CN104677808A - 一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明利用电磁阀开关原理，即电磁阀在打开的瞬间对流路中的液体有一个瞬间的吸吮效应，本发明有效地利用吸吮效应，设计构建了一种基于压力吸吮的流动状态下细胞/颗粒分选系统及方法，有效解决了压力驱动分选细胞/颗粒系统中的问题，并提高分选准确度和分选效率。所述分选系统包括细胞信号采集分析单元、微流控芯片和压力控制单元；连续流动的细胞/颗粒流在动力驱动下载微流控芯片微通道中流动，当细胞流经细胞信号采集分析单元检测点时，细胞信号被采集判断，当满足分选条件的特定细胞被检测到时，判别信号激活压力控制单元将特定细胞/颗粒吸吮进入细胞/颗粒分选通道。

Description

一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统和方法

技术领域

本发明属于生物技术和仪器科学领域，具体的说是利用压力吸吮的原理构建实现流动状态下特定细胞/颗粒与群体分离的系统和方法。

背景技术

细胞是生物体结构和功能的基本单位，对单细胞个体差异性机制的研究，可以揭示癌症发病机制，理解细胞分化与组织发育原理，识别基因表达特性与细胞特征。

快速识别、分离获取特定功能表型的单细胞成为单细胞分析的关键技术。流式细胞分选仪在单细胞分选和分析方面的重要仪器平台，是分离细胞的有效手段。然而由于绝大多数活体细胞本身荧光效应较弱或没有荧光，外加荧光标记不适用于活体细胞筛选。另外实现其细胞的物理分离方法相对复杂。单细胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息，可在非标记的条件下实时动态地监测细胞分子结构变化，亦可获得细胞的"分子指纹"，具有敏感性高、实时检测、活样品不需固定或染色、不损伤细胞等众多特点。当其与微流控技术结合，可实现拉曼光谱激活活体单细胞分选。

目前在微流控芯片平台上已经实现的驱动细胞分选/分离的方法包括：电场力、介电力、光镊、压力驱动等。压力驱动包括脉冲激光产生气泡推动、电热产生气泡推动，这些都是基于压力推动细胞/颗粒偏离流型进入分选通道。另外还有通过电磁阀控制外界压力的开关，实现待分选细胞/颗粒偏转流型进入分选通道，这种方法相对简单，易于实现，但采用这种利用电磁阀打开后联通外界压力实现细胞/颗粒偏转的方法存在一个无法克服的缺陷，即当电磁阀打开的一瞬间对液体的吸吮作用会扰动流体在微通道中的流型，尤其是在需要精确控制夹流从而实现单细胞流通过检测点的细胞/颗粒分选系统中的应用受到限制。

发明内容

针对现有技术中存在的上述不足之处，本发明要解决的技术问题是提供一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统和方法。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，包括：分选控制器、压力控制单元、电磁阀、液体导管、细胞/颗粒信号检测器、微流控芯片；

所述细胞/颗粒信号检测器，连接微流控芯片的分选细胞/颗粒出口，用于采集流经该出口的细胞/颗粒信号；

所述分选控制器，连接细胞/颗粒信号检测器，用于将所采集的细胞/颗粒信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的细胞/颗粒信号是否满足分选条件，并将判定结果发送到压力控制单元；

所述压力控制单元，用于根据判断结果控制电磁阀的开启；

所述电磁阀，通过液体导管连接微流控芯片的分选细胞/颗粒出口；

微流控芯片，用于细胞/颗粒悬液在外力驱动下在微通道内定向流动。

所述细胞/颗粒信号采集分析单元是由高速相机、荧光检测器、拉曼光谱检测器和阻抗检测器等其中一种或数种检测器和相应的控制软件构成。

所述微流控芯片由上下两层键和而成，形成用于流体通过的微通道；所述微通道接口包括夹流缓冲液入口、细胞悬液入口、废液出口、分选细胞/颗粒出口；下层设有电极对，距离为15-30微米。

所述微通道为20-150微米宽，10-50微米深的微通道网络。

所述微流控芯片的材质为塑料，玻璃或石英。

所述压力控制单元包括：压力源、微量液体电磁阀、压力控制单元、液体连接微导管。

所述压力控制单元用于控制电磁阀的开关，所述压力源连接电磁阀入口，电磁阀出口通过液体连接导管与所述微流控芯片的连接口相连。

所述压力源为静压力或者低压气瓶。

一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选方法，包括以下步骤：

液体注入：压力驱动细胞悬液和夹流缓冲液分别经细胞悬液入口和夹流缓冲液入口在微通道中流动，调节细胞和缓冲液的流速，实现稳定的单细胞夹流；

细胞/颗粒信号采集和判别：当单细胞/颗粒流经细胞/颗粒信号检测器时，将所采集的细胞/颗粒信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的细胞/颗粒信号是否满足分选条件，并将判定结果发送到压力控制单元；

细胞/颗粒的压力吸吮分选：当压力控制单元中接收到的判定结果为“是”时，压力控制单元产生高电平开启电磁阀，在电磁阀开启的瞬间产生一个吸吮效应，将细胞/颗粒吸入分选细胞/颗粒出口。

所述电磁阀开启后20-30毫秒之内自动关闭。

本发明具有以下优点及有益效果：

1.本发明有效地利用电磁阀开关的原理，设计利用压力吸吮实现特定细胞/颗粒与群体分离的系统和方法。

2.本发明提供的技术方法能有效解决由于压力驱动分选对微流体通道内流型干扰的问题，提供了一套简单可行、适用于不同检测方法的压力驱动细胞/颗粒分选系统和方法。

附图说明

图1为基于压力吸吮的细胞/颗粒分选微流控芯片示意图；

其中，1、夹流缓冲液入口；2、细胞悬液入口；3、废液出口；4、分选细胞/颗粒出口，用于经液体导管10与电磁阀9相连；5，6、电极对，与高频交流信号发生器输出相连；

图2为本发明的系统结构示意图，

其中，7、分选控制器；8、压力控制单元；9、电磁阀；10、液体导管；11、细胞/颗粒信号检测器；12、微流控芯片。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1：基于压力吸吮拉曼激活单细胞分选

如图1、2所示，本实例所构建的石英微流控芯片用于流动状态下基于压力吸吮拉曼激活单细胞分选，其芯片结构见图1，其中包括1、精密微泵或静压力驱动夹流缓冲液入口；2、精密微泵或静压力驱动细胞悬液入口；3、废液出口；4、分选细胞/颗粒出口，用于经液体导管10与电磁阀9相连；5，6、电极对，与高频交流信号发生器输出相连。芯片由上下两层石英基体组成，盖片上包括20-150微米宽，10-50微米深的微通道网络采用湿法刻蚀而得，下层石英基片上微电极结构采用光刻和电极刻蚀液蚀刻而得。上下石英基片经清洗，在显微镜下精确对准，然后真空加热加压键合。电极对5、6通过导线与信号发生器相连。芯片出口和入口通过固定接口和微管与外界相连，实现细胞/颗粒的导入和分离导出。本实例所述的芯片和相关方法实现流动状态下基于压力吸吮拉曼激活单细胞分选。酵母细胞经PBS缓冲液稀释为106-107个/毫升，经静压力或微量注射泵推动以0.1-100毫米/秒速度流动，启动信号发生器周期性产生5-12伏特，频率为0.5兆到10兆赫兹的高频电压信号，当酵母细胞流经电极对5、6时，在介电作用下瞬间捕获细胞，启动分选控制器7和细胞/颗粒信号检测器11开始采集酵母细胞拉曼光谱信号并与判别规则比对。当细胞满足分选条件时，触发压力控制单元10使电磁阀9迅速完成打开/关闭动作，待分选细胞被吸吮进入分选细胞/颗粒出口4所在的细胞采集通道，不满足条件的细胞直接通过废液出口3流入废液池中。

实施例2：基于压力吸吮的荧光细胞分选

本实例所构建的微流控芯片用于流动状态下基于压力吸吮的荧光细胞分选，其芯片结构包括细胞悬液入口2、夹流缓冲液入口1、废液出口3、分选细胞/颗粒出口4与压力偏转控制口相同。微流控芯片12由上下两层基体组成，上层基片包括20-150微米宽，10-50微米深的微通道网络，下层为盖片。上下基片经清洗，在显微镜下精确对准，然后键合。芯片出口和入口通过固定接口和微管与外界相连，实现细胞/颗粒的导入和分离导出。本实例所述的微流控芯片12和相关方法实现流动状态下基于压力吸吮拉曼激活单细胞分选。细胞（表达有荧光蛋白）经PBS缓冲液稀释为106-107个/毫升，经静压力或微量注射泵推动以0.1-100毫米/秒速度夹流进样，其信号被荧光检测器捕获，并与判别规则比对，当细胞满足分选条件，触发压力控制单元8，使电磁阀9迅速完成打开/关闭动作，待分选细胞被吸吮进入分选细胞/颗粒出口4所在的细胞采集通道，不满足条件的细胞直接通过废液出口3流入废液池中。

实施例3：基于压力吸吮的微液滴分选

本实例所构建的微流控芯片12和方法用于流动状态下基于压力吸吮荧光微液滴分选，其芯片结构包括，1、油相入口(夹流缓冲液入口)；2、液滴入口(细胞悬液入口)；3、废液出口；4、分选液滴出口(分选细胞/颗粒出口)，液滴采集口与压力偏转控制口相同。芯片由上下两层基体组成，上层基片包括20-150微米宽，10-50微米深的微通道网络，下层为盖片。上下基片经清洗，在显微镜下精确对准，然后键合。芯片出口和入口通过固定接口和微管与外界相连，实现细胞/颗粒的导入和分离导出。本实例所述的芯片和相关方法实现流动状态下基于压力吸吮荧光微液滴分选。细胞经PBS缓冲液稀释为106-107个/毫升，经静压力或微量注射泵推动以0.1-100毫米/秒速度流动，加有表面活性剂的矿物油经静压力或微量注射泵推动进入通道，形成细胞包裹的微液滴，启动信号检测（检测荧光、明场细胞生长状态），并与判别规则比对，当液滴满足分选条件，触发压力控制单元，电磁阀迅速完成打开/关闭动作，待分选液滴被吸吮进入液滴采集通道，不满足条件的液滴直接流入废液池中。

本发明利用电磁阀开关原理，即电磁阀在打开的瞬间对流路中的液体有一个瞬间的吸吮效应，而在传统的基于压力推动的分选系统中，这种吸吮效应会干扰流型，影响细胞/颗粒的分选准确率，而在本发明中有效地利用吸吮效应，设计构建了一种基于压力吸吮的流动状态下细胞/颗粒分选系统及方法，有效解决了压力驱动分选细胞/颗粒系统中的问题，并提高分选准确度和分选效率。所述分选系统包括细胞信号采集分析单元、微流控芯片和压力控制单元；连续流动的细胞/颗粒流在动力驱动下载微流控芯片微通道中流动，当细胞流经细胞信号采集分析单元检测点时，细胞信号被采集判断，当满足分选条件的特定细胞被检测到时，判别信号激活压力控制单元将特定细胞/颗粒吸吮进入细胞/颗粒分选通道。

Claims (9)

1.一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，包括：分选控制器（7）、压力控制单元（8）、电磁阀（9）、液体导管（10）、细胞/颗粒信号检测器（11）、微流控芯片（12）；

所述细胞/颗粒信号检测器（11），连接微流控芯片（12）的分选细胞/颗粒出口（4），用于采集流经该出口的细胞/颗粒信号；

所述分选控制器（7），连接细胞/颗粒信号检测器（11），用于将所采集的细胞/颗粒信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的细胞/颗粒信号是否满足分选条件，并将判定结果发送到压力控制单元（8）；

所述压力控制单元（8），用于根据判断结果控制电磁阀（9）的开启；

所述电磁阀（9），通过液体导管（10）连接微流控芯片（12）的分选细胞/颗粒出口（4）；

微流控芯片（12），用于细胞/颗粒悬液在外力驱动下在微通道内定向流动。

2.根据权利要求1所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，所述细胞/颗粒信号采集分析单元是由高速相机、荧光检测器、拉曼光谱检测器和阻抗检测器等其中一种或数种检测器和相应的控制软件构成。

3.根据权利要求1所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，所述微流控芯片由上下两层键和而成，形成用于流体通过的微通道；所述微通道接口包括夹流缓冲液入口（1）、细胞悬液入口（2）、废液出口（3）、分选细胞/颗粒出口（4）；下层设有电极对（5、6），距离为15-30微米。

4.根据权利要求3所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，所述微通道为20-150微米宽，10-50微米深的微通道网络。

5.根据权利要求1或3所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，所述微流控芯片的材质为塑料，玻璃或石英。

6.根据权利要求1所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，所述压力控制单元包括：压力源、微量液体电磁阀、压力控制单元、液体连接微导管。

所述压力控制单元用于控制电磁阀的开关，所述压力源连接电磁阀入口，电磁阀出口通过液体连接导管与所述微流控芯片的连接口相连。

7.根据权利要求6所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选系统，其特征在于，所述压力源为静压力或者低压气瓶。

8.一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选方法，其特征在于，包括以下步骤：

液体注入：压力驱动细胞悬液和夹流缓冲液分别经细胞悬液入口（2）和夹流缓冲液入口（1）在微通道中流动，调节细胞和缓冲液的流速，实现稳定的单细胞夹流；

细胞/颗粒信号采集和判别：当单细胞/颗粒流经细胞/颗粒信号检测器（11）时，将所采集的细胞/颗粒信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的细胞/颗粒信号是否满足分选条件，并将判定结果发送到压力控制单元（8）；

细胞/颗粒的压力吸吮分选：当压力控制单元（8）中接收到的判定结果为“是”时，压力控制单元（8）产生高电平开启电磁阀（9），在电磁阀（9）开启的瞬间产生一个吸吮效应，将细胞/颗粒吸入分选细胞/颗粒出口（4）。

9.根据权利要求8所述的一种基于压力吸吮的细胞/颗粒分选方法，其特征在于，所述电磁阀（9）开启后20-30毫秒之内自动关闭。