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CN104736169B - 海产鱼的类结节病用dna疫苗 - Google Patents

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CN104736169B CN201380047148.4A CN201380047148A CN104736169B CN 104736169 B CN104736169 B CN 104736169B CN 201380047148 A CN201380047148 A CN 201380047148A CN 104736169 B CN104736169 B CN 104736169B
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Abstract

本发明提供一种用于诱导针对类结节病的保护性免疫的鱼类用DNA疫苗。该疫苗含有DNA或包含上述DNA的表达载体作为有效成分，所述DNA包含编码针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. piscicida)的免疫原性多肽的核苷酸序列。

Description

海产鱼的类结节病用DNA疫苗
技术领域
本发明涉及一种用于诱导针对鱼类感染类结节病的病原菌美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. piscicida)的保护性免疫的DNA疫苗。
本说明书中的“类结节病(pseudotuberculosis，假结核病)”是指由P. damselae subsp. piscicida的感染引起的类结节病，因此，不仅包含在青甘鱼(Seriolaquinqueradiata，鰤鱼)类中发病的类结节病，还包含在青甘鱼类以外的鱼类[例如属于鲈形目(Perciformes)的鱼类(黑鲷、真鲷、赤点石斑鱼等)、属于胡瓜鱼目(Osmeriformes)的鱼类(香鱼等)、属于鲀形目(Tetraodontiformes)的鱼种(绿鳍马面鲀等)等]中因相同病原菌而发病的巴氏杆菌病(Pasteurellosis)。
背景技术
在以海鲜类为代表的众多水生生物的养殖产业中，作为封闭系统的养殖领域中的病毒性疾病和细菌性疾病，由于个体高密度地存在，因此这些感染的影响巨大，成为养殖产业中的严重问题。
类结节病(或巴氏杆菌病)作为1963年在美国切萨皮克(Chesapeake)湾中白鲈鱼(Roccus americanus，美洲白鲈)大量死亡的病原疾病而首次被报道(非专利文献1)。在日本，1968年在四国南西的养殖青甘鱼0岁鱼中观察到该病的发生，第二年1969年在西日本一带的养殖青甘鱼中流行。另外，并非只有青甘鱼类，在黑鲷、真鲷、赤点石斑鱼、香鱼、绿鳍马面鲀等鱼种中也有发生，由于该病具有极强的传染性，因此成为威胁海产养殖的问题(非专利文献1)。
P. damselae subsp. Piscicida属于发光杆菌属，是呈现革兰氏阴性兼性厌氧性的非运动性短杆菌(0.6～1.2×0.8～2.6μm)的一科。该细菌的增殖适温为25～30℃，最佳pH为7.5～8.0，最佳食盐浓度为2～3%，对氨苄西林(Ampicillin)、奥索利酸(Oxolinicacid)、氟苯尼考(Florfenicol)等显示出敏感性。该病的症状以在脾脏和肾脏中形成1mm左右的小白点为特征。小白点是细菌集落配置点，多数被纤维组织包围形成结节。这些菌集落的形成是基于：可耐受吞噬细胞的细胞内消化，并在吞噬细胞内发生增殖，从而在毛细血管或间质组织内形成菌球(非专利文献2)。
在日本，虽然针对该病已经批准了灭活疫苗，但灭活疫苗难以诱导细胞免疫。然而，细胞免疫的诱导能力高的疫苗还几乎没有开发(专利文献1和专利文献2)。
在细菌感染症的预防或治疗中通常使用疫苗。疫苗有灭活疫苗(日本脑炎、外氏病等)、类毒素(破伤风、白喉等)、减毒疫苗(卡介苗(BCG)、脊髓灰质炎等)、基因重组疫苗(乙型肝炎病毒等)等。灭活疫苗和使外毒素无毒化而获得的类毒素是诱导对抗这些疾病的抗体的比较安全的疫苗。与灭活疫苗相比，基因重组疫苗不含杂质，因此被认为是更安全的疫苗。
但是，虽然这些疫苗可以诱导抗体的产生，但难以诱导细胞免疫，这是其缺点。另外，灭活疫苗和减毒疫苗需要在产业上大量获得作为抗原的蛋白，必须适当地增殖病原菌。而且，通过减毒疫苗获得的免疫效果虽然大多能够长期维持，但另一方面被指出具有副作用、危险性。认为灭活疫苗和基因重组疫苗在宿主内的抗原持续性短，需要佐剂等。现有的这些疫苗从制备到接种到被检体内这段期间需要冷藏保存，因此存在着成本增加和效力降低的问题。
最近，疫苗的研究开发正在推进，通过给予编码免疫原性蛋白的质粒DNA，开发了带来免疫诱发的新疫苗种类(DNA疫苗)，如下所述改善了现有疫苗的不利。即，由于DNA疫苗不仅可以诱导体液免疫应答，还可以强效诱导细胞免疫，因此具有以下优点：可以赋予对感染症的保护能力；可以高度纯化；在室温或高温下也稳定，无需冷藏保存即可长期贮藏；通过基因工程学方法容易迅速地改良DNA疫苗；以及缩短疫苗开发所花费的时间等。
已知通过向肌肉内注射编码杆状病毒(Rhabdovirus)的结构蛋白的糖蛋白的基因，会刺激虹鳟和比目鱼的免疫应答(非专利文献3)。另外，关于虹鳟和比目鱼有DNA疫苗的报道(非专利文献4)。但在其他鱼种中没有DNA疫苗的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平9-176043号公报；
专利文献2：日本特开2002-003400号公报；
非专利文献
非专利文献1：S. F. Snieszko等人, “Bacteriology”, (美国), 1964年, 88卷,第1814-1814页；
非专利文献2：若林久嗣、室贺清邦编集, “魚介類の感染症寄生虫症”, (恒星社厚生阁), 2004年, 第206-211页；
非专利文献3：P. Boudinot等人, “Virology”, (美国), 1998年, 249卷, 第297-306页；
非专利文献4：McLauchlan等人, “Fish and shellfish Immunology”, (英国),2003年, 15卷, 第39-50页。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供：用于诱导针对类结节病的保护性免疫的鱼类用DNA疫苗。
用于解决课题的手段
本发明人深入研究了对海产鱼的类结节病有效的疫苗，结果发现：将携带编码P. damselae subsp. piscicida的脂蛋白(Lipoprotein: ppa1: SEQ ID NO: 1)、DegQ丝氨酸蛋白酶(DegQ serine protease: ppa2: SEQ ID NO: 3)和外膜蛋白A前体(Outermembrane protein A precursor: ppars1: SEQ ID NO: 5)的基因的质粒DNA混合或分别接种给比目鱼和红甘鲹(红甘)时，具有对抗海产鱼的类结节病的免疫效果、以及增加免疫相关基因的表达量。而且，将这些序列按照比目鱼的密码子使用频率进行序列变换形成人工基因(SEQ ID NO: 7、9、11)，将携带该基因的质粒DNA也同样进行接种时，发现各自具有高的免疫防除效果，完成了本发明。
即，本发明涉及下述的[1]～[9]。
[1] [1]的鱼类用DNA疫苗，其特征在于，包含下述物质作为有效成分：包含编码针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性多肽的核苷酸序列或将该序列根据比目鱼的密码子使用频率进行修饰而获得的核苷酸序列的DNA、或包含上述DNA的表达载体；
[2] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是由选自美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的ppa1、ppa2和ppars1的基因编码的多肽或其部分片段；
[3] [2]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是由SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列构成的多肽或其部分片段；
[4] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是：(1)包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的多肽；(2)包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代或添加而获得的氨基酸序列、且具有针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性的修饰多肽；或(3)与SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的同源性为80%以上、且具有针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性的同源多肽；或者它们的部分片段；
[5] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述核苷酸序列是：(1) SEQ ID NO: 1、3、5、7、9或11所表示的核苷酸序列；或(2) 与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9或11所表示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且编码具有针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性的多肽的核苷酸序列；或者它们的部分序列；
[6] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述表达载体为包含天然型基因的质粒wild-ppa1、wild-ppa2或wild-ppars1、或者包含修饰基因的质粒opt-ppa1、opt-ppa2或opt-ppars1；
[7] 类结节病的预防或治疗方法，其特征在于：对鱼给予[1]～[6]中任一项的鱼类用DNA疫苗；
[8] [7]的方法，其中，上述鱼为属于鲈形目、鲀形目或胡瓜鱼目的鱼；
[9] [1]～[6]中任一项的鱼类用DNA疫苗在诱发针对海产鱼的类结节病的免疫应答中的应用。
另外，本发明还涉及：
鱼类用DNA疫苗用的或类结节病的预防或治疗用的DNA、或包含上述DNA的表达载体，所述DNA包含编码针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性多肽的核苷酸序列；以及
DNA或包含上述DNA的表达载体在制备鱼类用DNA疫苗中的应用，所述DNA包含编码针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性多肽的核苷酸序列。
发明效果
根据本发明的鱼类用DNA疫苗，可以赋予针对由P. damselae subsp. Piscicida引起的类结节病的免疫能力。更详细而言，根据本发明的鱼类用DNA疫苗，可以诱导针对P. damselae subsp. piscicida的感染症或由P. damselae subsp. piscicida的感染引起的类结节病的免疫应答(包括体液免疫应答和细胞免疫应答)，因此对P. damselae subsp. piscicida的感染的预防或治疗、或者上述类结节病的预防或治疗有效。例如，由确认到海产鱼中的P. damselae subsp. piscicida感染保护试验和免疫相关基因的表达量大幅增加的结果可知：可用作本发明的鱼类用DNA疫苗的有效成分的质粒wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2和opt-ppars1作为DNA疫苗的有效成分有效，可以期待着预防海产鱼中的P. damselae subsp. piscicida的感染。
附图说明
图1是显示关于P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株(1.0×105cfu/mL浸渍感染)攻击后的累积死亡率，在1.0×105cfu/mL浸渍感染组中，经DNA疫苗(wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1)处理的比目鱼的累积死亡率的经时性变化的曲线图。
图2是显示关于P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株(1.0×105cfu/mL浸渍感染)攻击后的累积死亡率，在1.0×105cfu/mL浸渍感染组中，经DNA疫苗(wild-ppa1、opt-ppa1)处理的比目鱼的累积死亡率的经时性变化的曲线图。
图3是显示关于P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株(1.0×105cfu/mL浸渍感染)攻击后的累积死亡率，在1.0×105cfu/mL浸渍感染组中，经DNA疫苗(wild-ppa2、opt-ppa2)处理的比目鱼的累积死亡率的经时性变化的曲线图。
图4是显示关于P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株(1.0×105cfu/mL浸渍感染)攻击后的累积死亡率，在1.0×105cfu/mL浸渍感染组中，经DNA疫苗(wild-ppa3、opt-ppa3)处理的比目鱼的累积死亡率的经时性变化的曲线图。
具体实施方式
本发明的鱼类用DNA疫苗，只要是至少包含一个以上编码针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫原性多肽的核苷酸序列的DNA构建物，则没有特别限定，在本发明的鱼类用DNA疫苗中例如包括：
(a) DNA，该DNA包含编码针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫原性多肽的核苷酸序列；或
(b) 包含上述DNA(a)的表达载体。
上述DNA(a)可以进一步包含免疫原性多肽的表达所必需的各种调节序列，上述表达载体(b)也可以包含上述调节序列。
在本说明书中，“针对类结节病的免疫原性多肽”是指可以在生物体内诱导针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫(包括体液免疫和细胞免疫)的多肽。
作为针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫原性多肽，只要是可以在生物体内诱导针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫(包括体液免疫和细胞免疫)的多肽即可，没有特别限定，例如可以列举细菌的结构蛋白以及它们的部分片段。作为上述免疫原性多肽，优选由P. damselae subsp. piscicida的ppa1、ppa2或ppars1编码的多肽或其部分片段，更优选由SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列构成的多肽或其部分片段。
另外，作为上述免疫原性多肽，还可以列举下述多肽：(1)包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的多肽；(2)包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸被缺失、取代或添加而获得的氨基酸序列、且具有针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫原性的修饰多肽；或(3)与SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的同源性为80%以上(优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上)、且具有针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫原性的同源多肽；或者它们的部分片段。
本发明的鱼类用DNA疫苗可以是能够诱导仅任意一个免疫原性多肽(优选由ppa1、ppa2和ppars1编码的各多肽或它们的修饰或同源多肽中的仅任意一个)的DNA疫苗，或者还可以是能够诱导2个以上的免疫原性多肽(优选选自由ppa1、ppa2和ppars1编码的各多肽或它们的修饰或同源多肽的2个以上的多肽的组合)的DNA疫苗。作为后者的例子，可以列举：ppa1蛋白(或其修饰或同源多肽)与ppa2蛋白(或其修饰或同源多肽)的组合、ppa1蛋白(或其修饰或同源多肽)与ppars1蛋白(或其修饰或同源多肽)的组合、ppa2蛋白(或其修饰或同源多肽)与ppars1蛋白(或其修饰或同源多肽)的组合、ppa1蛋白(或其修饰或同源多肽)与ppa2蛋白(或其修饰或同源多肽)与ppars1蛋白(或其修饰或同源多肽)的组合。
在本说明书中，修饰多肽是指，在某SEQ ID NO所表示的氨基酸序列中发生了1个以上(例如1个～数个、优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个、特别优选1个)的氨基酸修饰(例如缺失、取代和／或添加)而获得的蛋白，其依然可以对本发明所使用的鱼类赋予免疫。
另外，在本说明书中，氨基酸序列中的同源性是指，利用计算机分析软件(SDC软件)比较分析两种氨基酸序列，在同一种氨基酸存在于相同位置的情况下视为氨基酸在两种序列中相同而算出的同源性。
作为本发明中使用的、编码免疫原性多肽的核苷酸序列，可以列举编码迄今为止所列举的各免疫原性多肽的核苷酸序列，例如可以列举：编码P. damselae subsp. piscicida的各结构蛋白、包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的多肽、上述修饰多肽、或上述同源多肽、或它们的部分片段的核苷酸序列。
作为上述核苷酸序列，优选(1) SEQ ID NO: 1、3、5、7、9或11所表示的核苷酸序列；或(2) 与SEQ ID NO: 1、3、5、7、9或11所表示的核苷酸序列的同源性为80%以上、且编码具有针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫原性的多肽的核苷酸序列；或者它们的部分序列。需要说明的是，在本说明书中，核苷酸序列的同源性是指，利用计算机分析软件(SDC软件)比较分析两种核苷酸序列，在同一种核苷酸存在于相同位置的情况下视为核苷酸在两种序列中相同而算出的值。另外，关于上述部分序列的长度，只要由该部分核苷酸序列编码的多肽可以在生物体内诱导针对P. damselae subsp. Piscicida的免疫(包括体液免疫和细胞免疫)，则没有特别限定。
另外，编码免疫原性多肽的核苷酸序列可以是来自天然的核苷酸序列，也可以是全合成的核苷酸序列，另外，还可以是利用一部分来自天然的核苷酸序列进行合成而获得的核苷酸序列。
本发明中使用的编码免疫原性多肽(例如脂蛋白)的核苷酸序列例如可以由P. damselae subsp. Piscicida获得。作为本发明中使用的上述核苷酸序列的典型获得方法，可以列举基因工程学领域惯用的方法，例如使用根据部分氨基酸序列信息制作的适当的DNA探针进行筛选的方法等。
本发明中使用的表达载体只要是可以在鱼类细胞内表达的载体，则没有特别限定。本发明中使用的表达载体是自身复制载体，即作为染色体外的独立体而存在，其复制不依赖于染色体的复制，例如基本上可以构建质粒。另外，上述表达载体可以是在导入宿主中时，被获取至该宿主的基因组中，与重组有其的染色体一起复制。本发明中可以使用的表达载体的构建顺序和方法可以采用基因工程学领域惯用的构建顺序和方法。
作为本发明中可以使用的转录调节序列，例如可以列举组成性启动子、诱导性或调节性启动子、组织特异性启动子、或来自所表达的抗原基因的启动子，但只要可以在鱼类细胞内表达，则没有特别限定。作为组成性启动子，例如可以列举来自巨细胞病毒(CMV)的启动子序列、或劳斯肉瘤病毒(RSV)、猿猴病毒-40(SV-40)、肌肉β肌动蛋白启动子、或单纯疱疹病毒(HSV)等强效启动子等。作为组织特异性启动子，例如可以列举胸苷激酶启动子等。作为诱导性或调节性启动子，例如可以列举：生长激素调节性启动子、处于lac操纵子序列控制下的启动子、或锌诱导性金属硫蛋白启动子。可以使上述转录调节序列与编码免疫原性多肽的核苷酸序列以可操作的方式(即以可以调节上述核苷酸序列的表达的方式)结合。
上述调节序列可以包含含有启动子(例如上述诱导性或组成性启动子)DNA序列的表达控制序列，根据需要，还可以包含增强子元件、用于转录或多聚腺苷酸化信号[例如来自猿猴病毒-40(SV-40)或牛生长激素]的剪接的内含子序列、或作为CpG模体(基序)而已知的免疫刺激DNA序列中的1个或1个以上的拷贝。
另外，根据需要，表达载体可以包含例如细菌复制起点序列、或用于选择的抗生素耐性(例如卡那霉素等)基因或非抗生素耐性基因(例如β－半乳糖苷酶基因等)等选择性标志物。
已知具有非甲基化CpG核苷酸的寡核苷酸会激活免疫系统(A. Krieg等人,Nature, 1995, 374, 546-549)。取决于侧翼序列，一些CpG模体对B细胞或T细胞应答更具有免疫刺激性，优先地刺激某种。DNA表达载体中的CpG模体的拷贝作为诱发针对表达蛋白的免疫应答的佐剂而作用。CpG模体、即包含特异化的序列内的CpG二核苷酸的DNA伸长部，其长度可以从5～40碱基对左右中选择。多个CpG模体可以被插入表达载体的非编码区。当需要体液应答时，优选的CpG模体是已知刺激CD8+T细胞应答的刺激细胞因子分泌的CpG模体。
作为可以适应本发明的鱼类，只要是具有感染P. damselae subsp. piscicida的可能性的鱼类，则没有特别限定，例如可以列举：属于鲈形目的鱼种(青甘鱼、红甘鲹、黑鲷、真鲷、赤点石斑鱼等)、属于胡瓜鱼目的鱼种(香鱼等)或属于鲀形目的鱼种(绿鳍马面鲀等)等。
DNA疫苗的接种方法例如可以列举口服给药、肌肉内注射、腹腔内注射、使用基因枪的给药和液浸，但优选为肌肉内注射、使用基因枪的给药。使用基因枪的给药是指，将质粒包覆在1μm左右大小的金颗粒中，使用高压氦气，再通过专用器具按照空气枪的要领将其击入被检体的皮肤、细胞或组织中的方法。该基因枪给药具有以下优异的特征：与肌肉内注射相比，以100～1000分之一的DNA量可以得到同等的免疫效果；以及与肌肉内注射相比，重现性优异等。
另外，佐剂是刺激免疫系统以提高对抗原的免疫反应的物质，主要是作为辅剂添加在疫苗中。作为代表性的佐剂，例如已知有铝化合物、多聚核苷酸或细菌的菌体成分等，但其中在应用于本发明时无法得到充分的效果的佐剂也较多。特别是，佐剂的作用对抗原物质广泛有效，因此还具有增强抗原中所含的杂质的抗原刺激性、或者产生有害的副作用的危险，存在着需要充分关注所使用的抗原纯度等问题。其中，据报道，例如IL-1β作为佐剂有效(J. Y. Scheerlinck, Genetic adjuvants for DNA Vaccine, 19, 2647-2656,2001)。在本发明中，可以制作以能够在鱼类(例如比目鱼等)体内表达的方式插入有IL-1β基因的质粒，和本发明的疫苗一起接种给鱼类。
免疫机制是在担当各种作用的细胞相互进行功能调节的同时，发挥各种生理功能。可以以作为在生物体保护中发挥重要作用的因子的T细胞和B细胞的细胞表面上存在的T细胞抗原受体(TCR)、主要组织相容性复合体(MHC)或免疫球蛋白(Ig)的表达量为指标，研究免疫系统的活化。在本发明中，例如，在对比目鱼接种对抗类结节病的DNA疫苗后，为了对鱼体内的生物体保护机制的活化进行分析，例如可以就TCR、MHC和Ig的表达量的变化进行实时PCR，进行定量性地确认，以研究免疫系统的活化。
实时PCR是指，利用荧光检测装置实时追踪PCR的基因扩增过程，剖析该PCR反应曲线的检测技术。当检查对象的检体通过PCR扩增时，如果检查达到指数增加曲线的PCR循环数，则可以计算正确的DNA量。在实时PCR中，例如可以使用Perkin-Elmer公司制造的TaqMan、BioRad公司制造的iCycler来进行。
在实时PCR中使用实时PCR用(SG)和标准DNA用(SG200)的两种引物。实时PCR用(SG)设计成扩增子短(60～100bp)且GC含量变少。若在3’UTR部分制作引物，则比较容易、且可以正确地设计基因特异性引物。另外，还有利用软件(例如primer express；PEBiosystems Japan株式会社)在计算机上进行设计的方法。在通过实时PCR设计的引物的外侧设计标准DNA用引物(SG200)。想要将基因彼此进行比较时，优选扩增子对齐。
调制标准DNA时，首先，对要测定的基因使用各自的特异性引物(SG200)，使总量50μL的PCR反应直至达到平稳状态(在PCR中，在95℃下处理2分钟后，接着进行30次以95℃下30秒、55℃下30秒、72℃下1分钟为1个循环的处理)。之后，使用柱(例如Microcon-PCRCentrifugal Filter Devices；MILLIPORE公司制造)从PCR产物中除去多余的引物，测定浓度。由阿伏加德罗常数(1mol=6.022×1023分子)算出拷贝数。接着，制作PCR产物的21个阶段的稀释系列(拷贝数1013～10-7)，使用设计在内侧的引物(SG)再次进行PCR。此时，以循环数为14个循环进行反应，使发生指数函数性扩增。将如此操作而得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，从完全看不到条带起的5个阶段为指数函数性扩增，因此以这5个阶段作为标准DNA，在实际的实时PCR中使用。
实施例
以下，通过实施例来具体地详述本发明，但本发明并不限于这些实施例。
《实施例1：来自P. damselae subsp. Piscicida的ppa1基因、ppa2基因和ppars1基因的分离》
(1) PCR引物的制作
按照常规方法，由来自P. damselae subsp. Piscicida的ppa1基因(SEQ ID NO:1)、ppa2基因(SEQ ID NO: 3)和ppars1基因(SEQ ID NO: 5)所对应的DNA的核苷酸序列制作下述PCR引物。
ppa1-正向= 5’CGGAATTCACCATGAATCGTAAAGTAACTA 3’(SEQ ID NO: 13)；
ppa1-反向= 5’CCGCTCGAGCTTAGTGTAAGAACCAC 3’(SEQ ID NO: 14)；
ppa2-正向= 5’CGGAATTCACCATGAGAAAACCTCTGCTTG 3’(SEQ ID NO: 15)；
ppa2-反向= 5’CCGCTCGAGACGCATGATTAAATACA 3’(SEQ ID NO: 16)；
ppars1-反向= 5’CGGAATTCACCATGTCTAAAGTTCGTTATG 3’(SEQ ID NO: 17)；
ppars1-反向= 5’CCGCTCGAGTTCAGCAAGAACTTGAG 3’(SEQ ID NO: 18)。
(2) DNA疫苗的制作
将P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株接种在2%食盐调制的HI液体培养基中，在25℃下振荡培养一夜。将其集菌，在提取用溶剂(0.5%的SDS、0.016mg/mL的蛋白酶K)中溶解，之后在37℃下处理1小时。接下来，加入100μL 5mol/L的NaCl和84μLCTAB/NaCl，充分混和，在65℃下处理10分钟。将其依次用等量的异丙醇-氯仿、600μL PCI、99%的乙醇进行纯化，舍去上层，使形成了沉淀物(Pellet)状态的基因组DNA干燥，再溶解于30μL TE缓冲液中。
以提取的基因组DNA为模板，利用市售的PCR反应试剂(ExTaq DNA聚合酶；宝酒造公司制造)，按照附录的操作方法，使用实施例1(1)中制作的PCR引物，按照常规方法进行PCR。PCR在下述反应条件下进行：用附带的5μL 10x缓冲液、4μL dNTP、1μL (25pmol/μL)的正向引物和反向引物、0.5μL 5单位/μL的DNA聚合酶、1μL (10ng)的DNA和37.5μL灭菌水调制成50μL后，在95℃下处理5分钟后，接着进行30次以95℃下30秒、53℃下30秒和72℃下1分钟为1个循环的处理，之后在72℃下处理5分钟。将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果通过目视确认到约0.2、1.4或1.0kbp左右的DNA片段被扩增。
(3) DNA核苷酸序列的分析
将该经扩增的DNA片段插入pGEM-T Eazy载体(Promega公司制造)中，使用荧光标记的M13引物(日清纺绩公司制造)和市售的测序试剂盒(Thermo Sequence FluorescentLabeled Primer Cycle Sequencing Kit with 7-deaza-dGTP；amersham pharmaciabitech公司制造)，按照双脱氧法(Dideoxy method)制成样品后，使用DNA测序仪(DNAsequencer model 4000型；LI-COR公司制造)确定核苷酸序列。分析该序列时，经PCR扩增的DNA片段中存在由249bp(ppa1)、1356bp(ppa2)或996bp(ppars1)构成的可读框(ORF)(SEQID NO: 1、3和5)。由该ORF预测的蛋白是89个氨基酸残基、462个氨基酸残基以及341个氨基酸残基。
《实施例2：根据比目鱼的密码子使用频率进行了修饰的ppa1基因、ppa2基因和ppars1基因的制作》
(1) 使用修饰序列的人工基因的制作
不论何种生物种中都存在多个指定氨基酸的密码子，其使用频率不同。因此，人工合成根据P. damselae subsp. Piscicida和比目鱼的密码子使用频率修饰了核苷酸序列的ppa1基因(SEQ ID NO: 7)、ppa2基因(SEQ ID NO: 9)和ppars1基因(SEQ ID NO: 11)，将其插入质粒中。
《实施例3：质粒wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2和opt-ppars1的制作》
用EcoRI和XhoI处理实施例1(3)和实施例2(1)的DNA核苷酸序列分析中使用的质粒。然后，将从各载体中切出的来自P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株或人工基因的ppa1基因、ppa2基因和ppars1基因插入位于pcDNA3.1/myc-his载体(Invitrogen公司制造)的编码来自人巨细胞病毒的启动子区的序列下游的多克隆位点的EcoRI和XhoI识别位点，制作了质粒wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2和opt-ppars1。
《实施例4：向比目鱼中导入质粒DNA》
对于每1条比目鱼，使用带有29G注射针的注射器，向肌肉内同时接种10.0μg的wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2、opt-ppars1和100μL磷酸缓冲生理盐水(PBS)。
《实施例5：针对比目鱼的感染保护试验》
各试验区使用比目鱼稚鱼(全长约8cm、鱼平均体重为10.0g)。将试验鱼在60L的水槽中循环人工海水进行饲养，在平均水温19.0℃下饲养。
首先，按照实施例4的方法，对比目鱼分别接种10.0μg的wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2和opt-ppars1、100μL作为对照的PBS、10.0μg的pcDNA3.1载体。在该接种30天后，将在与实施例1(2)的条件同样地调制成2%食盐浓度的HI液体培养基中培养的P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株的培养液用人工海水稀释至1.0×105cfu/mL，在该浓度下浸渍感染30分钟。进行感染保护试验的分区如下。
试验区1：10.0μg wild-ppa1/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区2：10.0μg wild-ppa2/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区3：10.0μg wild-ppars1/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区4：10.0μg opt-ppa1/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区5：10.0μg opt-ppa2/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区6：10.0μg opt-ppars1/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区7：10.0μg pcDNA3.1/myc-his载体/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株；
试验区8：100μL PBS/1条比目鱼+1.0×105cfu/mL P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株。
在P. damselae subsp. Piscicida TUMSAT-PPE05-02株感染后，继续观察比目鱼14天，算出试验区1～试验区8的比目鱼的累积死亡率(死亡个体数／试验个体数)×100(%)，其结果见图1、2、3、4以及表1。需要说明的是，表中的“RPS”是相对存活百分率的简写，通过以下的算式算出：
RPS＝{1－(X／C)}×100
[式中，记号X表示“疫苗接种区的死亡率(%)”，C表示“阴性对照区的死亡率(%)”]
疫苗的效果通过该比较来判定。
其结果，试验区1、2、3、4、5和6分别是约17%、8%、58%、8%、17%和15%的累积死亡率，相对于此，试验区7和8的累积死亡率是75%和90%，由此明确了：wild-ppa1、wild-ppa2、wild-ppars1、opt-ppa1、opt-ppa2和opt-ppars1对于P. damselae subsp. PiscicidaTUMSAT-PPE05-02株的感染保护的有效性、即疫苗效果。
[表1]
产业实用性
本发明的DNA疫苗可适用于海产鱼的类结节病的预防或治疗用途。
以上，按照特定方式对本发明进行了说明，但本领域技术人员所自明的变形或改良也包含在本发明的范围内。
序列表自由文本
以下的序列表的数字标题＜223＞中记载着“人工序列”的说明。具体而言，SEQ IDNO: 7、9、11所表示的核苷酸序列是来自P. damselae subsp. piscicida的修饰序列。SEQID NO: 13所表示的核苷酸序列是ppa1-正向引物，SEQ ID NO: 14所表示的核苷酸序列是ppa1-反向引物，SEQ ID NO: 15所表示的核苷酸序列是ppa2-正向引物，SEQ ID NO: 16所表示的核苷酸序列是ppa2-反向引物，SEQ ID NO: 17所表示的核苷酸序列是ppars1-正向引物，SEQ ID NO: 18所表示的核苷酸序列是ppars1-反向引物。

Claims (4)

1.由SEQ ID NO: 7所表示的核苷酸序列构成的DNA、或包含上述DNA的表达载体在用于制备针对鱼类感染美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacterium damselae subsp. piscicida)的预防或治疗的鱼类用DNA疫苗的应用。
2.权利要求1所述的应用，其中，上述表达载体为包含修饰脂蛋白基因的质粒。
3.权利要求1或2所述的应用，其中，上述鱼类用DNA疫苗用于类结节病的预防或治疗。
4.权利要求3所述的应用，其中，上述鱼为属于鲈形目、鲀形目或胡瓜鱼目的鱼。
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