CN104458703A - 一种转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法及其专用装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法及专用装置，该方法包括以下步骤：采用拉曼光谱装置获取转基因水稻种子及其亲本在200-3400cm^-1波数范围内的拉曼光谱散射特征曲线，采用核主成分分析法获取核主成分，将核主成分作为大间隔最近邻居算法的输入变量，在核空间中实现转基因水稻种子样本的鉴定。本发明方法与现有主流的基于细胞学方法及DNA化学检测方法相比，其显著优势在于其检测过程简单，检测效率高，不会造成环境污染，大大降低了检测成本。建立的转基因水稻种子及其亲本的快速检测模型识别精度达到86%，识别精度高，因此具有良好的应用前景和可观的市场价值。

Description

一种转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法及其专用装置

技术领域

本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及一种转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法及其专用装置。

背景技术

水稻是世界三大主要粮食作物之一，中国作为世界上最大的水稻生产地，有75％的水稻受水稻螟虫虫害影响，每年对水稻生产造成巨大危害。因此，培育抗螟虫水稻品种，对于提高水稻稳产性和保护生态环境都具有十分重要的意义。种植转Bt基因的抗螟虫水稻可以使水稻产量增加8％并减少80％的杀虫剂用量，使1.1亿水稻种植户直接受益，带来每年40亿美元的收益。综合各国的检测方法目前转基因产品的检测方法主要有两大类：蛋白质检测和DNA检测，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，核酸印记法(southern blot)，气相质谱法(gas chromatography and mass spectrometry，GC/MS)，酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，蛋白质印记法(Western blot)，生物传感器(Biosensor)等。但是这些理化学分析法存在实验操作复杂耗时长、检测成本高以及易于造成环境污染等缺点，难以满足目前流通市场上大样本快速鉴别的需要。因此，建立关于转基因水稻产品快速、低成本的检测方法显得尤为重要。

发明内容

发明目的：为了解决现有转基因产品检测技术存在的实验操作复杂耗时长、检测成本高以及易于造成环境污染等等的一系列的问题，本发明提供一种转基因水稻种子及其亲本快速检测方法，克服常规物理化学检测方法的缺点，实现对转基因水稻种子及其亲本低成本快速检测，本发明的另一名地是提供一种上述转基因水稻种子及其亲本快速检测方法的专用装置。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，包括如下步骤：

步骤1，将转基因水稻种子及其亲本样本固定在载物台上，采用全固态半导体激光器产生辐射源，通过显微拉曼探测装置获取转基因水稻及其亲本的拉曼光谱信息；建立转基因水稻及其亲本拉曼光谱数据库；

步骤2，对采集到的原始转基因水稻种子及其亲本的拉曼波谱信息进行归一化和中心化处理；

步骤3，运用核主成分分析方法计算步骤2处理后的转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱信息的核主成分；

步骤4，运用大间隔最近邻分析方法将步骤3提取到的核主成分映射到高维特征空间中，在核空间中获得转基因水稻及其亲本样本空间分布属性；

步骤5，对于待测转基因水稻及其亲本种子样本，依次通过步骤1-4，将待测样本的拉曼波谱映射到先验高维特征空间中，在高维特征空间中运用K最近邻分析方法，根据待测样本与数据库样本核空间的相对空间度量来估测转基因水稻种子样本的类别。

步骤2中，通过归一化处理，把数据映射到[-1,1]范围内处理，归一化处理算法为：

${\hat{x}}_i=2\·\left(\frac{x_i-x_{\min }}{x_{\max }-x_{\min }}\right)-1$

其中，x_i表示第i列待归一化特征向量，x_min表示列向量中最小值，x_max表示列向量中最大值，表示第i行归一化后的列向量。如果列向量中最大值等于最小值x_max＝x_min，则列向量值不变

步骤2，中心化处理，是指变量减去其数学期望值，对于样本数据，是指将样本变量的每个观测值减去该变量的样本的平均值，具体算法如下：

${\stackrel{\‾}{x}}_{\mathrm{ij}}={\hat{x}}_{\mathrm{ij}}-\frac{1}{M}\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{\hat{x}}_{\mathrm{ij}}$

其中，i对应样本序号，j对应变量序号，M表示样本总数。

步骤3中，运用核主成分分析算法通过引入Gaussian核函数把非线性转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱数据映射到高维核空间实现拉曼波谱变量线性化，在核空间利用主成分分析技术提取转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱特征信息，利用累计方差达到98％置信率和K-fold交互验证法来估计样本在核空间中最优的主成分数和Gaussian核函数宽度，最终使用20个主成分数作为特征参数，高斯核宽度设定为22。

步骤4中，运用大间隔最近邻分析方法训练损失函数需要计算两项惩罚项包括：目标近邻之间的距离和近邻中不同类的点之间的距离，在训练集中最小化损失函数，通过引入松弛变量，然后用半正定规划算法求解，训练出一个合适的马氏距离，作为测试阶段的度量参数。

步骤5中，所述在核空间中运用K近邻分析方法建立预测模型，最近邻样本参数可由用户自行选择设定。

步骤5中，所述空间度量采用服从同一分布并且其协方差矩阵的随机变量差异程度用Mahalanobis度量法来实现。

所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法的专用装置，包括PC机、显微拉曼探测装置和辐射源；所述的PC机通过USB总线与显微拉曼探测装置相连；所述的辐射源为全固态半导体激光器，为显微拉曼探测装置提供辐射。

所述的显微拉曼探测装置包括物镜、粗调微调张力器、载物台、莱卡显微镜、滤光器、色散系统和TE探测器PC机；所述的粗调微调张力器与载物台相连，在载物台上方设置全固态半导体激光器，在载物台于全固态半导体激光器之间设置物镜，所述的莱卡显微镜依次通过滤光器、色散系统与TE探测器相连。

所述的全固态半导体激光器产生辐射源，输出功率0～100mW，功率可在0-100％内可调，具有双激发波长：532nm和785±0.05nm，单模激光带宽可达0.01nm，激光束通过50X的物镜(数值孔径0.43mm，有效工作距离14.81mm，焦点距离4mm，分辨率0.64μm)聚焦到样本的表面，曝光时间50ns，激光强度是0.5mv。

有益效果：与现有技术相比，本发明的转基因水稻种子及其亲本快速检测方法及其专用装置，是基于拉曼光谱技术结合核空间分析法进行建模，建立了转基因水稻种子及其亲本种子类别鉴别的模型，该模型对未知样品的预测准确率达到86％，识别精度高，本发明能够起到提高检测效率、减低检测成本、减低环境污染等的功能，因此具有良好的应用前景和可观的市场价值。

附图说明

图1是转基因水稻种子及其亲本快速检测方法的专用装置的结构示意图。

具体实施方式

下面结合具体附图进一步阐明本发明，本具体实施方式在以本发明技术方案为前提下进行实施，应理解这些方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

如图1所示，转基因水稻种子及其亲本快速检测方法的专用装置，包括PC机、显微拉曼探测装置和辐射源；PC机通过USB总线与显微拉曼探测装置相连；辐射源为全固态半导体激光器，为显微拉曼探测装置提供辐射。显微拉曼探测装置包括物镜、粗调微调张力器、载物台、莱卡显微镜、滤光器、色散系统和TE探测器PC机；粗调微调张力器与载物台相连，在载物台上方设置全固态半导体激光器，在载物台于全固态半导体激光器之间设置物镜，莱卡显微镜依次通过滤光器、色散系统与TE探测器相连。

全固态半导体激光器为辐射源，输出功率0～100mW，功率可在0-100％内可调，具有双激发波长：532nm和785±0.05nm，单模激光带宽可达0.01nm，激光束通过50X的物镜(数值孔径0.43mm，有效工作距离14.81mm，焦点距离4mm，分辨率0.64μm)聚焦到样本的表面，曝光时间50ns，激光强度是0.5mv。

载物台配有粗调微调限位器与粗调微调旋钮张力调节旋钮，可以控制载物台装配空间位置，载物台可实现横向和纵向运动，横向空间分辨率为4um，纵向空间分辨率为5um。

镜头采用Leica TCS SP8 STED 3X显微镜头收集激光器辐射种子后产生的散射光，采用防热变形硬镀膜二向色性滤光片减低散射光中杂散光的能量，通过光束散射系统将波长在空间中展开，采用TE致冷薄型背照式线性硅基CCD阵列探测器检测种子的拉曼光谱强度，探测器光栅刻线密度为1500l/mm，分辨率为2cm^-1，采集波数范围为：200-3400cm^-1。

实施例1

一种转基因水稻种子及其亲本快速检测方法，采用上述专用装置，采集放在载物台上的转Bt crylAb基因水稻克螟稻1号(KMD1)、克螟稻2号(KMD2)及其亲本水稻秀水11三种水稻种子在200-3400cm^-1之间且分辨率为2cm^-1的光谱散射特征曲线，整个实验过程在室温环境温度约为25℃的条件下进行。3种类型转基因水稻种子及其亲本样本种子共1050个样本，每种类型品种各350个样本。样本拉曼光谱数据被随机分成建模和预测集两部分，其中取900个样本作为建模集样本(每种类型各300个样本)，另外150个样本作为预测集样本(每种类型各50个样本)。具体步骤如下：

步骤1，将3种类型转基因水稻种子及其亲本样本：转Bt crylAb基因水稻克螟稻1号(KMD1)、克螟稻2号(KMD2)及其亲本水稻秀水11固定在载物台上，通过粗调和微调旋钮调节样品受辐射位置区域。采用输出功率为80mW全固态半导体激光器产生532nm和785±0.05nm双激发波长激光束，通过50X的物镜聚焦到转基因水稻及其亲本种子上。采用Leica TCS SP8 STED 3X显微镜头收集激光器辐射种子后的产生的散射光，采用防热变形硬镀膜二向色性滤光片减低散射光中杂散光的能量，通过的光束通过散射系统将波长在空间中展开，采用TE致冷薄型背照式线性硅基CCD阵列探测器检测波数范围在200-3400cm^-1转基因水稻种子及其亲本样本的拉曼光谱信息。PC机通过USB总线与显微拉曼探测装置相连，将获得的转基因水稻及其亲本的拉曼光谱信息采集和存储到500G以上的大容量磁盘介质中，建立转基因水稻及其亲本拉曼光谱数据库；建立转基因水稻及其亲本拉曼光谱数据库包括3类样本数据集：转Bt crylAb基因水稻克螟稻1号(KMD1)拉曼光谱数据集、克螟稻2号(KMD2)拉曼光谱数据集及其亲本水稻秀水11拉曼光谱数据集。

步骤2，对采集到的原始转基因水稻种子及其亲本的拉曼波谱信息进行归一化和中心化处理；归一化方法可以去除特征量纲影响，它把每一个样本的特征归一化到[-1,1]范围内，实现的算法如下：

${\hat{x}}_i=2\·\left(\frac{x_i-x_{\min }}{x_{\max }-x_{\min }}\right)-1$

式中，x_j表示第j列待归一化特征向量，x_min表示列向量中最小值，x_max表示列向量中最小值，表示第j行归一化后的列向量。如果列向量中最大值等于最小值x_max＝x_min，则列向量值不变

使用中心化处理算法可以消除特征均值漂移的影响，对于转基因水稻种子及其亲本样本数据，是指将种子每个拉曼波谱变量的每个观测值减去所有种子样本在该变量上的观测值的平均值，具体算法如下：

${\stackrel{\‾}{x}}_{\mathrm{ij}}={\hat{x}}_{\mathrm{ij}}-\frac{1}{M}\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{\hat{x}}_{\mathrm{ij}}$

其中，i对应样本，j对应变量，M表示样本总数。

步骤3，运用核主成分分析方法计算步骤2处理后的转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱信息的核主成分；运用核主成分分析算法将波长范围在200-3400cm^-1非线性转基因水稻种子及其亲本样本的拉曼波谱投影到Gaussian核空间中区，采用Gaussian函数为其中高斯核宽度设为22，并在高维核空间中对拉曼波谱数据进行中心化处理后求解非零特征值。经核主成分分析光谱数据后，得到前20个核主成分累积贡献率达到98％，所以采用前20个核主成分作为后续大间隔最近邻分类模型的输入变量。

步骤4，运用大间隔最近邻分析方法将步骤3提取到的核主成分映射到高维特征空间中，在核空间中获得转基因水稻及其亲本样本空间分布属性。大间隔最近邻算法是一种基于Mahalanobis度量的建模方法，原理是通过最小化目标函数来缩小同类样本之间的距离，从而加大属于不同类样本之间的距离。该方法首先利用类信息设定一个目标函数，通过半正定规划来最优化目标函数，训练出一个专属于该集合的距离公式，然后设计一个能量损失函数，测试样本对于每一类计算一个损失能量值，从中选择损失能量最小的类作为测试样本的类别。在模型训练阶段，通过损失函数估计出一个适合该数据集的距离公式，它计算两项惩罚项，一个是目标近邻之间的距离和，另一个是近邻中不同类的点之间的距离，合并后获得的损失函数为：

其中：[·]₊＝max(·,0)，D_M(x_i,y_i)为Mahalanobis度量距离。在训练集中最小化损失函数，通过引入松弛变量，然后用半正定规划算法求解，训练出一个合适的Mahalanobis度量，作为测试阶段的度量。μ是平衡参数，这里取0.5。在测试阶段大间隔最近邻分类算法用能量损失来度量测试样本与每个类别的距离，假设测试样本为x_t，定义其能量损失函数为：

E＝(1-μ)Energy(Pull)+μ[Energy(Push)]

其中，Energy(Push)中第1项是测试样本与其第K个目标近邻节点距离加1范围内其他类的样本之间的能量损失值，Energy(Push)中第2项是测试节点在其不同类近邻节点的K个目标近邻节点距离加1范围之内的能量损失值；Energy(Pull)为测试样本与同类K个近邻样本之间的距离累加和。分别计算测试样本与每一类的能量损失值得到E，从中选取最小值对应的类作为测试样本的类别。

步骤5，对于待测转基因水稻种子样本，依次通过步骤1-4，将待测样本的拉曼波谱映射到先验高维特征空间中，然后设定好邻近样本参数K，在特征空间中运用K最近邻分析方法根据待测样本与数据库样本核空间的相对Mahalanobis空间度量来估测转基因水稻种子样本的类别。

用已建立大间隔最近邻模型对900个数据库训练集样本和150个待测样本进行估计，得到的建模集和的预测准确率分别为89％和86％，相对偏差均在5％以下，可以看出本申请提出的方法和装置是可行的，并且可以满足实际中转基因水稻种子快速及低成本检测的应用的需求。

Claims (10)

1.一种转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，将转基因水稻种子及其亲本样本固定在载物台上，采用全固态半导体激光器产生辐射源，通过显微拉曼探测装置获取转基因水稻及其亲本的拉曼光谱信息；建立转基因水稻及其亲本拉曼光谱数据库；

步骤2，对采集到的原始转基因水稻种子及其亲本的拉曼波谱信息进行归一化和中心化处理；

步骤3，运用核主成分分析方法计算步骤2处理后的转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱信息的核主成分；

步骤4，运用大间隔最近邻分析方法将步骤3提取到的核主成分映射到高维特征空间中，在核空间中获得转基因水稻及其亲本样本空间分布属性；

步骤5，对于待测转基因水稻及其亲本种子样本，依次通过步骤1-4，将待测样本的拉曼波谱映射到先验高维特征空间中，在高维特征空间中运用K最近邻分析方法，根据待测样本与数据库样本核空间的相对空间度量来估测转基因水稻种子样本的类别。

2.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，步骤2中，通过归一化处理，把数据映射到[-1,1]范围内处理，归一化处理算法为：

${\hat{x}}_i=2\·\left(\frac{x_i-x_{\min }}{x_{\max }-x_{\min }}\right)-1$

其中，x_i表示第i列待归一化特征向量，x_min表示列向量中最小值，x_max表示列向量中最大值，表示第i行归一化后的列向量。如果列向量中最大值等于最小值x_max＝x_min，则列向量值不变

3.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，步骤2，中心化处理，是指变量减去其数学期望值，对于样本数据，是指将样本变量的每个观测值减去该变量的样本的平均值，具体算法如下：

${\stackrel{\‾}{x}}_{\mathrm{ij}}={\hat{x}}_{\mathrm{ij}}-\frac{1}{M}\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{\hat{x}}_{\mathrm{ij}}$

其中，i对应样本序号，j对应变量序号，M表示样本总数。

4.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，步骤3中，运用核主成分分析算法通过引入Gaussian核函数把非线性转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱数据映射到高维核空间实现拉曼波谱变量线性化，在核空间利用主成分分析技术提取转基因水稻种子及其亲本拉曼波谱特征信息，利用累计方差达到98％置信率和K-fold交互验证法来估计样本在核空间中最优的主成分数和Gaussian核函数宽度，最终使用20个主成分数作为特征参数，高斯核宽度设定为22。

5.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，步骤4中，运用大间隔最近邻分析方法训练损失函数需要计算两项惩罚项包括：目标近邻之间的距离和近邻中不同类的点之间的距离，在训练集中最小化损失函数，通过引入松弛变量，然后用半正定规划算法求解，训练出一个合适的马氏距离，作为测试阶段的度量参数。

6.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，步骤5中，所述在核空间中运用K近邻分析方法建立预测模型，最近邻样本参数可由用户自行选择设定。

7.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法，其特征在于，步骤5中，所述空间度量采用服从同一分布并且其协方差矩阵的随机变量差异程度用Mahalanobis度量法来实现。

8.根据权利要求1所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法的专用装置，其特征在于，包括PC机、显微拉曼探测装置和辐射源；所述的PC机通过USB总线与显微拉曼探测装置相连；所述的辐射源为全固态半导体激光器，为显微拉曼探测装置提供辐射。

9.根据权利要求8所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法的专用装置，其特征在于，所述的显微拉曼探测装置包括物镜、粗调微调张力器、载物台、莱卡显微镜、滤光器、色散系统和TE探测器；所述的粗调微调张力器与载物台相连，在载物台上方设置全固态半导体激光器，在载物台于全固态半导体激光器之间设置物镜，所述的莱卡显微镜依次通过滤光器、色散系统与TE探测器相连。

10.根据权利要求8所述的转基因水稻种子及其亲本的快速检测方法的专用装置，其特征在于，所述的全固态半导体激光器产生辐射源，输出功率0～100mW，功率可在0-100％内可调，具有双激发波长：532nm和785±0.05nm，单模激光带宽可达0.01nm，激光束通过50X的物镜聚焦到样本的表面，曝光时间50ns，激光强度是0.5mv。