CN104357562A - 一种用于检测白血病细胞的磁珠捕获探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针及其应用。本发明所提供的用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针，由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子。实验证明，利用本发明所提供的磁珠捕获探针可用于白血病细胞的检测及白血病病情的监测。具体而言，本发明具有以下优点：1、本发明所提供的是一种直观的、可用于定量分析的白血病细胞检测方法。检测结果不受检测者经验的影响，客观性强。2、本发明可以作为白血病的快速诊断手段，在半个小时之内能够得到结果。3、本发明是使用简单、价格低廉、结果可靠的检测方法。

Description

一种用于检测白血病细胞的磁珠捕获探针及其应用

技术领域

本发明属于生物材料的临床医学应用领域，涉及一种用于检测白血病细胞的磁珠捕获探针及其应用。

背景技术

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。克隆性白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其他造血组织中大量增殖累积，并浸润其他组织和器官，同时正常造血受抑制。临床可见不同程度的贫血、出血、感染发热以及肝、脾、淋巴结肿大和骨骼疼痛。

白血病是我国的高发肿瘤之一，其分型诊断需要联合形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子生物学等各种手段。由于细胞形态的多样性，单纯依靠形态学检查很难准确分型；也未发现白血病细胞特异性单克隆抗体，白血病作为一种高度异质性疾病，抗原表达有时较紊乱，跨系列表达较为常见，部分白血病相关抗原在治疗过程中或复发时会丢失或发生系列转换；利用细胞遗传学(染色体核型和显带)与分子生物学的检查方法，使诊断的客观性和准确率明显提高，但只有40％的急性淋巴细胞白血病(ALL)有染色体的异常，而且各种临床亚型并没有对应特异性染色体异常，另外、这些检查耗时、成本高，使之普及性有一定难度。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针。

本发明所提供的用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针，具体由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子。

本发明的另一个目的是提供一种所述磁珠捕获探针的制备方法。

本发明所提供的所述磁珠捕获探针的制备方法，具体可包括如下步骤：将经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，通过生物素-链霉亲和素反应，使所述捕获探针固定于所述磁珠，从而获得所述磁珠捕获探针。

在本发明中，所述生物素具体标记于所述捕获探针的3’端。

所述方法中，进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠的配比为75pmol：1mg。

进一步，所述孵育具体为20-30℃(如25℃)80-150rpm(如100rpm)震荡孵育10-30(如15min)。所述孵育的液体环境为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，CaCl₂0.14g/L，Na₂HPO₄·H₂O 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.42g/L，NaHCO₃0.35g/L，KH₂PO₄0.2g/L，葡萄糖4.5g/L”。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述磁珠捕获探针的制备方法包括如下步骤：分别取浓度为500nM(以所述捕获探针的量计)的经生物素标记的所述捕获探针的溶液(溶剂为所述结合缓冲液)和浓度为10mg/ml(以所述磁珠的量计)的经链霉亲和素标记的所述磁珠溶液(溶剂为所述结合缓冲液)，按照体积比3:2的配比混合，20-30℃(如25℃)80～150rpm(如100rpm)震荡孵育10-30min(如15min)，即获得所述磁珠捕获探针。

含有所述磁珠捕获探针的试剂盒也属于本发明的保护范围。

所述磁珠捕获探针，或所述试剂盒，在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(a)制备用于白血病细胞检测的试剂盒；

(b)制备用于白血病病情监测的试剂盒。

在本发明中，所述白血病细胞检测为从待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞中检测白血病细胞。

在所述应用中，进行所述白血病病情监测时，采用的待测样本可为待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞。

所述待测者可为白血病患者、健康的正常人、或患有其他疾病(如地中海贫血、骨髓异常增多症、或缺铁性贫血)的非白血病患者。

在本发明中，所述白血病具体为急性淋巴细胞白血病(ALL)或急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)。其中，ATLL具体可如急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)或慢粒急淋变。

实验证明，利用本发明所提供的磁珠捕获探针可用于白血病细胞的检测及白血病病情的监测。具体而言，本发明具有以下优点：

1、本发明所提供的是一种直观的、可用于定量分析的白血病细胞检测方法。检测结果不受检测者经验的影响，客观性强。

2、本发明可以作为白血病的快速诊断手段，在半个小时之内能够得到结果。

3、本发明是使用简单、价格低廉、结果可靠的检测方法。

附图说明

图1为磁珠捕获探针从DIPY染色的健康正常人和ALL病人外周全血中捕获细胞荧光显微镜成像图。A、B分别为健康正常人外周全血捕获前光学显微镜和荧光显微镜观察结果；C、D分别为健康正常人外周全血捕获后光学显微镜和荧光显微镜观察结果。E、F分别为T-ALL病人外周全血捕获前光学显微镜和荧光显微镜观察结果；G、H分别为T-ALL病人外周全血捕获后光学显微镜和荧光显微镜观察结果。

图2为磁珠捕获探针从健康正常人和ALL病人外周全血细胞中捕获白血病细胞光学显微镜成像图。A、B分别为健康正常人全血与磁珠捕获探针孵育25分钟后洗涤前和洗涤后；C、D分别为ALL患者全血与磁珠捕获探针孵育25分钟后洗涤前和洗涤后。

图3为磁珠捕获探针从非白血病患者和白血病患者骨髓细胞中捕获白细胞光学显微镜成像图。A、B分别为非白血病患者骨髓与磁珠捕获探针孵育25分钟后洗涤前和洗涤后；C、D分别为白血病患者骨髓与磁珠捕获探针孵育25分钟后洗涤前和洗涤后。

图4为磁珠捕获探针从非白血病和ALL白细胞中捕获细胞光学显微镜成像图。A、B分别为非白血病患者骨髓白细胞与磁珠捕获探针孵育25分钟后洗涤前和洗涤后；C、D分别为ALL患者骨髓白细胞与磁珠捕获探针孵育25分钟后洗涤前和洗涤后。

图5为ALL患者骨髓白细胞中捕获细胞百分比与原始幼稚细胞百分比相关性分析图。

图6为通过对ALL患者的骨髓涂片与白细胞捕获后的涂片结果图。A、B分别为急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)患者骨髓涂片与白细胞捕获后的涂片。C、D分别为B-All-L2患者骨髓涂片与白细胞捕获后的涂片。

图7为磁珠捕获探针从健康正常人和ALL患者淋巴细胞中捕获白血病细胞光学显微镜成像图。A、B分别为健康正常人淋巴细胞捕获前、后；C、D分别为ALL患者淋巴细胞捕获前、后。

图8为磁珠捕获探针对T-ALL病人病情监测光学显微镜成像图。A为病人淋巴细胞；B为治疗前；C为治疗3天后；D为治疗4天后；E为治疗后第5天；F为治疗后第13天。

图9为T-ALL患者化疗前后外周血淋巴细胞中捕获细胞百分比和外周血淋巴细胞计数比较图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针的制备

一、经生物素标记的捕获探针的制备

所述生物素标记的捕获探针为生物素标记的单链DNA分子，为中国大连宝生物公司产品，该探针所用单链DNA的序列如下：

5’-ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGAAAAAA-3’(序列1)，其中生物素标记分子在核酸链的3’端。

二、经链霉亲和素标记的磁珠的制备

所述链霉亲和素标记的磁珠为Invitrogen公司生产的Dynabeads链霉亲和素磁珠M280，该磁珠的具体参数如下：如磁珠平均直径2.8μm、表面积：4-8m²/g、密度：1.4g/cm³、磁珠含量：10mg/ml、等电点：pH 5.0、低电荷：-10mV(pH 7)、CV值<3％、铁含量(铁氧体)：12％(17％)。

三、磁珠捕获探针的制备

1、将步骤一中获得的经生物素标记的捕获探针用结合缓冲液配制成浓度为500nM(以捕获探针的量计算)的溶液。其中，结合缓冲液的组成如下(以1L溶液为例)：NaCl 8g，KCl 0.2g，CaCl₂0.14g，Na₂HPO₄·H₂O 0.1g，MgCl₂·6H₂O 1.42g，NaHCO₃0.35g，KH₂PO₄0.2g，葡萄糖4.5g；余量为水。

2、取200μl步骤二获得的经链霉亲和素标记的磁珠(浓度为10mg/ml，以磁珠的量计算)，用结合缓冲液(配方同上)洗涤2次后，再将磁珠悬浮于200μl的结合缓冲液中。

3、取300μl步骤1获得的浓度为500nM(以捕获探针的量计算)的经生物素标记的捕获探针溶液与200μl经步骤2处理的链霉亲和素标记的磁珠充分混匀后，于25℃100rpm震荡孵育15分钟，置磁力架上，磁分离后，弃上清，所得沉淀用结合缓冲液(配方同上)重悬。

4、用50μl的结合缓冲液(配方同上)清洗两次，最后用200μl结合缓冲液(配方同上)重悬已固定有DNA的磁珠至10mg/ml(以磁珠计)。

实施例2、用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针的应用实例

一、磁珠捕获探针从DIPY染色的外周全血中捕获白血病细胞

待测样本：取自临床确认为健康正常人的外周全血，以及取自临床确诊为T-ALL患者的外周全血。

向待测的外周全血中加入含肝素溶液(10～50U/ml血样本)，混匀，使血液抗凝。然后按照如下步骤进行操作：

(1)取70μl的外周全血细胞悬液(含细胞总数约1×10⁶)，加入10μl的DAPI染液(浓度为2.9nmol/L，用于细胞核染色)，25℃孵育3分钟后，1200rpm离心5分钟，弃上清，加入100μl PBS洗涤3次，每次1200rpm离心5分钟，用40μl PBS重悬。

(2)在步骤(1)的重悬液中加入4μl浓度为10mg/ml(以磁珠计)的实施例1获得的磁珠捕获探针，25℃孵育25分钟后，用50μl结合缓冲液(配方同上)洗涤2次，将捕获前后的溶液分别取少量滴加到载玻片上制成滴片，滴片在荧光显微镜和普通光学显微镜下分别观察。实验重复三次。

结果如图1所示，可见磁珠捕获探针在健康正常人的外周全血中未捕获到细胞，但是能捕获到T-ALL病人的有核细胞，不捕获红细胞(无细胞核)

二、动态观察磁珠捕获探针对外周全血细胞的捕获情况

待测样本：取自临床确认为健康正常人的外周全血，以及取自临床确诊为T-ALL患者的外周全血。

向待测的外周全血中加入含肝素溶液(10～50U/ml血样本)，混匀，使血液抗凝。然后按照如下步骤进行操作：

(1)分别取健康正常人和T-ALL患者经过抗凝处理的外周全血500μl，1000rpm离心5分钟，弃上清，从离心管底部吸弃大部分的红细胞，加入2ml的结合缓冲液(配方同上)洗涤3次，最终将细胞悬浮于500μl结合缓冲液(配方同上)中，待用。

(2)取4μl浓度为10mg/ml(以磁珠计)的实施例1获得的磁珠捕获探针，加入到20μl步骤(1)最终获得的细胞悬浮液中，25℃孵育25分钟。缓慢加入50μl的结合缓冲液(配方同上)洗涤，并置于磁力架上吸弃上清，反复洗涤3次。最终悬浮于50μl的结合缓冲液中(配方同上)，在显微镜下观察。实验重复三次。

结果如图2所示，可见磁珠捕获探针不捕获健康正常人外周全血的细胞，而在T-ALL患者外周全血中可以捕获到白血病细胞。

三、动态观察磁珠捕获探针对骨髓细胞的捕获情况

待测样本：取自临床确诊为非白血病患者(具体为骨髓异常增多症1例，缺铁性贫血1例)的骨髓，以及取自临床确诊为慢粒急淋变患者的骨髓。

向待测的骨髓中加入含肝素溶液(10～50U/ml骨髓样本)，混匀，获得抗凝骨髓液。然后按照如下步骤进行操作：

(1)分别取待测的非白血病患者和慢粒急淋变患者抗凝的骨髓液500μl，1000rpm离心5分钟，弃上清，从离心管底部吸弃大部分的红细胞，加入2ml的结合缓冲液(配方同上)洗涤3次，最终将细胞悬浮于500μl的结合缓冲液(配方同上)中，待用。

(2)取4μl浓度为10mg/ml(以磁珠计)的实施例1获得的磁珠捕获探针，加入到20μl步骤(1)最终获得的细胞悬浮液中，25℃孵育25分钟。缓慢加入50μl的结合缓冲液(配方同上)洗涤，并置于磁力架上吸弃上清，反复洗涤3次。最终悬浮于50μl结合缓冲液(配方同上)，在显微镜下观察。实验重复三次。

结果如图3所示，可见磁珠捕获探针不捕获非白血病患者的骨髓细胞，而在慢粒急淋变患者的骨髓中可以捕获到大量白血病细胞。

四、动态观察磁珠捕获探针从白细胞中捕获细胞并计数

1、实验方法

待测样本：取自临床确诊为非白血病患者(具体为骨髓异常增多症1例，缺铁性贫血1例)的骨髓，以及取自临床确诊为ALL患者(2例T-ALL、4例B-ALL、1例慢粒急淋变)，以及1例急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)的骨髓。

向待测的骨髓中加入含肝素溶液(10～50U/ml骨髓样本)，混匀，获得抗凝骨髓液。然后按照如下步骤进行操作：

(1)白细胞的获取：取抗凝骨髓液100μl，加入红细胞裂解液4ml混匀，37℃水浴15min，至样品完全透明。1500rpm离心5分钟，弃上清加入500μl的结合缓冲液(配方同上)洗涤2次。

(2)取3×10⁵白细胞，置于96孔板中。

(3)取4μl浓度为10mg/ml(以磁珠计)的实施例1获得的磁珠捕获探针，加入到步骤(2)的细胞样品中，室温孵育25分钟。

(4)缓慢加入50μl的结合缓冲液(配方同上)洗涤，并置于磁力架上吸弃上清，反复洗涤3次。最终悬浮于50μl的结合缓冲液中(配方同上)，在光学显微镜下观察细胞捕获情况，计数200个细胞中被捕获细胞的数量，并计算捕获细胞百分比。

(5)一方面，将7例ALL患者骨髓白细胞中捕获细胞百分比与原始幼稚细胞百分比进行相关性分析。。

另一方面，将ALL患者和AML-M4患者的骨髓涂片与白细胞捕获后的涂片结果进行比较，从而对捕获细胞的类型进行进一步确定。

2、结果

(1)光学显微镜下的观察结果

如图4所示，可见磁珠捕获探针不捕获非白血病患者的白细胞，而在T-ALL患者的骨髓中可以捕获到大量细胞。

(2)ALL患者骨髓白细胞中捕获细胞百分比与原始幼稚细胞百分比相关性分析结果

如图5所示，可见7例ALL患者骨髓白细胞中捕获细胞和原始幼稚细胞百分比相关性分析，有5例患者(2例T-ALL、2例B-ALL和1例慢粒急淋变)明显相关P＜0.05，R²＝0.9159。2例B-ALL患者无明显相关性。这表明，绝大多数患者捕获结果与临床骨髓形态指标密切相关。

(3)通过对ALL患者的骨髓涂片与白细胞捕获后的涂片结果进行比较，从而对捕获细胞的类型

急性粒-单核细胞白血病(AML-M4)患者骨髓细胞形态检查显示：粒系异常增生，原粒占20.5％。单核系统异常增生占43.5％，原幼单占33.5％，胞体较大，呈类圆形或不规则形；胞浆丰富，呈不透明灰蓝色，胞核大，类圆形，易见扭曲，折叠和分叶等现象；核质纤细，疏松呈网状，核仁1～2个(图6中A)。AML-M4患者白细胞捕获后涂片结果：被捕获细胞的特点为胞体较大，胞浆丰富，呈不透明灰蓝色，胞核大，类圆形有分叶；核质纤细，疏松呈网状。鉴定为原幼单核细胞(图6中B)。

B-All-L2患者骨髓细胞形态检查显示：淋巴系增生异常，占92％，原、幼淋占89.5％，细胞大小不一，以大细胞为主，核圆形、类圆形或不规则。胞浆量少，染蓝色(图6中C)。B-All-L2患者白细胞捕获后涂片结果：捕获到细胞较大、圆形、核圆形或不规则，胞浆量少。鉴定为原始、幼稚淋巴细胞(图6中D)。

因此，可以确定磁珠捕获探针所捕获的细胞为白血病细胞。

五、动态观察捕获探针从淋巴细胞中捕获细胞并计数

待测样本：取自临床确认为健康正常人的外周全血，以及取自临床确诊为T-ALL患者的外周全血。

向待测的外周全血中加入。含肝素溶液(10～50U/ml血样本)，混匀，使血液抗凝。然后按照如下步骤进行操作：

(1)淋巴细胞的获取：用pH 7.2的PBS将1ml的抗凝血按照体积比1：1进行稀释；吸取1ml淋巴细胞分离液(Solarbio公司产品，其产品目录号为P8610)置于刻度离心管中。将稀释的全血沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液上面；在18℃～20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min，收集PBMC，用PBS液洗涤细胞3次，每次1600rpm，离心10分钟。用结合缓冲液(配方同上)重悬细胞，混匀，计数后加入完全1640培养基，移至6孔培养板中培养30～45min，收集悬浮细胞即为淋巴细胞。

(2)分别取3×10⁵淋巴细胞，置于96孔板中。

(3)取4μl浓度为10mg/ml(以磁珠计)的实施例1获得的磁珠捕获探针，加入到步骤(2)的细胞样品中，室温孵育25分钟。

(4)缓慢加入50μl的结合缓冲液(配方同上)洗涤，并置于磁力架上吸弃上清，反复洗涤3次。最终悬浮于50μl的结合缓冲液(配方同上)中，在光学显微镜下观察细胞捕获情况。

光学显微镜下的观察结果如图7所示，可见在健康正常人的淋巴细胞中未见细胞捕获，而在T-All病人中可见细胞捕获。

六、磁珠捕获探针用于白血病病情监测

待测样本：取自临床确诊为T-ALL患者化疗前、化疗开始3天、4天、5天、6天和第13天的外周全血。

向待测的外周全血中加入含肝素溶液(10～50U/ml血样本)，混匀，使血液抗凝。然后按照如下步骤进行操作：

(1)淋巴细胞的获取：同步骤五(1)。

(2)分别取3×10⁵淋巴细胞，置于96孔板中。

(3)取4μl浓度为10mg/ml(以磁珠计)的实施例1获得的磁珠捕获探针，加入到步骤(2)的细胞样品中，室温孵育25分钟。

(4)缓慢加入50μl的结合缓冲液(配方同上)洗涤，并置于磁力架上吸弃上清，反复洗涤3次。最终悬浮于50μl的结合缓冲液(配方同上)中，在光学显微镜下观察细胞捕获情况，计数200个细胞中被捕获细胞的数量，并计算捕获百分比。

(5)将捕获百分比与外周血淋巴细胞计数结果相比较。

光学显微镜下的观察结果如图8所示，T-ALL患者化疗前后外周血淋巴细胞中捕获细胞百分比和外周血淋巴细胞计数比较结果如图9所示。可以看到，捕获细胞百分比由化疗前的93％逐渐下降，至化疗后第13天，降至4.5％。捕获细胞周围的磁珠数目也随治疗天数的增加逐渐减少，且与患者的病情相符合。这表明，本发明所提供的磁珠捕获探针可以用于白血病病情的监测。

Claims (9)

1.一种用于白血病细胞检测的磁珠捕获探针，由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为序列表中序列1所示的单链DNA分子。

2.权利要求1所述的磁珠捕获探针的制备方法，包括如下步骤：将经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，获得所述磁珠捕获探针。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠的配比为75pmol：1mg。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述孵育为20-30℃80-150rpm震荡孵育10-30min。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述孵育的液体环境为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，CaCl₂0.14g/L，Na₂HPO₄·H₂O 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 1.42g/L，NaHCO₃0.35g/L，KH₂PO₄0.2g/L，葡萄糖4.5g/L。

6.含有权利要求1所述的磁珠捕获探针的试剂盒。

7.权利要求1所述的磁珠捕获探针，或权利要求6所述的试剂盒，在如下任一中的应用：

(a)制备用于白血病细胞检测的试剂盒；

(b)制备用于白血病病情监测的试剂盒。

8.根据权利要求1-7中任一所述的磁珠捕获探针或方法或试剂盒或应用，其特征在于：所述白血病细胞检测为从待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞中检测白血病细胞。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：进行所述白血病病情监测时，采用的待测样本为待测者的外周全血、骨髓细胞、白细胞或淋巴细胞。