CN104561095B - 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过同源重组技术生产转基因小鼠的方法。所述方法通过Cas‑9/CRISPR基因敲入技术，将人NGF基因取代小鼠染色体上的鼠NGF基因，通过繁殖获得带有纯合人NGF基因的基因敲入小鼠，从而获得颌下腺能够分泌人NGF的子代小鼠。较常规的利用正负双筛选同源重组基因打靶技术相比，本发明方法操作简单，只需将3种质粒DNA同时转染小鼠胚胎干细胞或者对小鼠的受精卵进行原核注射就可以，成功率高，可以达到2‑5％，显著高于普通基因打靶技术的0.1％的小鼠胚胎干细胞阳性率。

Description

一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生产转基因小鼠进而生产人神经生长因子的方法，属于分子遗传学和细胞生物学领域。

背景技术

神经生长因子(NGF)是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。NGF包含α、β、γ三个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体。目前，临床使用的NGF多为动物(小鼠)基因表达产物，虽然NGF的生物效应无明显的种间特异性，但是有研究表明人的NGF具有显著高于鼠源NGF的生物学活性。因此，采用人NGF用于临床治疗具有鼠源NGF无法比拟的优点。目前有采用重组方法生产的人NGF的报道。但是由于NGF分子结构的特殊性，很难获得具有生物学活性的重组人NGF。也有通过转基因的方法使人NGF在转基因小鼠体内表达的技术，但是外源基因在小鼠的基因组中是随机整合，其表达水平变化比较大。另外，在纯化过程中，会同时获得人NGF和鼠NGF，因此纯度达不到要求。

基因敲入技术是一项利用同源重组的原理，在小鼠的胚胎干细胞(ES细胞)中定位整合外源基因，使外源基因可以在小鼠体内表达的技术，在外源基因定位整合的同时，可以将整合位点小鼠的内源基因完整或者部分取代，成为一种特定基因人源化的转基因小鼠模型。目前这种技术已经用于基因表达调控的研究

目前利用基因敲入技术已获得多种特定基因人源化的基因敲入小鼠模型。例如人alpha-珠蛋白的基因敲入模型。通过分别在人alpha-珠蛋白基因的5’-端和3’-端连接小鼠alpha-珠蛋白基因的5’-端和3’-端DNA序列，构建同源重组载体，然后将载体导入小鼠的ES细胞，载体上的小鼠alpha-珠蛋白基因的5’-端和3’-端DNA序列和小鼠染色体上的alpha-珠蛋白基因5’-端和3’-端DNA序列发生2次同源重组，从而将人的alpha-珠蛋白基因序列定位整合在小鼠的alpha-珠蛋白基因位置上，同时将小鼠内源性的alpha-珠蛋白基因删除。这样，小鼠的红细胞中就可以表达人的alpha-珠蛋白基因，其表达水平与小鼠内源性alpha-珠蛋白基因的表达相当。

如果通过基因敲入的方法，采用人的NGF基因在小鼠基因组中定位替换鼠的NGF基因，可以使人NGF基因在小鼠内源性NGF的表达调控序列控制下表达，在纯化时也不会有鼠源NGF的污染。但是利用常规基因敲入技术获得NGF基因敲入的小鼠存在很多的困难或风险，例如，在基因敲入的过程中需要在ES内发生2次同源重组，经过2次筛选，一次正的筛选，一次负的筛选，才能获得阳性克隆。同源重组载体进入ES细胞内后，可以随机插入小鼠基因组的任何序列，造成假阳性结果，导致小鼠内源性NGF基因不能正确的删除。

2007年Barrangou等人首次发现并证明细菌可以利用Cas/CRSPR系统对抵抗噬菌体入侵。2008年Marraffini等人又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了Cas/CRISPR系统的功能。CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内切酶相似，它对序列的特异性切割，主要依赖crRNA与Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别靶序列上的PAM以及protospacer。根据CRISPR/Cas系统这一特性将它设计为人工的核酸内切酶(Engineered endonuclease，EEN)，用它来对科学家感兴趣的基因位点进行修饰。酿浓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的TypeⅡ型系统是被改造的最为成功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑马鱼中成功实现了基因组定点修饰。

为解决基因重组现有技术存在的上述问题，本发明人意欲通过利用Cas-9/CRSPR介导的基因组编辑技术，提供一种同源重组位点准确，成功率高的同源重组方法，以获得整合有人NGF基因的转基因小鼠，并进而提供一种制备具有高生物效能人NGF的方法。

发明内容

基于现有技术在NGF的制备领域存在诸多的问题，发明人设计利用Cas-9/CRSPR介导的基因组编辑技术，在小鼠NGF成熟肽基因内部把小鼠的染色体DNA切断，依靠细胞自身的同源重组修复能力，利用同时转入的人工合成的融合基因(带有鼠NGF信号肽、前体肽、人NGF成熟多肽)作为修复模板，一次完成小鼠NGF成熟多肽基因的删除和人NGF成熟多肽基因的定位敲入。不仅可以在ES细胞上完成，还可以直接对小鼠的受精卵进行显微注射，建立人NGF成熟多肽基因敲入小鼠，进而通过该转基因小鼠生产人NGF。

为此，本发明首先提供了一种通过同源重组技术生产转基因小鼠的方法，所述小鼠染色体中编码神经生长因子的基因被一个或多个拷贝的编码人神经生长因子的基因原位取代，所述方法包括如下步骤：

(1)构建含有人神经生长因子的编码基因的同源重组载体，该同源重组载体能与小鼠胚胎干细胞中鼠NGF基因发生同源重组；优选地，步骤(1)所述的同源重组载体依次包含5’-同源重组臂、FRT序列、嘌呤霉素抗性基因表达盒、FRT序列、鼠NGF信号肽序列、人NGF基因、鼠NGF3’-非翻译区序列、3‘-同源重组臂。

所述两个同源重组臂(5’-和3’-端的重组臂)的长度为200－5000bp，优选的长度为1000bp。5’-同源重组臂的序列可以如SEQ ID NO:1所示，嘌呤霉素抗性基因(Puro基因)表达盒序列如SEQ ID NO:4所示，在其两侧的FRT序列如SEQ ID NO:2所示，FRT序列用于在FLP酶的作用下删除抗性基因表达盒。

优选地，所述嘌呤霉素抗性基因表达盒受PGK启动子调控，所述PGK启动子序列如SEQ ID NO:3所示。

鼠NGF信号肽序列如SEQ ID NO:5所示，人NGF基因序列如SEQ ID NO:6所示，所述鼠NGF3’-非翻译区序列和3‘-同源重组臂序列可以如SEQ ID NO:7所示，所述3’-非翻译序列包括终止密码子、polyA加尾信号以及内含子序列。

在一个优选的技术方案中，所述载体还带有原核细胞的抗生素抗性基因，以便于在大肠杆菌中筛选阳性克隆。

在另一个优选的技术方案中，步骤(1)所述载体是在pBR322质粒基础上构建的，所述抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。。

(2)构建指导RNA模板DNA载体，所述载体在细胞内转录出20bp的RNA分子与小鼠染色体中编码神经生长因子成熟肽DNA特异性互补，并被Cas蛋白所识别，在互补区域下游切断小鼠NGF基因组DNA。优选地，所述的指导RNA模板DNA载体中，含有两种DNA编码序列分别如SEQ ID NO:8和9的第320-329位核苷酸所示。

所述载体含有启动子序列和终止序列；优选地可以采用U6启动子进行体内的转录，也可以选择其它可以进行体外转录的启动子，如T7和Sp6启动子控制指导RNA的合成。

(3)构建含有Cas-9 DNA内切酶基因的真核表达载体，所述载体含有编码入核信号肽的核苷酸序列；优选地，所述入核信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；更为优选地，在所述Cas-9 DNA内切酶基因和所述编码入核信号肽的核苷酸序列之间有一个编码如SEQ ID NO:12所示的柔性多肽的核苷酸序列。进一步优选地，在所述Cas-9 DNA内切酶基因和所述编码入核信号肽的核苷酸序列之间编码柔性多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的。

(4)将步骤(1)-(3)获得的3种载体一起转染入小鼠胚胎干细胞，并筛选发生了同源重组的细胞；优选地，所述转染可以为电转染或者脂质体转染。优选地，所述小鼠的品系为C57BL/6J。在同源重组载体整合有Puro基因的基础上，本步骤中所述的筛选为嘌呤霉素筛选。

(5)将步骤(4)获得的胚胎干细胞显微注射入小鼠囊胚中，之后移植到假孕母鼠的子宫中，手术缝合后饲养受孕母鼠，获得受孕母鼠生产的子代小鼠，对所述子代小鼠进行基因鉴定，筛选出人NGF基因阳性的小鼠。

(6)在步骤(5)获得的人NGF基因阳性小鼠中，通过基因鉴定筛选嵌合率大于50％的成熟公鼠与未发生同源重组的原品系野生型小鼠进行交配，之后饲养受孕的母鼠，获得受孕母鼠生产的子代小鼠。

(7)使步骤(6)获得的子代小鼠之间进行交配，通过基因鉴定筛选出纯合子转基因小鼠。

另外，本发明还提供了一种通过转基因小鼠生产人NGF的方法，所述方法包括：

(1)通过上述生产转基因小鼠的方法获得的转基因小鼠并进行饲养；

(2)从上述方法步骤(1)获得的小鼠的颌下腺中提取人NGF；

本发明方法的优点在于：

1)通过外源导入的RNA指导的DNA内切酶定点切割染色体DNA，激活小鼠细胞内源的重组修复机制，利用人工导入的模板DNA，通过同源重组将人NGF基因成熟多肽的DNA序列定位替换鼠的NGF基因成熟多肽，形成一个带有鼠NGF的表达调控序列、信号肽、前体肽和人NGF成熟多肽DNA序列嵌合基因。较常规的利用正负双筛选同源重组基因打靶技术相比，操作简单，只需将3种质粒DNA同时转染ES细胞或者对小鼠的受精卵进行原核注射就可以，成功率高，可以达到2-5％，显著高于普通基因打靶技术的0.1％的ES细胞阳性率。

2)小鼠细胞在合成人NGF蛋白时，完全利用鼠NGF的表达调控序列，转录出一个带有小鼠NGF信号肽、前体肽和人NGF成熟多肽的嵌合多肽，经小鼠细胞的翻译后修饰过程，切除信号肽和前体肽，最终获得人NGF的成熟多肽并分泌到小鼠颌下腺中，可以从雄性小鼠颌下腺中直接分离纯化人NGF。

3)人NGF完全采用小鼠NGF的表达调控元件和翻译后修饰机制，人NGF的表达水平与野生型小鼠内源性NGF的表达水平相当，克服了普通人NGF转基因小鼠表达水平不稳定的问题。

4)在小鼠颌下腺中表达的人NGF可以形成正确的空间结构，具有刺激鸡胚神经元生长的生物学活性，显著优于通过工程细胞，如CHO细胞和293细胞表达获得的重组人NGF。

附图说明

图1.同源重组供体DNA载体构建示意图；

图2.指导RNA模板DNA载体构建示意图；

图3.Cas-9 DNA内切酶基因载体构建示意图；

图4.基因敲入纯合小鼠的PCR鉴定图谱；

图5.受精卵显微注射获得基因小鼠F1代的PCR鉴定图谱；

图6.人NGF基因敲入小鼠颌下腺表达荧光检测结果图；

图7.转基因小鼠产生的人NGF的蛋白印迹检测结果图；

图8.转基因小鼠产生的人NGF生物活性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1

1.同源重组模板载体的构建

以pBR322质粒为基础构建同源重组模板载体，其结构如图1所示。构建好的载体依次包含5‘-同源重组臂、小鼠NGF基因第三内含子序列、FRT、嘌呤霉素抗性基因(Puro基因)、FRT、鼠NGF信号肽序列、人NGF基因、鼠NGF3’-非翻译区序列、3‘-同源重组臂。通过同源重组，可以将人NGF基因原位替换鼠NGF基因，同时在5’-端上游引入了一个嘌呤霉素抗性基因，其两端各有一个FRT位点，可以通过FLP重组酶的作用，去除嘌呤霉素抗性基因。而鼠NGF上下游DNA序列没有变化。

5’-同源重组臂的序列可以如SEQ ID NO:1所示，嘌呤霉素抗性基因表达盒序列如SEQ ID NO:4所示，在其两侧的FRT序列如SEQ ID NO:2所示，所述嘌呤霉素抗性基因表达盒受PGK启动子调控，所述PGK启动子序列如SEQ ID NO:3所示。鼠NGF信号肽序列如SEQ IDNO:5所示，人NGF基因序列如SEQ ID NO:6所示，所述3‘-同源重组臂含有鼠NGF3’-非翻译区序列。所述3’-非翻译序列包括终止密码子、polyA加尾信号以及内含子序列。3’-同源重组臂序列可以如SEQ ID NO:7所示。

所述载体还带有原核细胞的抗生素筛选基因氨苄青霉素抗性基因，以便于在大肠杆菌中筛选阳性克隆。

按照上述的序列和排列顺序使用常规的分子克隆技术进行DNA序列合成和连接，并将该序列克隆于pUC57载体的EcoRV位点上。

2.Cas-9/CRSPR指导RNA模板的设计和合成

按照Cas/CRSPR系统识别DNA序列的特点，在鼠NGF成熟多肽的DNA序列上设计20bp的指导RNA序列靶向序列。本发明在所述载体上设计了两种靶向序列：

(1)分别合成序列如SEQ ID NO:8所示的GGF-1和序列如SEQ ID NO:9所示的GGF-2DNA序列，在所述SEQ ID NO:8和9中，第1-319位为U6启动子序列，第320-329位为能够识别并结合小鼠的NGF基因，被Cas-9内切酶识别并切割的靶向序列，第330-456为终止序列(见图2)。

(2)合成的序列克隆于pUC57载体的EcoRV位点上。作为靶向序列，相应合成的模板DNA序列添加了U6启动子序列和终止序列，在U6启动子的驱动下，可以转录出20个核苷酸的RNA分子，可以识别并结合小鼠的NGF基因，被Cas-9内切酶识别并切割，造成小鼠NGF基因的断裂，启动小鼠细胞内的同源重组修复机制，以人工合成的供体DNA为模板，合成新的DNA链，从而使供体DNA分子中的人NGF基因取代小鼠内源性的NGF基因，获得人NGF基因敲入得基因修饰小鼠。设计2个靶向序列的目的，是提高Cas-9内切酶对内源性小鼠NGF基因的切割效率，提高同源重组替换的效率。

3.Cas-9 DNA内切酶基因载体构建

按照PGK启动子序列、Cas-9基因序列、入核信号肽编码序列和PolyA加尾信号的顺序合成Cas-9表达载体，合成的基因克隆于pUC57载体EcoRV位点中(见图3)。其中PGK启动子序列采用如Genebank：KF293661.1：4041-4680所示的序列，Cas-9 DNA序列采用如genebank：YP_008868573所示的序列，入核信号肽氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，其编码序列如SEQ ID NO:11所示，SV40 PolyA加尾信号序列采用如Genebank：HM771703.1：9523-9838所示的序列。

在所述Cas-9 DNA内切酶基因和所述编码入核信号肽的核苷酸序列之间有一个编码如SEQ ID NO:12所示的柔性多肽的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述柔性多肽连接Cas-9 DNA内切酶与入核信号肽，保证Cas-9 DNA内切酶的空间构型及顺利入核，完成对内源性小鼠NGF基因的切割功能。

4.ES细胞的转染和筛选

(1)构建好的人NGF同源重组模板载体的线性化

100μg纯化好的质粒pKI－NGFDNA用Kpn I(酶用量：120U)线性化，酶切体系为200μl、37℃消化过夜，等体积酚氯仿、氯仿处理后，无水乙醇沉淀，100μl无菌PBS重悬备用。

(2)转染

线性化同源重组DNA模板载体pKI－NGF量：10μg，Cas-9表达载体，5μg，指导RNA模板DNA质粒5μg，

电转仪型号：Bio-Rad Gene Pulser(Cat.No.165-2105)

电穿孔条件：电压240v，电容500μF,实际通电时间9.6ms，实际电压256v

克隆筛选条件：300μg/ml嘌呤霉素筛选8天。

也可以采用脂质体转染的方法导入小鼠的ES细胞，

(3)筛选和鉴定

首先通过嘌呤霉素筛选获得阳性克隆，然后通过PCR的方法对阳性克隆进行鉴定。G418抗性克隆的PCR阳性率达到4％(2/50)。阳性ES细胞克隆扩大培养以后用于小鼠的囊胚显微注射。

5.囊胚和受精卵显微注射和移植

(1)注射

显微注射用囊胚和受精卵来源：C57BL/6J小鼠超数排卵；

自然受孕；

体内发育至囊胚阶段。

将培养的阳性ES细胞用胰酶消化成单细胞后，吸入玻璃显微注射针中，通过显微注射的方法，将ES细胞注射到发育到3.5天的小鼠囊胚中。

将线性化后的pKI-NGF质粒DNA、Cas－9表达载体DNA和指导RNA模板DNA质粒按照2:1:1的比例稀释到1-2ng/ul，通过显微注射的方法将DNA注射到小鼠受精卵雄性原核中。

(2)移植

注射后的囊胚培养3-4小时后移植到假孕母鼠的子宫中，手术缝合共注射50枚胚胎，制作6只受体。

共出生22只小鼠，其中16只♂为>50％嵌合雄鼠。

注射小鼠受精卵100枚，成活45枚，制备了3只受体。

出生小鼠15只，经PCR检测，1只为阳性，雌性。

PCR检测条件：

鼠尾DNA0.5ug；

引物终浓度：0.2umol/l；

Taq DNA聚合酶：1个单位；

10XPCR缓冲液：2.5ul；

终体积：25ul。

其中，鉴定人NGF基因敲入纯合的转基因小鼠的PCR引物序列如SEQ ID NO:14和15所示，而鉴定野生型小鼠的PCR引物序列如SEQ ID NO:16和17所示。两种PCR产物的长度均为266bp。

PCR条件：94度预变性4分钟，94度30秒，58-62度30秒，72度30秒，30个循环后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物的长度：266bp。

基因敲入小鼠一般呈杂合状态，通过自交，可以获得人NGF基因敲入纯合的转基因小鼠。在这种情况下，人NGF基因敲入纯合的小鼠PCR结果是人NGF引物扩增阳性(PCR引物序列SEQ ID NO:14和15)，而鼠内源性NGF引物扩增阴性(PCR引物序列如SEQ ID NO:16和17)。野生型小鼠则是相反。杂合小鼠是2对引物均为阳性。本发明的目的是获得人NGF基因敲入纯合的小鼠，因此首先是使用人NGF引物鉴定是否有人NGF基因转入的杂合状态，然后通过自交繁殖后再鉴定获得纯合的小鼠用于后续的人NGF纯化工作。

检测结果见图4，其中，1，3，和6号为人NGF纯合小鼠，人NGF扩增产物为阳性，鼠NGF扩增产物为阴性。

6.带有人NGF的转基因小鼠的传代

通过PCR的方法，对新生转基因小鼠进行鉴定，阳性小鼠交配传代，采用同样的方法对F1代小鼠进行鉴定。检测结果见图5，其中1，2，4，6为阳性。

将嵌合率大于50％的成熟雄鼠与C57BL/6J雌鼠进行交配，后代黑色小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR鉴定，共获得阳性F1代小鼠9只。

然后将阳性的雄鼠和雌鼠进行交配，分别采用基因敲入小鼠的鉴定引物和野生型小鼠的鉴定引物鉴定人NGF纯合的F2代小鼠，从12只F2代小鼠中，鉴定获得人NGF纯合的小鼠3只。

将显微注射获得的转基因小鼠与C57雄鼠交配，F1代出生10只，4只经PCR检测为阳性小鼠。

实施例2.

人NGF在基因敲入小鼠颌下腺中的表达检测

1)分别将人NGF基因敲入纯合小鼠和野生型小鼠断颈处死，取颌下腺后冰冻切片4～8μm，室温放置30分钟后，放入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3％过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2次。

2)5～10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的兔抗人NGF抗体，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。PBS冲洗，5分钟×3次。

3)滴加适当比例稀释的荧光素标记羊抗兔二抗(1％BSA-PBS稀释)，37℃孵育10～30分钟；PBS冲洗，5分钟×3次。封片后荧光显微镜观察并照相记录。

在人NGF基因敲入小鼠的颌下腺中，可以检测到强的人NGF表达(图6B)，而在野生型小鼠颌下腺中则荧光信号很弱(图6A)，可能是鼠NGF与人NGF一定的交叉反应所致。

实施例3：NGF的获得和纯化

1.-20度保存的小鼠颌下腺在0.5mM EDTA溶液中化冻并匀浆(2ml/每克组织),然后9000转4度离心30分钟，取上清后冻干。用4ml 50mM的PBS溶液(pH6.8)重新溶解样品，相同缓冲液透析72小时。中间换液3次。然后将透析后的样品上透析液平衡的CM-52离子交换树脂(25X40厘米)，收集OD.280大于0.5的流出液并超滤浓缩至1ml(每克组织)，截留分子量为30KD。然后用20倍体积的25mM的PBS溶液(pH6.8)透析72小时，换液三次。

2.将透析液更换为50mM醋酸钠/氯化钠缓冲液(pH4.0),继续透析72小时，离心后收集上清。

3.将透析后的样品上50mM醋酸钠/氯化钠缓冲液(pH4.0)平衡的CM-52树脂柱(5X25cm),采用80ml/小时的流速进行洗脱，分别采用50mM醋酸(pH 4.0),50mMTris/HCl(pH9.0)和50mMTris/HC1,0.5M NaC1(pH 9.0)进行洗脱。将最后一种缓冲液洗脱的样品峰收集，上CM-Sephadex柱(2X10cm)进行浓缩，填料采用50mM醋酸/0.5M NaC1缓冲液溶胀和平衡(pH 5.0)，洗脱采用50mM醋酸钠/，1M氯化钠缓冲液(pH5.0)，流速为50ml/小时。

4.使用Amicon 8020超滤装置和YM10超滤膜将样品浓缩至1/4体积，取2ml样品上制备型HPLC进行进一步的纯化，采用PROHR5/10的柱子。采用含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度洗脱(28-40％)，流速0.4ml/分钟。洗脱的样品进行SDS-PAGE电泳纯度检测和生物学活性的检测。取HPLC不同时段获得的洗脱样品各10ul，加入等体积2×SDS-PAGE电泳上样缓冲液10ul，100度煮沸10分钟，冰浴冷却，上样于12％SDS-PAGE胶孔中，电泳至溴酚蓝到胶的底部，停止电泳。

将胶取下，切除浓缩胶部分，在甲醇中浸泡10分钟，在电泳结束前20min开始准备转膜所需的的滤纸和1张PVDF膜。PVDF膜使用前在无水甲醇中浸泡1min～2min。依次在电极上叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜、刚刚完成电泳的凝胶和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸。最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜60min。

5.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h即可。

6.将兔抗人NGF抗体用封闭液稀释1:1000，从封闭液中取出膜放于抗体液面上，37°孵育1h之后转移到室温下再孵育1h(或者4°孵育过夜)，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

7.在培养皿内加入HRP标记的羊抗兔二抗稀释液(1:10000用TBST稀释)，放在摇床上，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。并在凝胶成像仪上进行曝光。

从Western印迹结果中可以看出(图7)，人NGF在洗脱组分6和组分7中。混合组分6和7的样品，冻干后为纯化的人NGF蛋白。

实施例:4 NGF生物学活性的检测

取7-8d龄鸡胚背根神经节，接种于底部已涂有胶原蛋白的细胞瓶中，采用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。贴壁后，加入不同浓度的NGF纯化样品，同时设空白对照，37℃5％CO2孵箱培育24h，倒置显微镜下观察。图8(A)为加入人NGF后的鸡胚背根神经节的培养情况，可见大量神经纤维的生长。而图8(B)为没有添加人NGF的鸡胚背根神经节的培养情况，未见神经纤维的生长。说明本发明从人NGF基因敲入小鼠颌下腺中纯化获得了的人NGF多肽，其分子量大小、免疫学和生物学活性与人NGF相同，为大量生产人NGF打下了基础。

Claims (6)

1.一种通过同源重组技术生产转基因小鼠的方法，所述小鼠染色体中编码神经生长因子的基因被一个或多个拷贝的编码人神经生长因子的基因原位取代，所述方法包括如下步骤：

(1)构建含有人神经生长因子编码基因的同源重组载体，所述的同源重组载体依次包含5’-同源重组臂、FRT序列、嘌呤霉素抗性基因表达盒、FRT序列、鼠NGF信号肽序列、人NGF基因、鼠NGF3’-非翻译区序列、3’-同源重组臂；

(2)构建指导RNA模板DNA载体，所述载体含有在细胞内转录出RNA分子的两种DNA编码序列，所述DNA编码序列分别如SEQ ID NO:8和9的第320-329位核苷酸所示，所述RNA分子能够与小鼠染色体中编码神经生长因子成熟肽的DNA序列特异性互补，并被Cas-9DNA内切酶所识别并切割，造成小鼠NGF基因的断裂，启动小鼠细胞内的同源重组修复机制；

(3)构建含有Cas-9DNA内切酶基因的真核表达载体，所述载体含有与所述内切酶基因连接的编码入核信号肽的核苷酸序列，所述入核信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，在所述Cas-9DNA内切酶基因和所述编码入核信号肽的核苷酸序列之间有一个编码如SEQ ID NO:12所示的柔性多肽的核苷酸序列；

(4)将步骤(1)-(3)获得的3种载体一起转染入小鼠胚胎干细胞，并筛选发生了同源重组的细胞；

(5)将步骤(4)获得的胚胎干细胞显微注射入小鼠囊胚中，之后移植到假孕母鼠的子宫中，饲养受孕母鼠，获得受孕母鼠生产的子代小鼠，对所述子代小鼠进行基因鉴定，筛选出人NGF基因阳性的小鼠；

(6)在步骤(5)获得的人NGF基因阳性小鼠中，通过基因鉴定筛选嵌合率大于50％的成熟公鼠与未发生同源重组的原品系野生型小鼠进行交配，之后饲养受孕的母鼠，获得受孕母鼠生产的子代小鼠；

(7)使步骤(6)获得的子代小鼠之间进行交配，通过基因鉴定筛选出纯合子转基因小鼠。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述嘌呤霉素抗性基因表达盒的表达受PGK启动子调控，所述载体还带有原核细胞的抗生素抗性基因，以便于在大肠杆菌中筛选阳性克隆。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述载体是在pBR322质粒基础上构建的，所述抗生素抗性基因为氨苄青霉素抗性基因。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的转染为电转染或者脂质体转染。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)所述小鼠的品系为C57BL/6J。

6.一种通过转基因小鼠生产人NGF的方法，所述方法包括：

(1)饲养权利要求1-4中任一方法获得的转基因小鼠；

(2)从步骤(1)获得的小鼠的颌下腺中提取人NGF。