CN104404036A - 基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于基因敲除的引物，包括五组引物，分别如SEQNO:1和SEQNO:2、SEQNO:3和SEQNO:4、SEQNO:5和SEQNO:6、SEQNO:7和SEQNO:8、SEQNO:9和SEQNO:10所示。本发明还公开了所述的引物在基因敲除方面的应用。本发明还公开了基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法。本发明可进行条件特异性、时空特异性、药物诱导型基因修饰；减少对其他细胞的危害，研究组成型表达的基因在特定组织中的功能；只需Cas9工具鼠即可实现组织、空间特异性基因敲除或诱导型基因敲除；试验周期短，节省时间和成本。
Description
技术领域
本发明属于基因修饰技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法。
背景技术
随着科技的进步和对生命科学领域的不断探索，人们对活体内某一基因在特定组织、细胞及时间内的表达情况的研究显得更为迫切。近年来迅速发展的位点特异性重组技术是适应这种需要而产生的关键基因操作工具，其能够在一定发育阶段或在特定的组织中诱导靶基因失活，避免了靶基因缺失引起的胚胎早期死亡或出现复杂表型，删除筛选标记基因，从而对目的基因做出完整的功能分析。目前被广泛应用的重组酶系统有Cre-LoxP系统、FLP-FRT系统、R-RS系统以及I-SceI系统，但应用最多的还是Cre-LoxP系统。
Cre-LoxP重组酶系统是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的核心技术。
Cre-LoxP系统来源于P1噬菌体，包含以下两种成分：
①一段34bp的DNA序列，含有两个13bp的反向重复序列和一个8bp的核心序列。这段34bp序列是重组酶的识别位点，被称为LoxP位点。
②Cre重组酶，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发LoxP位点的DNA重组。任何序列的DNA，当其位于两个LoxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个LoxP位点的方向相同)，要么方向发生倒转(两个LoxP位点的方向相反)，如图1所示。
利用Cre-LoxP系统实现体内某特定基因在特定条件下的敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠：首先在体外构建一个目的基因，其两端分别含有一个LoxP位点，之后将构建好的这段基因序列转入胚胎干细胞内。经过处理的胚胎干细胞被植入到假孕小鼠的子宫内，使其重新发育成为一个完整的胚胎，最终成为一只转基因小鼠。在这只转基因小鼠中，LoxP位点被引入到相应基因的内含子内，理论上不会对相应基因的功能产生影响，因此一般情况下，该小鼠的表型是正常的。第二只转基因小鼠：一般采用卵母细胞注射或者胚胎干细胞技术获得，在这只小鼠中，Cre重组酶被置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定的条件下表达。最后，让这两只小鼠交配，产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的细胞中缺失某一特定的基因。
人工核酸内切酶Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPRs/Cas9系统，广泛存在于原核生物(大多数的细菌和所有的古细菌)基因组中。CRISPRs/Cas9系统自2002年首次被定义以来，一直以其独特的结构与特殊的功能引起各国科学家的共同关注。CRISPR大致分为3类，用于基因修饰的是II型CRISPR系统，其成分较为简单，只需要Cas9和两个非编码的RNA：crRNA与反式激活crRNA(tracrRNA)，三个组分即可介导外源DNA片段的靶向降解。在实际的操作过程中，我们只需要设计特异性的sgRNA，并与Cas9蛋白一起转入到小鼠的受精卵中即可。
Cre-loxp重组酶系统虽然能够介导基因的条件性敲除，避免缺失功能基因造成的胚胎过早死亡等传统基因打靶技术的劣势，但还是存在很多不确定性：
①哺乳动物基因组中存在隐含的/假的LoxP序列，其序列和LoxP的保守序列可能并不完全相同，但能够被Cre重组酶识别而发生重组，进而引起不必要的DNA损伤。
②特异性差，很难得到存在双转基因的后代小鼠，成功率<50％。
③鉴定筛选过程复杂、耗时长。
现有的CRISPR/Cas9系统虽然操作简单，靶向精确性高，但不能实现组织、细胞、时空的特异性敲除。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的第一个技术问题是提供了一种用于基因敲除的引物。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了上述的引物在基因敲除方面的应用。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供了一种基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法。
本研究的组织特异性敲除技术，是由第三代基因修饰技术CRISPR/Cas9与Cre-LoxP系统融合而来。其既有CRISPR/Cas9技术的优点，又能实现基因的组织特异性/药物诱导型基因敲除；另外又比Cre-LoxP技术的周期短、效率高，也减少了细胞毒性。本发明只需要设计特异性的sgRNA，即可实现基因的组织、时空的特异性修饰。利用Cas9工具鼠技术可以在短时间内高效、特异的研究组成型表达的基因在某一组织或特定的时间内的功能，为人类疾病的研究提供理论依据和动物模型。另外此发明也可作为临床和医药研究的配套技术，为人类的健康保驾护航。
技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一组用于基因敲除的引物，包括以下五组引物，第一组引物序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示，第二组引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示，第三组引物序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示，第四组引物序列如SEQ NO:7和SEQ NO:8所示，第五组引物序列如SEQ NO:9和SEQNO:10所示。
上述的引物在基因敲除方面的应用。
一种基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法，包括以下步骤：
1)表达载体的构建：构建组织特异性表达的sgRNA载体和组成型/药物诱导型表达的Cas9载体；
2)表达载体测序正确后，分别电转到ES细胞中；通过PCR或Southern Blot验证，分别获得含有sgRNA表达质粒的ES细胞和含有Cas9蛋白的ES细胞并扩大培养；
3)将含有Cre重组酶的质粒转化到含有Cas9蛋白的ES细胞中，获得没有筛选标记的Cas9表达载体的ES细胞；
4)将含有Cas9表达载体的ES细胞与含有sgRNA表达质粒的ES细胞分别注射到囊胚中；
5)将囊胚分别移植到代孕母鼠中，进行饲养；生产出的后代即为F0代组织特异性表达的sgRNA小鼠和组成型/药物诱导型的Cas9工具鼠；
6)将检测正确的Cas9工具鼠与sgRNA小鼠杂交，获得组织特异性/药物诱导型基因敲除小鼠。
其中，上述组织特异性表达的sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、反向的2个LoxP位点和反向的U6启动子，使其只能在特定组织内表达Cre酶，引导LoxP位点间的U6启动子倒位，从而启动sgRNA的表达，如图2所示。
其中，上述组织特异性表达的sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、正向的U6启动子、方向相同的2个LoxP位点和终止区域，使其只有在特定组织内表达Cre酶，敲掉两个LoxP位点间的终止区域，从而启动sgRNA的表达框架。如图3所示。
其中，上述F0代组织特异性表达sgRNA小鼠的构建方法如下：
21)sgRNA片段设计与合成：所述sgRNA片段序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示；所述sgRNA片段具体设计如下：
(a)在Ensembl和NCBI上寻找目标基因的相关信息，确定敲除区域；
(b)敲除区域选定之后利用Crispr软件(http://crispr.mit.edu/)设计sgRNA片段；
(c)在NCBI数据库上对Crispr选择的靶点进行分析，选择脱靶位点较少的sgRNA位点；
22)将合成的sgRNA片段退火为双链片段；
23)将双链片段连接到线性化载体Church Cloning Vector或pCR-Blunt II-TOPO中得到连接产物sgRNA表达质粒；
24)将连接产物sgRNA表达质粒转化、挑选阳性克隆，进行菌落PCR验证；
25)将菌落PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
26)将验证正确的克隆进行测序得到测序正确的sgRNA表达质粒；
27)将测序正确的sgRNA表达质粒电转至小鼠的ES细胞中；经Southern Blot验证；
28)将验证正确的ES细胞注射到小鼠的囊胚中，随后转移至代孕母鼠中，最后得到F0代sgRNA的小鼠。
其中，上述组成型/药物诱导型的Cas9工具鼠的构建方法如下：
31)Cas9蛋白的扩增；
32)Cas9蛋白与Rosa26载体连接得到组成型/药物诱导型表达的Cas9载体；
33)将测序正确的组成型/药物诱导型表达的Cas9载体线性化后电转到ES细胞中；
34)用含有新霉素的培养基筛选组成型/药物诱导型表达的Cas9载体得到含有Cas9蛋白的阳性ES细胞；随后用Southern Blot验证；
35)将带有Cre重组酶的质粒转到含有Cas9蛋白的阳性ES细胞中，获得没有筛选标记的阳性ES细胞；
36)将没有筛选标记的阳性ES细胞显微注射到小鼠囊胚中，而后转移至代孕母鼠中，最后得到含有Cas9蛋白的工具鼠。
其中，上述菌落PCR采用的引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示，菌落PCR的扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，20s；退火58℃，25s；延伸72℃，20s，25个循环，终延伸72℃，5min。
其中，上述Cas9蛋白的扩增步骤如下：设计扩增Cas9蛋白的引物，其序列如SEQNO:5和SEQ NO:6所示；采用PCR扩增Cas9蛋白全序列，PCR扩增条件为：预变性98℃，3min；变性98℃，25s；退火63℃，25s；延伸72℃，4min30s，25个循环，终延伸72℃，5min。
其中，上述Cas9蛋白与Rosa26载体连接步骤如下：用Clontech公司的HDClinging Kit试剂盒将检测正确的Cas9序列与经AsisI与HpaI酶线性化的载体连接，将连接好的载体转化大肠杆菌、挑取克隆子、菌落PCR验证后，送苏州金唯智公司测序，其中菌落PCR引物采用的是SEQ NO:7和SEQ NO:8所示的引物，该菌落PCR的扩增条件为：预变性95℃，3min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，45s，26个循环，终延伸72℃，5min。
我们以Rosa26载体为原型，将Cas9蛋白插入到小鼠的Rosa26区域，避免Cas9蛋白的随机插入引起的细胞毒性，如图4所示。
有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除技术的优点：
①操作简单，高效率，低致死率，没有物种限制。
②可进行条件特异性、时空特异性、药物诱导型基因修饰。
③减少对其他细胞的危害，研究组成型表达的基因在特定组织中的功能；避免功能基因的缺失造成的胚胎过早死亡。
④只需一只Cas9工具鼠即可实现组织、空间特异性基因敲除或诱导型基因敲除。
⑤试验周期短，节省时间和成本。
附图说明
图1：Cre-LoxP重组酶系统介导的条件性基因敲除模式图；任何序列的DNA，当其位于两个LoxP位点之间时，若LoxP位点方向相同，则序列缺失；若LoxP位点方向相反，则序列倒转；
图2：组织特异性表达的sgRNA表达载体模式图；该载体是由组织特异性启动子、Cre重组酶、反向的LoxP位点、反向的U6启动子和sgRNA的表达框架组成；该载体只有在特定的组织中，才能激发Cre重组酶的表达，进而介导两个反向的LoxP位点间的U6启动子正向并启动sgRNA表达框架的表达；
图3：组织特异性表达的sgRNA表达载体模式图；该载体是由组织特异性启动子、Cre重组酶、U6启动子、LoxP位点、终止子和sgRNA表达框架组成；该载体只有在特定的组织中，才能激发Cre重组酶的表达，进而敲掉两个LoxP位点间的终止区域，从而启动sgRNA表达框架的表达；
图4：广谱性表达的Cas9表达载体模式图；该载体是以Rosa26表达载体为框架，由Rosa26的5’、3’同源臂、组成型/药物诱导型启动子、neo筛选标记、LoxP位点、Cas9蛋白表达序列、DTA终止区域组成；将其转移至小鼠体内，就会利用同源重组技术插入到小鼠的Rosa26区域；
图5：肝脏特异性表达的sgRNA表达载体；该载体是由肝脏特异性表达的Alb启动子、Cre重组酶、反向的LoxP位点、反向的U6启动子和sgRNA的表达框架组成；该载体只有在肝脏中，才能激发Cre重组酶的表达，进而介导两个反向的LoxP位点间的U6启动子正向并启动sgRNA表达框架的表达；
图6：sgRNA与载体连接的菌落PCR验证图；得到的产物大小为338bp。DNA Marker条带大小自下而上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp；
图7～8：sgRNA表达质粒电转至小鼠的ES细胞中，用Southern Blot验证结果图；基因组经Xba I酶切后，用Alb探针、Cre和U6探针进行杂交后的图，说明sgRNA完整的转入了ES细胞中；
图9：Cas9蛋白体外扩增电泳图；PCR扩增后得到3.9kb的片段；DNA Marker条带大小自下而上分别为250bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp、2500bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、6000bp、8000bp、10000bp；
图10：广谱性表达的Cas9蛋白表达载体模式图；该载体是以Rosa26表达载体为框架，由Rosa26的5’、3’同源臂、CMV强启动子、neo筛选标记、LoxP位点、Cas9蛋白表达序列、DTA终止区域组成；将其转移至小鼠体内，就会利用同源重组技术插入到小鼠的Rosa26区域；
图11：sgRNA与载体连接的菌落PCR验证图；得到的产物大小为601bp；DNAMarker条带大小自下而上分别为100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp；
图12～13：Cas9表达质粒电转至小鼠的ES细胞中，用Southern Blot验证结果图；3’端验证：用Hind II酶切后，野生型片段9.3kb、突变型7.6kb；5’端验证：用EcoR V酶切后，野生型片段11.6kb、突变型5.2kb，说明正确修饰；
图14～26：野生型、样品1～10、13、15的测序图谱；
图27：sgRNA表达框架模式图；该载体是sgRNA表达所需的基本框架；
图28：组织特异性表达的Cas9表达载体模式图；该载体是以Rosa26表达载体为框架，由Rosa26的5’、3’同源臂、组织特异性表达的启动子、neo筛选标记、LoxP位点、Cas9蛋白表达序列、DTA终止区域组成；该载体只有在特定的组织内，才能激活载体的表达。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
实施例1：
1、实验材料
①HD Clinging Kit(639648)：购买于Clontech公司；
②Premix Taq(D331A)、Primerstar(DRO44A)、dNTP(4030Q)：购买于宝生物工程(大连)有限公司(Takara)；
③限制性核酸内切酶BbsI(R0539L)、AsisI(R0630L)、HpaI(R0105S)：购买于北京博迈斯生物科技有限公司(NEB)；Church Cloning Vector是商业化质粒，通过Addgene，购买于Church实验室；pCR-Blunt II-TOPO也是商业化质粒，通过Addgene，购买于Invitrogen公司；带有Cre重组酶的质粒：通过Addgene，购买于Albee Messing实验室；Rosa26表达载体来源，通过Addgene，购买于Liqun Luo实验室。
2、基因结构和序列分析
目的基因：小鼠真核翻译起始因子3(Eif3h基因)；
Ensembl基因编码号：ENSMUSG00000022312；
Eif3h基因结构：Eif3h基因含有8个外显子，包括以ATG起始的exon 1和以TAA终止的exon 8；
基因描述：真核翻译起始因子3(Eukaryotic translation initiation factors3，Eif3)是真核生物翻译起始因子中最大且最复杂的因子，在蛋白转录起始过程中发挥重要作用，是与其他翻译起始因子相互联系的中心蛋白因子。Eif3是一个多亚基复合体，哺乳动物包含至少12个亚基，Eif3h是其中的一个，在多种肿瘤组织中都高表达，表明其与多种肿瘤的发生、发展、恶性生物学行为密切相关。
3、寻找基因敲除位点并筛选
(1)在Ensembl和NCBI上寻找Eif3h基因相关信息，确定敲除区域；
(2)敲除区域选定之后利用Crispr软件(http://crispr.mit.edu/)设计sgRNA片段；
(3)在NCBI数据库上对Crispr选择的靶点进行分析，选择脱靶位点较少的sgRNA位点，最后将靶点定位在exon 4上。
4、sgRNA表达载体的构建及小鼠制作
(1)sgRNA片段设计：
上游引物：5’–AGTTGCTTCAGCGAGAGAGATCCTT–3’
下游引物：5’–AAACAAGGATCTCTCTCGCTGAAGC–3’
(2)将合成的sgRNA片段退火为双链片段；其中该退火的条件和体系如下：
上游引物(100μM) 1μl
下游引物(100μM) 1μl
10*T4连接buffer(NEB) 1μl
ddH2O 6.5μl
T4 PNK(NEB) 0.5μl
反应程序：37℃ 30min
95℃ 5min，随后缓慢降温到25℃，再反应5min。
(3)将双链片段连接到用BbsI酶切的线性化载体中得到连接产物，其为含有Alb启动子(肝脏特异性表达)的Church Cloning Vector，图谱如图5所示。
(4)将连接产物转化、挑选阳性克隆，进行菌落PCR验证；
菌落PCR流程如下：
引物为：
Product primer F:TGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAG
Product primer R:AAACAAGGATCTCTCTCGCTGAAGC
反应体系：
反应程序：
(5)将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到一段338bp的片段，如图6所示。
(6)将验证正确的克隆进行测序，以确保sgRNA序列的正确性。
(7)将测序正确的sgRNA表达质粒电转至小鼠的ES细胞中；经Southern Blot验证，结果如图7和图8所示；
(8)将验证正确的ES细胞注射到小鼠的囊胚中，随后转移至2只代孕母鼠中，最后得到9只具有sgRNA的小鼠。
实施例2 Cas9表达载体的构建及Cas9工具鼠的制作
(1)Cas9蛋白的扩增
①设计扩增Cas9蛋白的引物，如下：
Cas9-F：CGCGGTCTTTCCAGTGATCGATTAGTTATTAATAGTAATCAA
Cas9-R：CTCTAGTCCGCGGGTGCGATAGCTCACACCTTCCTCTTCTTCTTG
②PCR扩增Cas9蛋白全序列，体系如下：
PCR程序如下：
③将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图9所示。
(2)Cas9蛋白与Rosa26载体连接
①用Clontech公司的HD Clinging Kit试剂盒将检测正确的Cas9序列与经AsisI与HpaI酶线性化的载体连接。载体为公司改造，其带有广谱性表达的启动子CMV、Rosa26的5’arm、3’arm的Rosa26载体骨架，图谱如图10所示。
②将连接好的载体转化大肠杆菌、挑取克隆子、菌落PCR验证后，送苏州金唯智公司测序。菌落PCR引物如下：
Cas9-SF：CACCATAGACAGAAAGCGGTACACC
Cas9-SR：CTAAAGCGCATGCTCCAGACTG
反应体系如下：
反应程序如下：
(3)将测序正确的载体线性化后电转到ES细胞中；
(4)用含有新霉素的培养基筛选出含有Cas9蛋白的阳性ES细胞；随后用SouthernBlot验证，结果如图12和13所示。
(5)将带有Cre重组酶的质粒转到阳性ES细胞中，获得没有筛选标记的阳性ES细胞；
(6)将验证正确的ES细胞显微注射到小鼠囊胚中，而后转移至2只代孕母鼠中，最后得到10只含有Cas9蛋白的工具鼠。
实施例3 条件性敲除小鼠的获得
将Cas9工具鼠与sgRNA小鼠进行杂交，最终获得15只小鼠，取小鼠的不同组织，提取基因组，用Eif3h-F/Eif3h-R引物对进行PCR扩增后，送往苏州金唯智公司测序，结果显示肝脏组织中基因敲除率达到80％以上，其他组织的基因则完好。
上述引物对：Eif3h-F:ATCATATATTTAATTTTCAACAAGT
Eif3h-R：CTTTCCTACAGAGCTTCACCT
基因敲除结果分析：
肝脏组织：
野生型是指没有做过任何修饰的小鼠的肝脏组织；
1～15号样品分别指的是取15只小鼠的不同组织进行实验，分别提取不同组织的基因组，进行PCR扩增，随后送去测序，结果显示只有肝脏组织的Eif3h基因被修饰而其他组织的该基因则完好；11、12、14号样品的肝脏组织的Eif3h基因没有被修饰，与野生型相同。
测序后野生型的主峰是：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
1号样品：
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-ATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
(删除1bp)
2号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAA-CTTCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
(删除1bp)
3号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-GATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGAGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(插入1bp)
4号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-ATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(删除1bp)
5号样品
主峰：ATCCCATAAAAACTGCCCAAGG---TCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(删除3bp)
次峰：ATCCCATAAAAACTGC-----------------TGAAGGCGTACAGACTGAC(删除17bp)
6号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-ATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(删除1bp)
7号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-ATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
(删除1bp)
8号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：ATCCCATAAAAACTGCCCAA---TCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(删除3bp)
9号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-ATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(删除1bp)
10号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：ATCCCATAAAAACTGCCCAA-CTTCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(删除1bp)
13号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-GATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGAGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(插入1bp)
15号样品
主峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAG-GATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC
次峰：
ATCCCATAAAAACTGCCCAAGAGATCTCTCTCGCTGAAGGCGTACAGACTGAC(插入1bp)
上述样品1～10、13、15对应的测序结果参见图15～26所示。
实施例4组成型表达的sgRNA载体、组织特异性表达的Cas9载体的构建
sgRNA表达载体为pCR-Blunt II-TOPO载体，如图27所示；
组织特异性表达的Cas9载体以Rosa26载体为原型，将Cas9蛋白插入到小鼠Rosa26区域，避免Cas9蛋白的随机插入引起的细胞毒性，如图28所示；
其他的构建流程同实施例1和实施例2，结果同实施例3的结果部分，只有肝脏组织中的Eif3h基因被修饰，其他组织中的该基因则完好，这说明此方案同样可以达到条件性基因敲除的目的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于基因敲除的引物，其特征在于，包括以下五组引物，第一组引物序列如SEQ NO:1和SEQ NO:2所示，第二组引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示，第三组引物序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示，第四组引物序列如SEQNO:7和SEQ NO:8所示，第五组引物序列如SEQ NO:9和SEQ NO:10所示。
2.权利要求1所述的引物在基因敲除方面的应用。
3.一种基于CRISPR/Cas9技术的条件性基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)表达载体的构建：构建组织特异性表达的sgRNA载体和组成型/药物诱导型表达的Cas9载体；
2)表达载体测序正确后，分别电转到ES细胞中；通过PCR或Southern Blot验证，分别获得含有sgRNA表达质粒的ES细胞和含有Cas9蛋白的ES细胞并扩大培养；
3)将含有Cre重组酶的质粒转化到含有Cas9蛋白的ES细胞中，获得没有筛选标记的Cas9表达载体的ES细胞；
4)将含有Cas9表达载体的ES细胞与含有sgRNA表达质粒的ES细胞分别注射到囊胚中；
5)将囊胚分别移植到代孕母鼠中，进行饲养；生产出的后代即为F0代组织特异性表达的sgRNA小鼠和组成型/药物诱导型的Cas9工具鼠；
6)将检测正确的Cas9工具鼠与sgRNA小鼠杂交，获得组织特异性/药物诱导型基因敲除小鼠。
4.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述组织特异性表达的sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、反向的2个LoxP位点和反向的U6启动子。
5.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述组织特异性表达的sgRNA载体包括组织特异性表达的启动子、Cre重组酶、正向的U6启动子、方向相同的2个LoxP位点和终止区域。
6.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述F0代组织特异性表达sgRNA小鼠的构建方法如下：
21)sgRNA片段设计与合成：
22)将步骤21)合成的sgRNA片段退火为双链片段；
23)将双链片段连接到线性化载体Church Cloning Vector或pCR-Blunt II-TOPO中得到连接产物sgRNA表达质粒；
24)将连接产物sgRNA表达质粒转化、挑选阳性克隆，进行菌落PCR验证；
25)将菌落PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
26)将验证正确的克隆进行测序得到测序正确的sgRNA表达质粒；
27)将测序正确的sgRNA表达质粒电转至小鼠的ES细胞中；经Southern Blot验证得到验证正确的ES细胞；
28)将验证正确的ES细胞注射到小鼠的囊胚中，随后转移至代孕母鼠中，最后得到F0代sgRNA的小鼠。
7.根据权利要求3所述的基因敲除方法，其特征在于，所述组成型/药物诱导型的Cas9工具鼠的构建方法如下：
31)Cas9蛋白的扩增；
32)Cas9蛋白与Rosa26载体连接得到组成型/药物诱导型表达的Cas9载体；
33)将测序正确的组成型/药物诱导型表达的Cas9载体线性化后电转到ES细胞中得到含有Cas9蛋白的ES细胞；
34)用含有新霉素的培养基筛选含有Cas9蛋白的ES细胞得到含有Cas9蛋白的阳性ES细胞；随后用Southern Blot验证；
35)将带有Cre重组酶的质粒转到含有Cas9蛋白阳性ES细胞中，获得没有筛选标记的阳性ES细胞；
36)将没有筛选标记的阳性ES细胞显微注射到小鼠囊胚中，而后转移至代孕母鼠中，最后得到含有Cas9蛋白的工具鼠。
8.根据权利要求6所述的基因敲除方法，其特征在于，所述菌落PCR采用的引物序列如SEQ NO:3和SEQ NO:4所示，菌落PCR的扩增条件为：预变性94℃，3min；变性94℃，20s；退火58℃，25s；延伸72℃，20s，25个循环，终延伸72℃，5min。
9.根据权利要求9所述的基因敲除方法，其特征在于，所述Cas9蛋白的扩增步骤如下：设计扩增Cas9蛋白的引物，其序列如SEQ NO:5和SEQ NO:6所示；采用PCR扩增Cas9蛋白全序列，PCR扩增条件为：预变性98℃，3min；变性98℃，25s；退火63℃，25s；延伸72℃，4min30s，25个循环，终延伸72℃，5min。
10.根据权利要求7所述的基因敲除方法，其特征在于，所述Cas9蛋白与Rosa26载体连接步骤如下：用Clontech公司的HD Clinging Kit试剂盒将检测正确的Cas9序列与经AsisI与HpaI酶线性化的载体连接，将连接好的载体转化大肠杆菌、挑取克隆子、菌落PCR验证后，送苏州金唯智公司测序，其中菌落PCR引物采用的是SEQNO:7和SEQ NO:8所示的引物，该菌落PCR的扩增条件为：预变性95℃，3min；变性95℃，30s；退火58℃，30s；延伸72℃，45s，26个循环，终延伸72℃，5min。
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