CN104729947A - 一种牛奶蛋白的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于畜产品检测领域，具体涉及一种牛奶蛋白的检测方法。建立对比值(沉淀质量：牛奶体积)法检测牛奶蛋白含量的方法，发现影响牛奶蛋白含量的测定方法包括牛奶的静置时间、离心时间、离心转速、冰乙酸浓度等因素，获得了沉淀牛奶蛋白的最佳参数，即静置9min、离心7min、离心12000r/min、冰乙酸浓度为0.3mol/L。对牛奶蛋白含量与比值的相关性数据进行偏最小二乘法分析，获得牛奶蛋白含量X与比值Y的回归线性方程：Y＝0.0645X+0.0581，R²＝9896，在2.0-4.0g/100mL范围内时，牛奶蛋白含量X与比值Y之间存在较强的线性相关。本发明可用于辅助测定鉴别牛奶中是否存在掺假铵盐。

Description

一种牛奶蛋白的检测方法

技术领域

本发明属于畜产品质量检测技术领域，具体涉及一种牛奶蛋白的检测方法。

背景技术

蛋白质是牛奶的主要成分之一，也是牛奶检测中最重要的质量指标之一。目前，国内外关于牛奶蛋白检测方法的报道很多，主要有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin酚法、考马斯亮蓝法、毛细管电泳法、ELISA法、高效液相色谱法、近红外光谱法等方法^[1-9]。其中，凯氏定氮法是国家标准和国际标准中首推的蛋白质检测方法，但是该方法操作复杂，耗时长，并且需要浓酸浓碱，操作危险并且会产生有害气体。此外，凯氏定氮法无法区别无机氮和有机氮，一些不法分子利用这一缺陷往牛奶中添加铵盐类。其他一些方法虽然在某些方面具有明显优势，但也或多或少存在不足之处，如双缩脲法检测速度快，但是灵敏度较差；考马斯亮蓝法用于不同样品时容易出现偏差；毛细管法蛋白质容易黏附在毛细管上；HPLC法、近红外光谱法的仪器和耗材昂贵，并且需要专门的技术人员操作。

牛奶的蛋白质含量大约为3.0％左右，其乳清蛋白的含量为14％～24％，酪蛋白的含量为76％～86％，对同一品种奶牛来说，其组分含量变化相对较小。因此，牛奶当中酪蛋白含量的多与少，也代表牛奶中蛋白含量的多与少。近年来，关于酪蛋白的研究报道已经很多，在science direct上有89896篇关于casein的文献，在知网上也有13590篇关于酪蛋白的文献。这些文献主要涉及酪蛋白的分离、鉴定、组成、结构、功能、改性及检测等方面的研究，并且也有学者通过测定牛奶酪蛋白含量来鉴别牛奶掺假^[2,10,11]。但是，还未见有通过建立牛奶蛋白与酪蛋白沉淀质量之间相关关系的回归数学模型，然后利用回归数学模型来测定牛奶蛋白含量以及鉴别掺假的文献报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的缺陷与不足，提供一种基于酪蛋白特性的牛奶蛋白的检测方法，本发明是根据酪蛋白沉淀质量与酪蛋白含量密切相关、酪蛋白含量又与牛奶蛋白含量密切相关，那么酪蛋白沉淀质量与牛奶蛋白含量也应该密切相关这一原理来测定牛奶蛋白。本发明优化了酪蛋白的沉淀条件，分析了牛奶蛋白与酪蛋白沉淀之间的相关关系、建立牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值之间的回归数学模型，利用获得的回归模型计算牛奶蛋白含量等，本发明能准确检测牛奶蛋白含量，并能协助鉴别牛奶铵盐掺假，与传统方法相比，本发明的方法简单、快捷、经济、实用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种牛奶蛋白的快速检测方法，包括以下步骤：

1)建立牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值之间的回归数学模型；

2)向待测牛奶样品加冰乙酸溶液；

3)震荡并静置一段时间；

4)离心分离、倒掉上清液、甩干离心管并用滤纸擦拭离心管口；

5)准确称重、并计算酪蛋白沉淀的比值；

6)根据步骤1)的回归模型，计算牛奶样品中蛋白含量；

上述步骤2)中，取样牛奶体积与加冰乙酸溶液体积比为2：1，沉淀酪蛋白的冰乙酸浓度为0.3mol/L。

上述步骤3)中，加冰乙酸后，静置时间为9min。

上述步骤4)中，离心速度为12000r/min；离心时间为7min。

上述步骤1)中，所述的牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值的回归数学模型的建立方法如下：

①以蒸馏水、纯牛奶、全脂奶粉为原料，分别配制蛋白含量为2.0g/100mL、2.2g/100mL、2.4g/100mL、2.6g/100mL、2.8g/100mL、3.0g/100mL、3.2g/100mL、3.4g/100mL、3.6g/100mL、3.8g/100mL、4.0g/100mL的液态奶样品，同时采用凯氏定氮法测定每个样品蛋白的真实含量，每个处理重复3次；

②按照上述步骤2)-4)，测定上述样品的酪蛋白沉淀的比值；

③采用Origin 8.0进行偏最小二乘法(PLS)数据分析，获得了牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值的回归数学模型，其公式如下：

Y＝0.0645X+0.0581，R²＝9896，

式中：

Y：为酪蛋白沉淀的比值，即：酪蛋白沉淀质量：牛奶体积比，以g/ml计；X：为牛奶蛋白含量，以g/100mL计。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明检测效率高，从准备样品，到获得检测结果不超过30分钟，而传统测定方法大都在4、5个小时以上。

2、本发明成本低。较传统的牛奶蛋白检测方法(凯氏定氮法、双缩脲法、近红外光光谱法、ELISA法等)相比，本发明方法使用试剂很少，仅需要使用少许冰乙酸。而传统方法不仅需要昂贵的仪器设备和标准试剂，而且需要使用许多其他分析试剂。

3、本发明操作简单，本发明简单易学，使用的仪器仅有电子天平和离心机。

4、本发明操作安全、无有毒有害物质排放，由于试验中仅使用低浓度的冰乙酸，未使用强酸强碱物质或其他化学试剂，因此测定过程较为安全，并且无有毒有害物质排放。

5、本发明的检测方法精确度和准确度较高，并且还具有辅助鉴别铵盐掺假的能力。

附图说明

图1：是本发明实施例中静置时间对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响。

图2：是本发明实施例中离心速度对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响。

图3：是本发明实施例中离心时间对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响。

图4：是本发明实施例中浓度的酸对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响。

图5：是本发明实施例中牛奶蛋白含量与比值(沉淀质量：牛奶体积)的相关性。

具体实施方式

实施例1

1.材料与方法

1.1试验材料

从新疆阿拉尔市市场上，购买市售牛奶样品12个，其中9个样品为乳品企业加工后的液态纯牛奶，2个样品为市售原料鲜奶，1个为乳品企业加工后的全脂奶粉。

分析纯试剂：冰乙酸、浓硫酸、氢氧化钠、硼酸、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、柠檬酸二铵、醋酸铵、尿素、过硫酸铵等。

1.2仪器设备

试验用的仪器设备如下：TGL-16C离心机(上海安亭科学仪器厂)；JA5003N电子天平：(上海箐海仪器有限公司)；KDY-9830凯氏定氮仪：(北京市通润源机电技术有限责任公司)；UL20AL乳成份快速分析仪(杭州浙大优创科技有限公司)。

1.3试验方法

为了验证本发明方法的正确性和有效性，本发明进行了下述平行检测方法的比较测试。

1.3.1牛奶蛋白质测定方法

采用凯氏定氮法：参考食品安全国家标准食品中蛋白质的测定(标准号GB5009.5-2010)(下载网址http://www.glzy8.com/show/529610.html)。

取7ml牛奶至于消化管中，然后加0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20ml浓硫酸，再在微波消解仪上消化，消解完成后，用蒸馏水定容至100ml；移取10ml消化液至蒸馏管，加40％氢氧化钠溶液3s，2％硼酸收集，蒸馏5min，然后以0.05mol/L的盐酸标准溶液滴定，蛋白系数F按6.38计算。

乳成分快速检测仪测定：参考仪器的使用说明书操作。

1.3.2比值(沉淀质量：牛奶体积)的测定方法

取干燥的5ml离心管，准确称取离心管质量m₁，加入3ml牛奶和1.5ml一定浓度(如后所示)的冰乙酸，震荡、静置一段(如后所示)时间，然后在一定条件下离心(如后所示)，倒掉上清液，擦拭管口水珠后，称取离心管质量m₂，然后计算比值。

1.3.3数据分析

试验数据的方差分析和PLS分析均采用Oringin8.0进行分析，每个试验处理均设置3次及以上重复。

2.结果与分析

2.1静置时间对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响

向牛奶中加冰乙酸溶液后，迅速震荡，分别静置1、3、5、7、9、11、13min后，在9000r/min的转速下离心10.0min，倒掉上清液，并用滤纸擦拭管口残留水珠，最后称取质量并计算比值，每个处理重复3次。结果见图1。

从图1可以看出，静置时间对比值存在显著的影响，随着静置时间的延长，比值逐渐增加，但是当静置时间超过9min后，静置时间对比值的影响不显著。因此，为了获得较好的酪蛋白沉淀，应至少静置9min。

2.2离心速度对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响

向牛奶中加冰乙酸溶液后，迅速震荡，静置9min后，分别在2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000r/min的转速下离心10.0min，倒掉上清液，并用滤纸擦拭管口残留水珠，最后称取质量并计算比值，每个处理重复3次。结果见图2。

由图2可以看出，随着离心速度的增加，沉淀质量与牛奶体积的比值逐渐降低。当离心速度≤5000r/min的情况下，几乎没有沉淀产生，不能形成湿固态的沉淀；而当离心速度＞5000r/min的情况下，随着离心速度增加，形成的湿固态沉淀的结构越来越致密，与试管黏附的能力越来越强。因此，为了获得较好的酪蛋白沉淀，离心速度以12000r/min为宜。

2.3离心时间对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响

向牛奶中加冰乙酸溶液后，迅速震荡，静置9min后，在12000r/min的转速下分别离心3.0、5.0、7.0、9.0、11.0min，倒掉上清液，并用滤纸擦拭管口残留水珠，最后称取质量并计算比值，每个处理重复3次。结果见图3。

从图3来可以看出，随着离心时间的延长，沉淀质量与牛奶体积的比值逐渐降低，当离心时间超过7min后，比值变化越来越小。因此，为了获得较好的酪蛋白沉淀，离心时间选择7min左右为宜。

2.4酸浓度对比值(沉淀质量：牛奶体积)的影响

分别配制0.01、0.05、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、1.10、1.30、1.50、1.70、1.90、2.10、2.30mol/L浓度的冰乙酸，取3ml牛奶加1.5ml不同浓度的冰乙酸，迅速震荡后，静置9min，然后在12000r/min的速度下离心7min，倒掉上清液，并用滤纸擦拭管口残留水珠，最后称取质量并计算比值，每个处理重复3次。结果见图4。

由图4可以看出，当冰乙酸的浓度小于0.10mol/L时，无沉淀产生，其原因可能是冰乙酸浓度过低，不足以使牛奶中酪蛋白变性沉淀；当冰乙酸的浓度在0.10-0.30mol/L范围内时，随着冰乙酸浓度的增加，沉淀质量与牛奶体积的比值也逐渐降低，并且沉淀于离心管的黏附力也逐渐增强；当冰乙酸的浓度在0.30-2.10mol/L范围内时，随着冰乙酸的浓度增加，沉淀质量与牛奶体积的比值也逐渐增加，同时沉淀于离心管黏附力也逐渐降低，此外，当冰乙酸的浓度超过1.30mol/L后，离心液开始变浑浊；当冰乙酸的浓度超过2.1mol/L后，离心后管内液体十分浑浊，并且无沉淀产生。因此，为了获得较好的酪蛋白沉淀，沉淀牛奶蛋白应选择0.30mol/L冰乙酸为宜。

2.5牛奶蛋白含量与比值(沉淀质量：牛奶体积)的相关性比较

以蒸馏水、纯牛奶、全脂奶粉为原料，分别配置蛋白含量近似为2.0g/100mL、2.2g/100mL、2.4g/100mL、2.6g/100mL、2.8g/100mL、3.0g/100mL、3.2g/100mL、3.4g/100mL、3.6g/100mL、3.8g/100mL、4.0g/100mL的牛奶样品，同时采用凯氏定氮法测定样品蛋白真实含量，并用酪蛋白沉淀法测定比值(沉淀质量：牛奶体积)，每个处理重复3次。然后对牛奶蛋白含量与比值(沉淀质量：牛奶体积)进行PLS分析。结果见图5。

由图5可以看出，无论是0.3mol/L的冰乙酸还是0.1、0.5、0.7mo/L冰乙酸处理获得的结果，都呈现出明显的正相关。通过对试验数据进行PLS分析，四个浓度的冰乙酸处理均获得了一个回归方程，并发现回归方程的决定系数R² _0.3＝0.9896＞R² _0.1＝0.9687＞R² _0.5＝0.9666＞R² _0.7＝0.9421。这说明在牛奶蛋白含量在2.0g-4.0g/100mL范围内时，通过加冰乙酸处理，离心获得沉淀，沉淀质量与牛奶体积的比值与牛奶蛋白含量之间存在明显的线性关系，并且0.3mol/L的冰乙酸处理获得的回归模型最好，这与2.4的结果极为相似。

在0.3mol/L的冰乙酸处理获得的回归模型:Y＝0.0645X+0.0581，R²＝9896，(其中Y为比值g/ml(沉淀质量：牛奶体积)，X为牛奶蛋白含量g/100mL)，该回归模型说明沉淀质量与牛奶体积比值Y的变异中，有98.96％可以由可控制的牛奶蛋白含量X来解释。因此，在理论上，可以用该方法进行牛奶蛋白含量的测定

2.6本发明方法的精确性试验

每支离心管中加3ml牛奶和1.5ml 0.30mol/L的冰乙酸，摇匀，静置9min后，在12000r/min的转速下分别离心7.0，倒掉上清液，并用滤纸擦拭管口残留水珠，称取质量并计算比值，代入回归方程计算牛奶蛋白含量，每个样品重复测定4次，结果见表1。

表1精确性试验结果(g/100mL)

#：J、K是鲜奶，为奶农销售的原料乳，未经均质加工处理；

*：L是某品牌全脂奶粉，先用蒸馏水溶解配制成复原乳后，再进行测定的。

通过数据分析，获得了12个样品的标准差，并计算出12个样品测定结果的相对标准偏差RSD波动范围在0.562-7.144％，12个样品的平均相对标准偏差RSD＝2.659％＜5％，其中K#和J#样品为鲜奶，离心液上层悬浮物较多，对测定结果相对误差的影响较大。试验结果表明该方法测定牛奶蛋白的重现性较好。

2.7本发明方法的准确性试验

对12个牛奶样品分别用凯氏定氮法、乳成分快速检测仪发和沉淀法进行蛋白质测定，每个处理重复4次，结果见表2。

表2准确性试验结果(g/100mL)

#：J、K是鲜奶，为奶农销售的原料乳，未经均质加工处理；

*：L是某品牌全脂奶粉，先用蒸馏水溶解配制成复原乳后，再进行测定的。

通过对表1的数据方差分析，凯氏定氮法和乳成分快速检测仪测定结果之间无显著差异(P≥0.05)，但均显著高于沉淀法测定的结果(P≤0.01)，从数据中发现，三种方法中，大部分样品的三种方法测定的结果之间的差异不显著(≥0.05)，但在两个鲜奶样品中，结果之间存在显著差异(P≤0.01)。究其原因可能是，鲜奶是未经加工过的原料乳，鲜奶乳脂肪球的直径比均质后的牛奶的乳脂肪直径大得多，鲜奶乳脂肪球易浮于离心液上部，导致沉淀质量减小，从而导致测定结果偏低。这说明本发明方法适合于均质后的牛奶样品中的蛋白质测定，如果是原料乳或均质后放置时间较长的牛奶要用该方法测定，正确的方法是应该先均质处理后，再进行测定。

2.8铵盐掺假对本发明方法测定结果的影响

以纯牛奶A为原料，模拟蛋白质掺假增加1％的比例计算，分别将尿素、醋酸铵、过硫酸铵和柠檬酸二铵等铵盐原料加入样品中，然后分别采用三种方法测定蛋白含量，每个处理重复4次。结果见表3所示。

表3铵盐掺假对本发明方法测定结果的影响

由表2可以看出，当加入铵盐后，凯氏定氮法测定结果稳定，将加入的铵盐作为蛋白质氮计算，导致检测结果均增加了1％；快速检测仪测定结果显著低于凯氏定氮法(P≤0.01)，但是结果均比为添加铵盐样品的值高；而本发明的沉淀法获得的结果均显著低于其他两种方法测定的结果(P≤0.01)，其中添加过硫酸铵的样品显著高于其他样品，可能是由于过硫酸铵是强酸弱碱盐，降低了牛奶pH，导致沉淀疏松，吸附水的量增加，从而增加了沉淀质量，并且其上清液浑浊，与高浓度冰乙酸处理结果相似。至于加入醋酸铵后，沉淀法测出结果偏低，其原因还不清楚，有待于进一步探讨。但从以上结果来看，本发明的方法在鉴别牛奶铵盐掺假方面明显优于凯氏定氮法和快速蛋白检测仪的测定结果。

通过对影响静置时间、离心时间、离心转速、酸浓度因素等的研究，获得了沉淀牛奶蛋白的最佳条件，即：加酸后静置9min、离心7min、离心转速12000r/min、冰乙酸浓度为0.3mol/L，在该条件下获得的沉淀效果最佳，即沉淀质量最小，结果最稳定。同时，湿固态沉淀与离心管黏附的强度最大。

本发明在上述条件下，对牛奶蛋白含量与比值(沉淀质量：牛奶体积)的相关性也进行了相关研究，对数据的PLS法分析，也证实了0.3mol/L冰乙酸处理效果最佳，并获得了牛奶蛋白含量X与比值Y的回归线性方程为：Y＝0.0645X+0.0581，R²＝9896，说明在牛奶蛋白含量在2.0-4.0g/100mL范围内时，牛奶蛋白含量X与比值Y之间存在较强的线性相关。理论上讲，可以利用这一模型进行牛奶蛋白的测定。

在对12个牛奶样品的蛋白含量分析时，发现本发明的沉淀法与凯氏定氮法、乳成分快速检测仪检测的大部分样品的结果无显著性差异(P≥0.05)。但是两个鲜奶的结果差异显著，由于鲜奶未经过均质加工，乳脂肪球直径大，离心时未能与酪蛋白一起形成湿固态沉淀，导致分析结果偏低。这也说明该方法有望成为一种快速测定牛奶蛋白含量的方法，但是主要适用于均值加工后的液态奶或复原乳。如果要用于原料乳的分析，应先将原料乳均值后再分析。

此外，在对添加铵盐后的牛奶样品分析中，发现快速检测仪测定结果显著低于凯氏定氮法(P≤0.01)，但是结果均比未添加铵盐样品的值高；而酪蛋白沉淀法获得的结果均显著低于其他两种方法测定的结果(P≤0.01)。在酪蛋白沉淀法中，添加过硫酸铵的样品的结果显著高于其他样品(P≤0.01)，可能是由于过硫酸铵是强酸弱碱盐，降低了牛奶pH，与高浓度冰乙酸处理结果相似，离心液也出现浑浊。至于加入醋酸铵后，沉淀法测出结果偏低，其原因还不清楚，有待于进一步探讨。这也说明，本发明的方法不但可以测定牛奶蛋白含量，还可以作为牛奶铵盐掺假鉴别的辅助方法推广应用。

从试验结果来看，利用牛奶蛋白与酪蛋白沉淀之间的回归模型来间接测定牛奶蛋白含量具有很好的效果，并且具有经济、快速、简便、安全等优点。

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Claims (8)

1.一种牛奶蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)以均质后的液态奶或复原液态奶为待测牛奶样品；

2)建立牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值之间的回归数学模型；

3)向待测牛奶样品中加冰乙酸溶液；

4)震荡并静置；

5)离心分离，倒掉上清液，甩干离心管并用滤纸擦拭离心管口；

6)准确称重、并计算酪蛋白沉淀的比值；

7)将步骤6)的酪蛋白沉淀的比值代入步骤2)所示的回归模型，计算牛奶样品中的蛋白含量。

2.根据权利要求1所述的牛奶蛋白检测方法，其特征在于，步骤2)中所述酪蛋白沉淀为一种包含酪蛋白的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的牛奶蛋白检测方法，其特征在于，步骤3)中取样牛奶体积与加冰乙酸溶液体积比为2：1。

4.根据权利要求1或2或3所述的牛奶蛋白检测方法，其特征在于，沉淀酪蛋白的冰乙酸浓度为0.3mol/L。

5.根据权利要求1-4任一项所述的牛奶蛋白测定方法，其特征在于，加冰乙酸后，静置时间为9min。

6.根据权利要求1所述的牛奶蛋白检测方法，其特征在于，步骤5)中的离心速度为12000r/min；离心时间为7min。

7.根权利要求1所述的牛奶蛋白检测方法，其特征在于,步骤2)中牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值的回归数学模型的建立方法如下：

1)以蒸馏水、纯牛奶、全脂奶粉为原料，分别配制蛋白含量为2.0g/100mL、2.2g/100mL、2.4g/100mL、2.6g/100mL、2.8g/100mL、3.0g/100mL、3.2g/100mL、3.4g/100mL、3.6g/100mL、3.8g/100mL和4.0g/100mL的液态奶样品，同时采用凯氏定氮法测定每个样品蛋白的真实含量，每个处理重复3次；

2)按照权利要求1所述的步骤2)至6)，测定上述样品的酪蛋白沉淀比值；

3)采用Origin 8.0进行偏最小二乘法(PLS)数据分析，获得牛奶蛋白与酪蛋白沉淀的比值的回归数学模型，公式如下：

Y＝0.0645X+0.0581，R²＝9896，

式中：

Y：为酪蛋白沉淀的比值，即：酪蛋白沉淀质量：牛奶体积比，以g/ml计；X：为牛奶蛋白含量，以g/100mL计。

8.根据权利要求1-7任一项所述的牛奶蛋白检测方法，其特征在于，牛奶样品中蛋白含量的检测范围为2.0-4.0g/100mL。