组分及其浓度为：人血清白蛋白1.0～15.0g/L，优选1.5～12.0g/L，更优选2.5～10.0g/L；蔗糖15.0～95.0g/L，优选40.0～85.0g/L，更优选50.0～75.0g/L；谷氨酸钠0.5～15.0g/L，优选0.5～12.0g/L，更优选0.5～10.0g/L；其中所述组合物的pH为5.0～9.0，优选为pH 5.5～8.5，更优选为pH 6.0～8.0，最优选为pH 6.0～7.4。
本发明的组合物中还包括尿素，其浓度为0～8.0g/L，优选0.5～6.0g/L，更优选1.0～4.0g/L；精氨酸，其浓度为0～10.0g/L，优选1.0～10.0g/L，更优选1.4～10.0g/L；组氨酸，其浓度为0～2.0g/L，优选为0.5～1.5g/L；山梨醇，其浓度为0～70.0g/L，优选15.0～60.0g/L，更优选25.0～50.0g/L；甘氨酸，其浓度为0～20.0g/L，优选3.0～15.0g/L；甘露醇，其浓度为0～30.0g/L，优选10.0～20.0g/L。
本发明还提供了本发明的组合物用于制备流感减毒活疫苗的用途。
本发明还提供一种流感减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，使用本发明的组合物作为保护剂。
在一个优选实施方案中，本发明的流感减毒活疫苗的制备方法包括以下步骤：将本发明的组合物的各个组分依次溶于pH缓冲液中；将pH调节到指定值；过滤除菌；加入病毒原液，即得流感减毒活疫苗。
在一个优选实施方案中，根据本发明的方法制备的液体流感减毒活疫苗的pH为5.0～9.0，优选为pH 5.5～8.5，更优选为pH 6.0～8.0，最优选为pH 6.0～7.4。
在一个优选实施方案中，使用磷酸盐缓冲液作为pH缓冲液。
本发明还提供一种使用本发明的组合物和/或根据本发明的方法制备的流感减毒活疫苗。
在一个优选实施方案中，本发明的流感减毒活疫苗为注射剂或鼻喷雾剂。
以下通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：
1.pH的测定
pH的测定根据《中华人民共和国药典(2010年版)》(三部)附录V A进行。
2.病毒滴度的测定
细胞系：
MDCK细胞：犬肾上皮传代细胞系(Madin～Daby canine kidney cells)，购自ATCC。
病毒毒株：
H1N1型流感病毒毒株：A/17/California/2009/38(H1N1)，由WHO提供；
H3N2型流感病毒毒株：A/17/Perth/09/87(H3N2)，由WHO提供；
B型流感病毒毒株：B/56/Brisbane/60/08，由WHO提供。试剂：
TPCK-Trypsin(购自Sigma，货号：T1426)溶液；
DMEM细胞培养液(购自Sigma，货号：D6546)；
胎牛血清(购自Hyclone，货号：SH30070.03)；
L-谷氨酰胺(购自Gibco，货号：25030)溶液；
青链霉素(购自Gibco，货号：15140)；
HEPES(购自吉诺生物，货号：GNM11344)溶液；
一抗：Anti-Influenza A Virus Nucleoprotein antibody，购自Abcam，货号：[AA5H]ab20343；
Anti-Influenza B Virus Nucleoprotein antibody，购自Abcam，货号：[B017]ab20711；
二抗：Alexa488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Antibody，购自Lifetechnologies，货号：A-11001；
标准抗体：
抗A1标准抗体：Influenza Anti-A/California/7/2009(H1N1)-HA serum，购自NIBSC，货号：12/108；
抗A3标准抗体：Influenza Anti-A/Perth/16/2009-Like HA Serum，购自NIBSC，货号：11/206；
抗B标准抗体：Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008HA serum，购自NIBSC，货号：11/136。
方法：
(1)样品处理
取供试品3瓶混合在一起，作为待检样品。
将灭活后的标准抗体分为3组，分别为：
G1：抗A3标准抗体1份+抗B标准抗体1份+PBS 3份；
G2：抗A1标准抗体1份+抗B标准抗体1份+PBS 3份；以及
G3：抗A1标准抗体1份+抗A3标准抗体1份+PBS 3份。
将3组抗体G1、G2、G3分别与待检样品按1:1比例混合，在32℃水浴静置30分钟，作为病毒样品待用。
(2)滴度检测
将生长状态良好的MDCK细胞铺于96孔板中培养，待细胞铺满96孔板后使用。弃去板中细胞生长液，加入DMEM洗板，待用；将病毒样品10倍系列稀释至合适浓度，接种于96孔板中，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育，孵育17～20h后取出。用约20℃的80％(v/v)丙酮固定细胞；用0.5％TPBS洗涤两次；之后加入一抗，与细胞在37℃、5％CO2培养箱中孵育1h，取出后用PBS洗板；加入二抗，与细胞在37℃、5％CO2培养箱中再孵育1h，取出后用PBS洗板，用荧光显微镜观察荧光灶。
计算病毒滴度：在100×镜下观察，病毒滴度(lg FFU/0.2ml)＝2.8×10×病毒稀释度×该浓度各平行孔中荧光灶平均数。
除非另外特别说明，以下实施例中使用的物质或材料、仪器的来源和规格均与实施例1相同。
实施例2
根据下列处方配制本发明的疫苗：
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白(质量分数20％)，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A1号疫苗。
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、0.2g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A2号疫苗。
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、0.3g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A3号疫苗。
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、0.2g组氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A4号疫苗。
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、1.0g山梨醇，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A5号疫苗。
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、1.0g甘露醇，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A6号疫苗。
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、0.5g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成A7号疫苗。
将A1～A7号疫苗保存于25℃，分别在第0、14、21、28天取样，检查样品外观，并根据实施例1的方法测定其pH和病毒滴度。
表1：A1～A7号疫苗在25℃放置的稳定性结果
实施例3
根据下列处方配制本发明的疫苗：
分别称取2.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、0.2g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B1号疫苗；
分别称取2.5g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B2号疫苗；
分别称取2.5g蔗糖、1.0g谷氨酸钠、5.0ml人血清白蛋白、1.0g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B3号疫苗；
分别称取5.0g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、1.0g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B4号疫苗；
分别称取5.0g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、5.0ml人血清白蛋白、0.2g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B5号疫苗；
分别称取5.0g蔗糖、1.0g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B6号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、5.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B7号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.5g谷氨酸钠、1.5ml人血清白蛋白、1.0g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B8号疫苗；
分别称7.5g蔗糖、1.0g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.2g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.2，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成B9号疫苗。
将B1～B9号疫苗保存于25℃，分别在第0、14、21、28天取样，检查样品外观，并根据实施例1的方法测定其pH和病毒滴度。
表2：B1～B9号疫苗在25℃放置的稳定性结果
实施例4
根据下列处方配制本发明的疫苗：
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.8，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C1号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、2.5g山梨醇、1.0g甘露醇、0.4g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.8，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C2号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、5.0g山梨醇、2.0g甘露醇、0.8g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.8，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C3号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、0.8g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.3，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C4号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、2.5g山梨醇、2.0g甘露醇，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.3，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C5号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、5.0g山梨醇、0.4g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.3，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C6号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、2.0g甘露醇、0.4g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.8，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C7号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、2.5g山梨醇、0.8g尿素，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.8，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C8号疫苗。
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白，0.5g精氨酸、5.0g山梨醇、1.0g甘露醇，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到7.8，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成C9号疫苗。
将C1～C9号疫苗保存于25℃，分别在第0、14、21、28天取样，检查样品外观，并根据实施例1的方法测定其pH和病毒滴度。
表3：C1～C9号疫苗在25℃放置的稳定性结果
实施例5
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、2.5g山梨醇、0.1g尿素、0.3g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.0，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D1号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、3.5g山梨醇、0.2g尿素、0.9g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.0，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D2号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、5.0g山梨醇、0.4g尿素、1.5g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.0，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D3号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、2.5g山梨醇、0.2g尿素、1.5g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.3，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D4号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、3.5g山梨醇、0.4g尿素、0.3g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.3，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D5号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、5.0g山梨醇、0.1g尿素、0.9g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.3，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D6号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、2.5g山梨醇、0.4g尿素、0.9g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.7，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D7号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、3.5g山梨醇、0.1g尿素、1.5g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.7，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D8号疫苗；
分别称取7.5g蔗糖、0.1g谷氨酸钠、3.0ml人血清白蛋白、0.5g精氨酸、1.0g甘露醇、5.0g山梨醇、0.2g尿素、0.3g甘氨酸，用适量磷酸盐缓冲液溶解后，再定容至70ml，用0.1N HCl将pH调到6.7，并使用0.22μm滤器过滤除菌，加入H1N1型、H3N2型及B型流感病毒原液各10ml，配制成D9号疫苗。
将D1～D9号疫苗保存于25℃，分别在第0、14、21、28天取样，检查样品外观，并根据实施例1的方法测定其pH和病毒滴度。
表4：D1～D9号疫苗在25℃放置的稳定性结果
将D1～D9号疫苗保存于33℃，分别在第0天和第10天取样，检查样品外观，并根据实施例1的方法测定其pH和病毒滴度。
表5：D1～D9号疫苗在33℃放置的稳定性结果
将D1～D9号疫苗保存于2～8℃，分别在第0、1、3、6个月末时，检查样品外观，并根据实施例1的方法测定其pH和病毒滴度。
表6：D1～D9号疫苗在2～8℃放置的稳定性结果
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以进行其它多种形式的修改、替换或变更。本领域人员能够理解，本申请所描述的本发明技术方案的各个特征均可根据需要进行适当的组合。
Claims (21)
1.一种用作流感减毒活疫苗保护剂的组合物，其中包含的组分及其浓度为：人血清白蛋白1.0～15.0g/L；蔗糖15.0～95.0g/L；谷氨酸钠0.5～15.0g/L；其中，所述组合物的pH为5.0～9.0。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中包含的组分及其浓度为：人血清白蛋白1.5～12.0g/L；蔗糖40.0～85.0g/L；谷氨酸钠0.5～12.0g/L；其中所述组合物的pH为5.5～8.5。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中包含的组分及其浓度为：人血清白蛋白2.5～10.0g/L；蔗糖50.0～75.0g/L；谷氨酸钠0.5～10.0g/L；其中所述组合物的pH为6.0～8.0。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的pH为6.0～7.4。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中还包括尿素，其浓度为0～8.0g/L；精氨酸，其浓度为0～10.0g/L；组氨酸，其浓度为0～2.0g/L；山梨醇，其浓度为0～70.0g/L；甘氨酸，其浓度为0～20.0g/L；甘露醇，其浓度为0～30.0g/L。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中还包括尿素，其浓度为0.5～6.0g/L；精氨酸，其浓度为1.0～10.0g/L；组氨酸，其浓度为0.5～1.5g/L；山梨醇，其浓度为15.0～60.0g/L；甘氨酸，其浓度为3.0～15.0g/L；甘露醇，其浓度为10.0～20.0g/L。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中还包括尿素，其浓度为1.0～4.0g/L；精氨酸，其浓度为1.4～10.0g/L；山梨醇，其浓度25.0～50.0g/L。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物用于制备流感减毒活疫苗的用途。
9.一种流感减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，在配制过程中采用权利要求1-7中任一项所述的组合物作为保护剂。
10.根据权利要求9所述的方法，其包括以下步骤：
1)将权利要求1-7中任一项所述的组合物的各个组分依次溶于pH缓冲液中；
2)将pH调节到指定pH值；
3)过滤除菌；
4)加入病毒原液，即得流感减毒活疫苗。
11.根据权利要求10所述的方法，其中使用磷酸盐缓冲液作为pH缓冲液。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述指定pH值为5.0～9.0。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述指定pH值为5.5～8.5。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述指定pH值为6.0～8.0。
15.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述指定pH值为6.0～7.4。
16.一种流感减毒活疫苗，其特征在于，包含权利要求1-7中任一项所述的组合物。
17.根据权利要求16所述的流感减毒活疫苗，其特征在于，其pH为5.0～9.0。
18.根据权利要求16所述的流感减毒活疫苗，其特征在于，其pH为5.5～8.5。
19.根据权利要求16所述的流感减毒活疫苗，其特征在于，其pH为6.0～8.0。
20.根据权利要求16所述的流感减毒活疫苗，其特征在于，其pH为6.0～7.4。
21.根据权利要求16-20中任一项所述的流感减毒活疫苗，其可用作注射剂或鼻喷雾剂。
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