CN104673757A - 重组家蚕杆状病毒、其表达的重组蛋白及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组家蚕杆状病毒、其表达的重组蛋白及其制备和应用。该病毒是由重组转移载体pFastBacI-hEPO转化大肠杆菌，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。本发明构建的重组家蚕杆状病毒，耗时仅两周，比使用同源重组构建病毒的方法省时，不需要进行繁琐的病毒筛选，方法简单，操作性更强。本发明生产的BmrhEPO蚕蛹粉直接用于口服，而且疗效明显，可减轻患者的不适，服用方便，而且成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及重组病毒领域，具体涉及一种重组家蚕杆状病毒、其表达的重组蛋白及其制备和应用。
背景技术
人促红细胞生成素（hEPO）是一个分子量约为30KDa的糖蛋白，糖基化程度大约能达到分子量的40%左右。在胎儿发育过程中，hEPO主要是肝脏产生的，随着发育的进行，hEPO主要由肾脏产生，其主要的生理学作用是促进红系祖细胞向红细胞的生长与分化。由于基因重组技术的飞速发展，重组人促红细胞生素（rhEPO）已经可以通过包括COS-1细胞、SF-9细胞和CHO细胞等各种表达系统规模化表达了，临床上主要使用rhEPO治疗肾性贫血症，近期也发现了rhEPO具有保护神经、大脑和心脏等的非造血功能。与其它的蛋白类药物一样，rhEPO在临床上主要是通过静脉和皮下注射用于治疗肾性贫血症。然而，注射用药会引起患者的不适，并且也不方便，因此一种替代的用药途径是患者所迫切需要的，而口服给药由于安全方便而令人向往。
发明内容
本发明要解决的技术问题是目前尚无利用rhEPO的治疗肾性贫血症的口服药物。
为了解决上述技术问题，本发明利用bac to bac系统构建rhEPO重组家蚕杆状病毒，并在家蚕蛹中高效表达，利用TF-1细胞对家蚕表达的rhEPO(重组蛋白BmrhEPO)进行体外生物学活性的检测。通过检测口服不同剂量的BmrhEPO后的肾性贫血小鼠血液中网织红细胞数及百分率来评估口服BmrhEPO的药效。
本发明提供的重组家蚕杆状病毒，该病毒是由重组转移载体pFastBacI-hEPO转化大肠杆菌，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO，然后，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。
作为优选技术方案，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕BmN 细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO。
本发明提供上述的重组家蚕杆状病毒的制备方法，包括如下步骤：
1）制备人促红细胞生成素hEPO基因，将hEPO基因克隆到pFast Bac I载体上，得到重组转移载体pFastBacI-hEPO；
2）重组转移载体pFastBacI-hEPO转化大肠杆菌，经蓝白筛选后，得到含重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO的菌株，纯化后得到重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO；
3）将重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。
作为优选技术方案，步骤1）为合成hEPO cDNA基因，并将其克隆在PUC19载体上，设计以下引物：上游引物P1：5’-CGGAATTCATGGGGGTGCACGAAT-3’；下游引物P2：5’-CCGCTCGAGTCATCTGTCCCCTGT-3’，分别引入酶切位点EcoR I 和Xho I，进行PCR扩增得到目的基因片段，PCR产物经过EcoR I和Xho I限制性内切酶切割后，使用高效连接酶克隆到pFast Bac I载体的相应的酶切位点上，得到重组转移载体pFastBacI-hEPO。
优选地，步骤2）所述大肠杆菌为DH10Bac E.coli；步骤3）所述家蚕细胞为家蚕BmN 细胞。
作为优选技术方案，步骤3）为将Bacmid-rhEPO转染处于对数生长期的BmN 细胞，待细胞发病后，离心收集培养基上清液，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO。
本发明提供一种重组蛋白其由上述的重组家蚕杆状病毒接种家蚕中表达而得，该重组蛋白为SEQ ID NO. 2所示序列。
本发明提供上述的重组蛋白作为制备治疗肾性贫血口服药物的用途。
本发明提供一种由上述重组家蚕杆状病毒制备的治疗肾性贫血口服的药物，所述药物的制备方法为：将所述重组家蚕杆状病毒接种家蚕蛹，蚕蛹发病后，以液氮研磨，冻干，制成蚕蛹冻干粉，即得。
本发明利用bac to bac系统构新了一种新的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO，并在家蚕蛹中高效表达重组蛋白BmrhEPO。
将vBmrhEPO接种家蚕蛹，发病后，将蚕蛹匀浆，制成蚕蛹冻干粉。
经ELISA检测，BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO的含量达到8382IU/g。
利用BmrhEPO对TF-1 细胞的生长、增殖的促进作用检测其体外生活学活性，结果显示，BmrhEPO具有与rhEPO(CHO 细胞表达)相似的体外生物学活性。
小鼠口服BmrhEPO急性毒性实验显示，口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147882IU/kg。
BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液进行小鼠口服BmrhEPO治疗肾性贫血的药效学实验显示，以73958.8IU/kg、24652.9IU/kg、14791.8IU/kg三个不同剂量连续口服BmrhEPO，小鼠血液网织红细胞数及百分率与阴性对照组相比均有明显升高，并且与口服剂量呈正相关，口服BmrhEPO治疗小鼠肾性贫血具有明显疗效。
本发明利用bac to bac系统构建的新的杆状病毒，耗时仅两周，比使用同源重组构建病毒的方法省时，不需要进行繁琐的病毒筛选，方法简单，操作性更强。现在rhEPO药物大都是注射液，价格昂贵，注射给药会给患者带来不适，而且不方便，而本发明生产的BmrhEPO蚕蛹粉直接用于口服，而且疗效明显，可减轻患者的不适，服用方便，而且成本较低，普通老百姓负担的起，将来开发成药物对于患者来说是福音。
附图说明
图1为 重组质粒pFastBacⅠ-rhEPO的鉴定，M：DNA Ladder Mix；1：rhEPO基因片段PCR扩增；2：重组质粒EcoRⅠ和XhoⅠ酶切。
图2 为重组Bacmid-hEPO的PCR鉴定，M：marker 1：以P1和P2为引物的PCR产物 2：以P1和M13 R为引物的PCR产物 3：以P2和M13 F为引物的PCR产物 4：以M13 F和R为引物的PCR产物。
图3为重组病毒vBmrhEPO PCR鉴定，M：DNA Ladder Mix；1：以P1和P2为引物的PCR产物。
图4为重组蛋白BmrhEPO在BmN细胞中表达的SDS-PAGE检测（a图）和Western Blotting检测（b图），M：蛋白预染Marker；1：接种重组病毒vBmrhEPO的BmN细胞的上清；2：接种野生病毒BmNPV的BmN细胞的上清；3：rhEPO标准品（rhEPO注射液）。
图5为重组蛋白BmrhEPO在五龄蚕幼虫血淋巴中表达的SDS-PAGE(a图)和Western blotting(b图)鉴定, M：预染分子量标准蛋白； 1：rhEPO标准品（rhEPO注射液）；2：接种野生病毒BmNPV的五龄家蚕幼虫血淋巴上清的上清；3：接种重组病毒vBmrhEPO的五龄家蚕幼虫血淋巴的上清。
图6为重组蛋白BmrhEPO在蚕蛹中表达的SDS-PAGE检测（a图）和Western Blotting检测（b图），M：蛋白预染Marker；1：rhEPO标准品（rhEPO注射液）；2：接种野生病毒BmNPV的蚕蛹上清；3：接种重组病毒vBmrhEPO的蚕蛹上清。
图7为重组蛋白BmrhEPO在蚕蛹中表达的ELISA检测标准曲线（R2=0.9995）。
图8为 rhEPO作用于TF-1细胞的增殖曲线。
图9为模型组与空白对照组小鼠网织红细胞数。
图10 为模型组与空白对照组小鼠网织红细胞百分率。
图11 为模型组与空白对照组小鼠血肌酐浓度。
图12 为模型组与空白对照组小鼠血尿素氮浓度。
图13 为不同实验组小鼠网织红细胞数随时间的变化。
图14 为不同实验组小鼠网织红细胞百分率随连续给药时间的变化图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下面结合实施例详细阐述本发明的具体内容。
一、 利用bac to bac系统构建重组病毒vBmrhEPO及鉴定
hEPO cDNA由苏州金唯智生物科技有限公司人工合成，克隆于PUC19载体上。hEPO cDNA的序列如SEQ ID NO. 1所示；设计下游引物P2：5’-CCGCTCGAGTCATCTGTCCCCTGT-3’，分别引入酶切位点EcoR I 和Xho I，进行PCR扩增得到目的基因片段。PCR产物经过EcoR I和Xho I限制性内切酶切割后，使用高效连接酶克隆到pFast Bac I载体的相应的酶切位点上，得到重组转移载体pFastBacI-hEPO，对其进行PCR、双酶切鉴定（如图1），结果显示构建成功。将pFastBacI-hEPO送到华大基因公司测序，结果显示，pFastBacI-hEPO上的hEPO的序列和方向都正确。
纯化的pFastBacI-hEPO转化大肠杆菌DH10Bac E.coli，经两次蓝白筛选后，获得含有重组Bacmid（内含hEPO基因）的目的菌株，此重组Bacmid命名为Bacmid-hEPO。纯化得到Bacmid-hEPO，进行PCR鉴定，分别以P1和P2，P1和M13 R， P2和M13 F， M13 F和M13 R（P1：5’-CGGAATTCATGGGGGTGCACGAAT-3’；P2：5’-CCGCTCGAGTCATCTGTCCCCTGT-3’；M13 F：5-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3；M13 R: 5-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3；），作引物进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳分析，如图2所示，泳道1、2、3、4扩增的条带的大小与预期一致，所以重组Bacmid-rhEPO构建成功。
使用细胞转染试剂X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent(购于Roche公司)将纯化的重组Bacmid-rhEPO转染处于对数生长期的家蚕BmN 细胞（1×106/mL，本实验室保有）。转染6天后，待细胞出观漂浮、破裂等发病状态后，收集培养基上清液，1000rmp/min离心后，收集上清，得到第一代重组病毒（vBmrhEPO），连续传代两次，得到第三代重组病毒(F3)，使用病毒基因组提取试剂盒（上海生物工程有限公司）提取重组病毒的基因组，进行PCR鉴定，如图3所示，以第三代重组病毒vBmrhEPO的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，在600bp位置附近出现了目的基因条带。
取50μL F3 vBmrhEPO病毒和WT BmNPV病毒（本实验室保有）分别接种106/mL的长势良好的BmN细胞，轻轻混匀，以不接病毒的正常细胞作为对照，每天观察细胞状态，培养4d后， 80%以上的细胞出现漂浮，收集细胞悬液，25℃，1000rpm/min，离心10min，收集细胞沉淀，用PBS溶液（pH7.4）清洗三次，加入100μL PBS（pH7.4）溶液溶解，反复冻融三次，4℃，12000rpm/min，离心10min，收集上清，以感染WT BmNPV的细胞的上清作为阴性对照，以重组人促红细胞生成素注射液（rhEPO注射液，购于上海罗氏公司）为阳性对照，制蛋白样，进行SDS-PAGE和Western Blotting检测，配制12%的蛋白胶进行SDS-PAGE电泳，并用考马斯亮蓝（CBB）染色液染色。将电泳后的蛋白胶中的蛋白转到PVDF膜上，将PVDF膜封闭于含5%脱脂奶粉的PBS(pH7.4)中，4℃，孵育过夜。按照1：5000 的稀释倍数，将anti-hEPO兔多抗（R&D）加入到封闭液中，37℃，孵育2h。将膜取出，用含0.5%吐温的TBS溶液（TBST）清洗三次，每次10min。将膜孵育在TBS溶液中，按照1：10000的稀释倍数，加入羊抗兔IgG二抗，37℃，孵育1h。将膜取出，用TBST溶液清洗两次，每次10min，再用TBS溶液清洗5min。使用DAB显色法显色，待膜上出现了明显条带后，迅速用ddH2O终止。结果如图4所示，泳道3在26KDa附近出现了一条特异性条带，而软件预测的目的条带大小为21KDa，这提示rhEPO可能在BmN细胞中发生了糖基化修饰。
综上，重组病毒vBmrhEPO构建成功，并且能够在BmN细胞中稳定表达目的蛋白。
二、BmrhEPO蛋白在家蚕五龄幼虫中的表达及鉴定
使用F3代重组病毒vBmrhEPO接种家蚕五龄幼虫，用接种针蘸取病毒液刺入蚕体腹部尾部朝上数第3~4体节。接种后，保持家蚕室通风良好，每天喂两次桑叶，早晚各一次，并及时将蚕扁中的干枯桑叶和蚕沙清理掉，以保证幼虫处于良好的生长环境。接种3天后，五龄幼虫开始出现病毒感染的发病症状，如食量减少，蚕体变黄，狂燥不安，并在蚕匾内部频繁爬动。接种5～6天后，大部分五龄幼虫出现了典型的病毒感染的症状，及时收集发病幼虫，剪掉幼虫的腹足收集流出的黄色蚕血淋巴，加入适量食用油液封，防止氧化，放入-80℃冰箱保存备用。
取出适量保存于-80℃冰箱的蚕血淋巴，放在冰上缓慢化冻。4℃，12000rpm/min，离心10min，然后用9层医用脱脂纱布过滤除油，重复3次。收集上清，使用PBS缓冲液（pH 7.4）将蚕血稀释4倍后，取适量，进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定，方法同上。结果如图5，泳道3中出现了特异性条带，其分子大小与家蚕BmN细胞中表达的BmrhEPO相一致。这表明家接种重组病毒vBmhEPO的五龄蚕幼虫的血淋巴中表达了目的重组蛋白BmrhEPO（SEQ ID NO. 2）。
三、BmrhEPO在家蚕蛹中的表达及鉴定
家蚕蛹(青松×皓月，购于浙江中奇生物药业股份有限公司)经过削茧、挑选后平铺于经75%酒精消毒过的铁盘上，喷洒少量酒精消毒，用接种针蘸取滴度为108pfu/mL的重组病毒vBmrhEPO，在蚕蛹的背侧腹间节穿刺接种，注意不要刺到蛹的呼吸孔和血管，以免刺死。接种后，每天观察蚕蛹的变化，并及时挑出细菌感染的体色发黑的蚕蛹。接种5天后，蚕蛹出现体色暗褐，外皮易破，一经震动即会流出深黄色浓汁等感染病毒发病症状。收集发病的蚕蛹保存于-80℃冰箱备用。称取10g发病蚕蛹于预冷的研钵中，加入适量液氮，快速研磨，将研细的蚕蛹粉刮入到50ml离心管中，加入20mL PBS（pH7.4），充分混匀，反复冻融三次。4℃，15000rpm/min，离心30min。以相同的方法处理接种野生病毒的蚕蛹，作为阴性对照。取上清制样，进行SDS-PAGE和Western blotting检测，方法同上，结果如图6所示，泳道3在26KDa附近出现了一条特异性条带，这说明重组病毒vBmrhEPO在家蚕蛹中能够表达目的蛋白BmrhEPO。
四、BmrhEPO蚕蛹冻干粉的制备
称出500g的发病蚕蛹，加入1L PBS溶液(pH7.4)，使用匀浆机匀浆30min，每匀浆30s，冰浴30s，将匀浆好的匀浆液倒入玻璃皿中，放入-80℃冰箱，冻硬，再放入冻干机中，2d后冻干。将冻干粉保存于-20℃冰箱备用。
五、BmrhEPO的ELISA检测
称取BmrhEPO蚕蛹冻干粉0.1g，溶于0.5mL ddH2O，充分溶解，反复冻融三次，4℃，12000rpm/min，离心10min，取上清液用以ELISA检测。通过使用hEPO ELISA 试剂盒（购于R&D公司）来检测BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO的含量，标准rhEPO溶液稀释为200.0，100.0，50.0，20.0，5.0，2.5和0.0mIU/ml。家蚕蛹表达的BmrhEPO也按同样的方法做梯度稀释。然后进行ELISA检测，具体操作方法参考说明书。标准曲线见图7。根据全波长酶标仪读出的OD450nm值和标准曲线，BmrhEPO蚕蛹冻干粉中BmrhEPO的含量为8382IU/g。
六、BmrhEPO体外生物学活性检测
BmrhEPO的体外生物学活性的检测是通过其作用于TF-1细胞（购于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）后，细胞的生长增殖情况来检测的。称取0.1g BmrhEPO蚕蛹冻干粉WT BmNPV蚕蛹冻干粉，分别加入1mL ddH2O，充分溶解，12000rpm/min，离心10min，收集上清。使用RPMI1640培养基作溶剂（内含10%肥牛血清）将rhEPO注射液和BmrhEPO上清分别稀释成浓度为10.0，5.0，2.5，1.25，0.63，0.32，0.16和0.08IU/mL的rhEPO标准溶液和BmrhEPO蚕蛹上清稀释液。使用PBS(pH7.4)溶液将长势良好的TF-1细胞洗三次，加入不含rhGM-CSF的RPMI1640培养基（含10% FBS），细胞计数后，将内含103个细胞的50μL细胞悬液铺于96孔板的每孔中，将50μL的不同浓度的 rhEPO标准溶液和BmrhEPO蚕蛹上清稀释液分别加入到孔中，以 加入WT BmNPV蚕蛹冻干粉上清的孔作为阴性对照，每个浓度做三个重复孔，将96孔板放置于37 ℃，含5% CO2的培养箱中培养4d，向每孔加入10μL 5mg/mL的MTT溶液，37℃继续培养4h，1000rpm/min，离心 10 min，弃上清，加入150μL DMSO溶液，室温下于旋转振荡器上振荡 10 min ，充分溶解紫色结晶。将96孔板放于全波长酶标仪上，检测OD570值，如图8所示，BmrhEPO同rhEPO(CHO cell)一样都能使TF-1细胞生长增殖，说明BmrhEPO具有体外生物学活性，而且相同浓度下，BmrhEPO比rhEPO(CHO cell)体外生物活性高。
七、BmrhEPO小鼠口服急性毒性实验
选择Balb/c小鼠（购于中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心，批号为SCXK-（军）2012-0004）20只，周龄为5周，体重17±1g，雌雄各半，随机分成阴性对照组和口服给药组两组，每组10只，雌雄各半。经试验，1 ml ddH2O 中最多能溶解BmrhEPO蚕蛹冻干粉0.3g，其中BmrhEPO的含量为2514.6IU/mL，以此含量配制BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液，口服给药组小鼠每只灌胃1 ml BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液，阴性对照组小鼠每只灌胃1 ml ddH2O，分别灌胃一次，以小鼠平均体重为17g计算，口服剂量达到147882IU/kg。给药后观察小鼠，活动无异常，连续观察14d，无一死亡，每天称取小鼠体重，与阴性对照组小鼠相比，灌胃给药组小鼠体重变化无异常，外形正常完好，毛色光泽，粪便呈棕色，活动灵活，进食量正常，与阴性对照组小鼠相比无明显差异。14d后，解剖小鼠，口服给药组小鼠内脏完整无缺失，未见损失，与阴性对照组小鼠相比，无明显差异。因此，小鼠口服BmrhEPO最大耐受剂量大于147882IU/kg。
八、BmrhEPO小鼠口服药效学实验
本次实验选择Balb/c小鼠70只，周龄为5周，体重17±1g，雌雄各半，随机分成7组（A～G组），每组10只，雌雄各半，其中A组作为空白对照组，正常饲养，其它6组利用腺嘌呤灌胃造肾性贫血模型，腺嘌呤剂量为200mg/kg，每天灌胃一次，连续3周，对A、B两组小鼠进行眼内眦取血，并进行血液常规分析和肾功能检测，以鉴定小鼠肾性贫血模型是否造好，本实验中小鼠血液常规分析和肾功能检测由天津国际生物医药联合研究院新药毒理平台承担。结果显示，如图9和图10，模型组小鼠的网织红细胞数及百分率的数值都比正常生长的空白对照组小鼠的小，说明模型组小鼠出现了贫血；如图11和图12，模型组小鼠的血肌酐和血尿素氮的数都比空白对照组小鼠的大，说明模型组小鼠的肾脏功能受损，因此，小鼠肾性贫血模型构建成功。
造好小鼠肾性贫血模型后，对 C～G组5组小鼠进行药效学实验，分别是最大剂量组，每只小鼠灌胃0.5ml浓度为0.3g/ml的BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液，其中BmrhEPO的含量为1257.3IU，按照小鼠的平均体重为17g计算，本组小鼠的口服给药剂量（BmrhEPO有效剂量）为73958.8IU/kg（定为最大剂量）；1/3最大剂量组，将最大剂量组中的BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液用ddH2O稀释3倍，每只小鼠灌胃0.5ml，口服给药量为24652.9IU/kg；1/5最大剂量组，将最大剂量组中的BmrhEPO蚕蛹冻干粉水溶液用ddH2O稀释5倍，每只小鼠灌胃0.5ml，口服给药量为14791.8IU/kg；阳性对照组，皮下注射rhEPO注射液，给药量为200IU/kg，此剂量为rhEPO注射液说明书上人体推荐剂量的10倍；阴性对照组，只灌胃等体积溶剂（0.5mlddH2O）。连续给药12天，分别在给药前当天（命名为0 d），连续给药2 d后、5 d后和12 d后的同一时间点对5组小鼠进行眼内眦微量取血，每只小鼠取40μL血液，避免扎瞎扎死小鼠，并对血样进行血液常规分析。结果显示，如图13和14所示， 阳性对照组（皮下注射rhEPO注射液，剂量为200IU/kg）、最大剂量组（口服BmrhEPO蚕蛹粉，BmrhEPO有剂量为73958.8IU/kg）、1/3最大剂量组（口服BmrhEPO蚕蛹粉，BmrhEPO有剂量为24652.9IU/kg）、1/5最大剂量组（口服BmrhEPO蚕蛹粉，BmrhEPO有剂量为14791.8IU/kg）与阴性对照组（口服）相比都有明显的药效，药效依次递减，三个口服实验组的药效存在剂量依赖，口服药效与剂量正相关。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津耀宇生物技术有限公司
<120> 重组家蚕杆状病毒、其表达的重组蛋白及其制备和应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 582
<212> DNA
<213> hEPO
<400> 1
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacattgc 180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta acttctatgc ctggaagcgc 240
atggaggtcg gccagcaggc cgtagaagtc tggcagggtc tcgctctgct tagcgaagct 300
gtcctgcgcg gccaagcttt attagtgaac tcttcccagc catgggagcc cttgcagtta 360
catgtcgaca aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg tgccctcggt 420
gctcagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctctg cagctccact ccgtacaatc 480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccgt gtctactcca atttcctccg tggcaagctg 540
aagctgtaca caggtgaagc atgccgtaca ggcgatcgtt ga 582
<210> 2
<211> 193
<212> PRT
<213> BmrhEPO
<400> 2
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
Claims (10)
1.一种重组家蚕杆状病毒，其特征在于，该病毒是由重组转移载体pFastBacI-hEPO转化大肠杆菌，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO，然后，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。
2.根据权利要求1所述的重组家蚕杆状病毒，其特征在于，重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕BmN 细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO。
3.权利要求1或2所述的重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备人促红细胞生成素hEPO基因，将hEPO基因克隆到pFast Bac I载体上，得到重组转移载体pFastBacI-hEPO；
2）重组转移载体pFastBacI-hEPO转化大肠杆菌，经蓝白筛选后，得到含重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO的菌株，纯化后得到重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO；
3）将重组杆状病毒质粒Bacmid-rhEPO转染家蚕细胞，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1）为合成hEPO cDNA基因，并将其克隆在PUC19载体上，设计以下引物：上游引物P1：5’-CGGAATTCATGGGGGTGCACGAAT-3’；下游引物P2：5’-CCGCTCGAGTCATCTGTCCCCTGT-3’，分别引入酶切位点EcoR I 和Xho I，进行PCR扩增得到目的基因片段，PCR产物经过EcoR I和Xho I限制性内切酶切割后，使用高效连接酶克隆到pFast Bac I载体的相应的酶切位点上，得到重组转移载体pFastBacI-hEPO。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）所述大肠杆菌为DH10Bac E.coli；步骤3）所述家蚕细胞为家蚕BmN 细胞。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤3）为将Bacmid-rhEPO转染处于对数生长期的BmN 细胞，待细胞发病后，离心收集培养基上清液，得到带有重组人促红细胞生成素rhEPO基因的重组家蚕杆状病毒vBmrhEPO。
7.一种由权利要求1或2所述的重组家蚕杆状病毒接种到家蚕中表达得到重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于，该重组蛋白为SEQ ID NO. 2所示序列。
9.权利要求7或8所述的重组蛋白作为制备治疗肾性贫血口服药物的用途。
10.一种由权利要求1或2所述重组家蚕杆状病毒制备的治疗肾性贫血口服的药物，其特征在于，所述药物的制备方法为：将所述重组家蚕杆状病毒接种家蚕蛹，蚕蛹发病后，以液氮研磨，冻干，制成蚕蛹冻干粉，即得。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150603 |