CN104694558A

CN104694558A - 一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用

Info

Publication number: CN104694558A
Application number: CN201410774237.5A
Authority: CN
Inventors: 张炼辉; 陈少华; 胡美英; 常长青; 邓音乐
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2014-12-16
Filing date: 2014-12-16
Publication date: 2015-06-10
Anticipated expiration: 2034-12-16
Also published as: CN104694558B

Abstract

本发明公开了一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用。所述酯酶基因estZ全长为1206bp，G + C含量65.2%，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物酯酶EstZ含401个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。EstZ能催化降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药。生产的酶制剂可用于蔬菜、水果、茶叶、棉花、烟草等农产品中的农药残留去除，提高农产品品质及增加附加值。酯酶基因estZ可进一步用于构建转基因作物彻底解决农业生产中农药残留超标问题，生产无公害绿色农产品；也可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境，解决环境污染问题，保护生态环境和人类健康。

Description

一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及应用环境微生物和农业领域，更具体地，涉及一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用。具体用于农作物中农药残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境。

背景技术

农药的发明和使用为人类的生存和发展做出了巨大的贡献，特别是在农业生产、农作物病虫害防治、杂草清除等方面发挥了巨大的作用，成为保障农业丰收高产，解决人类粮食问题不可或缺的重要条件之一。据统计，每年我国通过农药防治，粮食挽回约5845万吨、棉花101.5万吨、油料228.5万吨，每年挽回直接经济损失约800亿元。农药的使用量稳步增长，已经是提高农民收入、促进农村消费、保障国民经济稳定发展的必然选择。但是，农药的使用也是一把双刃剑，由于农药的不科学使用特别是超剂量和超范围使用致使农药残留问题日益突出，引起了一系列的食品安全问题和环境安全问题。一方面农药残留污染直接导致农产品中农药超标，产品品质下降，严重威胁到人们的生命安全和我国农副产品的销售。据统计，我国每年遭受残留农药污染的作物面积超过10亿亩。另一方面，环境中残留农药通过食物链富集最终进入人体内，直接威胁到人类的生命健康；此外，人类所施用到田间的农药被植物体所截留的不足20%，有80%以上进入环境中，不仅被植物体所截留的部分会产生残留毒性，而且进入环境中的部分也会通过食物链达到生物富集，进而产生残留毒性，给生态系统造成巨大的破坏。因此，消除环境及农产品中的农药残留污染已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的科研命题。

生物降解技术(Biodegradation)可用于去除环境及农产品中各类有机污染物，与传统化学、物理处理方法相比具有操作简便、经济实用、无二次污染等优点。因此，研究利用微生物降解菌剂或酶制剂产品治理农药残留污染已成为近年来研究的热点。目前许多发达国家和大公司企业都投入巨资以从事农药残留生物降解制剂的研究和开发，如美国 BCI 公司、美国工程服务生物修复公司已经将降解制剂产品规模化生产，国内的北京佳农新贸易发展有限公司已成功生产“比亚”降解酶制剂可用于去除有机磷类农药残留。但是，目前还没有同时针对拟除虫菊酯类和甲氧基丙烯酸酯类农药残留的生物降解制剂产品。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种新的降解农药的酯酶基因estZ，该基因可用于农作物中农药残留的去除，生产无公害绿色农产品；同时可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境。

本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明又一目的是提供该基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

一种能降解含酯键农药的酯酶基因estZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明所述酯酶基因estZ是从一株能够降解含酯键农药的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1中克隆得到。所述菌株已于2014年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014630。发明人通过质谱分析发现：菌株PAO1可以使高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药的酯键发生断裂，使其失去农药毒性。

从菌株中克隆酯酶基因estZ 的具体方法为转座子标签法。菌株PAO1能在基础培养基平板上利用高效氯氰菊酯等农药为唯一碳源生长，通过双亲株杂交使供体大肠杆菌S17-1中的pBT20质粒上的转座子mariner 随机插入PAO1基因组后，利用转座子上的庆大霉素抗性基因和降解过程中产生水解圈与否筛选突变株，并利用Tail-PCR 技术克隆出被插入失活的基因片段，然后再进行功能验证。

用上面的策略筛选到一株不能在基础培养基加农药的平板上产生水解圈的突变株，进一步的降解实验表明该突变子不能降解高效氯氰菊酯等农药。设计引物，进行Tail-PCR，多次PCR测序后，拼接结果表明插入位点为PA3734基因中间，该基因是功能未知的酯酶基因，全长为1206bp（编码401个氨基酸），命名为estZ。这是一种新的降解农药的酯酶基因。

一种能降解含酯键农药的酯酶EstZ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有如上所述酯酶基因estZ的重组克隆载体pUCP19-estZ，将如上所述的酯酶基因estZ的核酸片段插入pUCP19的EcoR I和Xba I位点之间所得。

含有如上所述能降解含酯键农药的酯酶基因estZ的重组表达载体 pET28a(+)-His-P1，所述的重组表达载体优选将所述的酯酶基因estZ的核苷酸片段插入pET28a(+)的BamH I 和EcoR I位点之间所得。

含有如上所述降解含酯键农药的酯酶基因estZ的基因工程菌。

所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21为出发菌株。

如上所述酯酶基因estZ在降解农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药的应用。

如上所述酯酶基因estZ在构建降解含酯键农药的转基因作物中的应用。

如上所述酯酶EstZ在去除农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药残留的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明利用转座子标签法成功从一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1中克隆出降解含酯键农药的酯酶基因estZ。在GenBank比对结果表明该基因为一种新的降解农药的酯酶基因，全长（从起始密码子到终止密码子）为1206bp，G + C含量为65.2%，编码401个氨基酸。

2.本发明提供的酯酶EstZ能催化降解高效氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯、醚菌酯、吡唑醚菌酯和嘧菌酯等含有酯键的农药。生产的酶制剂可用于蔬菜、水果、茶叶、棉花或烟草等农产品中的农药残留去除，提高农产品品质及增加附加值。

3.酯酶基因estZ可进一步用于构建转基因作物，彻底解决农业生产中农药残留超标问题，生产无公害绿色农产品；也可用于修复农药污染的土壤、水体等自然环境，解决环境污染问题，保护生态环境和人类健康。

附图说明

图1. 酯酶基因estZ克隆的策略图。

图2. 酯酶基因estZ在BL21 (pET28a(+))中表达策略图。

图3. 酯酶EstZ蛋白电泳图谱；其中泳道1为蛋白质marker，泳道2为IPTG诱导的重组蛋白，泳道3为纯化的酯酶EstZ蛋白。

图4. 基因工程菌降解高效氯氰菊酯的HPLC色谱图。

图5. PAO1降解高效氯氰菊酯的HPLC色谱图。

图6. 高效氯氰菊酯降解产物质谱图中高效氯氰菊酯质谱图。

图7. 高效氯氰菊酯降解产物质谱图中间苯氧基苯甲酸质谱图。

图8.高效氯氰菊酯降解产物质谱图中间苯氧基苯甲醛质谱图。

图9.高效氯氰菊酯降解产物质谱图中α-羟基-3-苯氧基苯乙腈质谱图。

图10.高效氯氰菊酯降解途径。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例中使用的微生物来源如下：

大肠杆菌E.coliDH5α购自Gibco公司；转座子菌株E.coliS17-1(pBT20)华南农业大学广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室保存；大肠杆菌克隆载体pUCP19华南农业大学广东省微生物信号与作物病害防控实验室保存；大肠杆菌高表达载体pET28a(+)-His-P1华南农业大学广东省微生物信号与作物病害防控实验室保存；表达宿主菌大肠杆菌E.coliBL21购自Novagen公司。

能够降解含酯键农药的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1已于2014年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号是CCTCC M 2014630；保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。

实施例1 酯酶基因estZ的克隆（见图1）

S1.转座子突变体文库的构建

利用转座子mariner随机插入突变的原理，采用双亲株杂交的方法，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1和转座子菌株E.coliS17-1(pBT20)作为亲本进行双亲接合，将转座子mariner随机插入到PAO1基因组后，利用转座子上的庆大霉素抗性基因和降解过程中产生水解圈与否筛选突变株。通过这种方法获得降解功能缺失的突变株。

S2. Tail-PCR侧翼序列扩增

根据转座子mariner已知的插入片段序列设计左翼嵌套式特异性引物和右翼嵌套式特异性引物，结合适合所有物种基因组序列扩增的随机简并引物，采用Tail-PCR (热不对称交错PCR)技术分别向插入位点两侧扩增，获得未知基因片段后，继续设计引物扩增向两侧拉长基因，直至获得降解基因的完整序列。通过和基因组序列比对锁定转座子mariner的插入位点，通过 BlastX比对初步确定基因功能。

S3.酯酶基因estZ的克隆及功能验证

将扩增获得的目的基因序列用DNAStar的Seqman软件进行序列拼接，使用FramePlot 3.0beta在线软件和CLONE软件分析DNA序列的开放阅读框(ORFs)。使用BLAST在线搜索分析目的蛋白氨基酸序列，并与蛋白数据库中的已知氨基酸序列进行比对。将目的蛋白的氨基酸序列通过在线网络资源SMART及其他网络资源进行蛋白质结构域的分析，从而对目的基因进行功能预测并作图，判断整个降解相关基因的完整序列。通过直接在大肠杆菌E.coliDH5α中表达降解基因进行功能验证。获得的酯酶基因estZ的核苷酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

实施例2 酯酶基因estZ在BL21 (pET28a(+))中的高效表达（见图2）

S1.酯酶基因estZ的PCR扩增

以正向引物P1：GCTCTAGATGCCGGCGCAAATAGCCAT (SEQ ID NO.3) 和反向引物P2：CGGAATTCATGTCTTCTCAAAGGGC (SEQ ID NO.4) 为引物，使用PCR方法从铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株PAO1的总DNA中扩增出酯酶基因estZ片段。

PCR扩增体系：

PCR扩增程序：

95 °C预变性3 min，94 °C变性30 s，55 °C退火45 s，72 °C延伸1 min 30 s，进行34个循环后，于72 °C延伸5 min，最后16 °C保存。

S2. PCR产物使用BamH I 和EcoR I双酶切

酶切体系：

置于37 °C水浴中反应2 h以上。

酶切产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。

S3. pET28a(+)-His-P1使用BamH I 和EcoR I双酶切，具体操作同S2所述操作。

S4.转化和表达：将S2中回收片段和S3中酶切好的pET28a(+)-His-P1进行酶连。

连接体系：

酶连好的酯酶基因estZ的pET28a(+)-His-P1重组质粒转化到表达宿主菌BL21获得重组表达菌。

S5.验证阳性转化子表达产物对高效氯氰菊酯的降解功能

阳性转化子在LB培养基中培养至OD₆₀₀ 0.5时，加IPTG至浓度0.5 mM，18 °C低温诱导过夜。在50 mL基础培养基 (g/L)（(NH₄)₂SO₄, 2; MgSO₄, 0.2; CaCl₂, 0.01; FeSO₄, 0.005; MnCl₂, 0.002; K₂HPO₄, 10.5; KH₂PO₄, 4.5）中加入100 μg/mL高效氯氰菊酯，0.2 g/L接种量接入阳性转化子培养液，30 °C振荡培养5 d。对照为含空载体的大肠杆菌DH5α。

使用丙酮超声提取高效氯氰菊酯，并使用石油醚萃取培养液，重复萃取3次，滤液并入烧瓶中，50 °C恒温浓缩，将浓缩液全部转入5 mL刻度试管中，并用3 mL甲醇分3次洗涤圆底烧瓶，定容至5 mL，取2 mL经0.45 μm微孔滤膜有机膜注射式过滤器过滤，滤液收集于进样瓶中，使用HPLC测定其残留量，检测条件如下：C₁₈反相色谱柱（250 nm×4.60 mm, 5 μm），流速为1 mL/min，柱温为25 °C，流动相为乙腈﹕水= 90﹕10（v﹕v），扫描波长为190～400 nm，进样量为10 μL。结果显示：基因工程菌对100 μg/mL高效氯氰菊酯5 d的降解率达到81.7%（见图4）。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种酯酶基因estZ及其编码的蛋白质和应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1206

<212> DNA

<213> 酯酶基因estZ

<400> 1

gtgccggcgc aaatagccat tcgagccgaa ccaggccaac gcaacgatca gcccgctata 60

agggaagcac cgggaaaaac tccaaccatc ccaccctcgc gcaacgcctt cacctgcttg 120

aaattgcagt atccggcgcg tccgtcaggc agtaacaacg agacttcccc ctgcgcatcg 180

aacagcgagg atctcatgac tgccttcgca tccccccgca gcgcctggcg cgccttcatc 240

ctcgcgctgg cattcgccgc cggcacggca cagggctcgc tgctgttcgg cgccgtcggc 300

ctggccaacg accagtacgc gcgtccggtc gccgacaccg agatcgccag caccgccgtg 360

ctcgccgatt gtcgtggctt cgtcgggacc atcgccagga tcgtcctgct ggacggctcg 420

atccgctgca acgaggcttt cccctatggc ttcgccagcc cgatcagtac cagcgtctac 480

tatccggcgg acatcgccgc gtccgacgcc aagcttccgg tcatcacttt cgtcggcggc 540

atactttcca acgccggcaa ctatcacgaa ctgatgaaac tgtgggccag ccacggcttc 600

atcgtggtga tctcctccga cttcatcaat tccttcccgc tgatgcacgc cctcggcatc 660

cttgaggtcg cgaaactgga cagggacccg gcctcggccc tgcatggccg ggccgacttt 720

tcccggacgc tggtcgccgg gcactccgcc ggcggccagg ccacactgca gagcgccagc 780

ctctctgcac aagccctgca actcatcgag ccacggttga agctggtcgg cgccctgccg 840

atcgagccag gccccctggc catcggttcc acggtaaaga ccccgaccct gctgctgacc 900

ggactggccg atgtggtcgt gccgccgctc agttggccga tcctctggca gggcccgttg 960

atccgcgacg tgcccgcctg gggcgccacg gccaccacgg cgacccactt cagcccgctg 1020

cgacagatcg agtacaacga gttcgccggc atcagcgtcg cctgggtgct gtaccaggga 1080

aagaacgatg cccaggcccg cgactatttc gtcgggcgct actacaagct ggccagcgac 1140

atccagttca acgatccact gaggctgctc cgcccctcgc gcaacaaact cgccgctgcc 1200

ctttga 1206

<210> 2

<211> 401

<212> PRT

<213> 酯酶EstZ

<400> 2

Met Pro Ala Gln Ile Ala Ile Arg Ala Glu Pro Gly Gln Arg Asn Asp

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ile Arg Glu Ala Pro Gly Lys Thr Pro Thr Ile Pro Pro

20 25 30

Ser Arg Asn Ala Phe Thr Cys Leu Lys Leu Gln Tyr Pro Ala Arg Pro

35 40 45

Ser Gly Ser Asn Asn Glu Thr Ser Pro Cys Ala Ser Asn Ser Glu Asp

50 55 60

Leu Met Thr Ala Phe Ala Ser Pro Arg Ser Ala Trp Arg Ala Phe Ile

65 70 75 80

Leu Ala Leu Ala Phe Ala Ala Gly Thr Ala Gln Gly Ser Leu Leu Phe

85 90 95

Gly Ala Val Gly Leu Ala Asn Asp Gln Tyr Ala Arg Pro Val Ala Asp

100 105 110

Thr Glu Ile Ala Ser Thr Ala Val Leu Ala Asp Cys Arg Gly Phe Val

115 120 125

Gly Thr Ile Ala Arg Ile Val Leu Leu Asp Gly Ser Ile Arg Cys Asn

130 135 140

Glu Ala Phe Pro Tyr Gly Phe Ala Ser Pro Ile Ser Thr Ser Val Tyr

145 150 155 160

Tyr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Ser Asp Ala Lys Leu Pro Val Ile Thr

165 170 175

Phe Val Gly Gly Ile Leu Ser Asn Ala Gly Asn Tyr His Glu Leu Met

180 185 190

Lys Leu Trp Ala Ser His Gly Phe Ile Val Val Ile Ser Ser Asp Phe

195 200 205

Ile Asn Ser Phe Pro Leu Met His Ala Leu Gly Ile Leu Glu Val Ala

210 215 220

Lys Leu Asp Arg Asp Pro Ala Ser Ala Leu His Gly Arg Ala Asp Phe

225 230 235 240

Ser Arg Thr Leu Val Ala Gly His Ser Ala Gly Gly Gln Ala Thr Leu

245 250 255

Gln Ser Ala Ser Leu Ser Ala Gln Ala Leu Gln Leu Ile Glu Pro Arg

260 265 270

Leu Lys Leu Val Gly Ala Leu Pro Ile Glu Pro Gly Pro Leu Ala Ile

275 280 285

Gly Ser Thr Val Lys Thr Pro Thr Leu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Asp

290 295 300

Val Val Val Pro Pro Leu Ser Trp Pro Ile Leu Trp Gln Gly Pro Leu

305 310 315 320

Ile Arg Asp Val Pro Ala Trp Gly Ala Thr Ala Thr Thr Ala Thr His

325 330 335

Phe Ser Pro Leu Arg Gln Ile Glu Tyr Asn Glu Phe Ala Gly Ile Ser

340 345 350

Val Ala Trp Val Leu Tyr Gln Gly Lys Asn Asp Ala Gln Ala Arg Asp

355 360 365

Tyr Phe Val Gly Arg Tyr Tyr Lys Leu Ala Ser Asp Ile Gln Phe Asn

370 375 380

Asp Pro Leu Arg Leu Leu Arg Pro Ser Arg Asn Lys Leu Ala Ala Ala

385 390 395 400

Leu

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 酯酶基因estZ的PCR扩增正向引物P1

<400> 3

gctctagatg ccggcgcaaa tagccat 27

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 酯酶基因estZ的PCR扩增反向引物P2

<400> 4

cggaattcat gtcttctcaa agggc 25

Claims

1.一种能降解含酯键农药的酯酶基因estZ，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种能降解含酯键农药的酯酶EstZ，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述酯酶基因estZ的重组克隆载体pUCP19-estZ，其特征在于，将权利要求1所述酯酶基因estZ的核酸片段插入pUCP19的EcoR I和Xba I位点之间所得。

4.含有权利要求1所述酯酶基因estZ的重组表达载体pET28a(+)-His-P1，其特征在于，将权利要求1所述酯酶基因estZ的核酸片段插入pET28a(+)的BamH I 和EcoR I位点之间所得。

5.含有权利要求1所述酯酶基因estZ的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌以大肠杆菌BL21为出发菌株。

7.权利要求1所述酯酶基因estZ在降解农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药的应用。

8.权利要求1所述酯酶基因estZ在构建降解含酯键农药的转基因作物中的应用。

9.权利要求2所述酯酶EstZ在去除农作物、农产品、土壤或水体中含酯键农药残留的应用。