CN104812903A - 赋予玉蜀黍对玉米根虫i的抗性的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

提供了用于提高植物对诸如玉米根虫之类的昆虫害虫的抗性的方法和组合物。提供了用于在宿主植物或植物细胞中过表达Crwl或其变体以在植物如玉蜀黍中提高对昆虫害虫的抗性的方法。此外，提供了鉴定Crwl的变体的方法，所述变体在经由转基因手段或传统的育种手段掺入进植物中时可在植物如玉蜀黍中提高对昆虫害虫的抗性。

Description

赋予玉蜀黍对玉米根虫I的抗性的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年9月20日提交的美国临时申请No.61/703,396的权益以及2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/781,057的权益，将这两篇专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。

      序列表的引用

序列表作为于2013年9月19日创建的名为“BB2189PCT_Sequences_Listing”的文本文件于2013年9月20日提交，大小为83,193字节，特此根据37 C.F.R.§1.52(e)(5)以引用方式将其并入。

技术领域

本领域涉及植物育种和遗传学，并且具体而言，涉及可用于玉蜀黍植物中以赋予对玉米根虫的抗性的重组DNA构建体。

背景技术

根叶甲属(Diabrotica)甲虫的三个物种的幼虫形式即西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(Diabrotica barberiSmith和Diabrotica barberi Lawrence)和南部玉米根虫(Diabroticaundecimpunctata howardi Barber)代表了美国中西部的严重玉米昆虫害虫。大约3000万英亩(120,000km²)的玉米(总共种植8000万英亩)受玉米根虫的侵扰，美国农业部估计玉米根虫的幼虫可每年引起大约10亿美元的损失。

有许多不同的管理措施针对玉米根虫的控制，包括玉米品种选择、提早种植、杀虫剂、轮作以及使用转基因玉米品种；然而，没有一种就其本身而言已被证实可有效管理害虫。还另外存在复杂的情况，即玉米根虫昆虫已显示出明显的进化出对若干控制措施(包括杀虫剂、栽培措施以及已引入植物中的抗性基因)的抗性的能力。

因而，仍不断需要可纳入进一体化害虫管理策略中的新的玉蜀黍中的玉米根虫抗性机制。

发明内容

提供了在玉蜀黍植株中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法，其中编码CRW1的多核苷酸在玉蜀黍植株中表达。

还提供的是鉴定ZmCrw1(或ZmCRW1)的给予玉蜀黍植株提高的对昆虫害虫植食性的抗性的变体并然后进一步将该变体引入进玉蜀黍植株中的方法。该变体可通过基因改组实验鉴定或者可以是通过连锁作图(linkagemapping)或全基因组关联分析鉴定的天然存在的等位基因变体。基因改组引起的变体可通过转基因引入进玉蜀黍植株中以给予它们提高的抗性，而使用本文给出的方法鉴定的等位基因变体可使用分子育种掺入进玉蜀黍植株中。

在一些实施例中，昆虫害虫是鞘翅目昆虫。在其它实施例中，鞘翅目昆虫害虫属于根叶甲属。在其他实施例中，昆虫害虫是玉米根虫，包括但不限于，西部玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)、北部玉米根虫(Diabrotica barberi Smith和Diabrotica barberi Lawrence)和/或南部玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)。

在一些实施例中，昆虫害虫是鳞翅目昆虫。在其它实施例中，鳞翅目昆虫害虫是欧洲玉米螟。

还提供了分离的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组构建体以及含有所述重组构建体的植物细胞。

附图和序列表的说明

由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本公开。

图1示出了从叶取食选择测定法获得的结果，在该测定法中，将西部玉米根虫(WCR)甲虫放在具有来自玉蜀黍crw1-Ac突变株的叶子和来自其野生型亲缘株的叶子的盒子中。结果代表9份生物样品的平均值。

图2示出了玉蜀黍Crw1基因、crw1-Ac突变株系中的突变的位置以及公共的多样性株系Cd 09和NC316中的插入位置的示意图。

图3绘出了Crw1突变植株(MT)和野生型(WT)植株响应机械创伤(“机械创伤”)和秋粘虫毛虫(Fall Armyworm caterpillar)反刍(“反刍(Regurgitant)”)的茉莉酸(JA)的定量。与野生型植株(WT)相比Crw1突变植株积累较高水平的JA，但仅响应所施加的应激。

图4绘出了来自Crw1突变植株(MT)和野生型植株(WT)的幼叶和成叶的对香豆酸和阿魏酸水平的差异。

图5绘出了Crw1突变植株(MT)和野生型植株(WT)的叶木质素含量的差异。

图6A-6C示出了来自野生型亲缘株的Crw1的cDNA序列与crw1-Ac突变等位基因的比对，该突变等位基因是切除原始等位基因中存在的自主Ac转座子而得到的。外显子1中的8bp插入(加框显示)导致预测的肽链在插入位点处过早终止。

图7A-7C示出了来自野生型亲缘株的Crw1的cDNA序列与crw1-CO 09等位基因的比对。该crw1-CO 09等位基因与其野生型亲缘株相比，在外显子2中添加了1bp的插入和两个其他的bp变化(参见图7A中的箭头，其指示插入以及bp变化的位置)。在外显子2中插入1bp导致CRW1肽的过早终止。

图8A-8C示出了来自野生型亲缘株的Crw1的cDNA序列与crw1-NC316等位基因的比对。该crw1-NC316等位基因具有1bp插入(参见图8A中的箭头)并在第二外显子中具有45bp插入。该1bp插入的存在导致在45bp插入的位点处出现过早终止密码子。

图9A-9L示出了SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27的多肽的氨基酸序列的多序列比对。当某个位置处的所有残基匹配共有序列的残基时，则显示该残基；否则显示为“.”。另外，精确匹配共有序列的残基加框显示。

图10示出了图9A-9L中所示的多肽的每对氨基酸序列的序列同一性百分数和趋异值(divergence value)。

图11示出了T1植株中事件#8909.102.1.17.4的RT-PCR结果。

SEQ ID NO：1是野生型玉米(Zea mays)基因组Crw1的核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是野生型玉米Crw1(ZmCrw1)cDNA的编码区的核苷酸序列。

SEQ ID NO：3是野生型玉米CRW1(CRW1ZmCRW1)蛋白的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是突变crw1-Ac等位基因的cDNA的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5是突变crw1-Ac等位基因编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是来自玉蜀黍近交系CO109的Crw1 cDNA(crw1-CO109)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：7是SEQ ID NO：6编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是来自玉蜀黍近交系NC316的Crw1 cDNA(crw1-NC316)的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9是SEQ ID NO：8编码的多肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10是来自水稻(Oryza sauva)的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序列(UniProt条目G3M8D2)。

SEQ ID NO：11是来自水稻的推定的NAM蛋白(OsNAC7)的氨基酸序列(标识符0s06g04090.1；UniProt条目Q9SNM6)。

SEQ ID NO：12是来自高粱(Sorghum bicolor)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Sb07g001550.1；UniProt条目C5YM23)。

SEQ ID NO：13是来自高粱的推定的NAM蛋白的氨基酸序列(标识符Sb10g002120.1；UniProt条目Q5NKS7)。

SEQ ID NO：14是来自中国栽培大豆(Glycine max)的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Glyma16g02200.1；UniProt条目I1MKD6)。

SEQ ID NO：15是来自中国栽培大豆的未表征的蛋白的氨基酸序列(标识符Glyma07g05660.1；UniProt条目I1KHQ4)。

SEQ ID NO：16是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的含NAC结构域的蛋白43的氨基酸序列(标识符At2g46770.1；UniProt条目Q84WP6)。

SEQ ID NO：17是来自拟南芥的含NAC结构域的蛋白12的氨基酸序列(At1g32770.1；UniProt条目Q9LPI7)。

SEQ ID NO：18是来自拟南芥的含NAC结构域的蛋白66的氨基酸序列(标识符At3g61910.1；UniProt条目Q9M274)。

SEQ ID NO：19是来自玉米的次生壁NAC转录因子2的氨基酸序列(UniProt条目B4FPS5)

SEQ ID NO：20是来自玉米的推定的NAM蛋白的氨基酸序列(UniProt条目Q5NKQ3)。

SEQ ID NO：21是来自二穗短柄草(Brachypodium distachyon)的含NAC结构域的蛋白43样的氨基酸序列(NCBI Gl No.357139497，本文中称为BdCRW1)。

SEQ ID NO：22是来自葡萄(Vitis vinifera)的推定的未表征的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目F6HU82)。

SEQ ID NO：23是来自中国栽培大豆的含NAC结构域的蛋白43样的氨基酸序列(NCBI Gl No.356522480，本文中称为GmCRW1)。

SEQ ID NO：24是来自陆地棉(Gossypium hirsutum)的含NAC结构域的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目G4V2G0)。

SEQ ID NO：25是来自苹果(Pyrus malus)的NAC结构域类转录因子(NAC12)的氨基酸序列(UniProt条目D9ZJ90)。

SEQ ID NO：26是来自大麦(Hordeum vulgare)的预测的蛋白的氨基酸序列(UniProt条目F2DV83)。

SEQ ID NO：27是来自拟南芥的NAM样蛋白的氨基酸序列(NCBI GlNo.3510262；UniProt条目Q84WP6)。

SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29分别是有义链引物和反义链引物，用于从玉蜀黍基因组DNA扩增Crw1片段。

SEQ ID NO：30是引物phn 11317的核苷酸序列，其为该转基因的UBI启动子5′UTR区中的引物。

SEQ ID NO：31是引物phn140720的核苷酸序列，其位于Crw1-3′端并且包括终止密码子。

SEQ ID NO：32是引物phn140719的核苷酸序列，其为Crw1的5′端中的引物。

本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37 C.F.R.§1.8211.825中设定的关于专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的指导规则。

该序列表含有遵照NucIeic Acids Res.(《核酸研究》)13：3021 3030(1985)中和Biochemical J.(《生物化学杂志》)219(No.2)：345 373(1984)中描述的IUPAC IUBMB标准进行定义的核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的三字母代码，将所述文献以引用方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37 C.F.R.§1.822中设定的规则。

具体实施方式

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。

本文中和随附的权利要求书中所用名词形式上为单数，但包括复数指代，除非上下文清楚表明并非如此。因此，例如，提及“植物(植株)”则包括多株此类植物(植株)，提及“细胞”则包括一个或更多个细胞以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

如本文所用：

术语“单子叶植物”和“单子叶的植物”在本文可互换使用。

术语“双子叶植物”和“双子叶的植物”在本文可互换使用。

术语“全长互补序列”和“全长的互补序列”在本文可互换使用，是指给定核苷酸序列的互补序列，其中所述互补序列和所述核苷酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。

“表达序列标签”(“EST”)是源自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入片段的单程测序(singlesequencing pass)获得。将完整的cDNA插入片段的序列称为“全长插入片段序列”(“FIS”)。“重叠群(Contig)”序列是由可选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两种或更多种序列装配成的序列。编码完整或功能性蛋白质的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)并且可源自FIS或重叠群。

“性状”指植物或者特定的植物材料或细胞的生理特性、形态特性、生化特性或者物理特性。在某些情况下，该特性对人眼是可见的，例如种子或植株尺寸，或者可通过生物化学技术测量，例如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油脂含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果如渗透应激耐受性或产量。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生变更的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些。本文所用的术语“转基因(的)”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的变更。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核内的染色体DNA，而且还涵盖存在于细胞的亚细胞组分(例如线粒体、质体)内的细胞器DNA。

“植物(植株)”包括整株植物、植物器官、植物组织、植物繁殖体、种子和植物细胞以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。

“子代”包含植物的任何后续各代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如，异源多核苷酸被稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或者作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。

遗传上改善的种质的商业开发也已经进展到将多个性状引入作物中的阶段，通常称为基因堆叠(gene stacking)方法。在该方法中，可将多个赋予不同的所关注特性的基因引入进植物中。基因堆叠可通过许多手段(包括但不限于共转化、再转化以及使具有不同转基因的株系杂交)来实现。

“转基因植物”还包括指在其基因组内包含不止一种异源多核苷酸的植物。每种异源多核苷酸可为转基因植物赋予不同的性状。

针对序列而言的“异源”意指来源于外来物种的序列，或者如果来源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行实质性修饰得到的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用，为RNA和或DNA的聚合物，该聚合物是单链或者双链的，其任选含有合成的、非天然的或者变更的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5′单磷酸盐形式存在)用如下的其单字母代码指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任一核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白(质)”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白(质)”还可包括修饰，所述修饰包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”是指无内含子并且可由细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”是指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“编码区”是指信使RNA编码蛋白质或多肽的部分(或另一核酸分子如DNA分子的对应部分)。“非编码区”是指信使RNA或其他核酸分子不是编码区的所有部分，包括但不限于例如启动子区、5′非翻译区(“UTR”)、3′UTR、内含子和终止子。术语“编码区”和“编码序列”可在本文中互换使用。术语“非编码区”和“非编码序列”可在本文中互换使用。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白是指mRNA的翻译初级产物；即仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”是指这样的物质(如核酸分子和/或蛋白质)，该物质基本上不含在天然环境中通常伴随该物质或与该物质相互作用的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组的”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来实现的两个原本分离的序列区段的人工组合。“重组的”也指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源自经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖天然发生的事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的变更，所述天然发生的事件例如不经蓄意人为干预而发生的那些事件。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于自然界中通常存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”在本文可互换使用。

“调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”指能够控制另一核酸片段的转录的核酸片段。

在大多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。

“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但未必专门在一种组织或器官中表达，但是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

“有效连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调控核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段有效连接。

“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(例如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“过表达”指基因产物在转基因生物体中的产量超过来自相同实验的无效分离(null segregating)(或非转基因)生物体中的产量水平。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

在将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入到细胞中的语境中的“引入”，意指“转染”或者“转化”或者“转导”，并包括指将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，在该细胞中，核酸片段可掺入到细胞的基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转变成自主的复制子或者瞬时表达(例如转染的mRNA)。

“转化的细胞”是任何其中已引入了核酸片段(例如重组DNA构建体)的细胞。

本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指核酸片段引入到宿主生物的基因组中而得到遗传学上稳定的遗传。一旦稳定转化，该核酸片段稳定整合在该宿主生物及任何后续各代的基因组中。

“瞬时转化”指核酸片段引入到宿主生物的细胞核或者含DNA的细胞器中而得到没有遗传学上稳定遗传的基因表达。

术语“杂交的”或“杂交(cross)”意指配子经由授粉发生融合以产生子代(例如细胞、种子或植株)。该术语涵盖有性杂交(一株植物被另一株植物授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)两者。术语“杂交(crossing)”指经由授粉融合配子以产生子代的行为。

术语“基因座”一般指染色体的遗传上确定的区域，该区域携带某个基因，或者可能携带两个或更多个基因，所述两个或更多个基因是如此紧密地连锁，以至于它们在遗传上表现为负责某种表型的单一基因座。当在本文中关于ZmCRW1使用时，“ZmCRW1基因座”应该指染色体携带ZmCRW1基因(包括其相关的调控序列)的限定区域。

“基因”应指基因座内的特定遗传编码区，包括其相关的调控序列在内。本领域普通技术人员会理解，相关的调控序列与ZmCRW1编码序列的距离将在约4kb以内，启动子位于上游。

“等位基因”是占据染色体上的给定基因座的基因的几种可选形式中的一种。当二倍体植物中一对同源染色体上的给定基因座处存在的等位基因相同时，则该植物在该基因座是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上的给定基因座处存在的等位基因不相同时，则该植物在该基因座是杂合的。如果在二倍体植物中一对同源染色体中的一条染色体上存在转基因，则该植物在该基因座是半合的。

“有利的等位基因”是处于特定基因座、赋予或有助于所需表型的等位基因，或者作为另一种选择，是使得能鉴定不具有该所需表型的植株从而可将它们从育种程序或种植中移除的等位基因。标记的有利等位基因是以该有利表型分离的标记等位基因，或者作为另一种选择，是以不利的植物表型分离，从而提供鉴定植株的有益效果的标记等位基因。

“种质”指属于或者来自个体(例如某个植株)、一组个体(例如某个植物株系、品种或者家族)的遗传材料，或者源自某个株系、品种、物种或者培养物的克隆。种质可以是生物体或者细胞的一部分，或者可以是与该生物体或者细胞分开的。一般地讲，种质提供具有特定的分子构成(molecularmakeup)的遗传材料，该分子构成为生物体或者细胞培养物的一些或者全部遗传品质提供物理基础。本文所用的种质包括可从中长出新植物的细胞、种子或者组织，或者可培养成整株植物的植物部分如叶、茎、花粉或者细胞。

序列比对和同一性百分数计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，所述方法包括但不限于生物信息学计算软件包(威斯康星州麦迪逊市的Inc.公司(Inc.，Madison，W1))的程序。除非另有说明，否则本文提供的序列的多序列比对是使用Clustal W比对方法进行的。

Clustal W比对方法(描述于：Higgins和Sharp，CABIOS(《计算机在生物科学中的应用》)，5：151-153，(1989)；Higgins，D.G.等人，Comput.Appl.Biosci.(《计算机在生物科学中的应用》))，8：189-191(1992))可见于生物信息学计算软件包(威斯康星州麦迪逊市的Inc.公司)的MegAlign^TMv6.1程序中。多序列比对的默认参数对应于空位罚分(GAP PENALTY)＝10、空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝0.2、延迟趋异序列(Delay Divergent Sequences)＝30％，DNA转换权重(DNATransition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列，DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB。对于双序列比对，默认参数为：比对(Alignment)＝慢-准确(SIow-Accurate)、空位罚分＝I0.0、空位长度＝0.10、蛋白质权重矩阵＝Gonnet 250和DNA权重矩阵＝IUB。

在使用Clustal W程序进行序列的比对之后，通过查看该同一程序上的“序列距离”表格，可以得到“同一性百分数”和“趋异值”；除非另有说明，否则本文所提供和声称的同一性百分数和趋异值按此方式计算。本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域众所周知的并且在如下文献中更充分地描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：ALaboratory Manual(＜《分子克隆：实验室手册》)；Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)：Cold Spring Harbor(冷泉港)，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在转向实施例：

实施例包括可用于提高植物对昆虫害虫的抗性的分离的多核苷酸、cDNA和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。

      CRW1

crw1(玉米根虫易感的)是其叶子被西部玉米根虫(WCR)甲虫吞食的玉蜀黍突变株(Dhillon B、Moose SP和Johal GS.(2007).crw1-A novel maizemutant exceptionally susceptible to Western Corn Rootworm(crw1-一种对西部玉米根虫尤其易感的新型玉蜀黍突变株)。Maize Genetics Conference(玉蜀黍遗传学会议)。3月22-25日，美国伊利诺伊州圣查尔斯市(St.Charles，Illinois)。摘要和演示稿可从网上获取)。因此，看来某种通常造成玉蜀黍叶子对WCR甲虫来说不好吃的机制在该突变株中被削弱了。

crw1以隐性方式被遗传并且由单个基因控制。其也被称为ecw1(epidermal cell wall(表皮细胞壁))，因为在植物的突变株筛选中鉴定了该基因的独立突变体，其不经历从幼年期到成年期的阶段改变(Dhillon B、Moose SP和Johal GS.(2007).crw1-A novel maize mutant exceptionallysusceptible to Western Corn Rootworm(crw1-一种对西部玉米根虫尤其易感的新型玉蜀黍突变株)。Maize Genetics Conference(玉蜀黍遗传学会议)。3月22-25日，美国伊利诺伊州圣查尔斯市。摘要和演示稿可从网上获取)。由野生型Crw1编码的多肽(即CRW1；SEQ ID NO：3)是NAC转录因子，其响应西部玉米根虫甲虫取食而被诱导并且受到发育调节。在正在伸长的节间中表达最高。还看起来是Crw1突变株中茉莉酸生物合成和信号转导的上调，其导致些许绿叶挥发物基因响应西部玉米根虫甲虫取食而表达减少。

      分离的多核苷酸、cDNA和多肽

本公开包括下述的分离多核苷酸、cDNA和多肽：

一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)编码具有如下的氨基酸序列以及它们的组合的多肽的核酸序列，基于Clustal W比对方法，当与SEQ IDNO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其中该完全互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且100％互补。任何前述的分离的多核苷酸可在任何本公开的重组DNA构建体中应用。该多肽优选是CRW1多肽。

一种分离的多肽，其具有如下氨基酸序列以及它们的组合，基于ClustalW比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一个方面，该多肽是CRW1多肽。

一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：2比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的核酸序列；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。任何前述的分离的多核苷酸或cDNA可在任何本公开的重组DNA构建体中应用。

一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列可在严格条件下与包含SEQ ID NO：2的完全互补序列的DNA分子杂交。

一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含核苷酸序列，其中该核苷酸序列通过至少一种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQ ID NO：2的一个或更多个核苷酸而源自SEQ ID NO：2。

一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含一核苷酸序列，其中该核苷酸序列对应于SEQ ID NO：2的等位基因。

一种分离的多核苷酸或cDNA，其包含：(i)编码具有如下氨基酸序列的多肽的核酸序列，基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、21、23或27比较时，该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。

应当理解，本领域的技术人员将会知道，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。在给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响编码多肽的功能特性的核酸片段改变是本领域熟知的。例如，氨基酸丙氨酸(一种疏水氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基例如甘氨酸，或疏水性较大的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子置换。类似地，还可预期一个带负电的残基置换为另一个，例如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另一个，例如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肽分子的N端和C端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常规技术内，正如确定编码产物的生物活性的保留。

本公开的蛋白质还可以是包含这样的氨基酸序列的蛋白质：该氨基酸序列在SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20、21、22、23、24、25、26或27中给出的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入和/或添加。置换可以是保守的，意指某氨基酸残基被另一个具有类似物理和化学特性的残基替代。保守置换的非限制性例子包括含脂族基团氨基酸残基例如Ile、Val、Leu或Ala之间的替代，以及极性残基之间的替代，例如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn替代。

来源于氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的蛋白质可在编码其野生型蛋白质的DNA受到例如众所周知的定点诱变时制备(参见例如Nucleic AcidResearch(《核酸研究》)，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982年，特此将该文献全文以引用方式并入)。如本文所用，术语“一个或多个氨基酸”旨在意指可通过定点诱变缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸的可能数量。

定点诱变可以例如如下使用与待突变的单链噬菌体DNA互补，不同的是具有特定错配(即，所需突变)的合成寡核苷酸引物实现。也就是说，上述合成寡核苷酸用作引起互补链通过噬菌体合成的引物，然后将所得的双链DNA用于转化宿主细胞。将转化的细菌培养物置于琼脂上，从而允许噬菌斑从含噬菌体的单个细胞形成。因此，理论上，50％的新菌落含有作为单链的具有突变的噬菌体，而其余50％具有原始序列。在允许与具有上述所需突变的DNA完全相同的DNA杂交，但不与具有原始链的DNA杂交的温度下，允许所得的噬菌斑与通过激酶处理而标记的合成探针杂交。随后，拾取与探针杂交的噬菌斑并培养以收集其DNA。

允许生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸缺失、置换、插入和/或添加，同时保持其活性的技术包括上述定点诱变，以及其他技术，例如用诱变剂处理基因的那些，以及其中基因被选择性切割以移除、置换、插入或添加所选的一个或多个核苷酸然后进行连接的那些。

本公开的蛋白质也可以是由包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，该核苷酸序列在SEQ ID NO：2的核苷酸序列中包含一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入和/或添加。核苷酸缺失、置换、插入和/或添加可通过定点诱变或如上所述的其他技术实现。

本公开的蛋白质也可以是由包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，该核苷酸序列可在严格条件下与SEQ ID NO：2的核苷酸序列的互补链杂交。

术语“在严格条件下”意指两条序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地讲，本领域的普通技术人员可以例如根据DNA的长度容易地确定中等严格条件。基本条件在Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(《分子克隆：实验室手册》)，第三版，第6和7章，Cold SpringHarbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，2001中示出，并且包括使用硝化纤维过滤器的预洗涤溶液5xSSC、0.5％SDS、1.0mMEDTA(pH 8.0)，约50％甲酰胺、2xSSC至6xSSC、约40-50℃的杂交条件(或其他类似杂交溶液，例如Stark溶液，约50％甲酰胺、约42℃)以及例如约40-60℃、0.5-6xSSC、0.1％SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在约50℃和6xSSC下杂交(和洗涤)。本领域的技术人员也可以例如根据DNA的长度容易地确定高度严格条件。

一般来讲，此类条件包括与中等严格条件相比，在较高温度和/或较低盐浓度下杂交和/或洗涤(例如在约65℃、6xSSC至0.2xSSC、优选6xSSC、更优选2xSSC、最优选0.2xSSC下杂交)。例如，高度严格条件可包括如上所定义的杂交，并且在大约65-68℃、0.2xSSC、0.1％SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(IxSSPE为0.15M NaCI₁10mM NaH2P04和1.25mMEDTA，pH 7.4)可代替SSC(1xSSC为0.15M NaCI和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行洗涤15分钟。

使用不使用放射性物质作为探针的商购获得的杂交试剂盒也是可能的。具体的例子包括用ECL直接标记和检测系统(安玛西亚公司(Amersham))杂交。严格条件包括例如使用包括在试剂盒中的杂交缓冲液在42℃下杂交4小时，该缓冲液补充有5％(w/v)阻断试剂和0.5M NaCI，并且在0.4％SDS、0.5xSSC中55℃下洗涤20分钟两次，在2xSSC中室温下洗涤5分钟一次。

      重组DNA构建体

在一个方面，本公开包括重组DNA构建体。

在一个实施例中，重组DNA构建体包含与至少一个调控序列(如在植物中有功能的启动子)有效连接的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(i)编码如下氨基酸序列以及它们的组合的核酸序列，基于Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。

在一个实施例中，重组DNA构建体包含与至少一个调控序列(如在植物中有功能的启动子)有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)基于Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：2比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列，以及它们的组合；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列。

在一个实施例中，重组DNA构建体包含与至少一个调控序列(如在植物中有功能的启动子)有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CRW1多肽。该CRW1多肽可来自拟南芥、玉米、中国栽培大豆、烟豆(Glycinetabacina)、野生大豆(Glycine soja)、短绒野大豆(Glycine tomentella)、水稻、二穗短柄草、葡萄、墨西哥棉(Gossypium mexicanum)、苹果、大麦、甘蓝型油菜(Brassica napus)、高粱、甘蔗(Saccharum officinarum)或小麦(Triticumaestivum.)。

一种重组DNA构建体，其包含分离的多核苷酸或cDNA，该分离的多核苷酸或cDNA包含(i)编码具有如下氨基酸序列的多肽的核酸序列，基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、21、23或27比较时，该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其与至少一个调控元件有效连接。在一个方面至少一个调控元件是启动子。在一个方面，启动子可以是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。

      调控序列

本公开的重组DNA构建体可包含至少一个调控序列。

调控序列可以是启动子。

多个启动子可用于本公开的重组DNA构建体中。启动子可基于所需的结果进行选择，并且可包括组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或用于在宿主生物中表达的其他启动子。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括例如WO 99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，Nature(《自然》)313：810-812(1985))；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，Plant Cell(《植物细胞》)2：163-171(1990))；泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)12：619-632(1989)以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.(《植物分子生物学》)18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.(《理论与应用遗传学》)81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)、组成型的合成核心启动子SCP1(国际专利公开No.03/033651)等等。其他的组成型启动子包括例如在以下各个美国专利中论述的那些：No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463、No.5,608,142和No.6,177,611。

可用于本公开的组织特异性启动子可包括根优选启动子，例如玉蜀黍NAS2启动子、玉蜀黍Cyclo启动子(US 2006/0156439，2006年7月13日公开)、玉蜀黍ROOTMET2启动子(WO05063998，2005年7月14日公开)、CR1BIO启动子(WO06055487，2006年5月26日公开)、CRWAC81(W005035770，2005年4月21日公开)和玉蜀黍ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；Gl No.1063664)。

启动子可以完全源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的DNA片段。

本公开的重组DNA构建体可还包括其他调控序列，包括但不限于翻译引导序列、内含子和多腺苷化识别序列。在本公开的另一个实施例中，本公开的重组DNA构建体还包含增强子或沉默子。

可将内含子序列添加至5′非翻译区、蛋白质编码区或3′非翻译区以增加胞质溶胶中积聚的成熟信息的量。在动物和植物表达构建体中的转录单元中包括可剪接的内含子，已证实在mRNA水平上和蛋白质水平上都能提高基因表达最高达1000倍。Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.(《分子与细胞生物学》)8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.(《基因与发育》)1：1183-1200(1987)。

可选择任何植物用于鉴定待用于本公开的重组DNA构建体和其他组合物(如转基因植物、种子和细胞)及方法中的调控序列和编码CRW1多肽的基因。适用于分离基因和调控序列以及适用于本公开的组合物和方法的植物的例子将包括但不限于：苜蓿、苹果、杏、拟南芥、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、花茎甘蓝、球芽甘蓝、卷心菜、卡诺拉油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、香菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、越橘、黄瓜、花旗松、茄子、莴苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子、哈密瓜(honey dew)、豆薯、猕猴桃、生菜、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻籽、芒果、甜瓜、蘑菇、蜜桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄、洋葱、橙、观赏植物、棕榈树、番木瓜树、欧芹、欧防风、豌豆、桃子、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、李子、石榴、杨树、马铃薯、南瓜、榅桲、辐射松、红莴苣、萝卜、油菜籽、悬钩子、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柳枝稷、橘子、荼、烟草、番茄、黑小麦、草皮、芜菁、藤本植物、西瓜、小麦、山药和绿皮西葫芦。

      组合物

本公开的组合物包括包含本文所公开的重组DNA构建体的转基因微生物、细胞、植物和种子。该细胞可以是真核的，例如酵母、昆虫或植物细胞，或者是原核的，例如细菌细胞。

本公开的组合物是在其基因组中包含一种或多种本公开的重组DNA构建体的植物。组合物还包括该植物的任何子代，以及从该植物或其子代获得的任何种子，其中该子代或种子在其基因组内包含本文所公开的重组DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或串粉获得的后续世代。子代还包括杂种和近交系。

在杂种种子繁殖的作物中，可将成熟的转基因植物进行自花传粉以产生纯合的近交植物。近交植物产生含有新引入的重组DNA构建体的种子。可栽培这些种子以产生将展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性的植株，或者这些种子可用于育种程序以产生杂种种子，可栽培该杂种种子以产生将展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性的植株。该种子可以是玉蜀黍种子。

植物可以是单子叶或双子叶植物，例如，玉蜀黍或大豆植物，如玉蜀黍杂交植物或玉蜀黍近交植物。植物还可以是向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、甘蔗或柳枝稷。

该重组DNA构建体可稳定整合进植物的基因组中。

特定的实施例包括但不限于如下：

1.在其基因组中包含重组DNA构建体的植株(例如玉蜀黍植株)，该重组DNA构建体包含与至少一个调控序列有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽：基于Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、7％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时所述植株展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。

2.在其基因组中包含重组DNA构建体的植株(例如玉蜀黍植株)，该重组DNA构建体包含与至少一个调控序列有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CRW1多肽，并且其中当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时所述植株展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。

3.在其基因组中包含重组DNA构建体的植株(例如玉蜀黍植株)，该重组DNA构建体包含与至少一个调控元件有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含一核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)可在严格条件下与包含SEQ ID NO：2的完全互补序列的DNA分子杂交；或者(b)通过用至少一种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQ ID NO：2的一个或多个核苷酸而源自SEQ ID NO：2；并且其中当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时所述植株展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。

4.本文所述的实施例中的植物的任何子代，本文所述的实施例中的植物的任何种子、本文所述的实施例中的植物的子代的任何种子以及来自任何上述本文所述实施例中的植物的细胞及其子代。

在本文所述实施例中的任一者中，CRW1多肽可来自拟南芥、玉米、中国栽培大豆、烟豆、野生大豆、短绒野大豆、水稻、二穗短柄草、葡萄、墨西哥棉、苹果、大麦、甘蓝型油菜、高粱、甘蔗或小麦。

在本文所述实施例中的任一者中，该重组DNA构建体可包含至少一个在植物中具有功能的启动子作为调控序列。

在本文所述实施例中的任一者中，在相似的环境条件和害虫压力下，该植株(例如玉蜀黍植株)相对于对照植株可展现出较少的产量损失，例如少至少25％、至少20％、至少15％、至少10％或至少5％的产量损失。

“昆虫害虫压力”是指昆虫侵扰的水平。

“昆虫”和“昆虫害虫”在本文中可互换使用。

昆虫害虫可以是成虫阶段或幼虫阶段。成虫阶段是特别的昆虫。

昆虫可属于鞘翅目，并且鞘翅目昆虫可属于根叶甲属。根叶甲属是一广泛存在的属的甲虫，其包括数种毁灭性的农业害虫物种，包括例如玉米根虫。

该昆虫可是任何玉米根虫物种。玉米根虫是美国经济破坏力最大的玉蜀黍昆虫。西部玉米根虫(D.virgifera virgifera)和北部玉米根虫(D.barberi)是爱荷华州(主要的玉米种子区)最具毁灭性的根虫物种。第三个物种是南方玉米根虫(D.undecimpunctata howardi)，其在其他区域造成大量经济损失。

该昆虫可属于鳞翅目，并且鳞翅目昆虫可属于秆野螟属(Ostrinia)。秆野螟属是蛾的一个属。该属的一个这种成员是欧洲玉米螟，一种严重的玉蜀黍害虫。本公开的昆虫可以是但不限于欧洲玉米螟。

本文所用的“植食性”是昆虫对活植物组织取食。植物组织可以是来自任何植物部分(包括但不限于叶、茎、根、生殖部分等)的组织。食植动物的慢性攻击可对个体植株的尺寸、寿命或繁殖产出具有明显的累积效应。

“易感性”指某植物品种不能够限制指定的害虫的生长和发育。

“抗性”指某植物品种当与易感植物品种在相似的环境条件和害虫压力下比较时，能够限制指定的害虫的生长和发育和/或它们所造成的损害。

通常，当在其基因组中包含重组DNA构建体的转基因植物相对于参考或对照植株展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性时，该参考或对照植株在其基因组中不包含重组DNA构建体。

本领域普通技术人员熟悉用于评估昆虫对植物组织的响应(即吸引或排斥)以及用于评估植物对昆虫害虫的抗性水平的方案。

如本文所给出的，可进行取食选择测定法。在该测定法中，将具有可拆卸盖的PVC盒子用于容纳昆虫和植物宿主，并且将等重量的新鲜收获的植物宿主的成熟叶子以随机方式附于潮湿滤纸。使昆虫饿一夜并置于具有所述组织的盒子中。按0至5的尺度对叶取食进行评分，其中0表示无损害，5表示完全毁坏。

还可以通过植物在田间试验中在足够害虫压力下维持足够的产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力来评估植物对昆虫害虫的抗性。

本领域普通技术人员将容易认识到在评估或测量其中使用对照植株的任何本公开实施例(例如，如本文所述的组合物或方法)中的转基因植物的表型时要用到的合适对照或参考植物。例如，举个非限制性的例子：

1.经转化的植株的子代，其对重组DNA构建体而言是半合的，使得该子代分离成包含或不包含该重组DNA构建体的植株：通常将相对于不包含该重组DNA构建体的子代对包含该重组DNA构建体的子代进行测量(即不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参考植株)。

2.重组DNA构建体渗入进近交系中，例如渗入进玉蜀黍中，或进入一品种中，例如渗入进大豆中：将通常相对于亲本近交系或品系对经基因渗入的株系进行测量(即亲本近交系或品系为对照或参考植株)。

3.两个杂交系，其中第一杂交系从两个亲本近交系产生，而第二杂交系从相同的两个亲本近交系产生，不同的是该亲本近交系中的一者含有重组DNA构建体：将通常相对于第一杂交系对第二杂交系进行测量(即第一杂交系是对照或参考植株)。

4.包含重组DNA构建体的植株：可相对于不包含该重组DNA构建体而是具有与该植株相当的遗传背景(如，与包含该重组DNA构建体的植株相比具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的核酸遗传物质序列同一性)的对照植株评估或测量该植株。有许多基于实验室的技术可供植物遗传背景的分析、比较和表征；其中有同工酶电泳(Isozyme Electrophoresis)、限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(RandomIy AmpIified PolymorphicDNA，RAPD)、随机引物聚合酶链反应(Arbitrarily Primed PolymeraseChain Reaction，AP-PCR)、DNA扩增指纹分析(DNA AmplificationFingerprinting，DAF)、序列特征化扩增区域(Sequence CharacterizedAmplified Region，SCAR)、扩增片段长度多态性(Amplified FragmentLength Polymorphism，)和单序列重复(Simple Sequence Repeat，SSR)，单序列重复也称为微随体(Microsatellite)。

此外，本领域普通技术人员将容易认识到，当评估或测量转基因植株的表型时要用到的合适对照或参考植株将不包括先前为了所需表型已通过诱变或转化而进行选择的植株。

      方法

方法包括但不限于在植物中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法、评估植物中对昆虫害虫的抗性的方法、鉴定Crw1的赋予植物提高的对昆虫害虫植食性的抗性的变体和/或天然存在的等位基因的方法以及制备种子的方法。植物可以是单子叶或双子叶植物，例如，玉蜀黍或大豆植物。植物还可以是向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、甘蔗或者是高粱。种子可以是玉蜀黍或大豆种子，例如玉蜀黍杂种种子或玉蜀黍近交种子。

方法包括但不限于如下：

用于转化细胞(或微生物)的方法，包括用本公开的分离的多核苷酸或重组DNA构建体中的任一者转化细胞(或微生物)。还包括通过该方法转化的细胞(或微生物)。在特定的实施例中，细胞为真核细胞，如酵母、昆虫或植物细胞，或者为原核的，如细菌细胞。微生物可以是农杆菌(Agrobacterium)，例如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

制备转基因植株的方法包括用本公开的分离的多核苷酸或重组DNA构建体中的任一者转化植物细胞并从该转化的植物细胞再生转基因植株。本公开还涉及通过该方法制备的转基因植株以及从该转基因植株获得的转基因种子。通过该方法获得的转基因植株可用于本公开的其他方法中。

本发明的植物细胞可包含重组构建体，该重组构建体包含的多核苷酸包含(i)编码具有如下氨基酸序列的多肽的核酸序列：基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、21、23或27比较时，该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其与至少一个调控元件有效连接。例如，调控元件可以是启动子。示例性的启动子可以是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。本发明的植物可包含这样一种植物细胞，该植物细胞包含重组构建体，该重组构建体包含的多核苷酸包含(i)编码具有如下氨基酸序列的多肽的核酸序列：基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、21、23或27比较时，该氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；或者(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其与至少一个调控元件有效连接。例如，调控元件可以是启动子。示例性的启动子可以是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。这样一种植物可显示出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。该昆虫害虫可为鞘翅目害虫。该昆虫害虫可属于根叶甲属。该昆虫害虫可为鳞翅目昆虫。该昆虫害虫可为欧洲玉米螟。该植物可以是单子叶植物。该植物可以是玉蜀黍。

本发明的植物可在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含与至少一个调控序列有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽：基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27比较时，该氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时所述植株展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。例如，调控元件可以是启动子。示例性的启动子可以是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。该昆虫害虫可为鞘翅目害虫。该昆虫害虫可属于根叶甲属。该昆虫害虫可为鳞翅目昆虫。该昆虫害虫可为欧洲玉米螟。该植物可以是单子叶植物。该植物可以是玉蜀黍。

从细胞或该细胞的培养基分离本公开的多肽的方法，其中该细胞包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含与至少一个调控序列有效连接的本公开的多核苷酸，并且其中该转化的宿主细胞在适于该重组DNA构建体表达的条件下培养。

变更本公开的多肽在宿主细胞中的表达水平的方法，包括：(a)用本公开的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于该重组DNA构建体表达的条件下培养该转化的宿主细胞，其中该重组DNA构建体的表达导致在该转化的宿主细胞中产生变更水平的本公开的多肽。

在植物中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法，包括：(a)将重组DNA构建体引入可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含与至少一个调控序列(例如，在植物中有功能的启动子)有效连接的多核苷酸，其中该多核苷酸编码具有如下氨基酸序列的多肽：基于Clustal V比对方法，当与SEQ IDNO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。该方法可还包括(c)获得源自该转基因植株的子代植株，其中所述子代植株在其基因组中包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。

在植物中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含与至少一个调控元件有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含一核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)可在严格条件下与包含SEQ ID NO：2的完全互补序列的DNA分子杂交；或者(b)通过用至少一种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQ ID NO：2的一个或多个核苷酸而源自SEQ ID NO：2；以及(b)在步骤(a)后从该可再生的植物细胞再生转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时植物中展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。该方法可还包括(c)获得源自该转基因植株的子代植株，其中所述子代植株在其基因组中包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时在植物中展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。

评估植物中对昆虫害虫的抗性的方法，包括(a)获得转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含与至少一个调控序列(例如在植物中有功能的启动子)有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽：基于Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)获得源自所述转基因植株的子代植株，其中该子代植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)与不包含该重组DNA构建体的对照植株相比针对植物中对昆虫害虫的抗性对子代植株进行评估。

在另一个实施例中，评估植物中对昆虫害虫的抗性的方法，包括：(a)获得转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含与至少一个调控元件有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有如下氨基酸序列的多肽：基于Clustal V比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，该氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在其中该多核苷酸得以表达的条件下培养(a)部分的转基因植株；以及(c)与不包含该重组DNA构建体的对照植株相比针对植物中对昆虫害虫的抗性对(b)部分的转基因植株进行评估。

评估植物中对昆虫害虫的抗性的方法，该方法包括：(a)获得转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含重组DNA构建体，该重组DNA构建体包含与至少一个调控元件有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含一核苷酸序列，其中所述核苷酸序列：(a)可在严格条件下与包含SEQ ID NO：2的完全互补序列的DNA分子杂交；或者(b)通过用至少一种选自缺失、置换、添加和插入的方法变更SEQ ID NO：2的一个或多个核苷酸而源自SEQ IDNO：2；(b)获得源自所述转基因植株的子代植株，其中该子代植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)针对在与不包含重组DNA构建体的对照植株比较时植物中提高的对昆虫害虫植食性的抗性对该子代植株进行评估。

在任何前述方法或本公开的方法的任何其他实施例中，在所述引入步骤中所述可再生的植物细胞可包含愈伤组织细胞、胚胎发生愈伤组织细胞、配子细胞、分生组织细胞或未成熟胚的细胞。该可再生的植物细胞可源自近交玉蜀黍植株。

在任何前述方法或本公开的方法的任何其他实施例中，所述再生步骤可包括如下：(i)在包含胚胎发生促进激素的培养基中培养所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织机体形成；(ii)将步骤(i)的所述转化的植物细胞转移至包含组织机体形成促进激素的第一培养基；以及(iii)将步骤(ii)之后的所述转化的植物细胞在第二培养基上继代培养，以允许芽伸长、根发育或这二者。

本公开的重组DNA构建体引入进植物中可通过任何合适的技术进行，包括但不限于直接DNA摄取、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。用于植物转化和再生的技术已经在国际专利公开WO 2009/006276中进行描述，将该专利公开的内容以引用的方式并入本文。

含有编码所关注蛋白质的外来、外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域众所周知的。可使再生的植株自花授粉以提供纯合的转基因植物。另外，将从再生的植株获得的花粉与农艺上重要的株系的种子培育植株进行杂交。反过来，用来自这些重要株系的植株的花粉对再生的植株进行授粉。用本领域技术人员所熟知的方法来培植本公开的含有所需多肽的转基因植物。

在一个实施例中，提供了鉴定Crw1的使植物提高对昆虫害虫植食性的抗性的变体的方法。这种方法包括：(a)通过基因改组将一种或多种核苷酸序列组合在一起，所述一种或多种核苷酸序列编码SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27的一个或多个片段或者与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27或者其片段具有至少70％同一性的蛋白质的一个或多个片段；(b)将来自步骤(a)的经改组的序列转化到可再生的植物细胞的群体中；(c)从步骤(b)的经转化的可再生植物细胞的群体再生出经转化的植株的群体；(d)针对提高的对所述昆虫害虫植食性的抗性对来自步骤(c)的经转化的植株的群体进行筛选；以及(e)鉴定来自该经转化的植株的展现出提高的抗性的变体。该方法可还包括：(f)将重组构建体引入可再生的植物细胞中，该重组构建体包含Crw1的赋予植物提高的对昆虫害虫植食性的抗性的变体；(g)在步骤(f)之后从该可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中该转基因植株在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(h)选择(g)的转基因植株，其中该转基因植株包含该重组DNA构建体并且当与不包含该重组DNA构建体的对照植株比较时表现出提高的对所述昆虫害虫植食性的抗性。例如，鉴定Crw1的赋予植物提高的对昆虫害虫植食性的抗性的变体的方法可包括如下步骤：a)通过基因改组将一种或多种核苷酸序列组合在一起以生成Crw1的变体，所述一种或多种核苷酸序列编码SEQ ID NO：3的一个或多个片段或与SEQ ID NO：3或其片段具有至少70％同一性的蛋白质的一个或多个片段；b)鉴定展现出该提高的抗性的变体，将来自步骤(a)的经改组的序列转化进可再生的植物细胞的群体中；c)从步骤(b)的经转化的可再生植物细胞的群体再生出经转化的植株的群体；d)针对提高的对所述昆虫害虫的抗性对来自步骤(c)的经转化的植株的群体进行筛选；以及，e)鉴定展现出该提高的抗性的变体。该方法可包括为鞘翅目昆虫的昆虫害虫。该方法可包括属于根叶甲属的昆虫害虫。该方法可包括为鳞翅目昆虫的昆虫害虫。该方法可包括为欧洲玉米螟的昆虫害虫。该方法可包括使用取食选择测定法进行筛选。

本发明的方法可包括鉴定玉蜀黍植株中与提高的对昆虫害虫植食性的抗性相关的Crw1的等位基因变体的方法，该方法包括如下步骤：a)使具有不同水平的对所述昆虫害虫的抗性的两种玉蜀黍植株杂交；b)针对编码包含SEQ ID NO：3的蛋白质的多核苷酸序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，评估子代植株中的等位基因变异；c)针对对所述昆虫害虫的抗性对该子代植株进行表型分析；d)将等位基因变异与所述抗性关联；以及e)鉴定与提高的对所述昆虫害虫的抗性相关的等位基因。该方法可包括为鳞翅目昆虫的昆虫害虫。该方法可包括为欧洲玉米螟的昆虫害虫。该方法可包括使用取食选择测定法进行筛选。在该方法中，该群体中的玉蜀黍植株的抗性水平可从历史数据获得或者通过进行取食选择测定法获得。

术语“基因改组”和“定向进化”在本文中可互换使用。“基因改组”的方法由如下步骤组成：反复进行DNA改组，然后进行适当的筛选和/或选择以生成具有经修饰的生物活性的Crw1核酸变体或其部分(Castle等人，(2004)Science(《科学》)304(5674)：1151-4；美国专利No.5,811,238和No.6,395,547)。

还提供了通过传统的连锁作图鉴定玉蜀黍中Crw1的与提高的对昆虫害虫植食性的抗性相关的等位基因变体的方法。在一些实施例中，通过如下步骤鉴定该等位基因变体：(a)使具有不同水平的对所述昆虫害虫的抗性的两种玉蜀黍植株杂交；(b)针对编码包含SEQ ID NO：3的蛋白质的多核苷酸序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，评估子代植株中的等位基因变异；(c)针对对所述昆虫害虫的抗性对该子代植株进行表型分析；(d)将等位基因变异与所述抗性关联；以及(e)鉴定与提高的对所述昆虫害虫的抗性相关的等位基因。表型分析步骤(c)可使用本领域已知的评估对昆虫害虫的抗性的任何方法进行，或者可使用本文给出的取食选择测定法进行。

在其它实施例中通过如下步骤经由全基因组关联分析来鉴定该等位基因变体：(a)获得玉蜀黍植株的群体，其中所述玉蜀黍植株展现出不同水平的对所述昆虫害虫的抗性；(b)针对编码包含SEQ ID NO：3的蛋白质的多核苷酸序列，或者在调节编码该蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，评估等位基因变异；(c)将等位基因变异与所述抗性相关；以及(d)鉴定与提高的对所述昆虫害虫的抗性相关的等位基因变体。抗性可使用本领域普通技术人员已知的任何方法或取食选择测定法评估。作为另一种选择，还可使用有关该抗性的历史表型数据。

还提供的是鉴定展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性的玉蜀黍植株的方法，该方法包括：(a)检测该玉蜀黍植株的基因组中Crw1的与提高的对所述昆虫害虫的抗性相关的至少一种等位基因变体的存在(其中该等位基因可使用上述方法鉴定)；以及(b)鉴定包含所述至少一种等位基因变体的玉蜀黍植株。该方法可还包括：(c)使所述玉蜀黍植株与第二玉蜀黍植株杂交；以及(d)鉴定和选择由所述杂交产生的具有所述等位基因变体的子代植株。

在任何上文给出的方法中，该昆虫害虫可属于鞘翅目，并且该鞘翅目昆虫可以是根叶甲属。该昆虫害虫还可是任何玉米根虫物种。

或者，该昆虫害虫可属于鳞翅目，并且鳞翅目昆虫可属于秆野螟属。该昆虫害虫还可以是欧洲玉米螟。

在任何上文给出的方法中，对昆虫害虫的抗性的评估可包括本领域普通技术人员已知的任何规程。还可使用本文给出的取食选择测定法。

在任何上文给出的方法中，该植物是单子叶植物并且可以是玉蜀黍。

      实施例

以下实例进一步说明本公开，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。应理解，这些实例虽然说明本发明的各实施例，但仅以举例说明的方式给出。由以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本公开的必要特征，并在不背离本公开的精神和范围的情况下，可对本公开作出各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文显示和描述的那些修改之外，本领域技术人员由前文的描述将显而易见地知道其他各种修改。这类修改形式也旨在落入所附权利要求的范围内。

      实例1

      叶取食选择测定

进行取食选择测定法以评估Crw1突变植株和野生型植株中对玉米根虫甲虫的抗性水平。使用具有可拆卸盖的PVC盒，并将相等重量的来自突变植株和野生型植株的新鲜收获的成熟叶子以随机方式附于潮湿的滤纸。将已饿了一夜的西部玉米根虫甲虫和南部玉米根虫甲虫放入盒中。之前的观察表明，根虫通常在前45分钟随机觅食，然后才建立取食偏好，并且偏好的取食通常持续到所选择的叶子被完全吞食为止。按0至5的尺度对叶取食进行评分，其中0表示无损害，5表示完全毁坏。

      实例2

      玉蜀黍crw1基因的克隆和验证

在Ac活性材料中鉴定了对西部玉米根虫(WCR)成虫甲虫高度易感的Crw1玉蜀黍突变株(在本文中也称为crw1-Ac突变株)。图1显示，用取食选择测定法进行评估得知，WCR甲虫对crw1-Ac突变株叶子的偏好压倒性地超过对野生型亲缘株(WT-sib)叶子的偏好。将该基因通过共分离分析与Ac一起进行克隆，确定了Crw1基因位于6号染色体上，并且它编码与植物特异性NAC家族转录因子具有高度同源性的多肽。从原始的Ac等位基因鉴定了Crw1的稳定地突变但回复的等位基因，其在插入位点含有8bp的同向重复(Ac切除的“足迹”)。这个8bp的插入造成CRW1的过早终止。图2示出了突变株中Crw1基因及该突变的位置的示意图。图6A-6C示出了野生型Crw1和crw1-Ac等位基因之间的比对。SEQ ID NO：3和4分别指crw1-Ac核苷酸编码序列和CRW1-Ac氨基酸序列。

为鉴定Crw1的另外的突变等位基因，首先在大田中在天然的虫扰条件下对一批公共的玉蜀黍多样性株系进行WCR甲虫易感性的筛选，然后通过实例1描述的叶取食选择测定法进行验证。发现两个公共的多样性株系CO109和NC316在对WCR甲虫的易感性上发生分离。通过将每个株系与crw1-Ac株系杂交，显示了C0109和NC316在Crw1基因处含有赋予提高的WCR甲虫易感性的天然存在的突变等位基因。对每个株系中的Crw1cDNA进行测序表明，CO109在外显子2中含有1bp插入(在核苷酸368处)，而NC316在外显子2的不同位置处含有1bp插入(在核苷酸366处)和45bp插入。在两种情形中都产生过早终止密码子。图2示出了CO109和NC316株系中的突变的位置。图7A-7C示出野生型Crw1和来自CO109的Crw1之间的比对。SEQ ID NO：6和7分别指crw1-CO109核苷酸编码序列和CRW1-CO109氨基酸序列。图8A-8C显示野生型Crw1和来自NC316的Crw1之间的比对。SEQ ID NO：8和9分别指crw1-NC316核苷酸编码序列和CRW1-NC316氨基酸序列。

      实例3

      玉蜀黍Crw1基因的转录特征和生化特征

玉蜀黍Crw1基因的转录谱(transcriptional profile)一直难以完全地建立。尽管不希望受任何特定理论的束缚，一个可能的原因是玉蜀黍Crw1转录物可能缺乏聚腺苷酸尾。该预测是基于如下事实：在任何公用的EST数据库中都未曾找到玉蜀黍Crw1 cDNA。另外，在RNA seq实验(转录组学)中没有检测到玉蜀黍Crw1基因的读段(read)，该RNA seq实验是对从在发生甲虫损害后的不同时间间隔分离的成叶RNA样品生成的cDNA上进行的。尽管如此，该转录组学实验和随后对显著命中结果(significant hit)的RT-PCR验证揭示了玉蜀黍Crw1突变株的三个重要特征：

首先，玉蜀黍中控制茉莉酸(JA)和绿叶挥发物(GLV，如二萜烯)的生成的脂氧合酶途径基因的表达发生显著变化。这些化合物都在植物与昆虫害虫的相互作用中起到显著的作用，尽管作用是相反的。例如，已知JA能介导宿主抗性，而GLV有助于吸引害虫及其捕食者。与其野生型对应物相比，玉蜀黍Crw1突变株中JA途径基因的表达被上调(表1)，而GLV基因的表达却减少，从而暗示一种或多种GLV基因的过表达也可能提供了对昆虫的抗性。从该表达分析获得的结果与突变体Crw1植株较其野生型对应物出现较高的JA诱导水平是一致的(图3)。

表1是与野生型亲缘株相比，Crw1突变株中因响应昆虫取食而被差异化调节的脂氧合酶途径基因的列表。正值和负值表示突变株中的特定转录物与野生型相比的变化倍数。看来，因响应WCR的取食，Crw1突变株中出现JA生物合成和信号转导基因的上调，并伴随着出现GLV基因的下降。

      

其次，在玉蜀黍Crw1突变株中，苯丙素(phenylpropanoid)和木质素生物合成基因的表达下调(表2)。与这些结果一致的是如下的发现：Crw1突变株积累较低水平的对香豆酸和阿魏酸(图4)并且展现出成体组织的木质化减少(图5)。鉴于这些酚类化合物执行细胞壁交联，本文给出的结果与Crw1突变株叶子的拉伸强度减弱和所述叶子的甲苯胺蓝O(TBO，其与细胞壁中的游离羟基反应)染色的改变是相一致的。

表2是被差异调节的参与木质素生物合成的转录物的列表。正值和负值表示与野生型相比Crw1突变株中特定转录物的变化倍数。看来，因响应WCR甲虫取食，Crw1突变株中木质素生物合成的负调节因子被上调，并且木质素生物合成途径的几个关键基因被下调。

      

第三，Crw1突变株中的许多氨基酸生物合成基因和修饰基因的表达被上调(表3)，而这继而造成更高水平的相关氨基酸(表4)。这些游离氨基酸中突出的是丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸和丝氨酸，它们都显示出起到WCR甲虫的强效诱食剂的作用。

表3是与Crw1的野生型亲缘株相比，突变株中因响应WCR取食而被差异化诱导的氨基酸生物合成或修饰基因的列表。正值和负值表示与野生型相比Crw1突变株中特定转录物的变化倍数。丙氨酸氨基转移酶参与丙氨酸的形成，而丝氨酸家族氨基酸生物合成样蛋白和甘氨酸羟甲基转移酶参与丙氨酸和甘氨酸的形成。

      

表4显示Crw1突变株中生长阶段特异性的叶代谢物分布。差异的代谢物水平以突变株相比于野生型的变化倍数表示。负值和正值分别表示突变株与野生型相比在特定的生长阶段特定代谢物的较低水平和较高水平。表中的零值表示在该特定生长阶段没有检测到变化倍数。

      

      实例4

      玉蜀黍CRW1多肽的同系物的鉴定

可使用美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTP算法以及DUPONT^TM专有内部数据库，分析玉蜀黍CRW1多肽与“nr”数据库中含有的所有可公开获得的氨基酸序列的相似性。

使用玉蜀黍CRW1多肽的序列进行的BLAST搜索揭示了玉蜀黍CRW1多肽与来自各种生物体的NAC转录因子的相似性。表5(非专利文献)中显示的是玉蜀黍CRW1的氨基酸序列的BLASTP结果。图5和6中还显示了使用Clustal W比对方法和默认参数得到的每对氨基酸序列的序列同一性百分数的值：

      表5.玉蜀黍CRW1多肽的BLASTP结果(非专利)

      

*用星号注释的标识符不是UniProt标识符

图9A-9L给出了SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27中所示多肽的氨基酸序列的比对。图10给出了图9A-9L中示出的每个序列对的序列同一性百分数和趋异值。

序列比对和同一性百分数计算是用生物信息学计算软件包(Inc.公司，威斯康星州麦迪逊市)的程序进行的。所述序列的多序列比对是用Clustal W比对方法(Thompson等人，(1994)Nucleic Acids Research.(《(核酸研究》)22：4673-80)和默认参数(空位罚分＝10、空位长度罚分＝0.20)进行的。使用Clustal方法进行的双序列比对的默认参数为空位罚分＝10.00和空位长度＝0.10。所用的蛋白质权重矩阵为Gonnet系列。

      实例5

      在植物中过表达Crw1

可将玉蜀黍Crw1基因或其任何同源物插入载体中，可使用本领域普通技术人员已知的方法进一步将该载体转化进植物(包括但不限于玉蜀黍)中。然后可与先前描述的实例类似或者使用任何已知的评估方法进行表型分析以确定植物对昆虫害虫(例如但不限于西部玉米根虫)的抗性。

      实例6

      Crw1在玉蜀黍植株中的过表达

使用有义链引物(SEQ ID NO：28)和反义链引物(SEQ ID NO：29)以及Phusion DNA聚合酶从玉蜀黍基因组DNA扩增一2.05kb Crw1片段。将该DNA片段(基本上包含旁侧为Bglll(5’)位点和Hpal(3’)位点的Crw1编码区)亚克隆进pCR4-TOPO中。测定该序列以确保精确性，并然后切出该片段并克隆进入门克隆(PHP31847)中。该入门克隆由增强的玉蜀黍泛素启动子(加上5’UTR和内含子)、Crw1编码区和PINII终止子组成。将整个基因盒(cassette)(周围为Gateway attL1和attL2重组位点)经由LR重组反应迁移进适当的植物表达目的载体(destination vector)中。将所得的Ubi-Crw1构建体(PHP41109)经由农杆菌介导的转化引入进玉蜀黍愈伤组织中。从该愈伤组织再生植株，并且一个事件即8908.102.1.17显示具有全长转录物。使用引物组合phn11317(SEQ ID NO：30)/phn140720(SEQ ID NO：31)以及phn140719(SEQ ID NO：32)/phn140720(SEQ ID NO：31)进行的RT-PCR显示，Tl植株具有含有Crw1的全长转录物的事件#17.4(图11)。可使用本领域已知的任何方法或实例1中描述的取食选择测定法测试T1植株对昆虫害虫如西部玉米根虫的易感性。

产生第二构建体用于Crw1的根优选表达。为此目的，将来自玉蜀黍金属硫蛋白基因的一1.3445kb片段(Rm2；玉蜀黍ROOTMET2启动子(WO05063998，2005年7月14日公开))与一538bp玉蜀黍ADHIi-内含子1片段组合以用于该性状基因在转基因玉蜀黍植株中增强表达。将含有1927bp Rm2/ADHI启动子-内含子片段、2020bp Crw1基因组片段和313bpPinll终止子的Crw1盒连接进含有attL1、attL2重组位点的Gateway入门载体pENTR2B中。然后将该中间载体在LR重组反应中与目的载体组合。然后经由农杆菌介导的转化将该构建体引入玉蜀黍中。

Claims (17)

1.一种在植物中提高对昆虫害虫植食性的抗性的方法，包括：

(a)将重组DNA构建体引入进可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含与至少一个调控序列有效连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有这样的氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列基于Clustal W比对方法，当与SEQ ID NO：3、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27比较时，具有至少80％的序列同一性；以及

(b)在步骤(a)之后从所述可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中所述转基因植株在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时展现出提高的对植物害虫的抗性。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括：

(c)获得源自所述转基因植株的子代植株，其中所述子代植株在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时展现出提高的对昆虫害虫植食性的抗性。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一个调控元件是启动子。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述启动子是根特异性启动子或玉蜀黍泛素启动子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目(Coleopteran)昆虫。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述昆虫害虫属于根叶甲属(Diabrotica)。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

8.根据权利要求9所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。

9.一种鉴定赋予植物提高的对昆虫害虫植食性的crw1的抗性的变体的方法，所述方法包括如下步骤：

a.通过基因改组将一种或多种核苷酸序列组合在一起以产生Crw1的变体，所述一种或多种核苷酸序列编码SEQ ID NO：3的一个或多个片段或与SEQ ID NO：3或其片段具有70％同一性的蛋白质的一个或多个片段；以及

b.鉴定展现出所述提高的抗性的变体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括如下步骤：

a.将包含通过权利要求9的方法鉴定的Crw1的变体的重组构建体引入进可再生的植物细胞中；

b.在步骤(a)之后从所述可再生的植物细胞再生出转基因植株，其中所述转基因植株在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

c.选择(b)的转基因植株，其中所述转基因植株包含所述重组DNA构建体并且当与不包含所述重组DNA构建体的对照植株比较时展现出提高的对所述昆虫害虫的抗性。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目昆虫。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述昆虫害虫属于根叶甲属。

13.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述单子叶植物是玉蜀黍。

15.一种鉴定玉蜀黍植株中的Crw1的等位基因变体的方法，其中所述等位基因变体与提高的对昆虫害虫植食性的抗性相关，所述方法包括如下步骤：

a.获得玉蜀黍植株的群体，其中所述玉蜀黍植株展现出不同水平的对所述昆虫害虫的抗性；

b.针对编码包含SEQ ID NO：3的蛋白质的多核苷酸序列，或者在调节编码所述蛋白质的多核苷酸的表达的基因组区域中，评估等位基因变异；

c.将等位基因变异与所述抗性关联；以及

d.鉴定与提高的对所述昆虫害虫的抗性相关的等位基因变体。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述昆虫害虫为鞘翅目昆虫。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述昆虫害虫属于根叶甲属。