CN104694649A

CN104694649A - 一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件

Info

Publication number: CN104694649A
Application number: CN201510104527.3A
Authority: CN
Inventors: 赵清; 俞大鹏; 唐智鹏; 鲁铂
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2015-03-10
Filing date: 2015-03-10
Publication date: 2015-06-10

Abstract

本发明公开了一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件。其步骤如下：将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，纳米孔测序装置包括：设有正极和负极的电解池以及分隔电解池正极和负极的覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜；将核酸分子置于电解池的负极腔室；测定时，在正极和负极间施加电压，作为核酸分子穿孔的驱动电场。纳米孔器件由固态纳米孔薄膜及其覆盖其上的琼脂糖凝胶层组成。本发明不影响测量信号信噪比，有效的减慢了核酸分子在纳米孔中的运动速度，提高时间分辨率；保持高的测量信号信噪比，解决以牺牲信噪比使DNA减速的问题，为利用固态纳米孔实现精确的DNA测序奠定了基础；方法简单，易于操作。

Description

一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件

技术领域

本发明涉及一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件，属于材料测试领域。

背景技术

基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，除哈佛大学、波士顿大学、布朗大学、加州理工学院、荷兰代尔夫特工业大学等研究小组外，IBM公司也在2009年10月宣布加入下一代人类基因组测序‐1000美元计划，以基于纳米孔器件的测序技术为实现方法，使纳米孔的研究由基础研究开始走向应用(D.Branton,et al.Nature Biotechnology26(10),1146(2008)；M.Zwolak and M.Di Ventra,Reviews of Modern Physics 80(1),141(2008).)。通过在溶液中电泳驱动分子穿过一个纳米尺度的孔可以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时，高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链DNA分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，DNA穿孔速度过快，超出了通用仪器的分辨率，从而无法实现对单碱基的差别进行识别。

目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使DNA分子的穿孔时间延长，有效减慢DNA在孔中的运动速度。减慢DNA的穿孔速度，才有可能实现对不同碱基的分辨。美国Boston College的Amit Meller等人通过改变Cis和Trans腔填充的溶液盐浓度，可以在5nm的硅化氮(SiN)纳米孔中，实现DNA分子毫秒量级的穿孔过程(M.Wanunu,W.Morrison,Y.Rabin,A.Y.Grosberg and A.Meller,Nature Nanotechnology,5,160,(2010))。但是他们对产生这种现象的机理解释不清楚，而且他们使用的纳米孔很小，DNA与纳米孔壁之间的相互作用可能会起作用，而这对实验的可控性大打折扣。而且直径很小的纳米孔在实验实现起来非常困难，成功率很低。

美国阿肯色大学的Jiali Li等通过在溶液中加入甘油，可以增加DNA的穿孔时间，但是实验条件要求非常苛刻，对实验技术要求很高(D.Fologea,J.Uplinger,B.Thomas,D.S.McNabb,and J.L.Li,Nano Letters 5,1734(2005))。而且随着甘油的增加，导致溶液粘滞系数增加，DNA穿孔阻滞电流值幅度下降，这样测试的信噪比下降，导致测量误差增大。另外可以通过降低电压，使DNA穿孔速度减慢，但是电压降低导致电流信号降低，信噪比变差，导致测量非常困难。可以看到现有的很多减慢DNA穿孔速度的做法都是在牺牲信噪比的基础上才有可能实现，这样对准确测量信号增加了很大难度，不容易得到准确相关的生物学信息。

发明内容

本发明的目的是提供一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法及其专用的纳米孔器件，本发明在保证了不影响测量信号信噪比的前提下，以琼脂糖凝胶修饰固态纳米孔薄膜作为减速器件，有效减慢了核酸分子在纳米孔中运动的速度，以提高纳米孔器件的时间分辨率。

本发明提供的核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法，包括如下步骤：将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括：设有正极和负极的电解池以及分隔所述电解池正极和负极的一面覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜；将所述核酸分子置于所述电解池的负极腔室；测定时，在正极和负极间施加电压，作为核酸分子穿孔的驱动电场。

上述的方法，所述核酸分子可为DNA、RNA或肽核酸，所述DNA可为单链的DNA或者双链的DNA。

上述的方法，琼脂糖凝胶层的制备方法，包括如下步骤：将琼脂糖凝胶水溶液涂覆于所述固态纳米孔薄膜的一面上，所述琼脂糖凝胶水溶液凝固后即得所述琼脂糖凝胶层；具体过程为将琼脂糖凝胶粉末与去离子水混合加热后冷却，即得到琼脂糖凝胶溶液，通过转移流程，即可实现对所述固态纳米孔薄膜的表面涂覆。

本发明中，所述固态纳米孔薄膜涂覆有所述琼脂糖凝胶层的一面可与电解池的正极或负极相对；优选与电解池的负极相对，即所述琼脂糖凝胶层在负极腔室中。

上述的方法，所述琼脂糖凝胶水溶液的质量百分浓度可为0.5～2％，具体可为1％，所述固态纳米孔薄膜上涂覆的所述琼脂糖凝层的厚度可为10～100μm，具体可为100μm。

上述的方法，所述琼脂糖凝胶层均匀覆盖于所述固态纳米孔薄膜上。

上述的方法，所述固态纳米孔薄膜的纳米孔的直径为10～20nm，具体可为10nm，孔深为20～100nm，具体可为60nm；

测定过程中待测的所述核酸分子在进入所述固态纳米孔薄膜上的纳米孔时同时受到纳米孔外所述琼脂糖凝胶层的网格的减速作用。

上述的方法，所述电压可为100～300mV；

所述电解液的摩尔浓度可为0.1～3.2mol/L，具体可为1.6mol/L，所述电解液可为氯化钾溶液、氯化钠溶液或氯化锂溶液；

所述电解液的pH值可为8～10，具体可为9。

本发明还提供了上述的方法的专用的纳米孔器件，它由固态纳米孔薄膜及其覆盖在所述固态纳米孔薄膜上的琼脂糖凝胶层组成。

上述的纳米孔器件，所述固态纳米孔薄膜的纳米孔的直径可为10～20nm，具体可为10nm，孔深可为20～100nm，具体可为60nm；

所述琼脂糖凝胶层的厚度可为10～100μm，具体可为100μm；

制备所述琼脂糖凝胶层使用的琼脂糖凝胶水溶液的质量百分浓度可为0.5～2％，具体可为1％，所述琼脂糖凝胶以同一厚度均匀的覆盖在所述固态纳米孔薄膜上。

本发明还进一步提供了一种纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法，包括用固态纳米孔薄膜分隔设有正极和负极的电解池；所述固态纳米孔薄膜上覆盖有琼脂糖凝胶层。

本发明中由于琼脂糖凝胶层是由琼脂糖凝胶纤维构成的多孔的三维网格结构，孔道直径平均为200nm(1％质量浓度时)，因此该网格在不影响离子电流信号的前提下，可以对经由该网格进入纳米孔的DNA产生相互作用，从而实现对DNA的减速。而目前报道的纳米孔测序法检测核酸分子只有一个电场驱动，通过降低电场作用来减速DNA，这样做大大降低了测量信噪比，不利于信号测量。凝胶修饰层的引入更是创新性地引入了纳米孔外相互作用作为分子减速的原理，这在之前的报道中是从未有过的。之前利用小孔减速原理是引入纳米孔内相互作用，该方法需要使用的小孔制备极其困难，且可控性不好，同时小孔也极易被DNA堵塞。琼脂糖凝胶作为减速器件的好处是在减慢DNA穿孔速度的同时，保持了很高的测量信噪比，并且可以维持较高的DNA捕捉率，同时我们可以选用直径为10nm左右的纳米孔，有效保证了实验成功率。

本发明使用简单易行的方法，在固态纳米孔薄膜上引入琼脂糖凝胶层作为减速器件，在不降低测量信号信噪比的前提下，使用10nm左右的氮化硅固态纳米孔，有效降低DNA分子穿过纳米孔器件的速度，可以将穿孔速度减慢一个数量级以上；显著提高了现有工作的时间分辨率，为使用固态纳米孔器件进行DNA测序打下坚实的基础。既可以保持高的电流信号信噪比，又可以避免引入由于使用很小的纳米孔(直径小于5nm)带来的DNA分子与纳米孔壁不可控的相互作用问题，并且实验简单易行，重复性和可控性都比现有技术有显著提高。另外，在所探测DNA分子的长度越长时，本发明所使用的方法减速效果越显著，可以很好地适应固态纳米孔测序技术对DNA分子读长的要求，而提高DNA分子的读取长度正是下一代基因测序需要攻克的方向之一；而且此种方法的实验装置简单，可控性，可重复性高，信噪比很高。

本发明具有以下优点：

1、时间分辨率低的问题正是困扰固态纳米孔DNA测序最大的障碍之一，在不影响信噪比的前提下，以琼脂糖凝胶修饰层作为减速器件，有效的减慢了DNA分子在纳米孔中的运动速度，大大提高了时间分辨率。

2、本发明的方法保持了较高的测量信号信噪比，引入琼脂糖凝胶层作为减速器件之后，不需要通过降低电压来使DNA减速，这样信噪比没有受到影响，解决了以牺牲信噪比来使DNA减速的问题。

3、方法简单，易于操作。本发明的方法非常简单，琼脂糖凝胶粉末与去离子水混合加热后冷却，即得到琼脂糖凝胶溶液，通过简单的转移流程，即可实现对固态纳米孔薄膜的表面修饰。这种方法可重复性好，非常利于推广，不需要复杂的电路设计和程序设计，不需要引入复杂的体系和制作工艺，对技术要求不高，实验成功率很高，大大提高了实验效率。

4、本发明能有效降低DNA在纳米孔中运动速度，显著提高纳米孔器件时间分辨率的同时，有效降低了DNA分子在纳米孔中运动的速度涨落，提高了固态纳米孔器件探测DNA分子的时间精确度，为利用固态纳米孔实现精确的DNA测序奠定了良好的基础。

附图说明

图1为本发明中纳米孔测序装置，其中，图1(a)为离子电流测量与纳米孔表面琼脂糖凝胶示意图；图1(b)为在固态纳米孔薄膜表面修饰琼脂糖凝胶的流程图。

图2为本发明实施例1中穿孔电导-穿孔时间分布图，其中，图2(a)为1.6M KCl，48.5kb DNA，分别在没有凝胶修饰(裸孔)与修饰1％浓度琼脂糖凝胶条件下，300mV电压下的穿孔电导-穿孔时间分布图；图2(b)为1.6M KCl，48.5kb DNA，无凝胶修饰(裸孔)与修饰1％浓度琼脂糖凝胶条件下，300mV电压下穿孔时间分布对比图；图2(c)为1.6M KCl，48.5kb DNA，无凝胶修饰(裸孔)与修饰1％浓度琼脂糖凝胶条件下，300mV电压下穿孔事件的典型形貌对比图。

图3为本发明实施例1中穿孔导电测试数据图，其中，图3(a)为1.6M KCl，纳米孔薄膜表面修饰了1％浓度琼脂糖凝胶的条件下，5kb、10kb、48.5kb的DNA分别在电压为100mV、200mV、300mV条件下穿孔电导的统计平均值的图；图3(b)1.6M KCl，纳米孔薄膜表面无修饰(裸孔)和修饰了1％浓度琼脂糖凝胶的条件下，5kb，10kb，48.5kb DNA在电压为200mV条件下穿孔时间的统计对比的图。

图4为本发明实施例1中在1.6M KCl，纳米孔薄膜表面修饰了1％浓度琼脂糖凝胶的条件下，5kb，10kb，48.5kb DNA分别在电压为100mV，200mV，300mV条件下穿孔时间平均值的图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中琼脂糖凝胶粉末购于Sigma Aldrich，CAS:9012-36-6。

实施例1、纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法

1、制备芯片器件

利用透射电子显微镜中高能会聚电子束对器件悬空薄膜进行打孔操作，制备芯片器件。这其中包括了一系列传统半导体加工工艺中涉及的微纳加工工艺，并且还涉及了一系列现代前沿的纳米尺度加工技术。

具体方法如下：首先，将(100)面4英寸硅片，两面分别先后生长2微米的氧化硅，用低压化学气相沉积方法沉积150到200纳米左右的低应力氮化硅。然后制作光刻掩模版，目的是要在4英寸的硅片上做成很多3mm×3mm的小基片周期分布，每个3mm×3mm小基片图形中心有一个直径为584μm的圆形透光区域。为保证后期在4英寸硅片上分离每个3mm×3mm的小基片，保证分离划片时走刀的准确，又使得硅片不会破损成随机小片，在每个小基片图案边界加了一些透光的短划线：透光条的宽度为5μm，长度为20μm。光刻掩模版的具体制作参数为：制版尺寸：5英寸；图形分布范围：Ф100mm圆形分布；晶向条：距离中心49mm，长50mm，宽0.8mm。然后利用光刻和反应离子束刻蚀将Si片一面的二氧化硅和氮化硅按照光刻掩模版的图形刻透，露出Si表面。随后去掉光刻胶，使用KOH各向异性腐蚀，(40％KOH，80℃，6小时)腐蚀硅，腐蚀沿着(111)面进行。腐蚀穿的标准是：小窗格透光后再过腐蚀一段时间。光学显微镜下氧化硅面很平整，没有岛状结构。这样就实现了一面只有二氧化硅和氮化硅的小窗格(20～80μm)悬空膜，下面有硅衬底作支撑。接下来，为了从4英寸的大硅片上分离3mm×3mm小基片，需要进行划片操作。划片时需要在硅片背面贴上一层强力蓝胶做保护，因为在划片过后，撕开蓝胶时容易把悬空膜撕破，所以必须做好防护。办法是：用高温热融蜡把待划硅片和另一保护硅片用高温热融蜡粘在一起。然后把蓝胶粘在保护硅片的背面，放进划片机进行划片，划片深度为200到250微米左右。划片过后，把蓝胶撕下。把热融蜡粘在一起的硅片放在热板上加热，蜡融化，把硅片分开。上面的蜡用丙酮冲洗干净即可。这一步可以保证顺利解理得到大量3mm×3mm小基片。一般来讲，一张4英寸的硅片，可以解理得到800片3mm×3mm小基片。之后将3mm×3mm小基片放入热磷酸160℃加热减薄氮化硅膜厚度，减薄速率为1～5nm每分钟，减薄到70nm或其它需要的厚度，厚度可以通过椭偏仪监控。之后为了降低暴露在溶液中氮化硅膜的面积以减小电容噪声，并且降低氮化硅膜在溶液中破裂的可能，我们使用聚焦离子束(FIB，DB 235,FEI)刻蚀2微米氧化硅，离子束流300pA，大约刻蚀1分钟，可以在氮化硅下面形成一个1～2μm×1～2μm×1.5μm的小窗格，1.5μm是深度。目前我们得到了还剩余500nm厚氧化硅，1～2μm×1～2μm的小窗格。然后使用RCA反应，将剩余的500nm厚氧化硅腐蚀掉，只剩下1～2μm×1～2μm小窗格大小，厚度为70nm的氮化硅悬空膜。其中RCA反应为：NH₃·H₂O：H₂O₂＝1:1:5(v/v)，70℃加热10分钟，去除硅片上的有机污染，也为了下一步BOE腐蚀时更好的浸润；BOE(HF：NH₄F：H₂O＝1:2:3)腐蚀6分钟(腐蚀速率为100nm/min)，可以把剩余的500nm氧化硅去除干净得到悬空的氮化硅膜；HCl：H₂O₂：H₂O＝1:1:5(v/v/v)，70℃，清洗10分钟，去除无机杂质。

2、固态纳米孔薄膜制备

3mm*3mm芯片器件加工好之后，放入透射电子显微镜(FEI Tecnai F30)进行打孔操作，放大倍数调整到520k-890k，束斑大小为1，电子束聚到最小或稍大，5分钟左右，即可得到直径10nm左右、深度为60nm的纳米孔。打孔前后，样品杆要放在等离子体清洗仪中(O₂：Ar＝1:3,v/v)里清洗一分钟，去除有机污染，即制得固态纳米孔薄膜。储存在真空干燥箱里备用。

3、覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜的制备

图1(b)所示的流程制备，按质量比1：100将琼脂糖凝胶粉末与去离子水混合均匀，配成质量百分浓度为1％的琼脂糖凝胶溶液，置于烧杯中，水浴加热至80摄氏度，持续5分钟；然后用移液器吸取10μl脂糖凝胶溶液，滴于上述制备好的固态纳米孔薄膜(纳米孔的直径具体为10nm左右、孔深具体为60nm)的表面(Cis面)，在琼脂糖凝胶溶液冷却凝固前用玻璃棒在表面迅速滚涂，使琼脂糖凝胶溶液的液滴均匀分布于固态纳米孔薄膜表面，室温下静置10秒，此时脂糖凝胶溶液滴迅速凝固，即得到琼脂糖凝胶层(厚度约100μm)，制备得到覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜。

4、离子电流信号测量

如图1(a)所示，通过一系列浸润过程用聚二甲基硅氧烷(PDMS)垫片将覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜封装入由聚醚醚酮(PEEK)制成的电解池中，电解池由Cis腔(对应负极)和Trans腔(对应正极)构成，两个腔之间只通过覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜上的纳米孔进行连接，无其他连接通道。然后向两个腔中注入浓度为1.6mol/L的氯化钾溶液。氯化钾溶液中含有1mM的乙二胺四乙酸(EDTA)和10mM的三羟甲基氨基甲烷(英文名为Tris)调节pH为9。使用两个Ag/AgCl电极分别插入Cis腔和Trans腔中。向Cis腔注入DNA分子溶液，然后从正极加载电压(100mV-300mV)(图3a)，这样可以利用膜片钳放大器系统给出离子电流测量信号。

5、不同长度DNA和不同电压下的DNA分子减速

由图2可知，裸孔时平均穿孔时间611μs，修饰琼脂糖凝胶后平均穿孔时间2229μs；裸孔与修饰琼脂糖凝胶条件时穿孔电导基本相同，修饰琼脂糖凝胶后穿孔时间显著变长，事件形貌更易读取和分析。

由图3可知，5kb，10kb，48.5kb DNA分别在电压为100mV，200mV，300mV条件下穿孔电导水平相近，与没有修饰琼脂糖凝胶(裸孔)时的电导水平一致，证明本发明不会降低DNA探测的信噪比；经计算得出上述条件下DNA分子穿过无修饰纳米孔(裸孔)的平均穿孔速率为0.012μs/bp，穿过修饰琼脂糖凝胶的固态纳米孔薄膜上的纳米孔的平均穿孔速率为0.1μs/bp，穿过琼脂糖凝胶修饰的固态纳米孔薄膜将穿孔时间提高了近一个数量级。

由图4可知，对不同长度DNA分子(5kb，10kb，48.5kb)在不同电压下(100mV，200mV，300mV)进行了减速实验，并与没有凝胶修饰(裸孔)条件下的DNA分子穿孔时间平均值做了对比(相对穿孔时间)，本发明琼脂糖凝胶修饰将穿孔时间提高了近一个数量级，同时DNA分子长度越长，相对穿孔时间越大，说明减速效果越显著。此外，同样长度和同样电压条件下，DNA分子在有凝胶修饰的情况下穿孔速率的涨落更小，平均穿孔时间分布更加集中，这有效提高了固态纳米孔器件探测DNA分子的时间精确度，为利用固态纳米孔实现精确的DNA测序奠定了良好的基础。

Claims

1.一种核酸分子低穿孔速度的纳米孔测序方法，包括如下步骤：将待测的核酸分子加入到盛有电解液的纳米孔测序装置中，所述纳米孔测序装置包括：设有正极和负极的电解池以及分隔所述电解池正极和负极的一面覆盖有琼脂糖凝胶层的固态纳米孔薄膜；将所述核酸分子置于所述电解池的负极腔室；测定时，在正极和负极间施加电压，作为核酸分子穿孔的驱动电场。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸分子为DNA、RNA或肽核酸。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：琼脂糖凝胶层的制备方法，包括如下步骤：将琼脂糖凝胶水溶液涂覆于所述固态纳米孔薄膜的一面上，所述琼脂糖凝胶水溶液凝固后即得所述琼脂糖凝胶层。

4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶水溶液的质量百分浓度为0.5～2％，所述固态纳米孔薄膜上涂覆的所述琼脂糖凝层的厚度为10～100μm。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶层均匀覆盖于所述固态纳米孔薄膜上。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：所述固态纳米孔薄膜的纳米孔的直径为10～20nm，孔深为20～100nm。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：所述电压为100～300mV；

所述电解液的摩尔浓度为0.1～3.2mol/L；

所述电解液的pH值为8～10。

8.权利要求1-7中任一项所述的方法的专用的纳米孔器件，它由固态纳米孔薄膜及其覆盖在所述固态纳米孔薄膜上的琼脂糖凝胶层组成。

9.根据权利要求8所述的纳米孔器件，其特征在于：所述固态纳米孔薄膜的纳米孔的直径为10～20nm，孔深为20～100nm；

所述琼脂糖凝胶层的厚度为10～100μm；

制备所述琼脂糖凝胶层使用的琼脂糖凝胶水溶液的质量百分浓度为0.5～2％。

10.一种纳米孔测序法中降低核酸分子穿孔速度的方法，包括用固态纳米孔薄膜分隔设有正极和负极的电解池；其特征在于：所述固态纳米孔薄膜上覆盖有琼脂糖凝胶层。