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CN104640980A - 用于纯化转基因因子vii的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种尤其是用于纯化转基因来源的重组人活化因子VII的抗因子VII亲和配体。组合其他正交色谱步骤的亲和配体允许制备高度纯化的FVII溶液，其完全活化、不含聚集体并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。

Description

用于纯化转基因因子VII的方法
发明领域
本发明涉及尤其是用于纯化转基因来源的重组人活化因子VII的抗因子VII亲和配体。组合其他正交色谱步骤的亲和配体允许制备高度纯化的FVII溶液，其被完全活化、不含聚集体并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。
发明背景
因子VII(FVII)是一种维生素K依赖性糖蛋白，其活化形式(FVIIa)参与凝结过程，在钙和组织因子存在下活化因子X和因子IX。FVII是以406个残基的单肽链形式分泌，具有约50kDa的分子量。FVII包含四个独特结构的结构域：N端γ羧基结构域(Gla)、两个“表皮生长因子(EGF)-样结构域”以及丝氨酸蛋白酶结构域。FVII向FVIIa的活化表征为Arg152-Ile153结构域(精氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解。因此，FVIIa是这样的化合物：具有分子量约20kDa的152个氨基酸的轻链，并且具有分子量约30kDa的254个氨基酸的重链，通过单一的二硫键(Cys135-Cys262)彼此相连。
血浆的FVIIa包含几个翻译后修饰：前十个谷氨酸被γ-羧酸化，Asp63被部分羟基化，Ser52(丝氨酸52)和Ser60(丝氨酸60)被O-糖基化并且分别携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖型，Asn145(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通过二触角(biantennary)二唾液酸化(bisialylated)的复杂结构被N-糖基化。
FVII用于治疗表现为因子VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病)缺陷的血友病患者，以及表现出凝固因子的其他缺陷的患者，例如，FVII的先天性缺陷。因此有必要获得注射用FVIIa浓缩物。
获取FVIIa浓缩物的最古老的方法是从通过血浆分级得到的血浆蛋白质中纯化FVIIa。为这一目的，EP 0 346 241描述了富含FVIIa的级分的制备，其在吸附、接着洗脱包含FVII和FVIIa以及其他蛋白质如因子IX(FIX)、X(FX)和II(FII)的血浆蛋白质的分级二级产物，特别是PPSB的预洗脱液(P＝凝血酶原或FII，P＝前转变素或FVII，S＝斯图亚特因子或FX，以及B＝抗血友病因子B或FIX)后获得。这种方法的缺点在于获取的FVII仍然含有一些痕量的其他凝固因子。
同样地，文献EP 0 547 932描述了基本上不含维生素K依赖因子和FVIII的高纯度FVIIa浓缩物的制备工艺。通过这一工艺获得的FVII，不管其纯度，但仍表现出残留的血栓形成活性。
一般而言，这些方法的主要缺点之一是它们只能产生小量的产物。此外，还难以获取完全不含在血浆中存在的其它蛋白质的产物。最后，尽管在制备血浆凝固因子的每个阶段都实施了一些预防措施来确保它们的病毒和细菌安全性(随访献血者、检测已知病毒和细菌污染的测试、严格的纯化和病毒失活处理以尽可能减少传输血液传播致病物的危险)，然而，并不完全排除致病物污染的风险。此外，克罗伊茨费尔特-雅各布病的新变种的出现造成了通过血液产品非常规致病物传播的恐惧。此外，从献血者采集的血浆体积仍然有限。
因此，自从二十世纪八十年代，编码人因子VII的DNA被分离出来(Hagen等人；Proc.Natl.Acad.Sci.,1986,83(8):2412-6)，并在各种表达体系中表达。
已进一步描述了多种用于重组因子VII的纯化的工艺(参见例如WO2009/141418)。目前的重组因子VII多肽通常是由一个或两个不同的多步工艺纯化，或者只采用在常规树脂上的色谱，或者包括使用具有蛋白质配体的亲合树脂的亲和色谱。
重组因子VII可以通过分批发酵或由转基因哺乳动物产生。特别地，描述了在雌兔的乳腺中产生的FVII组合物，例如在专利申请WO2007/138199中。通过转基因哺乳动物在乳中产生的FVII然后可从乳中纯化，例如通过切向过滤和色谱，或通过钙沉淀，随后数个色谱步骤。
然而，可用的纯化方法并非没有缺点。尤其是可能仍然存在来自转基因哺乳动物的天然蛋白质，特别是来自转基因哺乳动物的天然因子VII，这会在向人类患者给药时触发免疫原性。
发明概述
本发明的一个目的是一种从源生物材料纯化转基因因子VII(TgFVII)和/或转基因活化因子VII(TgFVIIa)的方法，包括亲和色谱的步骤，该亲和色谱包括步骤：
(a)在允许TgFVII和/或TgFVIIa结合配体的条件下，使含有TgFVII和/或TgFVIIa的源生物材料接触对TgFVII和/或TgFVIIa特异的配体，和
(b)通过以非破坏性的方式打断与所述配体的相互作用，回收TgFVII和/或TgFVIIa。
在本发明的实施方案中，配体是针对至少一种TgFVII和/或TgFVIIa表位，或其功能片段或衍生物的抗原结合蛋白质。优选地，配体包括形成两个完整的抗原结合位点的两条重多肽链且缺乏轻多肽链，并且是源自骆驼科的免疫球蛋白重链。
在一个实施方案中，本发明方法是这样的，即步骤(b)包括至少一个洗涤步骤，用于在从配体洗脱TgFVII或TgFVIIa之前除去未结合的材料，并且进一步任选地包括用于除去结合在树脂上且具有比TgFVII或TgFVIIa更弱亲和力的污染物的第二洗涤步骤。
在本发明的一个实施方案中，用于纯化TgFVII或TgFVIIa的源生物材料获自生产TgFVII和/或TgFVIIa的转基因动物。优选地，所述动物是雌性哺乳动物，并优选雌兔，以及源生物材料是乳。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(a)之前的收集并澄清乳的预备步骤。优选地，通过加入柠檬酸盐，然后过滤来执行乳澄清步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在离子交换剂上的条件下，在离子交换剂上，并优选在阴离子交换剂上，对洗脱的TgFVII和/或TgFVIIa的色谱纯化的步骤c)。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在伪亲和树脂上的条件下，在伪亲和树脂，并优选在羟磷灰石上，对洗脱的TgFVII和/或TgFVIIa的色谱分离的步骤d)。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括在尺寸排阻支持物上对洗脱的TgFVII和/或TgFVIIa的色谱分离的步骤e)。这一步骤优选地致力于TgFVII和/或TgFVIIa抛光和配制。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括消除和/或灭活病毒的至少一个步骤，优选通过纳米过滤和/或通过溶剂/去污剂处理。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括配制、杀菌和冷冻干燥经纯化的TgFVII和/或TgFVIIa的最终步骤。
在一个实施方案中，在亲和色谱步骤期间，本发明的方法还包括步骤：
(a)在使所述配体结合TgFVII和/或TgFVIIa的条件下，用来自含有重组产生的TgFVII和/或TgFVIIa的转基因雌兔的乳装载已经固定有如上所定义的配体的色谱树脂；
(b1)洗涤未结合的材料；
(b2)洗涤具有对配体的亲和力比TgFVII和/或TgFVIIa更弱的污染物；和
(B3)从树脂洗脱TgFVII和/或FVIIa。
在一个实施方案中，在本发明方法的亲和色谱步骤期间，所述用于除去弱结合的材料的第二洗涤步骤是由包含10％至50％的疏水剂的缓冲液执行，并且其离子强度是从200至600mM的范围。
在一个实施方案中，在本发明方法的亲和色谱步骤期间，所述用于从树脂洗脱TgFVII和/或TgFVIIa的洗脱步骤是由包含20％到70％的疏水剂的缓冲液执行，并且其离子强度是从500至2500mM的范围。
参考以下列出的附图，本发明的其它特征和优点将从作为非限制性实例给出的本发明实施方案的以下描述中显而易见。
附图的简要说明
图1展示具有重多肽链而缺少轻链的骆驼科免疫球蛋白的IgG1、IgG2和IgG3形式的图示。
图2展示在本发明工艺期间的RMP清除的图示。RMP水平以ppm指示作为该工艺的步骤的函数。
图3展示在本发明工艺期间的DNA清除的图示。DNA水平以ppb指示作为该工艺的步骤的函数。
图4展示通过纯化工艺的TgFVII活化。泳道1-9分别对应于：泳道1和9：分子量，泳道2：澄清乳，泳道3：FVII-选择的洗脱液(在本发明的配体亲和色谱之后)，泳道4：中间产物1(在超滤后和渗滤后)，泳道5：纳米过滤，泳道6：QSXL洗脱液，泳道7：CHT-I洗脱液，泳道8：SEC池。
图5展示了在预过滤和溶剂/去污剂处理(样品命名为初始加载)的步骤后，以及在亲和FVII选择色谱(样品命名为洗脱液A)洗脱后，在样品中的病毒负载的直方图。
发明详细说明
转基因因子VII或因子VIIa
本发明纯化方法特别地是依赖于使用对转基因因子VII(TgFVII)和/或转基因活化因子VII(TgFVIIa)表现出特异性亲和力的配体。
用于本发明中的转基因因子VII和因子VIIa的氨基酸序列是已知的。特别地，转基因因子VII的氨基酸序列与人因子VII的氨基酸序列(如在美国专利号4,784,950中公开)相同。
源生物材料
本发明的方法尤其用于纯化从各种生物来源获得的转基因FVII和/或FVIIa，它们在此被称为“源生物材料”。
在本发明的一个实施方案中，源生物材料含有转基因FVII和/或FVIIa并且获自已被修饰来产生转基因FVII和/或FVIIa的转基因动物(或者是已被修饰的动物的后代)的体液的分级。转基因动物优选哺乳动物，例如牛、兔、山羊、绵羊等。优选地，含有TgFVII和/或TgFVIIa的源生物材料是哺乳动物乳的样品，即在其乳中生产转基因FVII和/或FVIIa的转基因哺乳动物乳的样品。
用于在转基因动物的乳中生产转基因FVII蛋白质的方法可以包括以下步骤：将包含编码转基因FVII(其氨基酸序列对应于人FVII)的基因的合成的DNA分子转移到非人哺乳动物胚胎中，该基因是由乳中天然分泌的蛋白质的启动子控制的。随后将胚胎引入相同物种的雌性哺乳动物中，该雌性哺乳动物然后生出转基因动物。一旦对象充分发育，诱导哺乳动物泌乳并收集乳。乳将含有所需的重组蛋白。EP 0 527 063提供了在除了人类以外的其他雌性哺乳动物的乳中制备转基因FVII(TgFVII)的工艺的一个实例。在这个具体实施方案中，通过引入含有用于WAP基因的启动子的序列构建了含有WAP启动子的质粒，并且这一质粒是以它可以接收呈现为依赖WAP启动子的外来基因的方式所创建的。编码转基因FVII的基因被掺入，并呈现为依赖WAP启动子。通过显微注射到兔胚胎的雄性原核中，含有该启动子和编码转基因FVII蛋白的基因的质粒用来获得转基因动物，如兔。将胚随后转移至激素制备的雌性的输卵管中。
纯化方法
本发明提供了用于纯化转基因FVII和/或FVIIa的方法。特别地，这样的方法包括使含有TgFVII和/或TgFVIIa的源生物材料接触对TgFVII和TgFVIIa高度特异的配体。
转基因FVII或FVIIa(TgFVIIa)在转基因兔的乳中的生产导致众多需要被清除的杂质的存在。本发明的工艺尤其设计用于从转基因兔的乳中纯化转基因FVII或FVIIa(TgFVIIa)，同时除去伴随的污染分子(所谓的宿主相关的杂质(HRI))，包括兔乳蛋白质(RMP)，也包括兔DNA和其它作为兔血清蛋白可能污染兔乳的分子。残留的血清蛋白(如白蛋白、兔FVII、免疫球蛋白和转铁蛋白)由于从血流被动渗入乳中而可被引入到乳源材料中。
乳实际上对应于可溶性乳清蛋白、不溶性酪蛋白微团和乳脂肪球的非灭菌的胶体悬浮液。TgFVII，由乳房上皮细胞合成并分泌，发现于可溶性乳清级分中。潜在的污染RMP包括但不限于：酪蛋白；乳清蛋白、乳球蛋白和乳铁蛋白。五种蛋白质家族：转铁蛋白、酪蛋白、白蛋白、乳清酸蛋白和免疫球蛋白(Ig)-表现出代表总兔乳蛋白的约90％。
另外，在本发明的一个实施方案中，本发明的纯化工艺也被设计成将在乳中表达的酶原TgFVII活化为TgFVIIa。遗憾的是，TgFVIIa一旦被活化就变得对补充裂解敏感。TgFVII和/或TgFVIIa裂解将导致TgFVII部分或完全丢失富含Gla区或导致轻链(LC)或重链(HC)裂解，所述裂解会限制分子的效力。因此可能有工艺中的TgFVIIa降解成非活性裂解产物或工艺中的TgFVII氧化，这需要被消除以保证对FVII的治疗适合性。
澄清
乳澄清作为乳的早期处理可以任选地由在专利申请WO2007/138198或WO2008/099077中描述的程序来执行，但是在应用本发明之前对于乳处理没有限制。任选地，也可以绕过澄清，例如，如果工艺的第一步是由流化床亲和捕获来执行。任选地，也可以在纯化之前通过在乳行业可获得的任何技术执行脂肪倾析或脱脂分离。在本发明的一个实施方案中，优选地，乳与柠檬酸盐缓冲液混合以迅速得到稳定化的乳的血浆状相，然后通过液相分离(如离心或倾析)随后通过深度过滤获得脂肪分离。在本发明的一个实施方案中，优选地，有利地执行深度过滤，以通过组合低切应力、非氧化的技术，以及来自乳收集的相关杂质的快速生物负载降低和尺寸截留来制备TgFVII和/或TgFVIIa完整生物活性分子。在这样的实施方案中，深度过滤器的相对孔径是从30至0.1μm的范围，并且深度过滤优选通过相序的25至0.5μm过滤之后0.5μm至0.1μm过滤来实施。具有或没有粒状佐剂或其他助滤化合物的基于纤维素的深度过滤器非常适于此步骤。在本发明的一个实施方案中，柠檬酸盐浓度和工艺温度范围是从0.15M到饱和柠檬酸盐以及从15℃至30℃，优选从0.2M至0.5M的柠檬酸盐以及从22℃至27℃。柠檬酸盐和温度的这些组合对于保持在微米级的乳蛋白质尺寸群体以及获得透明的血浆状相溶液是必要的。“透明”意指在本发明工艺中的澄清乳展现出500NTU(标准化浊度单元)以下的受控浊度或在λ400纳米分光光度计读取的1000AU(相对吸光度单位)以下的光密度。
在这些条件下，可以有利地执行用0.2μm孔径的膜过滤，以减少在蛋白质的生物源中的生物负载电荷。
得到的生物负载减少且稳定的溶液可以任选地在-20℃以下的低温下贮存数月。
对特异性配体的亲和色谱
配体
本发明用于从源生物材料纯化TgFVII/TgFVIIa的方法包括通过亲和色谱在对转基因FVII/FVIIa特异的配体上的至少一个分离步骤。
在本发明的一个实施方案中，所述亲和配体是一种分离的抗原结合蛋白质，其包含形成完整的抗原结合位点或若干个抗原结合位点的两条重多肽链，而进一步缺少轻多肽链。在本发明方法中使用的抗原结合蛋白质因此通常由重链二聚体组成而没有轻链。两条重多肽链足以形成一个或多个完整的抗原结合位点。“完整的抗原结合位点”根据本发明意指单独就能识别和完全结合抗原的位点，其可以通过任何已知的检测结合亲和力的方法进行验证。
在本发明方法中使用的抗原结合蛋白质的重链不具有用于与相应轻链(它们不存在)相互作用的特殊特征，并因此与常见的免疫球蛋白重链有很大不同。尽管它们的结构特殊，所述抗原结合蛋白质仍然能够显示出相比于标准的四链模型免疫球蛋白至少相当并且优选提高的功能特性。形成所述抗原结合蛋白质的重链因此表现为本质上更适用于被原核和低等真核细胞分泌。
在一个具体实施方案中，在本发明方法中用作亲和配体的抗原结合蛋白质的特征在于，其重多肽链包含可变区(VH)和恒定区(CH)，但是缺乏其恒定区的第一结构域(称为CH1)。这些不具有CH1结构域的抗原结合蛋白质因此使得它们链的可变区直接连接到在可变区的C端部分的铰链区。WO 94/25591公开了大规模制备这种重链抗体或其片段的方法，包括用编码所述抗体或片段的可表达的DNA序列转化霉菌或酵母。在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合蛋白质也可以按WO 94/04678中所述获得。
如在本发明方法中使用的重链免疫球蛋白的可变结构域不具有与VL或与CH1结构域的正常相互作用位点，它们不存在于重链免疫球蛋白中。这种免疫球蛋白在文献中也通常被命名为“VHH”。
在一个实施方案中，在本发明方法中用作配体的抗原结合蛋白质的特征在于，它们的可变区在位置45含有与亮氨酸、脯氨酸或谷氨酰胺残基不同的氨基酸。
在一个具体的实施方案中，在本发明方法中用作亲和配体的抗原结合蛋白质的特征在于，它们的可变区包含框架(FW)和互补决定区(CDR)，特别是4个框架和3个互补区。因此，它们与标准的四链免疫球蛋白的区别尤其在于这一可变区本身可以包含一个或数个抗原结合位点，并且不需要轻链可变区的贡献这一事实。
框架1和4的氨基酸序列分别包含选自以下的氨基酸序列等：
对于框架1结构域：
GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD(SEQ ID NO：1)
GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS(SEQ ID NO：2)
GGSEQGGGSLRLSCAISGYTYG(SEQ ID NO：3)
GGSVQPGGSLTLSCTVSGATYS(SEQ ID NO：4)
GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPYS(SEQ ID NO：5)
GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS(SEQ ID NO：6)
GGSVQAGGSLRLSCVSFSPSS(SEQ ID NO：7)；
对于框架4结构域：
WGQGTQVTVSS(SEQ ID NO：8)
WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：9)
WGQGAQVTVSS(SEQ ID NO：10)
WGQGTQVTASS(SEQ ID NO：11)
RGQGTQVTVSL(SEQ ID NO：12)和/或，
对于CDR3结构域
ALQPGGYCGYGX----------CL(SEQ ID NO：13)
VSLMDRISQH------------GC(SEQ ID NO：14)
VPAHLGPGAILDLKKY------KY(SEQ ID NO：15)
FCYSTAGDGGSGE---------MY(SEQ ID NO：16)
ELSGGSCELPLLF---------DY(SEQ ID NO：17)
DWKYWTCGAQTGGYF-------GQ(SEQ ID NO：18)
RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY(SEQ ID NO：19)
QKKDRTRWAEPREW--------NN(SEQ ID NO：20)
GSRFSSPVGSTSRLES-SDY-NY(SEQ ID NO：21)
ADPSIYYSILXIEY--------KY(SEQ ID NO：22)
DSPCYMPTMPAPPIRDSFGW-DD(SEQ ID NO：23)
TSSFYWYCTTAPY---------NV(SEQ ID NO：24)
TEIEWYGCNLRTTF--------TR(SEQ ID NO：25)
NQLAGGWYLDPNYWLSVGAY-AI(SEQ ID NO：26)
RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY(SEQ ID NO：27)
DGWTRKEGGIGLPWSVQCEDGYNY(SEQ ID NO：28)
DSYPCHLL--------------DV(SEQ ID NO：29)
VEYPIADMCS------------RY(SEQ ID NO：30)
在一个实施方案中，抗原结合蛋白质的恒定区包含CH2和CH3结构域，其包含选自以下组的序列的氨基酸序列：
对于CH2结构域：
APELLGGPTVFIFPPKPKDVLSITLTP(SEQ ID NO：31)
APELPGGPSVFVFPTKPKDVLSISGRP(SEQ ID NO：32)
APELPGGPSVFVFPPKPKDVLSISGRP(SEQ ID NO：33)
APELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRP(SEQ ID NO：34)
对于CH3结构域：
GQTREPQVYTLA(SEQ ID NO：35)
GQTREPQVYTLAPXRLEL(SEQ ID NO：36)
GQPREPQVYTLPPSRDEL(SEQ ID NO：37)
GQPREPQVYTLPPSREEM(SEQ ID NO：38)
GQPREPQVYTLPPSQEEM(SEQ ID NO：39)
优选地，抗原结合蛋白质的特征在于它们的铰链区包含0到50个氨基酸。这些蛋白质的铰链区的特定区域是以下序列：
GTNEVCKCPKCP(SEQ ID NO：40)或，
EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP(SEQ ID NO：41)
短铰链区对应于IgG3分子而长铰链序列对应于IgG2分子。
在一个具体的实施方案中，在本发明方法中用作配体的抗原结合蛋白质可以从动物中分离，更具体地从骆驼科，并且优选从骆驼科的血液中分离。在进一步的实施方案中，抗原结合蛋白质源自骆驼科免疫球蛋白，并且更具体地源自旧世界骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus)和单峰骆驼(Camelus dromedarius))或新世界骆驼(羊驼(Lama pacos)、美洲驼(Lamaglama)和小羊驼(Lama vicugna))的免疫球蛋白。根据它们所来自的动物，抗原结合蛋白质的分子量可以是从约43kDa至约47kDa，特别是45kDa。
在一个实施方案中，这些抗原结合蛋白质可能通过将它们恒定区的全部或一部分替换为人抗体的恒定区的全部或或一部分而已被修饰，并且尤其是人源化。例如，所述抗原结合蛋白质的CH2和/或CH3结构域可以被IgGγ3人免疫球蛋白的CH2和/或CH3结构域替代。在这样的人源化的抗原结合蛋白质中，可变序列的一部分，并且特别是不干涉结合位点的一个或多个框架残基也可以被人抗体框架残基替代。所述抗原结合蛋白质可以包含G型免疫球蛋白并且尤其是被定义为2类免疫球蛋白(IgG2)或3类(IgG3)免疫球蛋白的免疫球蛋白。
上述抗原结合蛋白质的优势依赖于这样的事实，即缺少轻链可变结构域就意味着因配对不同组合的可变结构域的可能性而产生的在抗体库中的可变性的额外维度是不存在的，所以制备针对特定抗原(在此是转基因FVII/FVIIa)的抗原结合蛋白质以避免产生大量无关的抗原结合蛋白质是可能的。第二个优点是VHH结构域已被证明比传统抗体显著更稳定，因此基于所述抗原结合蛋白质的色谱分离预计是显著更加稳健的。此外，缺乏对与用于维持结构和功能完整性的轻链可变结构域的相互作用的依赖性在便于生产和在溶液中的行为方面给予这些VHH结构域优于其他小抗体片段的大量优点。特别是，VHH片段是尤其适用于免疫亲和纯化的分子，因为它们不寻常的稳定性和它们在完全变性后有效地再折叠的能力，这经常在抗原的洗脱过程中发生。
当在本发明方法中使用的亲和配体是如上所定义的抗原结合蛋白质时，它可以针对任何转基因FVII/FVIIa的表位，条件是所述表位对该转基因FVII/FVIIa是特异的。这样的表位包括由氨基酸、多肽、碳水化合物，或它们的混合物组成的任何结构。
措词“对转基因FVII/FVIIa特异的配体”意指用于本发明的亲和色谱步骤的配体基本上不结合至任何其他蛋白质，或基本上限制任何其他蛋白质的结合，其中包括来自其它物种的FVII或FVIIa，如兔或山羊FVII或FVIIa。在本发明使用的配体优选对转基因因子VII或因子VIIa具有超过1μM的亲和力，并且可以有利地对转基因FVII或FVIIa具有至少100nM，更优选从1到10nM的亲和力。在一个具体的实施方案中，相比于兔FVII或FVIIa，本发明中使用的配体以一个log以上的差异结合转基因FVII或FVIIa。措词“基本上限制蛋白质的结合”意指在本发明中使用的配体允许以至少4 log或99.99％除去在装载到色谱支持物上的初始溶液中所含的宿主相关杂质(HRI)，以及以至少3 log或99.9％除去由用于表达转基因FVII的转基因哺乳动物内源产生的FVII或FVIIa蛋白质。
在一个实施方案中，在从亲和支持物洗脱的级分中的内源性因子VII或因子VIIa的质量相对于装载到柱上的初始溶液中的这些蛋白质的质量减少100倍，优选1000倍，或最优选10000倍或更多。相比之下，装载到FVII特异性配体并在洗脱级分中回收的转基因因子VII或因子VIIa的相对质量为初始装载溶液中的这些蛋白质的质量的至少30％，优选至少50％或更多。
在一个具体的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白质(配体)具有如下的动力学结合常数：Ka＝2.58x108M以及Kd＝9.88x10-9M。
上述抗原结合蛋白质的任何功能片段与或功能性衍生物还可以用作配体以在本发明的方法中特异性结合转基因因子VII和/或活化的转基因因子VII(FVIIa)。
上述抗原结合蛋白质的“功能性片段”是这样的片段，其对人因子VII或因子VIIa显示出强亲和力，并优选与它所来源的抗原结合蛋白质对于人FVII或FVIIa具有基本上相同的亲和力，或是由它所来源的抗原结合蛋白质所示的至少约50％，还优选至少约60、70、80或90％的亲和力。
被涵盖在本发明方法中用作配体的片段包括没有轻链的抗原结合蛋白质的一条重多肽链，由上述抗原结合蛋白质的酶消化获得的片段，尤其是通过用木瓜蛋白酶部分消化产生Fc片段(恒定片段)以及产生FVHh片段(含有重链的抗原结合位点)或它的二聚物F(VHh)2得到的那些，或通过进一步用木瓜蛋白酶消化Fc片段产生对应于Fc片段的C端部分的pFc片段而获得的片段，用其他蛋白水解酶获得的同源片段，抗原结合蛋白质的可变区的至少10个，优选20个氨基酸的片段，或完整的可变区，尤其是对应于分离的VH结构域或对应于连接到铰链的VH二聚体的片段，以及对应于抗原结合蛋白质的恒定区的至少10个，优选20个氨基酸或对应于完整恒定区的片段。
“功能性衍生物”意指这样的多肽，其与在本发明方法中用作配体的抗原结合蛋白质区别在于氨基酸的一个或几个置换、缺失或添加以达到该衍生物对于转基因FVII或FVIIa显示出结合亲和力和特异性的程度。“功能性衍生物”优选与上述抗原结合蛋白质显示出对于转基因FVIIa基本上相同的亲和力或显示出由所述抗原结合蛋白质对转基因FVIIa所示的至少约90％，还优选至少约50、60、70、或80％的亲和力。所述功能性衍生物包括与上述抗原结合蛋白质显示出高同一性百分比的同源物，它们与其是至少80％、85％、90％、95％或99％相同的，优选与上述抗原结合蛋白质区别为一个或几个保守性置换。
在本发明的一个实施方案中，抗原结合蛋白质被固定在固体相上。固定化可以通过吸附或通过化学交联来实现。
通常，通过将固体相表面暴露于蛋白质的溶液从而令蛋白质通过非特异性结合机制吸附在固体相表面上而使得蛋白质与固体表面，如色谱介质附着。蛋白质固定在色谱介质的方法已在文献中充分建立，参见例如，Boschetti E.,Egly J.M.,Monsigny M.,1983,Practical Guide for use inAffinity chromatography and related techniques，第二版，IBFVilleneuve-la-garenne,France，第1-157页。其中固体表面由疏水材料例如聚苯乙烯提供，例如，然后一般通过蛋白质的疏水区吸附在疏水表面而带来附着。
在制备固定化的蛋白表面中吸附蛋白质的方法的替代或改进是可获得的。
一种替代的方法是使用蛋白质中的残基的化学交联以利用常规的偶联化学品，共价附着到活化的固体表面，如描述于Boschetti E.,Egly J.M.,Monsigny M.,1983,Practical Guide for use in Affinity chromatographyand related techniques，第二版，IBF Villeneuve-la-garenne,France，第1-157页。例如，掺入巯基的氨基酸残基，如半胱氨酸，可以使用双特异性试剂如琥珀酰亚氨基-马来酰亚氨基苯丁酸(SMPB)被共价附着。
替代地，位于配体表面的赖氨酸基团可通过使用1,乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的常规的碳二亚胺偶联而被偶联到在固体表面上的活化的羧基基团。也可以使用肽尾形式的延伸附着配体，通过非共价吸附或使用常规化学交联剂固定到固相。
根据本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白质通过使用常规偶联化学品的共价交联被附着于固相。所述固相可以天然地包括适于共价附着的可交联残基，或者它可以根据本领域中公知的方法被包被或衍生而引入合适的可交联基团。
在其上发生固定化的固相可以由各种材料来提供，并且可以适当地是在固定蛋白质中常规使用的任何固体相载体材料。本发明的方法可直接或经过预处理后利用任何适合于蛋白质或蛋白质片段固定化的固相材料来应用。载体材料可以是微粒(例如微珠或颗粒，一般用在提取柱中)，或片形式(例如膜或过滤器，玻璃或塑料载玻片，微量滴定测定板，浸渍片，毛细管填充装置等)，它可以是平的、打褶的、或中空纤维或管。以下介质作为示例给出但并不详尽，这样的例子可包括二氧化硅(多孔无定形二氧化硅)，例如由Biotage(Dyax公司的分公司)提供的含60A不规则二氧化硅的FLASH系列筒(32-63μm或35-70μm)，琼脂糖或聚丙烯酰胺支持物，例如由Amersham Pharmacia Biotech提供的琼脂糖范围产品，或由Bio-Rad提供的Affi-Gel支持物。此外，还有大孔聚合物，如由Bio-Rad提供的压力稳定的Affi-Prep支持物。可被使用的其他支持物包括；葡聚糖、胶原、聚苯乙烯、甲基丙烯酸酯、藻酸钙、可控孔玻璃、铝、钛和多孔陶瓷。在一个优选的实施方案中，树脂用作固相，包括市售的树脂，如 以及交联的琼脂糖，和大孔聚苯乙烯或聚丙烯酸酯。固相也可以是主要无机性质，如大孔玻璃或粘土矿物，或树脂和无机物的组合，如Ceramic 或硅胶。
装载步骤
可以在装载包括上述配体的亲和性支持物之前任选地预处理含转基因FVII/FVIIa的源生物材料(例如，通过澄清或过滤步骤)。
源生物材料优选在装载到包括该配体的亲和性支持物之前进行调节。在本发明的一个实施方案中，加样缓冲液的pH从约6.0至8.0调节。为了本发明色谱步骤的目的，合适的加样缓冲液典型地对应于包含缓冲剂(通常磷酸盐、柠檬酸盐或tris)的水溶液。然而，也可以使用所有pK接近中性的羧酸或两性离子缓冲剂。可以以从0至50mM(最终浓度)的范围将二价离子，如钙、镁、锌等添加到加样缓冲液中。
装载步骤通常以每小时10至72个柱体积(CV)的流速进行，并优选以18至54CV/小时。在一些实施方案中，装载流速范围从30至48CV/小时，优选为36CV/小时。这些特定的范围允许转基因FVII/FVIIa与配体的足够的接触时间而不会时间过多形成非解离复合物。
在本发明的一个实施方案中，装载的材料在被装载到柱上后漂洗，直到洗脱掉非特异性结合剂和污染物。
第一洗涤步骤-除去未结合的材料
在本发明的一个实施方案中，进行第一洗涤步骤以洗脱包含在上样溶液中的未结合的材料。所述第一洗涤优选用pH在2至9范围的洗涤缓冲液进行。在一些实施方案中，第一洗涤缓冲液在施用到亲和树脂时的pH范围从3至10，从3至7，从5至9，从6.5至8.5或从6.5至10.0。在某些感兴趣的实施方案中，第一洗涤缓冲液的pH范围为从4.0至7.0，从7.0到9.0，或从4.5到8.5。
在第一洗涤步骤期间，存在于源材料中的污染蛋白质和固定化配体之间的弱相互作用可以通过在上述特定pH范围内的这种缓冲液减少。静电斥力相互作用确实有利地用于洗脱弱结合蛋白。
第一洗涤步骤通常以每小时10至72个柱体积(CV)的流速进行，并优选18至54CV/小时。在一些实施方案中，洗涤流速范围为30至48CV/小时，并优选为36CV/小时。在本发明的一个实施方案中，第一洗涤缓冲液是含有缓冲剂(通常是磷酸或Tris)的水溶液。然而，也可以使用所有pK接近中性的羧酸或两性离子缓冲剂。
在一个实施例中，第一洗涤缓冲液包含0至100mM，优选50mM Tris缓冲液，在pH 6.5和8.5之间，最优选pH 7.5。
应当理解的是，洗涤步骤可以通过使用一种、两种或数种不同的洗涤缓冲液，或通过应用梯度洗涤缓冲液而延长。
第二洗涤步骤-除去弱结合的材料
在本发明的一个实施方案中，有利地在洗脱TgFVII/TgFVIIa之前应用第二洗涤缓冲液，用于消除结合在树脂上但具有比TgFVII或TgFVIIa弱的亲和力的污染物。在一个实施方案中，第二洗涤缓冲液含有醚二醇化合物和至少一种可溶性盐。
在本发明的一个实施方案中，第二洗涤缓冲液的离子浓度用氯化钠或离液盐，如镁增加。在一个实施方案中，离子强度用离子组分如单价或多价阴离子和/或阳离子的盐增加。在一个实施方案中，离子强度或离子浓度范围为200至600mM，或更优选300至500或350至450mM。同时，缓冲液的疏水性用疏水剂如乙二醇或丙二醇增加。在一个实施方案中，在第二洗涤缓冲液中的疏水剂的百分比为从10％至50％，从20％至40％，以及优选从25％至35％的范围。
“弱结合的材料”意指第二洗涤步骤触发除去对本发明方法中使用的亲和配体具有至少100μM，优选至少10μM的亲和力(Kd)的材料。
在一个实施方案中，第二洗涤缓冲液的离子和疏水强度一起增加以除去尽可能多的，优选是全部的结合在亲和树脂上的污染物。
第二洗涤缓冲液优选包含在pH从6.5到8.5的Tris缓冲液中0至40％的乙二醇醚和0至0.5M的钠盐。在一个优选的实施方案中，第二洗涤缓冲液包含在pH 7.5的Tris缓冲液中30％丙二醇和0.4M的NaCl。
还应当指出的是，第二洗涤步骤和洗脱步骤不必是分开的步骤，而也可以组合，特别是如果在洗脱步骤中使用梯度洗脱缓冲液。
洗脱步骤
在洗涤步骤后，用洗脱缓冲液洗脱结合在亲和柱的配体上的TgFVII/TgFVIIa，并且将TgFVII和/或TgFVIIa的纯化溶液作为洗脱液收集。人FVII或FVIIa的解吸优选通过改变物理化学条件，使得抗原结合配体不再结合人FVII或FVIIa而实现。洗脱可以通过改变pH、盐、温度的条件或任何其它合适的措施来实现。
措词“以非破坏性的方式打断与所述配体的相互作用”，意指在洗脱所述转基因FVII形式时，TgFVII和/或TgFVIIa的完整性和功能性被保留。
在一个实施方案中，洗脱是用具有pH低于3.0的缓冲液进行的，但是快速中和至pH超过6.0对于维持洗脱分子的生物活性是必要的。
洗脱缓冲液通常是包括缓冲剂，典型地，磷酸盐或Tris的水溶液。然而，也可以使用所有pK接近中性的羧酸或两性离子缓冲剂。洗脱步骤优选用具有pH从2至10的洗脱缓冲液进行。在一些实施方案中，pH范围从3至9，从5至8，并且最优选从7至8。静电斥力相互作用不足以打断TgFVII或TgFVIIa和配体之间的特异性亲和相互作用。洗脱缓冲液可进一步有利地包括任何允许保持TgFVII/TgFVIIa生物活性而不丧失转导后转化(post-traductional transformations)如糖基，或避免其聚集或氧化的另外的组分。
优选地，洗脱缓冲液的离子强度用氯化钠或离液盐如镁而增加。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的离子强度范围从500至2500mM，从1000至1800mM，或优选从1200至1600mM。
优选地，洗脱缓冲液的疏水性用疏水剂如乙二醇或丙二醇而增加。在一个实施方案中，疏水剂在洗脱缓冲液的百分比范围从20％至70％，从30％至50％，或优选从40％至50％。
最优选地，洗脱缓冲液的离子强度和疏水性在pH从7至8的缓冲液中一起增加。在一个实施方案中，洗脱缓冲液中的疏水剂的百分比范围从20％至60％并且其离子强度范围从0.5到2.0M。优选地，疏水剂的百分比范围从30％至50％并且离子强度范围从1.0至1.8M或疏水剂的百分比范围从40％至50％并且离子强度范围从1.2至1.6M。
在一个优选的实施方案中，活性的且稳定的TgFVII和/或TgFVIIa分子解吸是由缓冲液进行的，其在pH 7.5Tris缓冲液中包括45％丙二醇和1.5M氯化钠。
洗脱步骤通常以每小时10至72个柱体积(CV)的流速进行，并优选18至54CV/小时。在一些实施方案中，洗脱流速范围为30-48CV/小时，并优选为36CV/小时。当流速增加时，与游离的固定化配体的潜在重新缔合减少，并且TgFVII在洗脱级分中的回收提高。这种影响主要与配体对TgFVII或TgFVIIa的强亲和力有关。
在本发明提出的亲和纯化后，制备了90％以上纯的TgFVII/TgFVIIa，代表超过4个十进制对数的兔乳蛋白(RMP)减少(4 log10或99.99％减少)。然而，RMP通常低于500 000ppm，优选低于100 000ppm并且最优选低于50 000ppm。兔转铁蛋白已被证明是一种最重要的伴随污染RMP。
为了将RMP降至非常低的水平，通常低于5ppm，纯化方案必须整合各种正交方法。“正交方法”意指采用了彼此不同的分离机制的多步纯化方法。在本发明中纯化是基于色谱方法，这是由于它们为放大的选择性、效率和简单性。这些方法的组合是专门设计的以确保最终的高TgFVII和/或TgFVIIa质量，不含聚集体，并且具有非常低水平的降解和氧化形式。
此外，申请人已经发现了亲和色谱的意想不到且令人惊奇的性质，特别是它对于包膜病毒如鼠白血病病毒(MLV)和非包膜病毒如猪细小病毒(PPV)的病毒滴度降低的改善能力。
在一个特别优选的方式中，执行亲和色谱的步骤以获得优于3 log10，优选优于4 log10，更优选优于5 log10的病毒降低系数(RF)。
“病毒降低系数”意指在实施色谱步骤之前测量的病毒量的值(滴度X体积)(即初始负载的病毒滴度值)与实施色谱步骤后测量的病毒量的值(滴度X体积)(即在洗脱液中测量的滴度值)之间的比率结果。病毒滴度是使用斯皮尔曼寇氏公式计算的，描述于Federal Gazette N°84,1994年5月4日以及Schmidt,N.J.&Emmons,R.W.(1989)in Diagnostic Procedures forViral,Rickettsial and Chlamydial Infection，第6版。
超滤/渗滤
根据本发明，亲和纯化的材料可被渗滤或稀释以在进一步纯化之前降低离子强度。在本发明的一个实施方案中，使用截断范围从5至50kDa，优选10至30kDa的超滤膜。通过缓冲液交换，离子强度降低到含有钠盐的缓冲液的1至50mM，优选5至15mM的范围，并且在本发明的一个实施方案中是柠檬酸钠盐。
在本发明的一个实施方案中，在该步骤中可有利地完成长期存储，并优选在-20℃以下的低温下。
在本发明的一个实施方案中，通过减盐、通过长期存储以及通过微生物去除来稳定的亲和纯化的材料可以进一步被纯化。
离子交换色谱法
根据本发明的一个优选实施方案中，本发明的方法还包括至少一个离子交换色谱步骤以进一步纯化TgFVII和TgFVIIa。
优选地，在阴离子交换树脂上进行至少一个色谱步骤。所述阴离子交换色谱可用强碱或弱碱型色谱支持物来实施。在一些实施方案中，可使用来自不同的商业树脂的季铵官能团如来自GE Healthcare的Q-Sepharose，并且最优选如Q Sepharose XL类型。这一列表并不是限制性的，并且可以使用来自Bio-Rad、Pall Biosepra、Merck、Millipore或其他供应商的强阴离子交换剂。
有利的是，在阴离子交换剂上执行的分离步骤期间，TgFVII向TgFVIIa的活化增加。
装载步骤
预纯化的材料被吸附到首先以相同范围的导电性和相同的盐平衡的阴离子支持物上备用。
在本发明的一个实施方案中，就在装载后马上引入盐变化以增强RMP对阴离子电荷的相互作用。钠盐，更特别是柠檬酸三钠盐被转换到具有较低导电性的咪唑缓冲液中。在这个特定的缓冲液中，咪唑范围从1至50mM，优选从5至30mM并且更优选20mM。缓冲液的pH也维持在6.5至8.5的范围内并且优选7至8。在这样的条件下，复合到其他蛋白质的转铁蛋白和非活性的TgFVII或TgFVII展示出对阴离子交换树脂增强的相互作用。
第一洗涤
在本发明的一个实施方案中，第一洗涤是通过在50和175mM之间并且更优选在130和160mM之间的范围内增加盐浓度并且尤其是氯化钠盐浓度来施用的。这种洗涤可以按照梯度或按照步骤来施用。在本发明的一个实施方案中，这一洗涤显示了对乳内源性转铁蛋白的特异洗脱，同时，在咪唑缓冲液的存在下，TgFVII/TgFVIIa留在离子凝胶上并且复合到其他蛋白质的痕量转基因FVII也保持吸附。
TgFVII/TgFVIIa洗脱
在本发明的实施方案中，通过在0至75mM之间，更优选在40至60mM之间的范围内降低盐浓度，特别是氯化钠盐浓度，并且同时通过引入非常低浓度的钙盐，在2至9mM的范围内并且更优选5至8mM之间，将TgFVII/TgFVIIa从阴离子交换剂中洗脱。钙与含gla-结构域的蛋白质如FVII分子的特异相互作用已被研究了很长时间。FVII分子的构象变化导致整体的电荷改变，从而允许以低导电性洗脱。在本发明的一个实施方案中，在咪唑的存在下，复合到其他蛋白质的痕量TgFVII保持吸附。其它盐，如三羟甲基氨基甲烷或柠檬酸三钠显示出共洗脱游离TgFVII和/或与复合其它蛋白质的TgFVII共洗脱。
从阴离子交换剂洗脱的TgFVII包括从50％至100％并且更优选从80至100％的活化形式的TgFVIIa。
此外，申请人已经发现离子交换色谱的意想不到且令人惊奇的性质，特别是它对于包膜病毒如鼠白血病病毒(MLV)和非包膜病毒如猪细小病毒(PPV)的病毒滴度降低的改善能力。
在特别优选的方式中，执行离子交换色谱的步骤以获得优于3 log10，优选优于4 log10，更优选优于5 log10的病毒降低系数(RF)。
伪亲和色谱，优选在羟磷灰石上
在本发明的一个实施方案中，从阴离子交换色谱收集的并含有TgFVII和/或TgFVIIa的洗脱液进一步通过伪亲和色谱纯化，有利地在羟磷灰石凝胶(Ca10(PO4)6(OH)2)上进行。
优选在以下条件下执行这一附加的伪亲和色谱：将柱用含有10至30mM钾或磷酸钠或它们的混合物的水性缓冲液A，pH 7.5到8.5之间平衡。
用钙配制的TgFVII/TgFVIIa分子保留在支持物上，而Des-gla-FVII和其他裂解物在流出物(“Des-Gla-FVII”意指可能通过蛋白水解，GLA结构域被除去的FVII)中被除去。
就在装载步骤之后的缓冲液A的渗滤洗脱出在该工艺中部分裂解的一部分TgFVII和/或TgFVIIa并且这允许了良好的消除不希望的FVII形式，如低活性或无活性的TgFVIIa。
TgFVIIa的洗脱用包括磷酸盐，如钠或钾的磷酸盐，或者它们的混合物的缓冲液在预定的浓度(优选表示为包括从0.1M至0.5M磷酸钠，优选0.1M至0.2M，pH 7.5和8.5之间的缓冲液B)来执行。所得的洗脱液含有充分活化的TgFVIIa，具有低百分比的裂解形式。
尺寸排阻色谱法
最终痕量的RMP可以仅通过质谱法或通过特异性ELISA来确认。在最终的抛光步骤之前，RMP范围介于50和500ppm之间，并且最优选小于或等于300ppm。
在本发明的一个实施方案中，可通过尺寸排阻色谱来执行进一步纯化步骤。需要选择尺寸排阻柱高度、树脂的孔隙率和色谱缓冲液以达到最佳的选择性。需要相当于Superdex S75制备级或更优选Superdex S200制备级的高性能树脂进行抛光步骤。凝胶床高度大于60cm且低于120cm并且更优选大于80cm且低于110cm允许足够除去额外2个log的RMP痕量的分辨率。
在一个实施方案中，SEC期间施用的缓冲液交换包含浓度在20至500ppm，优选从50至200ppm的非离子型去污剂组合氨基酸如精氨酸或甘氨酸或糖(没有限制)。在缓冲液中离子型去污剂的存在有利地帮助在SEC期间保持TgFVII/TgFVIIa的单体状态，产生FVII和污染分子之间的最佳分离。在本发明的一个实施方案中，配制缓冲液含有如在美国专利2012/0087908中描述的不同的氨基酸与脱水山梨醇单月桂酸盐和/或单油酸盐的混合物。应用在10和40cm/hr之间，更优选在20和25cm/hr之间的线性流速组合范围从1％至10％的SEC柱体积，更优选从2至5％的SEC柱体积的装载体积以获得低于5ppm的RMP或纯度大于99.9995％的TgFVII和/或TgFVIIa的单体峰。
此外，申请人已经发现了尺寸排阻色谱的意想不到且令人惊奇的性质，特别是它对于包膜病毒如鼠白血病病毒(MLV)和非包膜病毒如猪细小病毒(PPV)的病毒滴度降低的改善能力。
在特别优选的方式中，执行尺寸排阻色谱的步骤以获得优于3 log10，优选优于4 log10，更优选优于5 log10的病毒降低系数(RF)。
因此，亲和色谱步骤，和/或离子交换色谱步骤，和/或尺寸排阻色谱步骤允许获得优于3 log10，优选优于4 log10，更优选优于5 log10的病毒降低系数(RF)。
病毒消除/灭活
本发明的方法还可以包括至少一个病毒灭活/除去的专用步骤，但最优选必须包括至少两个正交的病毒灭活/除去的专用步骤。澄清的乳可通过用溶剂和/或去污剂处理的化学处理或其它类型的有效处理被病毒灭活。在本发明的一个实施方案中，使用溶剂/去污剂灭活包膜病毒，特别是在80(1％至1.5％w/v)和TnBP(三-正丁基磷酸盐0.3％至0.5％v/v)的混合物存在下。其它非离子型去污剂如Octoxynol100或Triton X114或胆酸钠或20(没有限制)也可以替代或补充80。
而且，可对从任何所述色谱步骤中得到的洗脱液进行纳米过滤步骤以有效地消除病毒，特别是无包膜的病毒，如细小病毒B19。尤其可能的是使用保留大于15nm大小的病毒的过滤器ASAHI PLANOVATM15。
在本发明的一个实施方案中，优选在第一色谱步骤后执行纳米过滤，其中TgFVII纯度大于90％，并且高分子大小的蛋白质的主要部分如酪蛋白微团被充分除去以允许在该孔径的纳米过滤器中进行过滤。起始的FVII浓度优选在1.0和2.5g/L之间，更优选在1.3和2.2g/L之间，并且典型的流速是在5和15LMH之间，优选在8和12LMH之间(“LMH”意指每小时每平方米的升数，或L/m2/h)。
除了病毒除去以外，纳米过滤还显示出通过纳米过滤器的宽度的筛分机制而有利地减少内源性的DNA。
在本发明的一个实施方案中，可以使用相当于Planova15纳米的平均孔径的纳米过滤过滤器。20纳米孔径的过滤器可以代替15纳米过滤器并且15纳米过滤器可以结合具有较高孔隙率的过滤器。在本发明的一个实施方案中，顺序的0.2μm/0.1μm随后Planova 20纳米过滤器随后Planova 15纳米过滤器可有利地减少在同一时间的任何风险(生物负载、支原体、病毒、偶发物(adventitious agent)、TSE)而不会损失TgFVII/TgFVIIa的生物活性。
配制、灭菌、冻干
一旦回收了含有经纯化的TgFVII和TgFVIIa的最后一次的洗脱液，所述洗脱液可以在0.22μm过滤器上进行过滤步骤，填充在容器中，然后冷冻/干燥。
优选地，由于由提供者所描述的蛋白质的低结合和非离子型去污剂的低吸附，本发明有利地使用改性的PVDF膜。来自Millipore的膜过滤器非常适于此步骤，但对其他商业过滤器没有限制。
下面的实施例举例说明了本发明，但不限制其范围。
实施例
实施例1：特异性抗FVII/FVIIa配体的制备
用高纯人FVIIa抗原免疫羊驼(lama)。在第二次增强后，观察到超过100倍的滴度增加，表明对人FVIIa/FVII抗原的特定富集。从羊驼收集RNA并产生VHH表达文库。在ELISA中用结合于人FVIIa的能力来测试克隆的羊驼VHH的表达。选择23个VHH克隆并进一步测试它们结合血浆源的人FVII和FVIIa和重组兔FVII的能力。发现所有克隆都能结合人FVII和FVIIa，并且没有观察到对重组兔FVII的交叉结合。进一步测试克隆对于FVII/FVIIa的结合和洗脱能力，以及其在酸性pH下的结合性质的稳定性。将选定的候选物重新克隆到BAC酵母表达系统中并表达相应的配体，然后再以每毫升基质为2.5mg的配体密度结合到NHS琼脂糖上。
实施例2：来自乳的TgFVIIa纯化
本实施例描述了来自150升兔乳的高度纯化的活化TgFVII溶液的制备。
2.1 乳收集
乳的复合起始合并物由完整哺乳周期内的从6个每天收集的乳的迷你合并物组成，一起装入1L瓶中，取样用于生物安全对照(生物负载、内毒素和内源性病毒)，然后保存，并冷冻在非常低的温度(<-60℃)下长时间储存(数月，在<-20℃)。从对应挤奶的自然周期的第4天到第24天收集乳。
2.2 澄清
将含乳的冷冻瓶放置在保持32-37℃的大解冻槽中。解冻时间大约1小时，在每个瓶子中获得最后一块冰。将147.4kg解冻的源材料(SM)转移并集中到500L混合体系袋中。加入0.315M柠檬酸三钠缓冲液，以获得范围为20至40g/L的蛋白质浓度。将混合物的温度调节到24-26℃。终止该混合体系以允许脂肪倾析在稀释并柠檬酸化的SM的上层。
用STAX装置(Pall Corporation)处理的孔径为15至0.5μm(PDH4)和介于0.3和0.1μm(PEKS)范围的深度过滤器在缓冲液中初步平衡。将用柠檬酸缓冲液处理的乳过滤并将444Kg滤液装入一次性使用袋中，随后用0.45/0.2μm Filtrer(Sartorius Corporation)执行0.2μm的过滤。不同过滤器的过滤性适于取决于连续的平均孔径，每平方米从约2至15kg的蛋白质的过滤而没有阻塞。
2.3 S/D处理
向澄清的源材料(CSM)加入Polysorbate 80和三正丁基磷酸酯溶液以得到509.8Kg含有0.8-1.5％w/v去污剂和0.2-0.5％v/v溶剂的溶液。将温度调节到25±2℃，并且在这样的条件下维持至少2小时的接触时间以灭活在生物源中任何可能的非包膜病毒。来自乳的痕量的残留脂质或甘油三酯也通过加入去污剂和溶剂被化学溶解，使溶液更适合于进一步的色谱步骤。
2.4 对转基因FVII/FVIIa特异性的配体的亲和色谱
将柱在pH7.5用50mM tris缓冲液平衡，然后以220L/H加载含有该蛋白质的溶液。6L亲和凝胶足够大到吸附来自处理过的乳合并物的所有TgFVII。装载后，用tris缓冲液进行第一洗涤。90升是保证稳定的基线回收所必要的。在这个大洗涤过程中除去通过非特异性相互作用结合的蛋白质。
通过将离子强度增加至500mM氯化钠，并用30％v/v丙二醇增加相对疏水性至初始tris缓冲液，执行用于最大化RMP洗脱和最小化FVII解吸的优化的洗涤步骤。
通过增加离子强度至1500mM氯化钠和用45％v/v丙二醇增加相对疏水性，执行用于最小化RMP解吸和最大化FVII洗脱的优化的洗脱步骤。
在亲和力洗脱液级分中收集50.6升。亲和力洗脱液的酰胺分解的FVII/抗原FVII的比例接近1，相当于对于1个单位的抗原分子的1个单位的凝结因子(clotting factor)。亲和步骤使得能够以4 log清除率除去RMP的主要部分。
通过这种方式，成功地免疫纯化了可凝结的TgFVII/TgFVIIa。
2.5 超滤
作为替代，使用超滤技术来制造可存储的中间产物。将亲和S/D处理的洗脱液浓缩，并稳定在30kDa的聚醚砜膜(来自Novasep的单次使用的TangenX Sius-)上。在浓缩阶段通过调节再循环泵速度将跨膜压力保持在20psig。当获得2g/L的蛋白质浓度时，在柠檬酸盐缓冲液中进行渗滤，以除去亲水性化合物、其盐和化学溶剂。
2.6 无菌过滤和冷冻-中间产品1
将比活性为2638单位(按mg计)的10.4L的浓缩中间体用0.45/0.2μm囊在层流通风橱下无菌过滤到1L的容器中。
将瓶<-60℃存储，以构成用于下游工艺的中间产物。
2.7 0.2/0.1μm过滤以及在20N和15N Planova过滤器上纳米过滤
进一步纯化对于TgFVII/TgFVIIa产物的临床和药物人类使用是必要的。首先，为了减少潜在的病毒负载，通过过滤序列(filtration train)过滤中间物：
·来自Sartorius的0.2/0.1μm Sartopore一次性囊
·1sq.m 20后跟来自ASAHI KASEI的1sq.m 15
将9.45L中间物以12LMH的初始流速直接泵送通过过滤序列并在整个步骤期间监测跨膜压力以维持每个纳米过滤器最大12psig。在该工艺的这一步骤中，计算纯度约95％，并将内源性转铁蛋白确定为主要的污染物之一。
在该工艺的这个阶段，通过在还原条件下的SDS-PAGE分析定量评估TgFVII活化在20％至50％之间。部分活化是由于在纯化工艺的澄清阶段释放的乳钙。
2.8 在Q琼脂糖XL上的离子交换色谱
TgFVII的纯度和活化通过阴离子交换色谱和钙依赖性洗脱增强。将纳米过滤溶液装载到先前用pH 7.0的10mM柠檬酸钠平衡过的Q-琼脂糖XL阴离子交换器(GE Healthcare)上。
用20mM的pH 7.5且在25℃的电导率低于5mS/cm的咪唑执行第一洗涤步骤。第二洗涤步骤通过除了20mM咪唑外还引入150mM氯化钠以在25℃下达到18mS/cm的电导率来执行。洗涤峰被鉴定为主要由游离的转铁蛋白组成。然后通过降低氯化钠盐至50mM，并在同一时间通过加入氯化钙直至7mM，同时保持咪唑为20mM来洗脱TgFVII/TgFVIIa。洗脱级分含有在还原条件下通过SDS-PAGE评估的90％以上的TgFVIIa的活化形式。通过ELISA测量RMP水平并与TgFVII比较，计算残余的RMP低于500ppm(见表3)。
QSXL色谱有助于HRI水平的降低，平均得分为2 log10，其中1.6 log10是转铁蛋白。
在该步骤中，通过在洗脱缓冲液中存在离子化钙而增强向FVIIa的活化。然后将Q-Sepharose XL洗脱液存储在+2/+8℃下过夜。
2.9 羟磷灰石上的伪亲和色谱
在存储期间，可能发生某些FVII裂解，尤其是重链上的裂解，轻链由钙离子保护。公知的是羟磷灰石和磷酸钙吸附剂吸附凝固因子如FVII/FVIIa和更广泛的含Gla结构域的蛋白质。这个伪亲和性用于该工艺的抛光步骤。
将含有转基因FVII/FVIIa的Q Sepharose XL洗脱液在预先用pH8.0的25mM磷酸钾平衡过的CHT陶瓷羟磷灰石I型柱(BioRad)上浓缩。
用pH8.0的25mM的磷酸钾进行恒溶剂洗涤步骤。该洗涤步骤特异地洗脱蛋白水解的形式，尤其是在其重链上含有一个或多个裂解的TgFVII/TgFVIIa并被监测以限制在恒溶剂模式下所有活化形式的最小损失。
随后用pH 8.0的150mM磷酸钾将TgFVII/TgFVIIa洗脱为TgFVIIa浓缩物。
2.10 在Superdex 200上尺寸排阻色谱(SEC)
单体TgFVII/TgFVIIa的稳定化是由该工艺的最后抛光步骤完成的。SEC允许除去磷酸钾并配制到至少聚山梨醇酯80和精氨酸中。
将从羟磷灰石色谱柱洗脱的和含有TgFVII/TgFVIIa的级分加载到预先用5mM柠檬酸钠、114mM精氨酸HCl、46mM异亮氨酸、16mM甘氨酸、6.5mM赖氨酸、0.07％(v/v)Tween 80、pH 6.0平衡过的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
具有较高的动态半径或较高分子大小的蛋白质如转铁蛋白(70kDa)或与其它蛋白质复合的FVII刚好在单体TgFVIIa(45kDa)之前通过尺寸排阻洗脱。
具有较低的动态半径或较低的分子大小的蛋白质像酪蛋白或肽紧跟在单体TgFVIIa(45kDa)之后洗脱。
用与平衡该柱所用相同的缓冲液洗脱含有TgFVII/TgFVIIa的级分。
2.11 稳定化和配制
最终的TgFVII/TgFVIIa溶液配制为在配制缓冲液中1g TgFVIIa/L的浓度，所述配制缓冲液包含5mM柠檬酸钠、114mM精氨酸HCl、46mM异亮氨酸、16mM甘氨酸、6.5mM赖氨酸、0.07％(v/v)Tween 80，pH 6.0。
通过SDS-PAGE在还原条件下评估93.5％的活化形式的TgFVIIa。
2.12 灭菌
然后将5243mL配制的稳定化的TgFVII/TgFVIIa溶液在0.2μmMillipak 100膜上无菌过滤。
实施例3：工艺中分析结果
对在实施例2中所述在纯化工艺中产生的样品进行分析。
3.1 纯化工艺重复性
对8批次的每个步骤(后接FVII酰胺分解测定或吸光度)的FVII收率在表1和2中总结。
表1：直至超滤的FVII酰胺分解收率
澄清 S/D处理 亲和 UFDF
批次1 98％ 136％ 56％ 75％
批次2 101％ 116％ 51％ 89％
批次3 95％ 120％ 54％ 91％
批次4 109％ 85％ N/D N/D
批次5 91％ 106％ 55％ 99％
批次6 107％ 99％ 48％ 99％
批次7 N/D 83％ 47％ 86％
批次8 104％ 94％ 48％ 93％
平均值 100％ 110％ 53％ 91％
SD 7％ 18％ 3％ 10％
N/D:迄今无数据
表2：直至灭菌过滤的FVII吸收度收率
％步骤 纳米过滤 QSXL CHT-I SEC
批次1 88％ 61％ 75％ 92％
批次2 95％ 59％ 60％ 89％
批次3 95％ 63％ 52％ 92％
批次4 93％ 55％ 58％ 81％
批次5 91％ 51％ 67％ 94％
批次6 95％ 51％ 67％ 91％
批次7 92％ 49％ 49％ 86％
批次8 91％ 52％ 64％ 95％
平均值 92％ 55％ 61％ 90％
SD 3％ 5％ 9％ 5％
FVII收率显示出在每个步骤的平均值方面小于10％变化的一致结果。
3.2 RMP清除
测定所测试的批次的平均RMP清除并示于图2(RMP清除)。
在纯化工艺期间的RMP清除是完全可重复的。对RMP清除贡献最大的步骤是：
-在对FVII/FVIIa特异的配体上的亲和色谱，
-Q Sepharose XL色谱，和
-Superdex200色谱。
表3：在纯化工艺期间的RMP清除。
3个批次的平均值 澄清的乳 亲和后 QSXL SEC
RMP,ppm 417 731 959 52 356 1733 13
从该工艺得到的总RMP清除在8至9 log10之间。
3.3 兔DNA清除
兔DNA清除也由Q-PCR技术测定其在不同的工艺中间物中的含量来进行评估。相应的结果展示在图3(DNA清除)中。结果以通过ELISA在乳中测定的TgFVII/TgFVIIa浓度方面的ppb以及通过对其他中间物的OD280表示。
表4：在纯化工艺期间的兔DNA清除
澄清的乳 亲和后 纳米过滤 SEC
DNA,ppb 371 134 69 808 <23 <4
贡献最大的步骤是纳米过滤。在Q Sepharose XL色谱后，所有批次均低于定量水平(LOQ)。
从该工艺得到的总DNA清除是在5和6 log10之间。
3.4 FVII活化动力学
如上文所披露，在该工艺期间TgFVII活化成TgFVIIa，并且主要地，活化随Q Sepharose XL色谱增加。如在下表5中详述，在工艺结束时，通过凝结单位与抗原单位的比率所定义的活化比率在17和25之间。
表5：通过纯化工艺的Tg FVIIa定量。
Tg FVII活化(平均值3PB) Tg FVIIa 活化比率的范围
纳米过滤前 23,434 4至5
纳米过滤液 16,595 7至9
QSXL洗脱液 16,032 14至17
CHT-I洗脱液 160,822 17至25
SEC池 45,855 17至25
TgFVII可粗略地且方便地由SDS-PAGE(考马斯蓝着色，图4)跟随。
FVII同种型也可以通过Protein Mapping分析(RP(C4)-HPLC-MS)以更高的精度定量。测定了从活化位点(重链和轻链)切割以产生生物活性的TgFVIIa的形式。未裂解的链对应于具有非常低的生物活性的未活化的TgFVII而从轻链和重链切割的同种型对应于分子降解和生物活性的失活(％LC：轻链裂解或％Des-Gla，％HC：重链裂解)。
该分析方法不能够具体定量氧化形式。这些形式均包括在未活化形式的定量中。
未活化的，未降解的TgFVII在工艺期间逐步减少，是TgFVII活化成TgFVIIa的标志。对于三个测试批次，活化是累进的，并且在工艺结束时，保留了平均3.6％的未活化形式。这种形式是不可降解的，并保持了其随后在工艺中(配制操作)和静脉内给药期间被活化的能力。它保留了其在人血浆中活化的潜力。
3.5 在工艺中的TgFVIIa降解
对于这个实例，将羟磷灰石(CHT)洗脱液级分浓缩到3.9 g/L TgFVIIa并且在表6中总结RP-HPLC结果，与在表7示出SEC的结果相比较。
表6：在CHT洗脱液(RP-HPLC)中的FVII形式重新分配：
轻链 28.21％
裂解轻链 1.67％
重链 62.29％
裂解重链 6.66％
氧化+未活化链 1.10％
表7：在纯化的产物(RP-HPLC)中的FVII形式重新分配：
轻链 31.37％
裂解轻链 0.48％
重链 61.16％
裂解重链 5.82％
氧化+未活化链 1.12％
对于CHT洗脱液和最终的纯化产物(SEC洗脱液)，既不裂解也不氧化的TgFVII形式的总量大于90％的总TgFVII。这清楚地表明了尽管TgFVII活化但CHT步骤仍控制TgFVII降解的能力。
实施例4：高度纯化的TgFVIIa制品的质量
4.1 在纯化溶液中的残留RMP定量。
利用来自羊驼抗体的FVII-高度特异性的配体结合更传统的色谱技术(离子交换、羟磷灰石伪亲和和尺寸排阻)因而允许优化从乳中TgFVII/TgFVIIa的纯化，尽可能除去尤其是RMP。
对试点批次(15L乳)的RMP水平是如表8所示的约10ppm并且对于大规模生产的批次(150L乳)是低于定量以下水平(LLOQ)或小于6ng/ml。
用ELISA法检测纯化产物中的转铁蛋白，发现对于试点批次其含量接近3ppm。
表8：在纯化产物中的RMP和转铁蛋白污染
RMP，ppm 转铁蛋白，ppm
试点批次1 13 4
试点批次2 <6 3
试点批次3 <6 3
大规模批次1 <6 N/A
N/A：不适用
4.2 在纯化溶液中的残留兔DNA定量。
如所述的工艺因此达到目标残留DNA低于4ppb。
4.3 兔凝固因子VII
因为兔在其循环中具有内源性因子VII并且存在从血流进入乳的一些血清蛋白的被动渗漏，评估了纯化工艺分离人类与兔FVII的能力。内部开发了特定的ELISA来调查这种潜在伴随蛋白在纯化产物中的存在。结果低于LLOQ(对于分析的所有制品，<45pg/ml)。
实施例5：在Tg FVIIa特异性配体上实施亲和色谱步骤后，对包膜病毒(MLV，鼠白血病病毒)的病毒清除研究
在下表中描述了鼠白血病病毒(MLV)的特性：
病毒 MLV
命名 鼠白血病病毒(Murine Leukemia Virus)
科 逆转录病毒科(Retroviridae)
亚科/属 Orthoretrovirinae Gammaretrovirus
天然宿主 小鼠
基因组 ARN
包膜 包膜的
直径大小 80-110nm
5.1 感染性滴定测定法
5.1.1 感染性滴定的原理
滴定法是基于观察特定的细胞病变效应来检测在感染的细胞中的病毒产生而测量病毒滴度的定量测定法。
滴定测定法将按以下所述在两个不同的96孔板上进行：
·通过连续的3倍稀释在整个96孔板(“样品稀释板”)用培养基稀释测试样品(为每个稀释执行8次重复)。
·来自“样品稀释板”的每个孔然后接种在新的96孔板(“样品滴定板”)的相应孔中。
将细胞悬浮液添加到“样品滴定板”的各孔中，然后在具有或不具有CO2的环境(取决于病毒)下，将板在适当的温度温育。
经过一段时间的孵育，使病毒复制并感染相邻细胞，这取决于病毒，
·通过在倒置光学显微镜的观察，计数感染后的病灶孔。
·或加入染色覆盖层(结晶紫1p-半乳糖苷酶)，并检测孔的细胞病变效应。被感染的孔显示为空白区，而未感染的孔被染色(或者根据病毒反过来)。
使用相应的公式计算表示为每毫升50％组织培养感染剂量(TCID50/mL)的感染滴度。
5.1.2 滴定对照
*阴性对照
在每次滴定测定中，制备细胞作为细胞参照对照。以与用于在初步测定中产生的样品滴定所用相同的条件制备这些细胞，不同是它们用未掺入(spiked)的培养基接种(在每个96孔板中4-8孔)。
*阳性滴定对照(病毒参照对照)
在每次滴定测定中，以与用于在初步测试中产生的样品滴定所用相同的条件下滴定约103-105TCID50/mL的病毒参照对照。
5.1.3 滴定测定的验收标准
当：
·每个滴定板的细胞参照对照符合预期的结果，
·得到的病毒参照对照的感染滴度在预期的范围内时，
保留并验证滴定测定法。
5.1.4 病毒滴度的测定
根据Schwartz D.,1993(Schwartz D.,“Méthodes statistiquesàl’usagedes médecins et des biologistes”,Flammarion Médecine-Sciences,第四版，1993)；Kaplan M.和Koprowski H.,“Laboratory techniques in rabies，第三版，World Health Organization编辑，Geneva,1973，测定病毒滴度。
使用Spearman Karber公式计算TCID50(50％组织培养感染剂量)。TCID50是由quantal测定法评估并定义为能够感染50％的接种培养物的病毒剂量。
5.2 实验方案
在这个工艺中实施的步骤如下：
-解冻经澄清的源材料；
-用1％的包膜病毒MLV感染解冻的经澄清的源材料；
-用0.2μm过滤器预过滤；
-加载到FVII选择柱上；
-柱洗涤；
-洗脱。
表9提供在亲和FVII选择色谱的步骤期间实施的工艺条件。
表9：
*Affinity Select VII凝胶与实施例2.4中使用的亲和凝胶相同
5.3 结果
在预过滤步骤(样品命名为负载2)后和在亲和FVII选择色谱洗脱(样品命名为洗脱液)之后，测量解冻并澄清的源材料样品中的病毒清除。结果示于表10。
表10：在亲和FVII选择色谱之前(负载2)和之后(洗脱液)的病毒清除的测量
TCID 50：50％组织培养物感染剂量
表10的结果表明，亲和FVII选择色谱步骤以降低系数(RF)优于4.37log10减少病毒滴度。
实施例6：在Tg FVIIa特异性配体上实施亲和色谱步骤后，对非包膜病毒(PPV，猪细小病毒)的病毒清除研究。
在下表中描述猪细小病毒(PPV)的特性：
6.1 实验方案
在这个工艺中实施的步骤如下：
-解冻经澄清的源材料；
-用1％的非包膜病毒PPV感染解冻的经澄清的源材料；
-用0.65/0.45μm和0.45/0.2μm的过滤器预过滤；
-溶剂/去污剂处理(1小时)；
-加载到FVII选择柱上；
-洗涤；
-洗脱。
表11 提供在亲和FVII选择色谱步骤期间实施的工艺条件。
*Affinity Select VII凝胶与实施例2.4中使用的亲和凝胶相同
6.2 结果
在预过滤步骤和在溶剂/去污剂处理(样品命名为初始负载)步骤后和在亲和FVII选择色谱洗脱(样品命名为洗脱液A)后，测量解冻并澄清的源材料样品中的病毒清除。结果示于图5的直方图形式中。
图5的直方图显示亲和FVII选择色谱步骤以优于3.8 log10的降低系数(RF)减少病毒滴度。
实施例7：在实施制备级尺寸排阻色谱Superdex S200步骤后，对包膜病毒(MLV)和非包膜病毒(PPV)的病毒清除研究
7.1 实验方案
在这个工艺中实施的步骤如下：
-解冻从临床批次取样的初始材料(陶瓷羟磷灰石-1(CHT-1)洗脱液)；
-用1％掺入(spike)(1％MLV或1％PPV)感染初始原料；
-用0.2μm过滤器(MLV)或0.1μm过滤器(PPV)预过滤；
-装载2.3％柱体积(CV)到S200柱上；
-收集S200洗脱液(对应FVII的级分)。
表12 提供在制备级尺寸排阻色谱Superdex S200的步骤期间实施的工艺条件。
**Superdex S200凝胶与实施例2.10使用的凝胶相同
7.2 结果
在0.2μm过滤器(对于MLV病毒)或在0.1μm过滤器(对于PPV病毒)的预过滤步骤后(样品命名为负载2)以及在尺寸排阻色谱Superdex S200上洗脱(样品命名为洗脱液)后，测量CHT-1洗脱液的样品中的病毒清除。结果示于表13。
表13：在尺寸排阻色谱Superdex S200之前(负载2)和之后(洗脱液)的病毒清除测量
TCID 50：50％组织培养物感染剂量
表10的结果表明，尺寸排阻色谱Superdex S200色谱对于包膜病毒(MLV)以等于3.01 log10的降低系数减少病毒滴度和对于非包膜病毒(PPV)以等于3.00 log10的降低系数减少病毒滴度。
综上所述：
-由亲和FVII选择色谱获得病毒清除的高降低系数，对于包膜病毒(MLV)优于4.37 log10并且对于非包膜病毒(PPV)等于3.8 log10；
-由尺寸排阻色谱Superdex S200获得病毒清除的中等降低系数，对于包膜病毒(MLV)和对于非包膜病毒(PPV)等于3.0 log10；亲和FVII选择色谱比尺寸排阻色谱Superdex S200对于降低包膜和非包膜病毒的病毒滴度更有效。
实施例8：实施几项技术之后对于包膜病毒和非包膜病毒的病毒清除研究
8.1 实验方案
对每个纯化操作单元，分别用在初始材料中1％各种病毒掺入(spiking)进行FVII选择亲和色谱，纳米过滤和Q Sepharose XL病毒验证研究，并且进行在目的级分中(FVII被回收的那个)滴定掺入的病毒。针对每个纯化单元操作获得的log10降低系数针对每种病毒相加，并且针对各病毒评估总体降低系数。
8.2 结果
结果列于表14。
表14：
*与实施例2.8的离子交换色谱步骤相同
NA：不适用
NE：无效。溶剂-去污剂处理对非包膜病毒无效。
表14示出：
-在工艺中实施FVII选择色谱步骤加纳米过滤加Q Sepharose XL离子交换色谱步骤，使病毒降低增加了9.3 log10，导致非包膜病毒的总体降低系数对于PPV病毒模型大于或等于18.5 log10
-在工艺中实施FVII选择色谱步骤加纳米过滤加Q Sepharose XL离子交换色谱步骤，使病毒降低增加了10.5 log10，导致包膜病毒的总体降低系数用MLV病毒模型等于16.5 log10。

Claims (19)

1.一种从源生物材料纯化转基因因子VII(TgFVII)和/或转基因活化因子VII(TgFVIIa)的方法，包括亲和色谱的步骤，该亲和色谱包括步骤：
(a)在允许TgFVII和/或TgFVIIa结合配体的条件下，使含有TgFVII和/或TgFVIIa的源生物材料接触对TgFVII和/或TgFVIIa特异的配体，和
(b)通过以非破坏性的方式打断与所述配体的相互作用，回收TgFVII和/或TgFVIIa。
2.根据权利要求1的方法，其中所述配体是针对至少一种TgFVII或TgFVIIa表位的抗原结合蛋白质，或其功能片段或衍生物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述配体包括形成两个完整的抗原结合位点的两条重多肽链且缺乏轻多肽链。
4.根据权利要求1至3的方法，其中所述配体源自骆驼科的免疫球蛋白重链。
5.根据权利要求1至4的方法，其中步骤(b)包括至少一个洗涤步骤，用于在从配体洗脱TgFVII或TgFVIIa之前除去未结合的材料，并且进一步任选地包括用于除去弱结合的材料的第二洗涤步骤。
6.根据权利要求1至5的方法，其中所述源生物材料获自生产TgFVII和/或TgFVIIa的转基因动物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述动物是哺乳动物雌性，并优选雌兔，以及源生物材料是乳。
8.根据权利要求7的方法，还包括在步骤(a)之前的收集并澄清乳的预备步骤。
9.根据权利要求8的方法，其中通过加入柠檬酸盐，然后过滤来执行乳澄清步骤。
10.根据权利要求1至9的方法，还包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在离子交换剂上的条件下，在离子交换剂上，并优选在阴离子交换剂上，对洗脱的TgFVII和/或TgFVIIa色谱纯化的步骤c)。
11.根据权利要求1至10的方法，进一步包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在伪亲和树脂上的条件下，在伪亲和树脂，并优选在羟磷灰石上，对洗脱的TgFVII和/或TgFVIIa色谱分离的步骤d)。
12.根据权利要求1至11的方法，还包括在尺寸排阻支持物上对洗脱的TgFVII和/或TgFVIIa色谱分离的步骤e)。
13.根据权利要求1至12的方法，还包括消除和/或灭活病毒的至少一个步骤，优选通过纳米过滤和/或通过溶剂/去污剂处理。
14.根据权利要求1至13的方法，还包括配制、杀菌和冻干经纯化的TgFVII和/或TgFVIIa的最终步骤。
15.根据权利要求1至14的方法，其中亲和色谱的步骤包括步骤：
(a)在使配体结合TgFVII和/或TgFVIIa的条件下，用来自含有重组产生的TgFVII和/或TgFVIIa的转基因雌兔的乳装载固定有如权利要求1至4任一项所定义的配体的色谱树脂；
(b1)洗涤未结合的材料；
(b2)洗涤弱结合的材料；和
(B3)从树脂洗脱TgFVII和/或TgFVIIa。
16.根据权利要求5至15的方法，其中，在所述亲和色谱步骤期间，所述用于除去弱结合的材料的第二洗涤步骤用含有10％至50％的疏水剂的缓冲液执行，并且其离子强度是从200至600mM的范围。
17.根据权利要求5至16的方法，其中，在所述的亲和色谱步骤期间，所述用于从树脂洗脱TgFVII和/或TgFVIIa的洗脱步骤用含有20％至70％的疏水剂的缓冲液执行，并且其离子强度是从500至2500mM的范围。
18.根据权利要求1至17的方法，其中所得到的纯化的转基因FVII是几乎完全活化的、高纯度的FVII，其包含低百分比的降解的、蛋白水解的或氧化的形式。
19.根据权利要求1至18所述的方法，其特征在于，所述亲和色谱步骤和/或离子交换色谱步骤和/或尺寸排阻色谱步骤允许获得优于3log10，优选优于4log10，更优选优于5log10的病毒降低系数。
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